專利名稱：一種治療斑禿藥物的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物的制備方法，特別是涉及一種治療斑禿藥物的制備方法。
背景技術：
斑禿是皮膚科臨床常見疾病之一，占皮膚科門診量的10～15％，由于生活節奏的加快，這一數字還有進一步升高的趨勢，斑禿進一步發展可演變為普禿和全禿，這給患者身心帶來嚴重的負擔。在斑禿的的治療中，多以全身或局部應用激素，但長期使用激素會產生一系列明顯的副作用如庫欣氏征、皮膚變薄等。如何減少或不用激素治療斑禿是目前亟待解決的問題。
一般認為，人毛乳頭細胞(dermal papilla cells，DPC)在毛囊的發育及周期性生長調控中起重要作用。要闡明人毛乳頭細胞對調節毛囊生長和發育的機制，必須從人毛乳頭細胞自身分泌的生物活性成份著手，這也是今后毛囊研究的重要內容之一。我們在建立人毛乳頭細胞體外培養模型基礎上，應用低傳代人毛乳頭細胞的培養上清制成條件培養基，觀察其對不同傳代的人毛乳頭細胞生長狀態的影響，發現人毛乳頭細胞條件培養液(dermal papilla cellconditional medium DPCCM)能將非凝集生長的人毛乳頭細胞有效誘導為凝集性生長狀態，并促進細胞增殖。為進一步分析人毛乳頭細胞生長活性蛋白的體內生物學活性，我們將人毛乳頭細胞條件培養液制成凍干粉，初步應用于斑禿患者，發現其有確切的治療作用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種治療斑禿藥物的制備方法。
本發明藥物制備的方案是通過以下步驟來實現的1.試劑和材料低糖培養基(DMEM)購自Sigma公司。Hepes購自BoehringerMannheim公司。健康人AB型血清第三軍醫大學西南醫院輸血科提供。
2.藥物制備的方法基礎培養基的制備1).人AB型血清的制備a)采集健康獻血員(經查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋體感染)全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的人AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用，也可直接行下例步驟h)；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；f)將人AB型血清室溫放置2小時；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，注意其上下溫差應小于0.5℃；i)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存備用。
2).基礎培養基的制備將15ml人AB型血清與85ml低糖培養基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存備用。
3).人毛乳頭細胞條件培養液的收集(1)取意外死亡的正常健康青年(經查排除HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋體感染)枕后一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭細胞(參見鐘白玉，楊希川，楊衛兵，等。二步酶消化法分離人頭皮毛乳頭細胞[J]。中華皮膚科雜志，2003；36(7)406。)；(2)培養時在50ml培養瓶中加入5ml基礎培養基，100ml培養瓶中加入7ml基礎培養基，3天換一次基礎培養基；(3)開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代毛乳頭細胞培養上清從培養瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在IK16型離心機(美國SIGMA公司)中3000rpm離心10分鐘；(4)在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清(小心不能攪起底部的沉淀)，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標記，-20℃凍存備用。
4).人毛乳頭細胞條件培養液凍干粉的制備(1)凍干室紫外線消毒4小時；(2)操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將人毛乳頭細胞條件培養液分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；(3)將凍干瓶放入凍干機中；(4)凍干過程I -40℃4小時II -20℃3小時III-5℃ 10小時IV 5℃ 4小時V 15℃ 3小時VI 25℃ 5小時(5)在真空環境下，用手搖下壓力蓋，真空封包凍干瓶完成；(6)打開凍干機凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；(7)貼上標簽，注明標識和日期，4℃保存備用。
治療斑禿藥物的理化特性為顏色白色；形態粉末狀；pH值7.35；溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內可完全溶解，溶解后液體為橙紅色。
本發明的優點和產生的有益效果是人毛乳頭細胞為分泌性細胞，在體外培養時可分泌許多蛋白質，這些蛋白質可促進毛囊的生長和發育，在體外實驗我們已證明其有確切的生物學活性，但其應用于臨床還未見報道，我們在原有的培養人毛乳頭細胞的基礎上，改進其培養基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培養出人毛乳頭細胞，我們收集培養過低傳代人毛乳頭細胞的基礎培養基，用于臨床治療斑禿，觀察其治療效果，發現有確切的治療作用，取得了良性的經濟效益和社會效益。
應用本發明制備的藥物在治療斑禿中有明顯的療效，明顯優于其它藥物(如激素)對斑禿的治療效果，且本藥物所用細胞和培養血清均對人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應，本發明用含人AB型血清的基礎培養基培養人毛乳頭細胞，較以前用小牛血清培養人毛乳頭細胞在技術上取得了突破，這就為本藥物應用于臨床奠定了基礎，這也是本發明關鍵技術的核心所在。
具體實施例方式
藥物的配制每瓶凍干粉用3ml生理鹽水溶解(恢復凍干前原始濃度)。藥物的生物安全性實施例1).小鼠急性毒性試驗我們選用7～9周齡、體重為18～22g的昆明種小鼠。按預試驗公比0.8設立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg等5個劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。單次腹腔注射，藥后立即觀察、記錄動物的中毒反應、死亡情況及時間，連續觀察14天。
2).家兔熱原試驗選3只體重為1.8～2.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg耳靜脈注射給藥。測量家兔肛門體溫，深度為6厘米，以后每隔1小時測量體溫1次，共3次。
