調節植物中的種子和器官大小的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及改變植物的種子和器官的大小，例如W便提高植物產量的方法。
【背景技術】
[0002] 種子和器官的大小是在遺傳控制下的農藝學上和生態學上重要的性狀(Alonso-Bianco, C.PNAS USA 96,4710-7(1999) ;Song，X.J. 化 t Genet 39,623-30(2007);Weiss, J.Int J Dev Biol 49,513-25(2005)；Dinneny,J.R.Development 131,1101-10(2004)； Disch,S.Curr Biol 16,272-9(2006)!Science 289,85-8(2000);Ho;riguchi,G.Plant J 43,68-78(2005);Hu，Y Plant J 47，l-9(2006);Hu，Y.Plant Cell 15,1951-61(2003); Krizek，B.A.Dev Genet 25,224-36(1999);Miz址ami,Y.PNAS USA 97,942-7(2000);化th, U.Science 299,1404-7(2003)；0hno,C.K.Development 131,1111-22(2004)；Szecsi, J.Embo J 25,3912-20(2006)；White,D.W.PNAS USA 103,13238-43(2006)；Horvath, B.M.Embo J 25,4909-20(2006);Garcia，D.Plant Cell 17,52-60(2005)。種子和器官的最 終大小在給定物種內是恒定的，而物種間種子和器官大小變化非常大，運表明植物具有W 協調且及時的方式控制種子和器官生長的調控機制。然而，盡管種子和器官大小的重要性， 關于控制植物中的最終器官和種子大小的分子和遺傳機制的所知甚少。
[0003] 已經使用數量性狀基因座(Q化)定位在植物中包括在西紅柿、大豆、玉米W及水稻 中對種子大小的遺傳調控進行了研究。迄今為止，在公開的文獻中，已經鑒別了兩種基因 (Song ,X. J.化t Genet 39,623-30(2007);化11, C. !"Iieor .Appl. Genet. 112,1164-1171 (2006))，運兩種基因是水稻粒度的潛在的兩種主要QTL但是運些基因的分子機制仍有待 闡明。在擬南芥中，已經對影響種質(accessiorOLer和Cvi之間的雜交中的種子重量和/或 長度的^^一種基因座進行了定位{Alonso-Bianco, 1999同上}，但是尚未鑒別相應基因。最 近研究已經掲示AP2和ARF2參與控制種子大小。然而，不幸的是，ap2和arf2突變體具有比野 生型更低的能育性（Schruff,M.C.Development 137,251-261(2006);0hto，M.A.PNAS USA 102，3123-3128(2005);化fuku，K.D.PNAS USA 102,3117-3122(2005))。此外，使用突變植 物的研究已經鑒別了通過對細胞增殖或膨大起作用而影響器官大小的幾種正和負調控因 子化rizek'B.A.Dev Genet 25,224-36(1999) ;Mizukami,Y.Proc Natl Acad Sci U S A 97,942-7(2000);化th，U.Science 299,1404-7(2003);0hno，C.K.Development 131,1111-22(2004)；SzecsiJ.Embo J 25,3912-20(2006)；White ,D.W.PNAS USA 103,13238-43 (2006);Horvath,B.M.Embo J25,4909-20(2006);Garcia，D.Plant Cell 17,52-60(2005)。 Horiguchi,G.Plant J 43,68-78(2005)；Hu,Y Plant J 47,1-9(2006)Dinneny, J.R.Development 131,1101-10(2004))。
