一種調控植物組織或器官凋亡的方法及其專用表達載體的制作方法

專利名稱：一種調控植物組織或器官凋亡的方法及其專用表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種調控植物組織或器官凋亡的方法及其專用表達載體。
背景技術：
在自然界，植物與其它種類的生物一樣，具有自身決定的細胞程序性死亡，例如，落花、落果、落葉等。這些細胞程序性死亡是由生物自身的基因所決定，外界因素，如光、溫、濕和生長調節劑等最多只能對其起微量的調節作用，而無法控制這一進程是否發生。在人類利用植物生產人類所需要的產品時，往往需要并且希望能人工控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發育進程，包括死亡。例如，當棉花、玉米和番茄等成熟時，人們希望整株的葉片凋萎脫離，以方便采收，特別是機械采收；人們也希望楊樹在春天不產生飛絮、法國梧桐(二球懸鈴木)在春夏不產生“飛絮”；為了利用作物的雜種優勢，人們希望有穩定而且完全的雄性不育系。但在自然狀態下，人們的這種希望僅僅是一種希望，因為棉花、玉米和番茄植株在其果實或種子成熟時仍然有很多葉片處于活躍期，仍然在為植株生產所需的碳水化合物等；楊樹和法國梧桐的“飛絮”是它們為了繁衍后代所開的花或結的籽。為了實現控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發育進程，人們在習慣上往往多利用化學劑，例如，用乙烯利使番茄落葉；用化學殺雄劑去雄等。然而，問題是，這些化學劑往往沒有選擇性，在使目標組織或器官致死的同時，也對其它非目標組織或器官乃至整體都生產毒害或致死作用。例如，化學殺雄劑在殺死花藥花粉的同時，也對雌蕊和葉片產生毒害。
為了克服純化學劑的缺點，人們轉向生物技術，特別是基因工程技術。近十幾年來，利用基因工程來控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發育和死亡進程取得了長足的進展。Mariani等利用花藥絨氈層特異性啟動子TA29與細胞毒素酶基因(RNase T1或Barnase)連接構建成嵌合基因，通過農桿菌介導轉入煙草和油菜中，細胞毒素酶基因在轉基因植株的花藥中特異性地表達，將花藥的絨氈層細胞殺死，從而獲得了雄性不育的植株。Van der Meer等將“花藥盒”(anther box)和CaMV 35S啟動子串聯，然后與CHS(查爾酮合成酶)的反義基因融合構建成花粉特異性表達載體，轉化矮牽牛的結果表明CHS反義基因的花粉特異性表達在抑制CHS合成、導致類黃酮合成受阻的同時，阻斷了花粉的發育，造成了雄性不育。根據同樣的原理，花藥中特異表達反義LAT52和反義Bcpl基因，也得到了雄性不育。藥絨氈層特異性表達反義肌動蛋白基因(actin)在轉基因番茄和小麥等作物上也獲得了雄性不育株。這些成功范例實現了人類定向控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發育和死亡進程的夢想，但還沒有實現人們按照自己的意愿隨時定向控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發育和死亡進程的夢想。例如，在Mariani等的體系中，獲得的轉基因植株發育到花藥形成時就自己啟動細胞毒素基因(RNase T1或Barnase)的表達而殺死花藥細胞，人們無法干預。1996年，Kriete等的工作突破了這種限制，初步實現了人們按照自己的意愿隨時定向控制植物某一特定組織、器官乃至整個個體的生長發育和死亡進程的夢想。大腸桿菌argE基因的產物為N-乙酰-L-鳥氨酸脫乙酰酶，它可以把非毒性的物質N-乙酰-L-磷絲菌素(N-ac-pt)脫去乙酰基，轉化為毒素物質L-磷絲菌素，即PPT(除草劑Basta等的活性成分)。組成型啟動子(CaMV35S啟動子)與argE基因構成嵌合基因在轉基因煙草中表達并不影響其生物學及形態學性狀，但當葉面施用外源N-ac-pt時，轉基因煙草葉面出現壞死斑；在含有N-ac-pt的培養基上，轉基因煙草由于對N-ac-pt的吸收而出現葉面變白，以至整株枯死的現象。他們還將argE基因置于花藥特異性啟動子TA29的控制之下，轉化煙草，在花粉發育時期施用N-ac-pt，轉基因植株的花藥變空，表現為雄性不育，而不施用N-ac-pt時，轉基因植株的花藥正常可育。該體系的主要缺點是，用于誘導的非毒性物質N-乙酰-L-磷絲菌素(N-ac-pt)迄今為止仍然沒有商品化生產。
胞嘧啶脫氨酶基因(codA)編碼胞嘧啶脫氨酶(Cytosine Deaminase，CD)，最早從大腸桿菌(E.coli)中克隆出。在細菌和真菌體內發現有胞嘧啶脫氨酶，但在高等植物細胞和哺乳動物細胞內以及代謝活躍的植物樣品等沒有發現它的存在(Stougaard等，1993，Plant J，3755-761；Austin等，1993，Mol.Pharmacol.，43380-387)。在細菌體內，CD參與核酸的合成代謝。它把5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)脫氨為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，而5-FU被代謝為5-FUTP(5-氟三磷酸尿苷)和5-FdUTP(5-氟三磷酸脫氧尿苷)。5-FUTP能代替UTP整合到RNA從而抑制rRNA和mRNA的合成。5-FdUTP可抑制胸腺苷酸合成酶(TS)，從而抑制胸腺苷酸的合成，導致dNTP的衰竭從而引起了細胞的DNA合成障礙。也就是說5-FU可以從RNA和DNA分子水平來干擾細胞的存活，因而是細胞毒劑，而其前體藥物5-FC則是無毒無害。
codA基因在人體及動物的腫瘤治療方面的研究在國內外都有很多。在國內，王寶梅等以重組腺病毒ADCD為載體將大腸桿菌codA基因體外轉染小鼠紅白血病細胞(FBL3)，得到的轉基因細胞對5-FC的敏感性顯著提高，并對小鼠皮下腫瘤結節的生長有明顯的殺傷效果。宋艷斌等用含codA基因的高滴度逆轉錄病毒感染小鼠T淋巴細胞(T/PCD2)，表達結果表明，外用5-FC濃度大于1μmol/L時，對轉基因細胞有顯著的殺傷作用，而對未轉基因的正常T淋巴細胞基本無毒性，且轉基因細胞在加入5-FC后生存時間明顯短于未轉基因的細胞。陳綱等的結果顯示，亞葉酸鈣(CF)與5-FC合用，對轉codA基因的直腸癌細胞的殺傷作用顯著增強。對肺癌、乳腺癌、膠質瘤、淋巴瘤以及前列腺癌等的治療研究結果也表明，codA/5-FC的聯合作用均有一定的療效。
在植物上，codA基因主要用作轉基因植物研究的一種選擇標記基因。Helmi等將組成型codA基因轉入煙草，轉基因煙草耐受5-FC的能力明顯比未轉基因的對照低未轉codA基因的煙草葉盤在含5-FC 1000mg/L的分化培養基上都生長良好，而轉codA基因的煙草葉盤在250mg/L的分化培養基上只有20％可以分化再生。Babwah等發現，野生型蕓薹的子葉、胚軸、真葉和根在5-FC 1600mg/L上生長16天都沒有顯著的影響，而轉組成型codA基因的蕓薹植株則對培養基中的5-FC就非常敏感。Dai等發現野生型水稻的幼胚和種子在含5-FC分別為500mg/L和1.5g/L的培養基上正常生長或正常萌發，而在含有5-FU分別為25mg/L和50mg/L的培養基上則停止發育或停止萌發。他們將codA基因轉入水稻，轉基因植株的子代有3/4對5-FC敏感。Prasad等在榨菜上的結果表明，導入的codA基因在子一代可以穩定表達。codA基因作為選擇標記基因還被轉入擬南芥和日本山茶蓮等植物，其在轉基因植物中的表達效率可以通過T-DNA的非同源性重組來提高。
