專利名稱：一種液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法
技術領域：
本發明涉及微生物工程技術領域，特別涉及一種大團囊蟲草菌(Cordyceps ophioglossoides)的液體深層發酵培養工藝。
背景技術：
大團囊蟲草是一種名貴中草藥，我國南方地區民間使用較為普遍，具有悠久的歷史。該蟲草子實體在治療婦科疾病方面藥用價值極高，主要用于治療月經不調、痛經、閉經等病，對產后出血、促進產后子宮復原也具有顯著效果。由于野生資源的匱乏和生長環境的惡化，現有該真菌的天然資源已不能滿足人們的需求，利用現代的生物技術來挽救這種名貴的中藥十分必要。
上個世紀中后期發展起來的現代發酵技術已成功應用于多種藥用真菌的大規模生產，其中以液體發酵技術最為成熟。本次將液體發酵技術應用到大團囊蟲草菌體的生產在國內尚屬首例，研究結果表明該方案是可行的。
發明內容
本發明的目的在于針對液體發酵過程中的營養需求與菌體生長的關系，提供了一種液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，菌種是本實驗室分離得到的大團囊蟲草菌的純菌株(拉丁文學名為Cordycepsophioglossoides)，現保存于中國專利局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號為CGMCC No.1146。
本發明提供的一種液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法的實施方案為以人工分離培養到的大團囊蟲草純菌株為出發菌種，依次經固體斜面培養，搖床種子培養和發酵培養完成。
固體斜面培養的條件為，從保藏菌種接種到配制的斜面培養基上，溫度20～30℃，培養200～240小時。
每1000毫升斜面培養基的主要成份為馬鈴薯100～300克、蔗糖或葡萄糖10～30克、瓊脂15～25克，加水定容至1升，調pH值為4.8～6.5。
搖床種子培養的條件為，菌種固體斜面培養200～240小時后，挑取菌絲體接種于裝有液體種子培養基的搖瓶中，在20～30℃培養，轉速150～200rpm，培養60～72小時。
種子培養基與搖瓶的容積比為1∶3～1∶5。
每1000毫升種子培養基的主要成份為蔗糖20～60克、酵母粉或酵母膏10～50克、蛋白胨10～50克、MgSO4·7H2O 0.1～0.5克、KH2PO40.1～0.5克，pH自然。
發酵培養的方法是，液體種子搖床培養60～72小時后接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，接種量5～15％(V/V)、保持罐溫20～30℃、罐壓0.4～0.8kg/cm，攪拌速率100～250rpm，通氣量1∶0.3～1∶1.2，發酵時間85～110小時。
每1000毫升發酵培養基的主要成份為蔗糖50～100克、酵母粉或酵母膏10～60克，蛋白水解液20～100毫升(V/V)、MgSO4·7H2O 0.2～1克、KH2PO40.2～1克，培養基的pH值調為4.8～6.5。
發酵培養采用液體深層通氣發酵培養。
本發明的放罐標準是發酵液變得粘稠，鏡檢發現菌絲體開始衰老。
經與其他培養工藝進行比較、反復試驗驗證，本發明效果顯著(1)本發明中種子培養基提供了菌體短期內快速生長所需的營養物質，培養60小時左右即可進行深層發酵。
(2)本發明中液體深層通氣發酵培養基，營養成分配比合理，能夠保證大團囊蟲草菌的生長需要，培養基材料豐富，整個分批發酵過程中只需一次配料、一次滅菌即可，具有省時、省工，又減少了由于中途加料造成污染雜菌的機會。
(3)采用本發明中的液體深層通氣發酵工藝進行分批發酵，每升發酵液可得到20～30克的干菌體。
(4)本發明是國內首次對大團囊蟲草菌的發酵工藝進行研究，對于該菌以后的實驗研究和工業化生產均有很大的指導意義。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步詳細描述本發明。