[0004] 設及泛素相關活性的幾種因子已知影響種子大小。生長限制因子DAl是泛素受體 并且包括在體外結合泛素的兩個泛素相互作用基序化IM)，并且dal-1突變體通過影響胚珠 的母體珠被而形成大種子化i等人，2008) "dal-l的一個增強子化ODlK其編碼E3泛素連接 酶BIG BROT肥R(BB) (Disch等人，2006;Li等人，2008)中的突變協同增強dal-1的種子大小 表型，從而指示DAl與EODl/BB協同作用來控制種子大小。在水稻中，粒寬和粒重2(GW2)的編 碼E3泛素連接酶的數量性狀基因座(Q化)通過限制細胞分裂來控制粒度(Song等人，2007)。 已經鑒別了小麥中的GW2同源物(Ta-GW2; Be化arek等人2012)。需要由水稻qSW5/GW5編碼的 未知蛋白質來限制水稻中的粒度(Shomura等人，2008 ;Weng等人，2008) eGW5在酵母雙雜交 測定中與聚泛素物理地相互作用，從而表明GW5可能參與泛素-蛋白酶體途徑(Weng等人， 2008)。然而，尚不清楚運兩種因子是否在水稻中的母體組織和/或合子組織中起作用。
[0005] 鑒別控制種子和器官兩者的最終大小的其他因子將不僅增進對植物中的大小控 制的機制的了解，而且可W例如在提高作物產量和用于產生生物燃料的植物生物質方面具 有大量的實際應用。
【發明內容】
[0006] 本發明人已經鑒別了植物E3泛素連接酶(被稱為DA2)，其通過限制發育種子的珠 被中的細胞增殖來調控種子和器官的最終大小。出人意料地發現DA2與DAl協同作用且獨立 于EODl來控制種子和器官大小。WDA2和DAl和/或EODl為目標因此可用于提高植物產量。
[0007] 本發明的一方面提供了一種增加植物的產量的方法，包括：
[0008] 降低所述植物的細胞內的DA2多膚的表達或活性，
[0009] 其中所述植物缺乏DAl表達或活性。
[0010] 本發明的另一方面提供了一種增加植物的產量的方法，包括：
[0011] 降低所述植物的細胞內的DA2多膚的表達或活性，
[0012] 其中所述植物缺乏EODl表達或活性。
[0013] 本發明的另一方面提供了一種增加植物的產量的方法，包括：
[0014] 降低所述植物的細胞內的DA2多膚的表達或活性，
[0015] 其中所述植物缺乏DAl和EODl表達或活性。
[0016] 本發明的另一方面提供了一種增加植物的產量的方法，包括：
[0017]降低或消除所述植物的細胞內的DA2多膚的表達或活性，W及；
[0018] i)降低或消除所述細胞內的DAl多膚的表達或活性，
[0019] i i)降低或消除所述細胞內的EODl的表達或活性，和/或
[0020] i i i)在所述細胞內表達顯性陰性的DA多膚。
[0021] 本發明的另一方面提供了一種產生具有增加的產量的植物的方法，包括：
[0022] 提供缺乏DAl、E0D1或DAl和EODl兩者的表達或活性的植物細胞，
[0023] 通過轉化將消除或抑制DA2多膚的表達或活性的異源核酸并入所述植物細胞中， W及；
[0024] 從一個或多個轉化的細胞再生所述植物。
【附圖說明】
[00巧]圖1示出da2-l突變體中的種子和器官大小。IA示出Col-0、da2-l和35S: :DA2#1種 子的投影面積。將種子分成=組(〉〇. 13、0.12-0.13和<0.12mm2)。將每組的值表示為所分析 的總種子數目的百分比。IB示出Col-0、da2-l和35S::DA2#1的每角果種子數目。主莖上的角 果(從第四角果至第十角果）用于測量每角果種子數目。IC示出Co^0、da2-1和35S: :DA2#1 的每植株種子重量。ID示出Col-0、da2-l和35S: :DA2#1的每植株種子數目。化示出Col-0、 da2-l和35S: :DA2#1植株的高度。數值(B-E)作為相對于野生型數值的平均值±SE給出，設 置成100%。相較于野生型，**，P<0.01和*，P<0.05(學生t檢驗）。尺條:F，lcm;G，lmm