上述結果表明，植物，特別高等植物，盡管自身因為沒有codA基因或codA基因不表達而對外源5-FC不敏感，但是對外源5-FU卻非常敏感。這暗示，5-FU也可以從RNA和DNA分子水平來干擾植物細胞的存活。外源codA基因在植物體內不僅能正確表達，而且表達產物-胞嘧啶脫氨酶(CD)能將外源無毒的5-FC在體內轉化成有毒的5-FU，從而賦予轉基因細胞、組織、器官乃至個體對無毒的5-FC的敏感性。

發明內容
本發明的目的是提供一種可用于定時定向調控植物組織或器官凋亡的表達載體。
本發明所提供的調控植物組織或器官凋亡的表達載體，是含有胞嘧啶脫氨酶基因表達盒的植物表達載體，所述胞嘧啶脫氨酶(codA)基因表達盒包括植物組織特異性啟動子，胞嘧啶脫氨酶基因和終止子。
所述胞嘧啶脫氨酶基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID No.2；2)編碼胞嘧啶脫氨酶的核苷酸序列；所述胞嘧啶脫氨酶具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列或將序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中的SEQ ID No.2由1824個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1位-1824位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列的胞嘧啶脫氨酶。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
所述高嚴謹條件可為在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜。
所述組織特異性啟動子是能驅動基因(內源和外源)編碼區在植物的特定組織或器官表達而在其它組織和器官都不表達的啟動子。所述植物組織特異性啟動子可為花藥或花粉特異性啟動子、花絲特異性啟動子、花瓣特異性啟動子、子房特異性啟動子、花柱特異性啟動子、柱頭特異性啟動子、葉片特異性啟動子、種子或胚特異性啟動子或根特異性啟動子等。
所述花藥或花粉特異性啟動子包括TA29、A3、A8、AG、Amb aI、BA42、BA112、BA158、Bcp1、Bp4B、Bp4C、Bp19、BetVI、BetvIII、ca55、CDPK、ChiA、ChiB、ChsA、Def A、E1、E2、F2s、13#、17#、G10、KBG41、LAT52、LAT59、Lol P1、Lol Pib、Lec6、MS2、Osg6B、P2、SF1、SF2、SF3、SF5、SF6、SF9、SF16、SF18、SF19、TA13、TA20、TA32、TA56、T72、Tap2、TUA1或Zm13啟動子等；所述花絲特異性啟動子包括TSJT1等；所述花瓣特異性啟動子包括(cell-wall)P4等；所述子房特異性啟動子包括TRRP-F1，iaaH.DefH-9等；所述花柱特異性啟動子包括SA2-Rnase、Chi21、SIs、SLG-13和Sp4等；所述柱頭特異性啟動子包括ARC1和ARClBoler等；所述種子或胚特異性啟動子包括Napin B、Gtl、Lea(LEA)、REP-2、BCSP666、nad6、oleosin、AB13、Fus3、KCS和Vp1等；所述的葉片特異性啟動子包括psbA、Osppc和St-LS1等；所述根特異性啟動子包括HRGP、PRP1、PRP2、Lec、WGA和RB7等。
所述花藥特異性啟動子優選為TA29。
所述終止子包括Nos終止子，Ocs終止子(章魚堿合成酶基因的終止子)和花椰菜花葉病毒(CaMV)35s終止子。
用于構建所述調控植物組織或器官凋亡的表達載體的出發載體可為Ti類質粒載體和病毒載體，優選為Ti類質粒載體。
所述Ti類質粒載體優選為目前通用或商品雙元載體，如pCAMBIA3301，pBI101，pBI121，pBIN19等。
為了便于對轉基因植物或轉基因植物細胞進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入可選擇性標記(GUS基因、GFP和熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記基因(如抗卡那霉素基因NPT II、NPT I和NPT III，抗潮霉素基因hpt等)或除草劑抗性基因(如，bar、PAT、bxn、aroA、EPSPS等)。
所述調控植物組織或器官凋亡的表達載體優為p3dAJM。
本發明的第二個目的提供一種定時定向調控植物組織或器官凋亡的方法。
本發明所提供的調控植物組織或器官凋亡的方法，是將上述調控植物組織或器官凋亡的表達載體導入植物細胞、組織或器官中，篩選得到可表達胞嘧啶脫氨酶基因的轉基因植株，利用5-氟胞嘧啶誘導轉基因植株的目標組織或器官凋亡。
所述5-氟胞嘧啶的使用時期為目標凋亡組織或器官發育期前7-14天；優選的使用時期為目標凋亡組織或器官發育期前7天。
所述目標凋亡組織或器官為花藥時，所述5-氟胞嘧啶的使用時期為花藥絨氈層形成前7-14天。
所述被調控的植物可為自花授粉或常自花授粉的單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物包括小麥、水稻、高梁、谷子和玉米；所述雙子葉植物包括煙草、油菜、大白菜、小白菜、甘藍、番茄、黃瓜、甜瓜、西瓜、辣椒和棉花。
所述5-氟胞嘧啶的適宜使用濃度為對非目標調亡組織或器官不產生毒害的最高濃度，可為100-350mM。對于雙子葉植物(煙草)，5-氟胞嘧啶的使用濃度為100-200mM時效果較好，對于單子葉植物，5-氟胞嘧啶的使用濃度為為250-350mM時效果較好。
本發明的調控植物組織或器官凋亡的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導或基因槍等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。
本發明通過調控植物組織或器官凋亡的表達載體實現胞嘧啶脫氨酶基因的定向表達，通過5-氟胞嘧啶實現定時誘導組織或器官凋亡。
本發明的調控植物組織或器官凋亡的方法，使人們能夠根據自己的意愿隨時、定向、徹底地除去不需要的植物或作物的某一器官或組織而保留所需要的部分，并且對所保留的所需要的部分不產生負作用。如，在番茄和棉花上，可以將葉片特異性啟動子控制的codA基因導入，在轉基因番茄或棉花成熟時，通過施用上述的無毒誘導劑(5-FC)來殺死葉片，而保留番茄或棉花果及其植株，從而方便采收，特別是機械采收。而經典的去葉片的方法則多利用具有植物毒性的全身性的化學物質。例如，在番茄上，施用乙烯利能除去葉片，但也同時促進和刺激了果實的后熟，縮短了果實的儲藏壽命和貨架壽命。本發明的具體實施例中建立了一種新的化學調節性雄性不育/保持兼用系植物的培育方法及由此產生的雜交種子生產的“兩系”法。兩系法則可省去繁殖保持系及保持系與不育系雜交的操作程序，打破恢保關系的限制，可以大大地提高配組自由度，是一種前景廣闊雜交育種方法。當人們需要植物或作物為雄性不育時，可以施用無毒的5-FC，定向“殺死”花藥花粉；當人們需要植物或作物為雄性可育時，或人們不需要雄性不育時，不施用5-FC就可以了。而在經典的雜交種子生產時，通常必須要三系(雄性不育系、保持系和恢復系)配套，這無形中增加了育種工作的時間和資金，并且三系法可利用的親本有限，配組不自由。現有的兩系法存在雄性育性穩定性問題，到目前為止，兩系法中的不育系與保持系兼得性多數依靠“光敏”或“溫敏”來調節，這就導致其不育系的育性對環境敏感，容易受外界環境因素的影響以及不育系的起點溫度漂移，容易造成自花授粉結實從而降低雜交種子的純度。按照本發明方法及本發明實施例中已經建立的“兩系法”則是通過人工施用或不施用化學劑來調節，不受環境因素的影響，因此，不存在育性穩定性的問題。


