專利名稱：一種體外培養骨骼肌表達體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體地說涉及一種體外培養的骨骼肌表達體系的建立。
背景技術：
隨著基因工程技術的不斷發展，目前已有多種表達體系可用于生產具有研究或醫療價值的人或動物來源的蛋白質。雖然原核表達體系、酵母表達體系、以及昆蟲表達體系表達量高，但由于其產品缺乏有效的加工修飾使其在藥物生產中的應用受到極大限制。因此，目前已經投放市場，以及正在進行臨床實驗的治療用蛋白質生物類藥物，大多數來自哺乳動物細胞表達體系。
雖然哺乳動物表達體系所表達的蛋白在質量和安全性上具有競爭力，但是和酵母、細菌和昆蟲體系相比其產量較低而成本較高。
哺乳動物表達體系的表達載體調控機理的研究中，人們可通過選擇不同載體、不同增強子和啟動子來獲得外源基因的高表達，從而構建新的真核表達載體。另一方面，Cottet和Corthesy(Sreekrishna K，Webster T D，Dickson RC.Transformation of Kluyveromy ces L actis.with the Kanamycin(G418)resistance gene of Tr903.Gene，1984；2873～81)發現單純增加蛋白的表達量并不足以導致重組蛋白的產量增加，因為利用哺乳動物表達體系多是引導蛋白分泌到培養基內，細胞用于蛋白的成熟和分泌的組分是影響其產量的瓶頸。因此增加重組蛋白的產量，不能僅僅依靠通過改善載體等手段，鑒別和清除細胞產生和分泌蛋白的瓶頸問題至關重要。因此表達體系的宿主細胞問題是制約目前哺乳動物細胞表達體系發展的根本問題，篩選優于以上細胞的新宿主類型應成為該領域重點解決的關鍵問題。
QM7屬于骨骼肌細胞系，是從鵪鶉纖維肉瘤細胞QT6分離出來(Chen XJ，Saliola M，Falcone C et al.Sequence organization of the circular Plasmic p KD1from the yeast Kluyveromyces droxophilarum.Nucleic Acids Res，1986(14)4471～4481)。骨骼肌細胞的特性之一是在血清含量高的培養基中，細胞分裂、增殖；在低血清含量的培養基中，細胞退出細胞周期融合形成肌管。QM7雖非哺乳動物細胞，但和其非常相似。QM7有發達的類似于內質網的肌漿網，并且能分泌大量糖基化細胞外基質，說明它有完善的蛋白修飾加工體系。在進行細胞培養時，QM7細胞在10％血清的培養基中增殖旺盛，在0.5％血清的培養基中，細胞融合形成粗大的肌管。肌管仍可繼續合成外源蛋白，而且轉染陽性的細胞和陰性細胞融合后，可以利用后者的細胞器合成蛋白，這一特性也是其作為表達體系的優勢之一。雖然QM7細胞在含0.5％血清的培養基內能分化形成肌管并存活較長時間，但這樣濃度的血清仍可對后續純化和未來的藥物開發產生影響，合適的無血清培養基的篩選至關重要。
發明內容
本發明要解決的技術問題旨在克服上述已有技術的不足，提供了一種體外培養的骨骼肌細胞進行重組蛋白生產的配套體系，更進一步地，提供了以QM7為宿主細胞進行重組蛋白生產的配套體系，包括構建利于重組蛋白表達和檢測的真核表達載體；篩選有效引導重組蛋白分泌的信號序列，增大了目的蛋白的分泌量；篩選有利于QM7細胞分化及重組蛋白純化的無血清分化培養基，這種無血清培養基造價低并且利于后期純化工作；利用構建的真核表達載體表達兩種已知可以相互結合的蛋白，驗證QM7表達體系用于Pull-Down檢測的可行性；利用表達體系表達具有應用價值的重組蛋白PEX，為PEX作為重組蛋白藥物進行大規模生產奠定了前期基礎。
本發明采用的技術方案是
一種體外培養骨骼肌表達體系，包括含目的基因的表達載體的構建、表達載體轉染宿主細胞群及篩選、目的基因在宿主細胞中的表達和表達產物的分離純化、表達產物的活性檢測等步驟，其特征在于所述的表達載體是在pcDNA3.0基礎上，構建的帶有myc10檢測標簽及6×his純化標簽的表達載體；且在所述的表達載體中插入人基質金屬蛋白酶9(MMP-9)信號序列(見序列1)。
進一步地，本發明涉及的真核表達載體用以表達基質金屬蛋白酶MMP-2C-末端片段PEX蛋白或人胰島素樣生長因子I(IGF-I)。
進一步地，本發明涉及的宿主細胞是QM7細胞。
進一步地，本發明涉及的宿主細胞的培養基采用含3μg/ml insulin的M199無血清分化培養基。
進一步地，本發明涉及的真核表達載體用以表達小鼠P53蛋白和SV40大T抗原，并用于檢測表達蛋白間的相互作用。