[0026] 圖2示出Col-O(左）、da2-l(中間）和35S: :DA2#1(右）的4天齡植株（F)和Col-O (上）、da2-l(中間）和35S: :DA2#1(下）的花(G)。
[0027] 圖3示出DAl和DA2協同作用來控制種子大小。3A示出Col-0、dal-l、da2-dPdal-l da2-l的干種子。3B示出C〇]_-0、da2-l、dal-l和dal-1 da2-l(從左至右）的10天齡幼苗。3C示 出(：〇^0、(1曰1-1、(1曰2-1和(1曰1-1(1曰2-1的種子重量。30示出(：〇1-0、(1曰1-1?)1、(1曰2-巧0(1曰1-1?)1 da2-l的種子重量。數值作為相對于對應野生型數值的平均值±56給出，設置成100%。相較 于野生型，**，P<0.01 和*，P<〇.〇5(學生 t 檢驗）。尺條:A，0.1mm;B，lm
[002引圖4示出DAl和DA2協同作用來控制種子大小。左上圖示出10天齡Col-O、dal-l、 da2-l和dal-1 da2-l幼苗的子葉面積。右上圖示出10天齡Co^0、dal-kol、da2-dPdal-kol da2-l幼苗的子葉面積。左下圖示出仿^0、(1曰1-1、(1曰2-巧日(1曰1-1(1曰2-1胚芽的子葉中的柵欄 細胞的平均面積。右下圖示出Col-0、dal-l、dal-l da2-l、dal-kol da2-l、dal-kol darl-l 和dal-kol darl-1 da2-l種子的投影面積。數值作為相對于對應野生型數值的平均值±56 給出，設置成100%。相較于野生型，**，P<0.0l和*，P<0.05(學生t檢驗）。尺條:A，0.1mm;B， Im
[0029] 圖5示出DAl和DA2協同作用來控制發育種子的母體珠被中的細胞增殖。（5A-5D)分 別示出(：〇^0、(1曰1-1、(1曰2-1和(1曰1-1(1曰2-1的成熟胚珠。(1曰2-1突變協同增強(1曰1-1的胚珠大 小。
[0030] 圖6示出（左圖）Col-0XCol-0(c/c)Fl、da2-lXda2-l(d2/d2)Fl、Col-0Xda2-l (c/d2)FlW及da2-lXCoレ0(d2/c)F巧中子的投影面積和（中間圖）Col-0XCoレ0(c/c)Fl、 dal-kol da2-lXdal-kol da2-l(dd/dd)Fl、Col-〇Xdal-kol da2-l(c/dd)Fl、dal-kol da2-lXCol-0(dd/c)Fl種子的投影面積。右圖示出在用dal-kol da2-l雙突變體花粉對 (1曰1-4〇1/+(1曰2-1/+植物授粉，從而導致(1曰1-1?)1/+(1曰2-1/+種皮內的(1曰1-1?)1/+(1曰2-1/+(曰）、 dal-kol/+da2-lda2-l (b)、dal-kol/dal-kol da2-l/+(c) W及dal-kol da2-l(d)胚芽的發 育之后的投影種子面積。測量了來自用dal-kol da2-l雙突變體花粉受精的dal-kol/+da2-IA植株的單個種子的投影面積。將運些種子針對dal-kol和da2-l突變進一步基因分型。數 據顯示dal-kol和da2-l突變與運些種子的大小的變化不相關(P〉0.05,學生t檢驗）。數值作 為相對于對應野生型數值的平均值± SE給出，設置成100 %。相較于野生型，**，P<0.01 (學 生t檢驗）。尺條:A-D，0.5mm。
[0031 ] 圖7不出（左圖）〔〇1-〇、(1曰1-1、(1曰2-1和(1曰1-1(1曰2-1成熟胚珠的投影面積；（中間 圖）在抓AP和8DAP時防^0、(1曰1-1、(1曰2-巧日(1曰1-1(1曰2-1種子的外珠被中的細胞的數目；^ 及化圖）從單個種子的外珠被長度和細胞數目計算在抓AP和8DA郵tCo^0、dal-l、da2-l和 dal-1 da2-l種子的外珠被中的細胞的平均長度。