圖1為質粒pdAJM的部分結構示意2為含有codA基因表達盒的載體pUATA的構建與結構示意3為含有codA基因表達盒的5-FC誘導性花藥特異性凋亡植物表達載體p3dAJM的構建與結構示意4為轉p3dAJM煙草植株的PCR檢測圖5為轉codA基因煙草的Southern雜交圖譜圖6為150mM 5-FC調控轉p3dAJM煙草植株和對照植株一次的花粉萌發率比較圖7為150mM 5-FC調控轉p3dAJM煙草植株二次的花粉萌發結果比較圖8為150mM 5-FC調控轉p3dAJM植株E-2株系三個單株一次，二次，三次的花粉萌發比較圖9為轉p3dAJM小麥分化苗的PCR檢測圖10為5-FC調控的轉p3dAJM小麥花藥大小的變化圖11為5-FC調控的轉p3dAJM小麥和未轉基因小麥花粉的I2-KI染色圖12為5-FC調控的轉p3dAJM小麥和未轉基因小麥的小穗比較圖13為5-FC調控的轉p3dAJM小麥和未轉基因小麥與未經5-FC調控的轉p3dAJM小麥和未轉基因小麥的幼穗比較圖14為5-FC調控的轉p3dAJM小麥和未轉基因小麥的成熟穗的比較圖15為轉p3dAJM小麥T1代幼胚在含PPT3.0(mg/L)的培養基上的分化具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
T0表示由愈傷組織得到的轉基因植株及其無性系，T1表示T0代自交產生的種子及由它所長成的植株和無性系。
實施例1、含有codA基因表達盒的5-FC誘導性花藥特異性凋亡植物表達載體p3dAJM的構建根據GenBank登記號為S56903.1的codA基因序列，設計5’端引物dA1，未端加Bam HI識別位點；設計3’端引物dA2，未端加Sac I識別位點。引物序列如下dA15’-GGA TCC ATG TCG AAT AAC GCT TTA CAA ACA A-3’(31nt)dA25’-GAG CTC TCA ACG TTT GTA ATC GAT GGT TTC TGG C-3’(34nt)。
以大腸桿菌株系JM101基因組DNA為模板，經PCR擴增得到了預期的約1.3Kb的目標片段。回收此片段，并將其連接到pUCm-T(上海生工公司)載體上，構建成pdAJM(圖1，EiEcoRI，SaSacI，KpKpnI；NdNde I；ClClaI；EvEcoRV；NcNcoI；NtNotI；PsPstI；BgBgII I；BhBamHI；XhXhoI；XbXbaI；S1Sal I；PaPaeI；HdHindIII)。用Bam HI和Sac I對pdAJM進行酶切，結果切出了約1.3Kb的目標帶和3.0Kb的載體帶。說明1.3Kb的目標片段正確地連接到pUCm-T載體上，即pdAJM構建正確。測序結果表明擴增出的片段全長1284bp(SEQ ID No.2)，編碼427個氨基酸，氨基酸序列詳見SEQ ID No.1。克隆片段的核苷酸序列和由此推導的氨基酸序列與GenBank登記號為S56903.1和AE000140.0的序列除了第一個氨基酸編碼(翻譯起始編碼)為植物識別的ATG外均有100％的同源性。該片段的核苷酸序列已經在GenBank注冊，登記號為AY331712。
從pdAJM質粒中用Sac I和Bam HI雙酶切取下大約1.28kb的小片段，連接到經Sac I和Bam HI消化的克隆載體pG729上得到pGTA。其中，pG729是在pGEM-7(購自Promega公司)中插入TA29啟動子得到的，具體方法如下根據Mariani等(1990，Nature，347737-741)的方法從煙草品種NC89中克隆TA29啟動子，在其5’和3’端分別加入Kpn I和Bam HI酶切位點，將克隆的TA29插入經過Kpn I和Bam HI雙酶切的pGEM-7，形成pG729。pGTA質粒用Sac I和Kpn I雙酶切，取下大約1.58kb(TA29+codA)的小片段，插入到用Sac I和KpnI消化的pUAN質粒(pUAN含增強子APS和終止子nos，按照楊曉東，2001，北京，中國農業大學碩士論文“花藥特異性啟動子的克隆和人工雄性不育基因表達載體的改良”第53頁的方法構建)，得到pUATA(圖2)。pUATA用Sac I和Bam HI和KpnI三酶切鑒定，結果切出1.28kb(codA基因)、450bp(APS基因)以及大約300bp(TA29啟動子)三條目標帶和一條2.95kb的載體帶。酶切鑒定結果表明，含有codA基因表達盒的pUATA構建正確。
pUATA質粒用Xba I和Eco RI消化，取出2294bp的小片段，連接到經過Xba I和Eco RI雙酶切的通用雙元植物表達載體pCAMBIA3301(澳大利亞CAMBIA)上，得到codA基因化學誘導性組織特異凋亡基因表達盒的植物表達載體p3dAJM(圖3)。分別用Sac I和Bam HI雙酶切和Sac I和Bam HI和Kpn I三酶切p3dAJM，Sac I和Bam HI酶切得到1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目標帶和12kb的載體帶；Sac I和Bam HI和Kpn I三酶切得到1.28kb(codA)、450bp(APS)、大約300bp(TA29啟動子)三條目標帶和一條12kb的載體帶。該酶切鑒定結果表明，含有codA基因表達盒的5-FC誘導性花藥特異性凋亡植物表達載體p3dAJM構建正確。
實施例2、利用含有codA基因表達盒的5-FC誘導性花藥特異性凋亡植物表達載體p3dAJM調控煙草的雄性育性1、農桿菌的轉化與鑒定用所構建的p3dAJM轉化農桿菌株系EHA105。農桿菌感受態細胞的制備(CaCl2法)與轉化(凍熔法)按照《分子克隆》(Sambrook等，2001)進行。轉化的農桿菌的鑒定方法如下挑取在含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB固體培養基上長出的單菌落，經含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB液體培養基振蕩培養12小時，小量堿液法(Sambrook等，2001)提取質粒DNA；質粒用Sac I和Bam HI雙酶切，切出1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目標帶和12kb的載體帶。酶切結果說明，質粒載體p3dAJM已經轉化到農桿菌株系EHA105中。
挑取攜帶植物表達載體p3dAJM的農桿菌EHA105單菌落，接種于5ml含Rif 20mg/L YEB液體培養基中，28℃振蕩培養10小時，按1∶50的體積比稀釋到含Rif 20mg/L的新鮮YEB液體培養基中，繼續培養至OD600值0.6-0.8。5000rpm離心5min，收集菌體，用1/2MSO液體培養基(1/2MS礦質營養成分)洗滌菌體一次，并將其稀釋到離心前菌液5倍體積的1/2MSO液體培養基中，準備侵染用。