3).細菌培養隨機抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，4道劃線法接種于普通血平板上，培養48小時后觀察結果。
4).真菌培養隨機抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，接種于沙堡氏培養基上，培養10日后觀察結果。
試驗結果小鼠急性毒性試驗顯示在腹腔注射不同劑量人毛乳頭細胞條件培養液樣品溶液后，各組動物未發現明確的中毒癥狀，在整個試驗期限內無動物死亡或其它異常征象。家兔熱原試驗顯示在耳靜脈注射人毛乳頭細胞條件培養液樣品溶液后，各動物的體溫變化均符合熱原試驗的要求。細菌和真菌培養均未見細菌和真菌生長。
藥物的臨床實施例選擇50例年齡在12～64歲的斑禿患者為人毛乳頭細胞條件培養液治療組，其中26例為人毛乳頭細胞條件培養液治療組中多發性斑禿患者，選擇與人毛乳頭細胞條件培養液治療患部距離在2厘米以上的患部作為去炎松治療組；選擇與人毛乳頭細胞條件培養液距離在5厘米以上的患部作為空白自身對照患部，以上3組均常規消毒患部皮膚后皮下多點注射治療，2月后觀察療效。
表1各組斑禿治療2月后情況(％)
*與空白對照組比較，P＜0.01，*與去炎松組比較，P＜0.01人毛乳頭細胞條件培養液在通過生物安全鑒定后，我們在患者知情同意的情況下應用于患部。50例人毛乳頭細胞條件培養液治療的斑禿患者中，除2例無效外其余均有一定療效，這與去炎松治療組比較取得了良好的療效。人毛乳頭細胞條件培養液治療組中有29例為復發性斑禿患者且多次臨床治療無效，在這29例患者中除1例無效外其余均有一定療效，說明人毛乳頭細胞條件培養液在治療復發性斑禿上明顯優于患者以前治療所使用過的方法。在人毛乳頭細胞條件培養液治療的50例斑禿患者中，我們選擇26例多發性斑禿患者，在同一患者頭部不同的斑禿患部分別應用人毛乳頭細胞條件培養液和去炎松，發現人毛乳頭細胞條件培養液在治療斑禿時，其促進頭發生長的速度明顯快于去炎松治療組，而且新生毛發在光澤度上也明顯優于去炎松治療組。人毛乳頭細胞條件培養液治療斑禿患者時新生毛發的生長先是呈島狀生長的，而去炎松則是呈現平原狀生長，說明毛發的生長是有一定的相互促進作用，也可能與一定的毛乳頭生長活性蛋白濃度依賴有關。我們用利多卡因生理鹽水溶液作空白對照，發現有3例新發斑禿患者有一定療效，而復發性斑禿無一有效，說明對于新發的斑禿，用一定的刺激是有一定的療效的，而復發性斑禿用普通刺激則效果較差，這也與過去臨床上用生姜、辣椒膏、石碳酸等外用治療斑禿結果相一致。
權利要求
1.一種治療斑禿藥物的制備方法，其特征在于用含人AB型血清的基礎培養基培養低傳代人毛乳頭細胞，收集低傳代人毛乳頭細胞培養上清，將所收集上清液制備成凍干粉。(1)上述人AB型血清制備的步驟為a)采集健康獻血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，e)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，注意其上下溫差應小于0.5℃；f)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；h)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存備用。(3)上述的基礎培養基的制備方法基礎培養基將15ml人AB型血清與85ml低糖培養基(DMEM)，0.24gHepes，0.2g碳酸氫鈉，0.03g L-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-20℃凍存備用。(4)人毛乳頭細胞條件培養液的收集過程為a)取意外死亡的正常健康青年枕后一手掌大小頭皮，用二步酶法分離人毛乳頭；b)培養時在50ml培養瓶中加入5ml基礎培養基，100ml培養瓶中加入7ml基礎培養基，3天換一次基礎培養基；c)開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代人毛乳頭細胞培養上清從培養瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在離心機中離心；d)在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標記，-20℃凍存備用。(5)人毛乳頭細胞條件培養液的凍干過程為a)凍干室紫外線消毒4小時；b)操作時著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75％酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將藥物分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；c)將凍干瓶放入凍干機中；d)連續凍干過程I -40℃4小時II -20℃3小時III -5℃ 10小時IV 5℃ 4小時V 15℃ 3小時VI 25℃ 5小時e)在真空環境下，用手搖下壓力蓋，真空封包凍干瓶完成；f)打開凍干機凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；g)貼上標簽，注明標識和日期，4℃保存備用。
2.根據權利要求1所述的一種治療斑禿藥物的制備方法，其特征在于上述人AB型血清制備的步驟也可為a)采集健康獻血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37℃水箱中放置1小時；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-20℃冷凍箱備用；e)將人AB型血清袋從-20℃冷凍箱中取出，放入4℃冷藏箱中12小時；f)將人AB型血清室溫放置2小時；g)將人AB型血清在37℃水箱中放置1小時；h)將人AB型血清在56℃水箱中放置1小時去除補體，注意其上下溫差應小于0.5℃；i)在超凈臺上用2％碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20℃凍存備用。
全文摘要
本發明涉及一種藥物的制備方法，特別是涉及一種治療斑禿藥物的制備方法。藥物的前體為含15％人AB型血清的基礎培養基，該基礎培養基按15ml人AB型血清、85ml低糖培養基(DMEM)、0.24gHepes、0.2g碳酸氫鈉、0.03g L－谷氨酰胺配比構成。用基礎培養基培養低傳代人毛乳頭細胞，收集低傳代人毛乳頭細胞培養上清為人毛乳頭細胞條件培養液，將所收集的人毛乳頭細胞條件培養液制備成凍干粉。本發明所制備的藥物在治療斑禿中有明顯的療效，明顯優于其它藥物(如激素)對斑禿的治療效果，且本藥物所用細胞和培養血清對人體均無抗原性，用于人體無任何過敏反應，克服激素治療斑禿給人體帶來的副作用。
文檔編號C12N5/08GK1824310SQ200510048870
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月31日 優先權日2005年12月31日
發明者羅洋 申請人:羅洋