[0032] 圖8A示出DA2基因結構。指示了起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)。閉合框指示 編碼序列，開放框指示5'和3'非翻譯區，并且框之間的線指示內含子。示出DA2基因中的T-DNA插入位點(da2-l)。圖8B示出DA2蛋白質包括預測的RING結構域。
[0033] 圖9示出DA2的E3泛素連接酶活性。將MBP-DA2和突變的DA2(MBP-DA2C59S和MBP- DA2N91L)融合蛋白針對在E1、E2和化S-泛素化is-Ub)存在下的E3泛素連接酶活性進行測 定。分別通過用抗-Hi S抗體(抗-Hi S)和抗-MBP抗體(抗-MBP)免疫印跡（IB)來檢測泛素化蛋 白質。下部箭頭指示MBP-DA2蛋白質，并且上部箭頭示出泛素化MBP-DA2蛋白質。
[0034] 圖10示出(：〇^0、(1曰2-1、011#6、0^#8^及0^#10種子的投影面積（上圖），其中0^ 是由其自己的啟動子驅動的用DA2編碼序列轉化的da2-l;Col-0、da2-l、C0M#6、C0M#8和 COM# 10植株的花瓣面積（中間圖）W及Co 1-0、da2-1、C0M#6、C0M#8 W及COM# 10幼苗中的DA2 基因表達的定量實時RT-PCR分析（下圖）。數值(D和E)作為相對于da2-l數值的平均值± SE 給出，設置成100%。相較于da2-l突變體，**，P<0.0 l (學生t檢驗）。
[0035] 圖11示出DA2的表達模式。IlA示出DA2基因表達的定量實時RT-PCR分析。從根(R)、 莖(S)、葉化）、幼苗(Se)W及花序（In)分離總RNA。llB-llN示出通過pDA2:GUS轉基因表達監 巧化勺DA2表達活性。觀察到四個GUS表達系，并且全部顯示類似的模式，盡管它們在染色的強 度方面略有不同。4天齡幼苗（IlB)、10天齡幼苗（IlC)、花的花序（IlD)、正發育的花瓣（11E-11G)、正發育的雄蕊（11H和111)、正發育的屯、皮（IlJ-IlL)W及正發育的胚珠（11M和11N)中 的GUS活性的組織化學分析。尺條:B-D，Imm; E-N，0.1 mm。
[0036] 圖 12 示出 DAl 在體外直接與 DA2 相互作用。將651'-041、651'-0411?3581(、651'-0八1-UIM、GST-DA1-LIM、GST-DA1-LIM+C和GST-DAl-C通過固定在直鏈淀粉樹脂上的MBP-DA2拉下 來(PD)并且使用抗GST抗體通過免疫印跡(IB)進行分析。
[0037] 圖13示出含有特異性蛋白質結構域的DAl及其衍生物的示意圖。預測的DAl蛋白質 包括兩個UIM基序，單個LIM結構域和C末端區域。
[003引圖14示出DAl在體內與DA2相互作用。將本氏煙草（Nicotiana benthamiana)葉通 過注射擁有35S = Myc-DAl和35S:GFP-DA2質粒的根癌±壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)GV3101細胞進行轉化。將總蛋白質用GFP-Trap-A免疫沉淀，并且分別用抗GFP 抗體和抗Myc抗體探測免疫印跡。在免疫沉淀的GFP-DA2復合物中檢測到Myc-DAl，從而指示 在植株中在DAl與DA2之間存在物理相關性。
[0039] 圖15示出da2-l突變體展示增加的器官大小。15A示出Co^0、da2-1 W及35S: DA2#1 植株的花瓣長度(PL)、花瓣寬度(PW)、花瓣面積(PA)、專片面積(SA)、屯、皮長度(CL)、長雄蕊 長度化化）W及短雄蕊長度（S化）。158示出Col-0、da2-l和35S: :DA2#1植株的第五葉面積。 15C示出Col-0、da2-l和35S: :DA2#1花的重量。1抓示出Col-O和da2-l花瓣的最大寬度區域 中的近軸表皮細胞的大小。15E示出Co 和da2-l的第五葉中的柵欄細胞的大小。開放的花 (階段14)用于測量花瓣的大小（15A)、花的重量(C)和表皮細胞的大小（15D)。數值(A-E)作 為相對于對應野生型數值的平均值± SE給出，設置成100 %。相較于野生型，**，P<0.01 (學 生t檢驗）。