選取30天苗齡的煙草品種“NC89”無菌苗，在無菌條件下，切下成熟葉片，用直徑6mm的打孔器取葉圓盤；將取下的葉盤投入上述準備好的菌液中，15分鐘后，取出葉盤，置于再生培養基(MS+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+肌醇0.1g/L+蔗糖3％+瓊脂粉7g/L，pH5.8)上于25℃暗培養2天。然后接種到含有羧芐青霉素(Carb)500mg/L和膦化麥黃酮(PPT)1.25mg/L的再生培養基上。侵染葉盤不斷膨大，10天后長出綠色愈傷，繼代后，抗性愈傷很快分化出小芽，而對照葉盤(未被侵染葉盤)則保持原有大小并黃化死亡。當抗性芽長到1-1.5cm時，將其切下，轉到含有PPT 5.0mg/L和Carb 200mg/L的生根培養基(MS+IAA 0.5mg/L+肌醇0.1g/L+蔗糖3％+瓊脂粉7g/L，pH5.8)上10天左右開始生根，2-3周后得到正常生根的抗性植株。
2、轉基因煙草的組織化學和分子檢測分析(1).PPT抗性苗的GUS染色結果將已經生根的煙草PPT抗性植株的整株和部分葉片按照Jefferson等(1987，EMBO J，63901-3907)的方法進行GUS染色，脫色后轉基因植株根、莖、葉都呈現不同程度的藍色，而未轉基因的對照株則完全白化無藍色。表明報告基因GUS已經整合到煙草基因組中并得到正確表達。
(2).GUS陽性苗的PCR擴增對GUS染色的陽性苗進一步進行分子檢測。用目標基因codA兩端的特異性引物dA1和dA2(dA15’-GGA TCC ATG TCG AAT AAC GCT TTA CAA ACA A-3’；dA25’-GAG CTC TCA ACG TTT GTA ATC GAT GGT TTC TGG C-3’)進行PCR擴增，結果如圖4所示，GUS陽性株均擴增得到大小為1.28kb的目標帶，而未轉化的對照煙草在相應位置則沒有擴增出此目標片段。這一結果初步表明目標基因codA已整合到煙草基因組中。圖4中，MλDNA(Hin dIII和Eco RI)雙酶切marker；泳道1質粒對照p3dAJM，目的片段為1.28kb(箭頭所指)，泳道2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16GUS陽性植株，擴出1.28kb的帶，泳道11未轉基因植株對照。
(3).GUS和PCR陽性苗的Southern雜交檢測通過Southern分析來檢驗基因組的整合情況。
用Sac I和Bam HI于37℃過夜消化轉基因煙草和未轉基因煙草的基因組DNA(10μg)。通過電泳法0.7v/cm在0.8％瓊脂糖凝膠上分離酶切后的DNA 16-20小時，DNA用向上毛細管轉移法轉移到一帶正電荷的尼龍膜上(BoehringerMannheim，Germany)。用內切酶Bam HI和Sac I從p3dAJM上切下約1.28kb的codA片段，以此作為模板，利用地高辛DNA標記試劑盒(Roche)所帶的DIG-標記dNTP和酶，對上述模板DNA進行標記。以標記好的單鏈DNA作為探針，按照地高辛DNA標記試劑盒所敘述的方法，將制備好的探針與上述尼龍膜雜交，并用堿性磷酸酶標記地高辛抗體(Anti-Digoxigenin-AP，alkaline phosphotase)(購自Roche公司)進行檢測。結果如圖5所示，陽性對照質粒出現一條很明顯的1.28kb的雜交帶，但同時還有其他的弱帶；轉基因煙草植株呈現陽性，出現一條1.28kb的雜交帶，而未轉基因的對照植株NC89則無雜交帶出現。用Eco RI單酶切轉基因植株基因組DNA，也出現雜交帶(見圖5)。此結果表明，嵌合codA基因確實已經整合到煙草的基因組中。圖5中，泳道1，質粒對照(經Sac I和Bam HI酶切的p3dAJM)；泳道2，3，4，6，7為轉基因煙草；泳道5，8為未轉基因煙草對照。
3、codA基因表達盒在轉基因煙草中的功能分析(1).轉基因植株的移栽將GUS染色、PCR和Southern雜交均呈陽性的轉codA基因的煙草植株在三角瓶中開口煉苗一周，移入花盆，在溫室中培養，第一周套袋保濕，之后去袋并進行常規管理。
(2).化學誘導劑5-FC對煙草植株不致死最高濃度的選擇選取長勢大小基本相同的煙草5株，其中3株為NC89未轉基因苗(NC89-1、NC89-2和NC89-3)，2株為轉基因的抗性苗(L-1-1，L-5-1)，選取接近中部的完整的完全伸展開的3片葉子，取對稱葉片的一半涂抹不同濃度(0.0-500mM)的5-FC，每50mM為一個濃度梯度，另一半作為對照。涂抹后每天進行觀察，連續觀察8天。從中選出不殺死煙草葉片的最高5-FC濃度，此后采用該濃度進行整株噴施，檢測其對整株的作用效果。
用50-500mM的5-FC涂抹野生型煙草NC89和轉基因煙草的葉片，處理后1-8天觀察葉片的反應，結果如表1和圖6所示。
表1.5-FC涂抹煙草NC89以及轉基因植株的葉片反應情況統計

說明數字---可引起葉片局部傷害的最低濃度；*--表示微黃，**--有小死斑，***--有較大的死斑，****--有大的壞死斑。空者--沒有反應，葉片的位置是從下向上數，括號內的數目是指涂抹時葉片的數目(設有清水對照)。
表1表明，一般在大于150mM濃度的5-FC才可以完全殺死涂抹部位，并使周圍組織黃化。當然不同生長狀態的植株和涂抹不同部位的葉片對5-FC的敏感程度是不完全相同的，有的植株耐受5-FC的程度更高一些，達到300mM，而有的植株在150mM處就使組織有少許損傷。
綜合涂抹的所有植株的情況，選用150mM進行轉基因煙草的育性調控。經過全株噴施150mM的5-FC處理，煙草植株均正常生長。說明這一濃度的5-FC本身不會對煙草產生毒害作用，噴施不會使煙草黃化或死亡。
(3)轉基因植株的雄性育性調控根據codA基因表達盒的設計原理，轉基因植株需經過適當濃度的5-FC誘導處理，5-FC進入植物體內，在花藥中在胞嘧啶脫氨酶的作用下，轉化為毒性產物5-FU，引起DNA合成障礙，導致花粉敗育。試驗中除了對轉基因植株(L-1-1，L-5-1，E-2-1，E-2-2，E-3-2，E-2-3，E-6-2和L-5-2)的5-FC處理之外，還設計了轉基因植株不處理(nCK，n為株系號)、非轉基因植株不處理(CK0)和非轉基因植株5-FC處理(CK1)三個對照。5-FC處理植株從開花前7天開始每隔5天噴施一次5-FC(150mM)，選擇同一株系號的不同植株分別噴施1-3次，這期間對花粉活力進行連續檢測。
花粉活力檢測方法取含苞待放的花朵(花藥未開散)，挑取其中的花粉，置于花粉萌發培養基(蔗糖10％，硼酸100mg/L，瓊脂0.5％，pH5.6)上，室溫暗處培養4-5小時顯微鏡下觀察，記錄正常萌發和不萌發或萌發后畸形的花粉數目。
經過150mM的5-FC處理，轉基因植株和對照植株在花藥形態和花粉活力等各方面有著顯著的差異。
1).用150mM的5-FC噴施一次轉基因植株和各種對照植株，花粉萌發率如表2和圖6所示。
表2.一次噴施150mM的5-FC對轉codA基因煙草株系花粉活力的影響
注*時間是指從噴藥后算起，開花期取花粉檢測的時間(天)；CK0未轉基因煙草，不用5-FC處理；CK1未轉基因煙草，用5-FC處理；nCK轉基因煙草，不用5-FC處理。