實施例1種子培養基的制備稱取蔗糖40克、酵母粉(膏)20克、蛋白胨30克、MgSO4·7H2O 0.2克、KH2PO40.2克，將各組分混合溶解，加水定容至1000毫升，滅菌后即得。
實施例2蛋白水解液的制備方法一取新鮮原料黃豆粉、蝦粉、蠶蛹粉等，于60℃烘箱中干燥6個小時，然后放于80℃烘箱中干燥17個小時，稱取干粉100克，加入生石灰6克，水640毫升，在0.15Mpa下加壓水解2個小時，過濾，取濾液即得。
方法二取新鮮原料黃豆粉、蝦粉、蠶蛹粉等，于60℃烘箱中干燥6個小時，然后放于80℃烘箱中干燥17個小時，稱取干粉100克，加入6mol/l的鹽酸600毫升，在沸水浴中水解30分鐘，過濾后收集濾液。
實施例3液體深層通氣發酵培養基的制備稱取蔗糖50克、酵母粉(膏)20克、按實施例2制備的蛋白水解液40毫升、MgSO4·7H2O 0.5克、KH2PO40.5克。將上述成分混合加水至1000毫升，另外加0.6毫升泡敵作消泡劑，用鹽酸調pH到5.6，滅菌后即為發酵培養基。
實施例4斜面培養基的制備稱取馬鈴薯200克、蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂20克，將各組分混合溶解，加水定容至1000毫升，用鹽酸調pH到5.6，滅菌后即為斜面培養基。實施例5液體深層培養方法一(1)取適量按實施例4配制的新鮮斜面培養基，挑取保藏菌種的菌絲體采用涂布或劃線的方法接種到斜面培養基上，于25℃培養200小時。
(2)選菌體繁茂的斜面培養菌種，從上挑取1立方厘米菌絲體或挖取1立方厘米菌苔接種于裝有按實施例1制備的液體種子培養基的搖瓶中，在溫度25℃，轉速200rpm條件下培養70小時。
(3)取處于對數生長中后期的種子培養物，以8％(V/V)的接種量轉接入裝有按實施例3制備的發酵培養基的發酵罐中，保持罐溫25℃、罐壓0.5kg/cm，攪拌速率150rpm，通氣量1∶0.6，發酵培養時間100小時。待發酵液變的粘稠，鏡檢觀察菌絲體開始衰老時，停止發酵、放罐，分別收集菌絲體和發酵液，每升發酵液可獲得20g以上的干燥菌絲體。
實施例6液體深層培養方法二(1)取適量按實施例4配制的新鮮斜面培養基，挑取保藏菌種的菌絲體采用涂布或劃線的方法接種到斜面培養基上，于20℃培養240小時。
(2)選菌體繁茂的斜面培養菌種，從上挑取1立方厘米菌絲體或挖取1立方厘米菌苔接種于裝有按實施例1制備的液體種子培養基的搖瓶中，在溫度30℃，轉速150rpm條件下培養60小時。
(3)取處于對數生長中后期的種子培養物，以5％(V/V)的接種量轉接入裝有按實施例3制備的發酵培養基的發酵罐中，保持罐溫30℃、罐壓0.4kg/cm，攪拌速率250rpm，通氣量1∶0.3，發酵培養時間110小時。待發酵液變的粘稠，鏡檢觀察菌絲體開始衰老時，停止發酵、放罐，分別收集菌絲體和發酵液，每升發酵液可獲得20g以上的干燥菌絲體。
實施例7液體深層培養方法三(1)取適量按實施例4配制的新鮮斜面培養基，挑取保藏菌種的菌絲體采用涂布或劃線的方法接種到斜面培養基上，于30℃培養220小時。
(2)選菌體繁茂的斜面培養菌種，從上挑取1立方厘米菌絲體或挖取1立方厘米菌苔接種于裝有按實施例1制備的液體種子培養基的搖瓶中，在溫度20℃，轉速180rpm條件下培養72小時。
(3)取處于對數生長中后期的種子培養物，以15％(V/V)的接種量轉接入裝有按實施例3制備的發酵培養基的發酵罐中，保持罐溫20℃、罐壓0.8kg/cm，攪拌速率100rpm，通氣量1∶1.2，發酵培養85小時左右。待發酵液變的粘稠，鏡檢觀察菌絲體開始衰老時，停止發酵、放罐，分別收集菌絲體和發酵液，每升發酵液可獲得20g以上的干燥菌絲體。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。