[0040] 圖16示出DAl和DA2協同作用來控制種子大小。1抓示出Col-0、dal-kol、da2-l和 dal-kol da2-l花的花瓣面積。16E示出(：〇1-0、(1曰1-1?)1、(1曰2-1和(1曰1-1?)1(1曰2-1花瓣的最大 寬度區域中的近軸表皮細胞的大小。16F示出防^0、6〇(11-2、(1曰2-1和6〇(11-2(1曰2-1的種子重 量。16G示出防^0、6〇(11-2、(1曰2-1和6〇(11-2(1曰2-1的花瓣面積。開放的花(階段14)用于測量 花瓣的大小（16D和16G)和表皮細胞的大小（16E)。值（16D-G)作為相對于對應野生型數值的 平均值±SE給出，設置成100%。相較于野生型，**，P<0.01和*，P<0.05(學生t檢驗）。尺條： 0.lmm〇
[0041 ] 圖17示出DA2的過度表達限制器官生長。17A示出Co^O、35S: DA2#2和35S: DA2#4的 花瓣面積。17B示出(：〇1-0、355:042#2和358:042#4幼苗中的歴2的表達水平。值(4和8)作為 相對于Co值的平均值± SE給出，設置成100 %。相較于野生型，**，P<0.01 (學生t檢驗）。
[0042] 圖18示出DA化的過度表達限制器官生長。18A示出Co^O、35S: DA2L#1、35S: DA^# 3、35S: DA2LM、35S: DA化#5 和 35S: DA 化#6 的 20 天齡植株。18B 示出 Co 、35S: DA 化# 1、35S: DA化#3、35S: DA化#4、35S: DA化#5 和 35S: DA化#6 的 30 天齡植株。18C示出 Co^O、35S: DA化#1、 35S: DA化#3、35S: DA化#4、35S: DA化#5和35S: DA化#6幼苗中的DA化表達的RT-PCR分析。對從 2周齡幼苗制備的第一鏈CDNA進行RT-PCR。將CDNA通過參考ACTIN2標準標準化。尺條:A， 1cm，B，1cm
[0043] 圖19示出GW2的過度表達限制種子和器官生長。19A示出Col-0、35S:GW2#l、35S: 0胖2#2、355:6￥2#3、355:6胖2#6和355:6胖化#7的30天齡植株。198示出(：〇^0、355:6胖2#1、355: GW2#2、35S: GW2#3、35S: GW2#6 和 35S: GW 化 #7 種子的投影面積。19C 示出 Col-O、35S: GW2#1、 35S: GW2#2、35S: GW2#3、35S: GW2#6 和 35S: GW 化 #7 幼苗中的 GW2 基因表達的定量實時 RT-PCR 分析。數值(B)作為相對于Col-O數值的平均值±SE給出，設置成100%。相較于野生型，**，P <0.01(學生t檢驗）。尺條:A，lcm
【具體實施方式】
[0044] 本發明設及通過改變植物E3泛素連接酶DA2的表達或活性結合改變DA巧日/或EODl 的表達或活性來改變影響產量的植物性狀(如種子和器官大小）的方法。優選地，在植物中 改變DA2和DAl的表達或活性。
[0045] 可在改變DAl和/或EODl的表達或活性之前、同時或之后改變DA2的表達或活性。例 如，在一些實施例中，可在一個或多個植物細胞中改變DA2多膚的表達或活性，所述植物細 胞已經具有W下之一:改變的DAl表達或活性、改變的EODl表達或活性、或改變的DAl和EODl 表達或活性。
[0046] 本文提供例如通過增加器官或種子大小來增加植物的產量的方法，所述方法包括 提供缺乏DAl和/或EODl表達或活性的植物，并且降低所述植物的一個或多個細胞中的DA2 的表達。在其他實施例中，可降低一個或多個植物細胞中的DAl和/或EODl的表達或活性，所 述植物細胞具有降低的DA2多膚表達或活性。