表2和圖6表明，未轉基因植株不管用(CK1)或不用(CK0)150mM的5-FC處理，自處理后的第5天至第30天取樣，其花粉的萌發率都在80％以上。轉基因植株不用5-FC處理(nCK)時，其相應的花粉萌發率也都在80％以上。當轉基因植株用150mM的5-FC處理后，株系L-5-1自第13天后，花粉萌發率顯著下降，一直到第24天。其中的第14天至第19天下降最明顯，花粉萌發率為40％以下，即下降了一半；株系L-1-1自處理后，第10天花粉的萌發率顯著下降，一直持續到第21天。其中，處理后的第11天至第17天花粉的萌發率在40％以下，第14-16天的萌發率還不到30％；株系E-2-1自處理后第9-19天，花粉萌發率下降顯著，特別是從第11天至第17天，花粉萌發率在30％以下，其中有2天(第14-15天)在20％以下，不到同時期對照株系的1/4。
從表2還可以看出，用150mM的5-FC處理的效果在處理后的第9-10天才明顯可見，其作用可以持續13天左右，但以處理的第14-17天最為明顯(圖6)。
2).150mM的5-FC隔5天二次噴施，轉基因植株及其各種對照株系花粉的萌發率如表3和圖7所示。
表3.二次噴施150mM的5-FC對轉codA基因煙草花粉活力的影響

注*時間是指從第一次噴藥算起，取花粉檢測的時間(天)，兩次施藥的時間相隔5天。
表3和圖7表明，二次處理，觀察的4個轉基因株系的花粉萌發率自第一次處理后的第10天至第27天，花粉的萌發率都在40％以下(株系E-3-2的至第24天)，而此時的各對照花粉萌發率均在80％以上。株系E-2-2自處理后的第12-14天的萌發率僅為12.4-17.8％，第17-20天在30％以下，以后在40％以下，直到第34天仍在56％以下。
比較一次噴施與二次噴施5-FC的花粉萌發率，可以看出，二次比一次顯著的降低了轉基因植株株系的花粉萌發率，而且這種降低持續的天數延長近10天(圖7)。
3).對于同一轉基因株系(E-2)的三個單株，噴施一、二和三次150mM的5-FC之后的花粉萌發率進行了比較分析，結果如表4和圖8。
表4不同次數噴施150mM的5-FC，對轉codA基因株系E-2各單株花粉萌發率的影響


*時間(天)是從最初噴藥的時間開始算起，同一株系的三棵苗子的花粉萌發率的縱向比較。
表4和圖8表明，自第一次噴施后的第9-10天開始，花粉的萌發率開始顯著下降。噴一次(E-2-1)顯著下降的作用時間持續大約7-8天，而以第一次噴后的第11-16天的效果最為顯著，花粉發芽率在17-30％之間。噴二次時(E-2-2)，花粉的萌發率自第一次噴后的第10天至第28天，一直在40％以下，而噴一次時的第19天，花粉萌發率已經上升到50％以上。噴二次時，花粉萌發率最低時段出現在第一次噴后的第11-14天，都在20％以下。這一作用持續4天，然后逐漸減弱，故花粉萌發率有所上升，在22-35％左右，至到第28天。噴施三次(E-2-3)，其效果與噴施二次沒有顯著的差異，只不過維持低水平的花粉萌發率的時間更長一些(至第31天)。
從表4還可以看出，單株E-2-1和E-2-3噴后第7-9天花粉萌發率就有46.5-85.1％之間，此后才開始顯著下降(圖8)，可能由于起始噴施時間偏晚。
4、轉基因T1代的雄性育性調控(1)轉基因T1代的獲得收集飽滿的野生型NC89植株的種子，放入1.5ml離心管(Eppendorf管)中，用70％酒精消毒20秒，0.1％HgCl2消毒3分鐘，無菌水洗滌5次，放入含不同濃度PPT的種子萌發培養基(1/2MS)中，暗處培養7天，后置于光下培養30天，統計NC89種子的萌發情況，并找出致使NC89種子萌發后黃化死亡的最低PPT濃度(3.0mg/L，表5)，作為轉基因T0代植株種子(T1)的發芽選擇濃度。
收集飽滿的轉基因T0代植株的種子，做同樣的消毒處理，轉入含有上述選擇濃度PPT的種子萌發培養基上，暗處培養7天，置于光下培養30天，統計T1代的萌發情況(表5)。
表5.轉codA基因的煙草T1與對照植株的種子在不同濃度的PPT培養基上的成苗率 說明成苗率是指萌發后的綠苗數與接種的總數目(綠苗+黃化苗+未萌發種子)的比值。
表5表明，在PPT 3.0mg/L或以上時，未轉基因對照(NC89-1，NC89-2)的種子完全不能成苗(成苗率為0％)，而轉基因(L-1，E-2，E-8)T1的成苗率在60-65％。
(2)T1代苗的GUS染色將在選擇濃度PPT(3.0mg/L)的培養基中得到的T1代苗洗凈根部培養基，將整株和部分葉片按照上述方法進行GUS染色，脫色后轉基因植株根、莖、葉都呈現不同程度的藍色，而未轉基因的對照株則完全白化無藍色。
(3)轉基因T1代植株的功能分析待T1代苗長到5cm左右高時，移入花盆，在溫室中培養，第一周套袋保濕，之后去袋并進行常規管理。在T1代植株開花前10天噴施150mM 5-FC，然后每5天噴一次，共噴3次，開花時檢測花粉活力。在檢測的3個株系共7個單株中，花粉發芽率在25-30％的只有1個單株，其余的都在20％以下，其中株系T1E-8的2個單株的花粉發芽率都在10％以下，達到育種學上的完全雄性不育。而未調控的轉基因植株、調控和未調控的未轉基因對照植株的花粉發芽率都在85％以上。
實施例3、利用植物表達載體p3dAJM調控小麥的雄性育性選取普通小麥(Triticum aestivum L.)半冬性栽培品種—“揚麥158”。取開花后12-16天的幼嫩種子，用0.1％的HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5次，每次5分鐘，然后于超凈工作臺上剝取幼胚待用。
培養基與培養條件(單位為mg/L；除特別說明外，含3％蔗糖和7g/L瓊脂)愈傷組織誘導培養基MS+2.4-D2.0+KT0.5pH5.8高滲培養基MS+2.4-D2.0+KT0.5+甘露醇0.4M pH5.8恢復培養基MS+2.4-D2.0+KT0.5+carb150-500pH5.8誘導愈傷組織篩選培養基MS+2.4-D2.0+KT0.5+carb150-500+PPT5.0pH5.8分化篩選培養基MS+VB10.5+CuSO40.5+KT0.5+carb150-500+PPT1.5-3.0pH5.8生根篩選培養基1/2MS+NAA1.0+PPT3.0-5.0+2％蔗糖+7g/L瓊脂pH5.8培養條件溫度25±1℃，光暗周期16(光照)/8hr(黑暗)—、p3dAJM轉化小麥的愈傷組織可用農桿菌法或基因槍法轉化小麥愈傷組織。
1.農桿菌法侵染小麥愈傷組織用所構建的p3dAJM轉化農桿菌株系LBA4404。農桿菌感受態細胞的制備(CaCl2法)與轉化(凍熔法)按照《分子克隆》(Sambrook等，2001)進行。轉化的農桿菌的鑒定方法如下挑取在含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB固體培養基上長出的單菌落，經含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB液體培養基振蕩培養12小時，小量堿液法(Sambrook等，2001)提取質粒DNA；質粒用Sac I和Bam HI雙酶切，切出1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目標帶和12kb的載體帶。酶切結果說明，質粒載體p3dAJM已經轉化到農桿菌株系LBA4404中。