本發明的與已有技術相比具有以下積極效果在表達載體中插入了myc檢測標簽及6×his純化標簽，利于目的蛋白的純化及檢測；在上述表達載體中插入了基質金屬蛋白酶9(MMP-9)信號序列，增大了蛋白的分泌量；采用了QM7細胞作為宿主細胞表達蛋白，蛋白的表達量約為COS7的1.5-2.5倍；篩選出適合QM7細胞分化的無血清分化培養基，即含3μg/ml insulin的M199培養基，這種無血清培養基造價低并且利于后期純化工作；MMP9的信號序列可以引導SV40大T抗原和小鼠p53蛋白成功分泌至細胞培養液中，并且這兩種蛋白具備生物活性，二者可以相互作用結合，驗證了QM7表達體系用于Pull-Down檢測的可行性。
另外，基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的C末端片段PEX是粘附分子αvβ3的拮抗活性片段，具有抑制血管發生、拮抗腫瘤的效應(Clare J J，Romanos M A，Rayment F B et al.Production of mouse epidermal growth factor I yeasthigh2level secretion using Pichia Pastoris strains containing multiple gene copies.Gene，1991，105205～212；Tschopp J F，Sverlow G Kosson R et al.High2 levelsecretion of glycosylated invertase in the methy2 lotrophic yeast，Pichia Pastoris.Biotechnology，1987(5)1305～1308)，抑制腫瘤的血管發生被認為是藥物治療腫瘤的有效、最佳合理手段，因此PEX有可能成為具有潛在應用前景的內源性抗腫瘤藥物。本文所涉及的體外培養骨骼肌表達體系為PEX作為重組蛋白藥物進行大規模生產奠定了前期基礎。
圖1表示本發明涉及的一種體外培養骨骼肌表達體系中構建的pM9/PEX/hismyc載體的一級結構及其所表達肽鏈一級結構的示意圖。
圖2表示本發明體外培養骨骼肌表達體系中不同信號肽對于促進PEX蛋白分泌效果的SDS-PAGE電泳圖；圖3表示本發明體外培養骨骼肌表達體系中不同信號肽對于促進IGF-I蛋白分泌效果的SDS-PAGE電泳圖。
圖4表示本發明體外培養骨骼肌表達體系用于Pull-Down檢測的SDS-PAGE電泳圖。
圖5表示本發明體外培養骨骼肌表達體系用于Pull-Down檢測的Western印跡圖。
具體實施例方式
所用材料分子克隆所用的各種DNA限制性內切酶，Taq酶為New England Biolab產品；T4DNA連接酶購自Promega公司。HRP酶標羊抗兔IgG購自Jackson公司。ECL發光試劑盒購自Pharmacia公司。
實施例1和實施效果例1～4將說明本發明所涉及的體外培養骨骼肌表達體系的具體實施方式
。
實施例1一、載體的構建1.prGH/PEX/hismyc表達載體構建pIg/PEX/hismyc和prGH/PEX/hismyc是在pcDNA3.0基礎上構建的雞PEX的表達載體。PEX的C末端XhoI位點處融合有myc10肽抗原標簽和6×his純化標簽的編碼序列，N端HindIII和BamHI位點之間分別插入小鼠免疫球蛋白Ig輕鏈和大鼠生長激素(rGH)的信號序列。
用RT-PCR分別從大鼠腦垂體和十一日齡雞胚胎擴增大鼠生長激素(rGH)信號肽序列和雞MMP-2 C末端片段PEX序列。大鼠生長激素引物正義5’-GGCAAGCTT(Hind III)ACAGATCACTGAGTGG-3’、反義5’-AGAGGATCCT(BamH I)GGACAAGGGCATG-3’；雞MMP-2C-末端PEX引物正義5’-CGGATCC(BamHI)TCTGCAAGCACG-3’，反義5’-CCTCTAGA(Xba I)GCAAGTCCTCTTCAGAAATCAGTTTT TG CTC GAG(Xho I)GCAACCCAACCAGTC。大鼠生長激素信號肽與PEX的PCR產物以約等分子比混合作為模板，以rGH的正義引物和PEX的反義引物PCR擴增使rGH信號肽與PEX相連接，再以該產物為模板用rGH的正義引物和引物5’-CTGGGCCC(Apa I)TAATGATGATGAT G ATGATGTCTAGA(Xba I)CAAGTCCTCTTCAG-3’在融合蛋白的C-端PCR加上myc抗原標簽和6Xhis純化標簽的編碼序列，Hind III與Apa I酶切后，T4DNA聚合酶連接裝入相應酶切的真核表達載體pcDNA3.0(美國Invitrogen公司)。轉化大腸桿菌DH5α，取酶解鑒定正確的克隆測序確認，用Tip-500(Qiagen公司)大量提取和純化質粒備用。