[0047] 其他方法可包括降低植物的一個或多個細胞中的DA2的表達并且降低一個或多個 細胞中的DAl、E0D1或DAl和EODl兩者的表達或活性。
[004引本文還提供產生相對于野生型植物具有增加的產量的植物的方法，包括：
[0049] (a)通過轉化將W下各項并入植物細胞中：
[0050] (i)第一異源核酸，所述核酸降低DA2多膚的表達，
[0051] (ii)第二異源核酸，所述核酸降低DAl多膚和EODl多膚之一的表達，W及任選地，
[0052] (iii)第S異源核酸，所述核酸降低DAl多膚和EODl多膚中的另一者的表達，W及
[0053] (b)從一個或多個轉化的細胞再生所述植物。
[0054] 產生具有增加的產量的植物的其他方法可包括：
[0055] 提供缺乏DAl和/或EODl表達或活性、優選DAl活性的植物細胞，
[0056] 通過轉化將降低DA2多膚的活性或表達的異源核酸并入所述植物細胞中，W及；
[0057] 從所述轉化的細胞再生所述植物。
[0058] 在再生之后，可選擇相對于野生型植物具有降低的DA2多膚活性或表達W及降低 的DAl和/或EODl活性或表達的植物。
[0059] 降低的DA2表達與降低的DAl和/或EODl表達的結合協同增加植物的種子和/或器 官的大小，從而增加植物產量。
[0060] 植物中的一種或多種與產量相關的性狀可通過降低的DA2表達或活性結合降低的 DA巧日/或EOD1表達或活性來改進。例如，可相對于DA2多膚的表達尚未降低的對照或野生型 植物增加植物的壽命、器官大小和種子大小中的一者或多者。
[0061 ] DA2、DA1或EODl的表達或活性可在本文描述的方法中相對于野生型植物降低至少 50%、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %。在一些優選的實施 例中，表達或活性被降低至零或基本上為零(即表達或活性被消除）。
[0062] 本發明的方法包括改變植物的一個或多個細胞中的DA2多膚的表達或活性。
[0063] DA2多膚是在植物中發現的E3泛素連接酶。如本文所述的表達或活性被降低的DA2 多膚可包括RING結構域（Stone，S丄.等人（2005))，優選地為C5HC2、C5NC2或C5TC2RING結 構域。適合的RING結構域可由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成；
[0064] C(X)2C(X)iiCC(X)4CX2CX7化/N/T巧6C拉Ce(SEQ ID N0:1)
[0065] 例如，適合的RING結構域可由SEQ ID NO:2的氨基酸序列組成；
[0066] CPICFL(Y/F)YP化NRS 化/R)CC(S/M/T/A 化(G/S)ICTEC化（Q/R)MK(P/N/S/V/T/N) (T/P)(H/N/T)(T/S)(A/T/C)(R/Q/K)PTQCP(F/Y)C
[0067] (沈Q ID NO:2)
[006引在一些實施例中，SEQ ID NO: 2的RING結構域中的位置33處的H/N/T殘基可W是T 或N。
[0069] 在一些優選的實施例中，DA2多膚可包括RING結構域，所述RING結構域具有表1中 所示的氨基酸序列（SEQ ID N0:3-19)，例如擬南芥DA2(SEQ ID N0:11)、擬南芥DAL2(SEQ ID NO: 13)或水稻GW2(SEQ ID N0:7)或其變體。例如，RING結構域可具有W下各項的氨基酸 序列：SEQ ID N0:20(Pt_GI-224061326.pro)的殘基 59 至 IOUSEQ ID N0:21(Rc_GI-255578534.口'〇)的殘基59至101、沈9 10顯：22(￥￥_61-147817790.口'〇)的殘基59至101、 SEQ ID N0:23(Gm_GI-35