(1).愈傷組織的誘導與前處理選取開花12-15天的小穗，剝取種子，在超凈工作臺上70％的乙醇消毒30秒，無菌水洗一次，再用0.1％HgCl2消毒10分鐘，無菌水沖洗4-5遍，每次5分鐘。仔細剝取幼胚，將幼胚置于愈傷組織誘導培養基上，25±2℃暗處培養。10-20天后產生的淡黃色、鮮嫩的愈傷組織。在轉化前4-6小時轉移至含0.4M的甘露醇的高滲培養基上，用于農桿菌的轉化。
(2).農桿菌的培養及活化從YEB培養基中挑取少量帶有目標基因的植物表達載體的農桿菌LBA4404接種于5ml含Str(鏈霉素)100mg/l和Kan(卡那霉素)50mg/L的YEB液體培養基中，28℃振蕩培養10小時，按1∶50的體積比稀釋到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的新鮮YEB液體培養基中，繼續培養至OD600值大約為0.6-0.8，待侵染。
(3).侵染幼胚愈傷組織挑取淡黃色、幼嫩的小麥幼胚愈傷組織置于活化好的農桿菌菌液中。侵染1-2小時后取出愈傷組織用無菌、干燥的濾紙和吸水紙吸干，然后將愈傷組織轉入共培養培養基(MS基本培養基)上，2-3天轉入恢復培養基，繼續暗培養7-10天左右，轉入誘導愈傷組織篩選培養基上，培養2-4周，轉入分化篩選培養基，光下分化培養。20天后將再生出的綠苗移至生根培養基上，生根培養的同時進行春化處理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養)，15天后移至新鮮生根培養基中，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養。
2.基因槍法轉化小麥愈傷(1).質粒的提取和純化將p3dAJM通過CaCl2法轉化大腸桿菌DH5α。將含有p3dAJM的大腸桿菌DH5α加入100mg LB液體培養基(含Amp 50mg/L)中，于37℃，振蕩培養(200rpm)至OD值為0.5-0.6時，按照QIAGEN-tip100試劑盒的說明提取質粒。
(2).微彈制備基本按說明書進行。稱取50mg直徑為1μm的金粉顆粒放入滅菌的離心管中，加入1ml無水乙醇振蕩懸浮，放置過夜。5000rpm離心3分鐘，去上清，收集金粉，無菌水沖洗3-4次至乙醇完全除去，最后加入1ml無菌水制成濃度為50mg/ml的金粉懸液。用前吸取50μl金粉懸液移至Eppendorf管中，加入5μg質粒DNA，充分震蕩；然后分別加入2.5M CaCl250μl和0.1M亞精胺20μl，并充分混勻；靜置2分鐘后用140μl的70％乙醇洗滌；12000rpm離心2分鐘，棄上清，加140μl 100％乙醇洗滌；12000rpm離心2分鐘，棄上清，加入90μl 100％乙醇，4℃保存備用。
(3).愈傷組織的前處理愈傷組織在轉化前4-6小時轉移至含0.4M的甘露醇的高滲培養基上，集中在直徑5cm的培養基的中央(直徑2cm的范圍內)，用于基因槍的轉化。
(4).基因槍轟擊轟擊使用PDS-1000/He型基因槍。打開電源，將消毒過的可裂圓片裝入固定蓋，旋緊。取微彈懸浮液10μ|均勻涂抹在消過毒的微彈載體中心區域，自然風干，然后于阻擋網一并裝入發射裝置中。將待轉化的材料放在樣品板上(轉化材料與微彈之間的距離為7cm)，關上轟擊室，按VAC鍵抽真空，當真空度為27-28Pa時，將VAC鍵轉到HOLD位置，按FIRE鍵使氮氣壓力達到可裂膜的壓力(1000-1100psi)時進行轟擊。
(5).植株再生與篩選將轟擊12小時后的幼胚愈傷組織移至不加滲透壓調節劑和選擇壓的愈傷組織誘導培養基上，繼續暗培養兩周后移至分化篩選培養基，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養；20天后將再生出的綠苗移至生根培養基，生根培養的同時進行春化處理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養)，春化處理15天后移至新鮮生根培養基中，25±2℃，16hr(光照)/8hr(黑暗)培養。
3、農桿菌法轉化愈傷和分化苗的GUS染色農桿菌侵染小麥幼胚愈傷組織7天后，對愈傷組織進行GUS染色，有25％的愈傷組織能染成藍色，而未侵染的對照愈傷則不能被染色(表6)。
表6.農桿菌法轉化小麥愈傷的GUS染色

愈傷組織在經過恢復、誘導、篩選培養后，最終轉入分化篩選培養基上分化出苗，取出部分抗性苗進行GUS染色，結果染出深淺不等藍色，而對照無藍色。抗性苗在生根培養基上正常生根，而對照揚麥158則在生根培養基上不生根，黃化死亡。生根后的小麥移苗到溫室，轉基因植株在株高，株葉，形態方面與對照植株沒有差異。
從侵染的650塊愈傷組織中，有8塊愈傷組織的再生苗能被GUS染色，由此計算，轉化頻率為1.23％。
4、基因槍法轉化愈傷組織的GUS染色用基因槍轟擊350塊愈傷組織，其中6塊愈傷組織的再生苗能被GUS染色，轉化頻率約為1.71％二、轉基因小麥的PCR檢測用目標基因codA兩端的特異性引物dA1和dA2進行PCR擴增，結果GUS陽性株可以擴增得到大小為1.28kb的目標帶，而未轉化的對照小麥在相應位置則沒有擴增出此目標片段(圖9)。圖9中，泳道1λDNA經Hind III和EcoRI雙酶切分子量標記(虛線箭頭所指1.375Kb)；泳道2載體p3dAJM對照，目的片段為1.28Kb(實線箭頭所指)；泳道3-6轉codA基因小麥PPT抗性植株，其中，泳道4，6為GUS陽性植株；泳道7未轉基因小麥對照。
三、誘導劑5-FC對揚麥158葉片最高非致死致傷濃度的篩選用葉片涂抹法對轉基因植株(dA-10，L158-20，L158-11)和未轉基因植株(揚麥158-1，揚麥158-2，揚麥158-3，揚麥158-4)進行5-FC的耐受性試驗，5-FC的濃度為150-500mM，從處理后的第一天進行觀察，葉片有反應的5-FC的濃度如表7。
表7野生型小麥與轉基因小麥葉片對5-FC濃度的耐受性(單位mM) 注方格內數字是表示在這一時間可以使葉片凋亡的最低5-FC濃度，空格為沒有明顯反應。*--表示黃化，**--表示有壞死斑。
從表7中可以看出，5-FC涂抹小麥葉片7天以后，涂抹點葉片的變化基本沒有明顯的改變。5-FC在300mM以上，造成了葉片明顯的傷害。因此以下實驗選用300mM的5-FC來噴施全株作育性調節。
四、轉基因小麥雄性育性的化學調控1.轉化株的花器官的解剖結構觀察在植株長到4-6節高時用300mM的5-FC噴施全株一次，小麥營養生長正常。在小麥抽穗的過程中，小心撥開內外麩，觀察雄蕊的發育情況，結果發現，有L-13，L-11，L-19，L-20，dA-4，dA-10，dA-20這7個GUS陽性株系出現雄蕊發育不良現象(圖10)，花藥小而淡黃。圖10中，左側花藥為未轉基因植株未調控(對照)的花藥；右側花藥為轉基因植株調控的花藥。
2.轉化株花粉的碘-碘化鉀染色轉p3dAJM小麥植株經過化學誘導后花粉的碘-碘化鉀(I2-KI)染色結果如表8。表8表明，轉基因株6個株號(dA-10-3，dA-10-4，dA-20-1，dA-8-1，L-158-19，L-158-3)降低了約20％，dA-10-2的花粉染色率比對照少將近30％(圖11)，這些株號均為GUS陽性株。圖11中，左側圖片為未轉基因經5-FC調控的對照株的花粉；右側圖片為轉基因株調控株的花粉。