2.pIg/PEX/hismyc表達載體構建Igκ鏈的分泌信號肽的合成其上游引物為5’GGG AAG CTT CAC ACACAC ACA CAT GAG CGT GCC GAC ACA GGT CCT GGG TTT GCT GCTGCT ATG GC 3’(含有HindIII位點)；下游引物為5’GAG GAT CCG GAT ATCACATCT CGC ATC TGTAAG CCATAG CAG CAG c 3’(含有BamHI位點)。上游引物與下游引物經退火粘鏈成雙鏈簡稱Ig。Ig經HindIII和BamH I酶切后，與被同樣酶切的prGH/PEX/hismyc相連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，得到pIg/PEX/hismyc重組體。
3、pM9/PEX/hismyc表達載體的構建及鑒定人基質金屬蛋白酶9(MMP9)的信號序列為57bp(見序列1)，載體pcDNA3.0/MMP9中CMV啟動子處有NdeI位點。上游引物設計于NdeI位點上游5’CGC CAATAG GGA CTT TCC 3’；下游引物在MMP9的信號序列3’端引入BamHI位點5’CCG GAT CCT GGG GGC AGC AAA GCA GC 3’。PCR產物經NdeI和BamH I酶切后，與被同樣酶切的pIg/PEX/hismyc用T4DNA連接酶相連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，得到pM9/PEX/hismyc重組體。酶切鑒定并測序。該載體的構建包括以下步驟3.1 PCR以MMP9-pcDNA3.0為模板，進行PCR
PCR反應在熱循環儀中進行，95℃預變性5min，循環反應程序為94℃變性1min，55℃退火1min；72℃延伸1min，30cycles，循環反應結束后，72℃，10min充分延伸，4℃保存。電泳觀察結果3.2內切酶消化及目的片段的回收由于MMP9引物設計時在兩端引入NdeI和BamH I酶切位點，故可以用NdeI和BamH I酶切MMP9PCR產物及載體pIg/PEX/hismyc，并通過酶切后產生的粘端將目的片段克隆到載體當中。
1)內切酶消化下列體系在37℃，消化3-4h
2)酶切后載體及目的片段的回收1％ agarose制備膠分離插入片段新鮮配制1％ agarose膠，將上述酶切產物同時上樣，75V電泳50分鐘，在紫外下切取含目的帶的凝膠。
用Glassmilk回收凝膠中的DNA片段切下的凝膠稱重后，按1g≈1ml計算，加入3倍體積的碘化鈉試劑55℃溶解凝膠，加入5-10μl玻璃奶置室溫15分鐘，間歇2-3分鐘混勻一次。離心10000轉，2分鐘，棄上清，用300-500μl洗脫緩沖液洗滌沉淀3次，最后一次棄上清后，再離心2分鐘，盡量吸干上清。加15μl dd-H2O洗脫，55℃水浴15分鐘，離心，保留上清。再次洗脫沉淀，兩次洗脫液混合，取3μl電泳鑒定。
3.3目的片段與載體pIg/PEX/hismyc的連接上述酶切后純化的MMP9DNA片段(BamH I/NdeI)和pIg/PEX/hismyc(BamH I/NdeI)用T4DNA連接酶進行連接。
室溫3h，或14-16℃連接過夜即可進行轉化。
3.4大腸桿菌DH5α感受態細胞的制備(inoue method)1)取-70℃凍存的細菌用接種環接種于瓊脂平皿上，37℃，倒置培養16-20h；2)從平皿中挑取多克隆菌落，至250ml SOB中，225rpm，18℃，培養至細菌密度OD600＝0.6；3)冰浴10min，離心(4℃，2500×g，10min)，棄上清，沉淀用80ml預冷的TB輕輕懸浮，冰浴10min；4)離心(4℃，2500×g，10min)，沉淀用20ml預冷的TB輕輕懸浮，加入DMSO使其終濃度為7％，冰浴10min；5)每支100μl分裝，-70℃凍存備用。
3.5細菌的轉化1)新鮮制備或取出凍存的感受態菌，每100μl感受態菌加50-100ng質粒DNA，冰浴30分鐘。
2)42℃熱休克1分鐘，立即插入冰中。
3)加入500μl SOC，37℃，225rpm培養0.5小時。
4)取適量鋪盤，倒置培養于37℃，12-16h3.6質粒DNA的提取及純化