本發明可用其他的不違背本發明的精神和主要特征的具體形式來概述。因此，無論從哪一點來看，本發明的上述實施方案都只能認為是對本發明的說明而不能限制本發明，權利要求書指出了本發明的范圍，而上述的說明并未指出本發明的范圍，因此，在與本發明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。
權利要求
1.一種液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，其特征在于，以人工分離培養到的大團囊蟲草純菌株為出發菌種，依次經固體斜面培養，搖床種子培養和發酵培養完成；所述大團囊蟲草純菌株，拉丁文學名為Cordyceps ophioglossoides，保藏號是CGMCC No.1146。
2.根據權利要求1所述液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，其特征在于，固體斜面培養的條件為，從保藏菌種接種到配制的斜面培養基上，溫度20～30℃，培養200～240小時。
3.根據權利要求1所述液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，其特征在于，每1000毫升斜面培養基的主要成份為馬鈴薯100～300克、蔗糖或葡萄糖10～30克和瓊脂15～25克，培養基的pH值調為4.8～6.5。
4.根據權利要求1所述液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，其特征在于，搖床種子培養的條件為，菌種固體斜面培養200～240小時后，挑取菌絲體接種于裝有液體種子培養基的搖瓶中，在20～30℃培養，轉速150～200rpm，培養60～72小時。
5.根據權利要求1所述液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，其特征在于，每1000毫升種子培養基的主要成份為蔗糖20～60克、酵母粉或酵母膏10～50克、蛋白胨10～50克、MgSO4·7H2O 0.1～0.5克和KH2PO40.1～0.5克。
6.根據權利要求1所述液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，其特征在于，發酵培養的方法是，液體種子搖床培養60～72小時后接種至裝有發酵培養基的發酵罐中，接種量5～15％(V/V)、保持罐溫20～30℃、罐壓0.4～0.8kg/cm，攪拌速率100～250rpm，通氣量1∶0.3～1∶1.2，發酵時間85～110小時。
7.根據權利要求1所述液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，其特征在于，每1000毫升發酵培養基的主要成份為蔗糖50～100克、酵母粉或酵母膏10～60克，蛋白水解液20～100毫升、MgSO4·7H2O 0.2～1克和KH2PO40.2～1克，培養基的pH值調為4.8～6.5。
8.根據權利要求1所述液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，其特征在于，發酵培養采用液體深層通氣發酵培養。
全文摘要
本發明公開了一種液體深層發酵生產大團囊蟲草菌體的方法，以大規模液體深層發酵培養大團囊蟲草菌體(Cordyceps ophioglossoides)為目標。以人工分離培養到的大團囊蟲草純菌株為出發菌種，經斜面培養、搖瓶種子培養、最后到發酵罐培養，發酵液中的菌絲體以干重計可達2～3％的。本發明中公開的液體種子培養基和發酵培養基分別由蔗糖、酵母粉(膏)、蛋白胨、鎂鹽、鉀鹽和蔗糖、酵母粉(膏)、蛋白水解液、鎂鹽、鉀鹽組成。兩種培養基分別適合液體種子階段培養和深層液體通氣培養大團囊蟲草菌，合理滿足了大團囊蟲草菌不同發酵時期所需的營養物質，促進了菌體的生長和繁殖，提高了菌的活性。
文檔編號C12N1/14GK1737110SQ20051005019
公開日2006年2月22日 申請日期2005年6月22日 優先權日2005年6月22日
發明者李永泉, 鄭靜 申請人:浙江大學