雄蕊發育不良或花粉I2-KI染色藍色率低的麥穗一般伴隨有花藥短小皺縮，花絲縮短，花藥內花粉含量較少等形態學改變，如果不進行人工授粉，(株號L-13，L-20)，在后期的生長發育的過程中則出現內、外稃張開，穎殼開放，最后則不產生或產生很少幾粒種子(圖12，13，14)。圖12表明，5-FC調控的轉p3dAJM小麥的小穗(A)與5-FC調控的未轉基因小麥的小穗相比，內、外稃張開，穎殼開放。圖13表明，5-FC調控的轉p3dAJM小麥的幼穗(A)的小穗張開，內、外稃張開，穎殼開放，顯示出典型的雄性不育的特征，而5-FC調控的未轉基因小麥的幼穗(B)、未經5-FC調控的轉p3dAJM小麥的幼穗(C)和未經5-FC調控的未轉基因小麥的幼穗(D)則，小穗抱軸，內、外稃密閉，穎殼不開。圖14表明，5-FC調控的轉p3dAJM小麥的成熟穗(A)瘦癟，沒有種子，而未轉基因小麥的成熟穗(B)則肥碩，有36粒以上的飽滿種子。
表8.轉p3dAJM小麥花粉的碘-碘化鉀染色

注*CK(1-3)是野生型的揚麥158的種子苗。#GUS陽性。
3、T1代幼胚在分化篩選培養基上的分化為了加快轉基因小麥的繁殖循環，可以用幼胚培養加抗性篩選。篩選壓以野生型揚麥158的幼胚愈傷在0-5mg/L PPT上的芽分化情況來確定(表9)。
表9野生型揚麥158的幼胚愈傷在含不同濃度的PPT分化篩選培養基上的分化(分化30天)

表9表明殺死揚麥158幼胚的最低有效濃度是PPT 3.0mg/L。根據這一結果，以下試驗用PPT 3.0mg/L篩選轉基因T1代幼胚苗。
取所有轉p3dAJM株號的T1代幼胚愈傷，置于含PPT 3.0mg/L的分化篩選培養基上，分化30天后，芽分化率如表10，其分化狀態照片如圖15。
表10轉p3dAJM小麥T1代幼胚愈傷組織在PPT 3.0mg/L的分化篩選培養基上分化(分化30天)


表10表明轉基因(轉p3dAJM)植株小麥幼胚在含PPT 3.0mg/L的分化篩選培養基上的分化率都在30％以上，遠比未轉基因的(表9)分化率高。轉基因植株小麥幼胚分化率最高的是L-19，為73.33％，是對照(野生型)揚麥158幼胚分化的14.7倍。分化率最低的是L-13，為31.25％，是對照愈傷組織的6.25倍。
表10也顯示，不同的轉基因植株，其幼胚愈傷對PPT 3.0mg/L的抗性有較大的差別，這可能與導入的PPT抗性基因(bar)的拷貝數、插入位置及其分離有關。
PPT抗性苗在進行生根培養的同時進行春化處理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養)，春化處理15天后移至新鮮生根培養基中，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培養。當苗高大約5-6cm時，移栽到溫室。
當苗長出新葉后，取其新葉，進行GUS染色，陽性苗再進行PCR確認。對經過PCR確認者，按照前述方法進行雄性育性的化學調控(300mM 5-FC)，每隔4天1次，共3次。開花時用碘-碘化鉀(I2-KI)對花粉活力進行檢測，花粉活力低于10％的植株套袋，成熟時檢查單穗結實率。結果表明，55-60％的植株的花粉活力在20％以下，40-45％在10％以下。在套袋自交的15株中，僅有5株能產生1-5粒種子，而且種子很癟。
序列表<160>2<210>1<211>427<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>1Met Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly1 5 10 15Glu Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala20 25 30Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp35 40 45Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His50 55 60Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly65 70 75 80Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu85 90 95Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln100 105 110Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp115 120 125Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val130 135 140Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu165 170 175Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu180 185 190Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr
195 200 205Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser210 215 220Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly225 230 235 240Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly245 250 255Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn260 265 270Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp275 280 285Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu290 295 300Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp305 310 315 320Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu325 330 335His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn340 345 350Leu Ile Thr His His Ser Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly355 360 365Ile Ala Ala Gly Asn Ser Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn370 375 380Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg385 390 395 400Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr405 410 415Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg420 