1)小量質粒提取(堿裂解法)挑一單菌落置于5ml LB(AMP+)中；→37℃，225rpm，過夜培養后，收集菌體，離心(6000rpm，4℃，3min)；→棄上清，沉淀加入Solution A 100μl充分混勻，室溫3-5min；→Solution B 200μl，緩慢顛倒混勻，室溫3-5min(SolutionB，現配現用)；→加入Solution C 150μl，顛倒混勻，冰浴5min；離心(16,000rpm，4℃，5min)；→吸上層水相于另一Eppendorf管中，加2.0倍體積無水乙醇，混勻；→離心(16,000rpm，4℃，5min)；→棄上清，加入預冷70％乙醇1ml，離心(16,000rpm，4℃，1min)，吸棄上清，室溫揮發至干，加適量TE/Rnase(10μg/ml)20-50μl，-20℃保存。
2)PEG法純化質粒DNA質粒用于轉染前應用PEG法進行純化，以除去超螺旋結構，提高轉染效率。純化方法質粒DNA沉淀(250ml菌液)用400μl TE溶解；→加等體積(400μl)13％PEG+0.8mol/LNaCl，混勻，冰上放置20min；→離心(16,000rpm，4℃，15min)；→沉淀用70％乙醇洗，離心(16,000rpm，4℃，1min)；→吸棄上清，風干，沉淀用400μl TE溶解，并用1％agarose電泳鑒定。
3.7 PEX表達載體pM9/PEX/hismyc的鑒定把連接產物轉化大腸桿菌DH5α，涂布于LB(含氨芐青霉素)1.5％瓊脂的盤上，37℃，倒置培養過夜。少量制備所挑選克隆的質粒.對重組的質粒進行HindIII與XbaI的雙酶切鑒定，37℃ 2hrs酶切后樣品行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察各克隆釋放出0.6kb DNA片段，說明pcDNA3.0插入了600bp的外源基因，經測序證明插入序列正確，MMP9信號序列與PEX的讀碼框架一致。
pM9/PEX/hismyc載體的一級結構及其所表達肽鏈一級結構的示意圖見圖1。
二、真核細胞轉染采用常規轉染方法均可，優選采用以下轉染真核細胞的方法采用脂質體lipofectamine(GIBCO/BRL)，2μg質粒與10μl脂質體在1ml無血清培養基中混合形成DNA/脂質體復合物，然后加入到接種有3×105QM7(來源于美國ATCC)細胞的35mm培養皿中。37℃ CO2孵箱中孵育3-5小時后換含有血清的完全培養基。
三、篩選為得到穩定轉染的克隆，轉染后48小時將細胞以105/10cm培養皿的密度接種，在含有400μg/ml G418的培養基中篩選陽性克隆。2-3周后收集所有的陽性克隆形成POOL，得到穩定表達PEX蛋白的細胞系。
四、目的蛋白的純化由于所構建的載體帶有His標簽，可以用Ni-NTA方便的進行PEX蛋白純化。純化方法如下pM9/PEX/hismyc轉染后的穩定表達PEX蛋白的QM7細胞3×105密度接種到35mm培養皿中，細胞匯片后，換含3μg/ml insulin的M199(Gibco公司)無血清分化培養基1.5ml培養細胞；每天收集上清，換新鮮分化培養基，連續兩天共收集上清3ml，離心去除細胞。上清中加入Ni-NTAagrose(Qiagen公司)50μl室溫振蕩2h后離心棄上清，沉淀用洗液洗三遍后加入150mM咪唑洗脫液100μl振蕩1min，離心吸取上清做SDS-PAGE分析，結果顯示26KD處有目的片段。3ml上清中純化量約為3μg。
五、目的蛋白的檢測由于所構建的載體帶有myc10肽抗原標簽，可以用Western印跡方便的進行PEX蛋白檢測。蛋白檢測方法如下取上述PEX純化產物3μl，進行Western印跡以確認純化產物為目的蛋白。方法同前。可檢測到約26KD的陽性條帶，與理論推導的PEX分泌蛋白的分子量吻合。
六、目的蛋白PEX的生物活性測定將購買的新鮮種蛋在40℃的0.1％新潔爾滅溶液中浸泡3-5分鐘，消毒后用凈紗布擦干蛋殼表面溶液，置于37.5℃、60-70％濕度孵化(每天翻動3次，勿使蛋殼附著水)。孵化3天后將雞蛋去殼，雞胚移至平皿中繼續培養.去殼時用75％酒精消毒切口及手指，氣室端為上，牙科鉆在種蛋上、中1/3處切割蛋殼，形成2-3CM的切口，雙手拇指伸入切口處輕輕打開種蛋殼及殼膜，使雞胚落入平皿中，保證卵黃膜向上，勿傷及白色殼膜，以免造成卵黃膜破壞導致雞胚死亡。繼續培養第5天加藥(取玻璃纖維濾紙，用打孔器打d＝2mm d＝3mmd＝5mm d＝8mm不同規格的圓片，高壓滅菌，加在尿囊膜血管分枝處，每片滴加純化后的濃度為30ng/μl PEX蛋白溶液5μl；對照組加1×PBS 5μl。24h后重復給藥1次，48小時后觀察并照相。