425<210>2<211>1284<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>3atgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg120cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag180ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc240acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat300gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg360cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg420aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt480ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta540gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa600accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat660gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc720gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca780cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat840attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa900gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg960tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg 1080acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca 1260gaagccatcg attacaaacg ttga 128權利要求
1.調控植物組織或器官凋亡的表達載體，是含有胞嘧啶脫氨酶基因表達盒的植物表達載體，所述胞嘧啶脫氨酶基因表達盒包括植物組織特異性啟動子，胞嘧啶脫氨酶基因和終止子。
2.根據權利要求1所述的調控植物組織或器官凋亡的表達載體，其特征在于所述胞嘧啶脫氨酶基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID No.2；2)編碼胞嘧啶脫氨酶的核苷酸序列；所述胞嘧啶脫氨酶具有序列表中SEQ IDNo.1的氨基酸殘基序列或將序列表中SEQ ID No.1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
3.根據權利要求2所述的調控植物組織或器官凋亡的表達載體，其特征在于所述植物組織特異性啟動子為花藥或花粉特異性啟動子、花絲特異性啟動子、花瓣特異性啟動子、子房特異性啟動子、花柱特異性啟動子、柱頭特異性啟動子、葉片特異性啟動子、種子或胚特異性啟動子或根特異性啟動子。
4.根據權利要求3所述的調控植物組織或器官凋亡的表達載體，其特征在于所述花藥或花粉特異性啟動子包括TA29、A3、A8、AG、Amb aI、BA42、BA112、BA158、Bcp1、Bp4B、Bp4C、Bp19、BetVI、BetvIII、ca55、CDPK、ChiA、ChiB、ChsA、DefA、E1、E2、F2s、13#、17#、G10、KBG41、LAT52、LAT59、Lol P1、Lol Pib、Lec6、MS2、Osg6B、P2、SF1、SF2、SF3、SF5、SF6、SF9、SF16、SF18、SF19、TA13、TA20、TA32、TA56、T72、Tap2、TUA1或Zm13啟動子；所述花絲特異性啟動子包括TSJT1；所述花瓣特異性啟動子包括(cell-wall)P4；所述子房特異性啟動子包括TRRP-F1，iaaH.DefH-9；所述花柱特異性啟動子包括SA2-Rnase、Chi2∶1、SIs、SLG-13和Sp4；所述柱頭特異性啟動子包括ARC1和ARC1Boler；所述種子或胚特異性啟動子包括Napin B、Gtl、Lea(LEA)、REP-2、BCSP666、nad6、oleosin、ABI3、Fus3、KCS和Vpl；所述的葉片特異性啟動子包括psbA、Osppc和St-LS1；所述根特異性啟動子包括HRGP、PRP1、PRP2、Lec、WGA和RB7。
5.根據權利要求4所述的調控植物組織或器官凋亡的表達載體，其特征在于所述花藥特異性啟動子為TA29。
6.根據權利要求1-5中任一所述的調控植物組織或器官凋亡的表達載體，其特征在于所述終止子包括Nos終止子，Ocs終止子和CaMV 35s終止子。
7.根據權利要求5所述的調控植物組織或器官凋亡的表達載體，其特征在于所述調控植物組織或器官凋亡的表達載體為p3dAJM。
8.一種調控植物組織或器官凋亡的方法，是將權利要求1-7中任一所述的調控植物組織或器官凋亡的表達載體導入植物細胞、組織或器官中，篩選得到可表達胞嘧啶脫氨酶基因的轉基因植株，利用5-氟胞嘧啶誘導轉基因植株的目標組織或器官凋亡。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述5-氟胞嘧啶的使用時期為目標凋亡組織或器官發育期前7-14天；優選的使用時期為目標凋亡組織或器官發育期前7天。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述目標凋亡組織或器官為花藥，所述5-氟胞嘧啶的使用時期為花藥絨氈層形成前7-14天。
11.根據權利要求8或9或10所述的方法，其特征在于所述被調控的植物是自花授粉或常自花授粉的單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物包括小麥、水稻、高梁、谷子和玉米；所述雙子葉植物包括煙草、油菜、大白菜、小白菜、甘藍、番茄、黃瓜、甜瓜、西瓜、辣椒和棉花。
12.根據權利要求8或9或10所述的方法，其特征在于所述5-氟胞嘧啶的使用濃度為100-350mM。
全文摘要
本發明公開了一種調控植物組織或器官凋亡的方法及其專用表達載體。本發明所提供的調控植物組織或器官凋亡的表達載體，是含有胞嘧啶脫氨酶基因表達盒的植物表達載體，所述胞嘧啶脫氨酶基因表達盒包括植物組織特異性啟動子，胞嘧啶脫氨酶基因和終止子。調控植物組織或器官凋亡的方法，是將該調控植物組織或器官凋亡的表達載體導入植物細胞、組織或器官中，篩選得到可表達胞嘧啶脫氨酶基因的轉基因植株，利用5－氟胞嘧啶誘導轉基因植株的目標組織或器官凋亡。本發明的調控植物組織或器官凋亡的方法，使人們能夠根據自己的意愿隨時、定向、徹底地除去不需要的植物或作物的某一器官或組織而保留所需要的部分，并且對所保留的所需要的部分不產生負作用。
文檔編號C12N15/82GK1699580SQ20051007761
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月21日 優先權日2005年6月21日
發明者肖興國, 孫曉紅, 曹克浩, 王志林, 韓曉紅 申請人:中國農業大學