給藥第48小時后，揭開濾紙片，于解剖顯微鏡下(10倍)觀察結果并照相記錄。對照組血管生長正常；實驗組血管生長受阻，表現為血管阻斷。這表明，在體內150ng純化的PEX蛋白具有明顯的抑制血管生成的作用，證實QM7可以對重組蛋白進行比較完善的修飾，表達的蛋白具有生物活性。
實施效果例實施效果例1、MMP-9信號序列促進目的蛋白的分泌量1.1表達載體的構建1.1.1 pIGF-I/hismyc表達載體的構建以人胰島素樣生長因子(human insulin-like growth factor I，IGF-I)的cDNA為模板，上游引物5’GGAAGC TTATGG GAAAAA TCA GCA G 3’(含有HindIII位點)；下游引物為5’CGC TCG AGA GCT GAC TTG GCA GGC 3’(含有XhoI位點)。將擴增的PCR產物以HindIII和XhoI酶切，將酶切產物(約350bp)與被同樣酶切的prGH/PEX/hismyc相連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，得到pIGF-I/hismyc重組體。
pIGF-I/hismyc被HindIII和Xho I酶切，樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察各克隆釋放出350bp的片段，說明pcDNA3.0插入了350bp的外源基因，經測序證明插入序列正確。
1..1.2 prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc表達載體的構建以pIGF-I/hismyc為模板，上游引物5’CGG GAT CCT CGG ACC GGAGAC GCT CTG 3’(含有BamHI位點)；下游引物為5’CGC TCG AGA GCTGAC TTG GCA GGC 3’(含有XhoI位點)。將擴增的PCR產物以BamHI和XhoI酶切，將酶切產物(約210bp)分別與被同樣酶切的prGH/PEX/hismyc、pIg/PEX/hismyc、pM9/PEX/hismyc相連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，得到prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc重組體。
prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc被BamHI和Xho I酶切后，樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察各克隆釋放出210bp片段，說明pcDNA3.0插入了210bp的外源基因，經測序證明插入序列正確。
1.1.3IGF-I前肽表達載體pIGF-Ipre/hismyc的構建以IGF-I的cDNA為模板，上游引物5’GGAAGC TTA TGG GAA AAA TCAGCA G 3’(含有HindIII位點)；下游引物為5’GCC TCG AGC ATC CTG TAGTTC TTG TTT CC 3’(含有XhoI位點)。將擴增的PCR產物以HindIII和XhoI酶切，將酶切產物(約460bp)與被同樣酶切的pIg/PEX/hismyc相連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，得到pIGF-Ipre/hismyc重組體，插入片段編碼48個氨基酸的信號肽和70個氨基酸的成熟肽及35個氨基酸的E-DOMAIN。
pIGF-Ipre/hismyc被HindIII和Xho I酶切，樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察各克隆釋放出約460bp的片段，說明pcDNA3.0插入了460bp的外源基因，經測序證明插入序列正確。
1.1.4prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc、pM9/IGF-Ipre/hismyc表達載體的構建以pIGF-I/hismyc為模板，上游引物5’CGG GAT CCT CGG ACC GGA GACGCT CTG 3’(含有BamHI位點)；下游引物為5’GCC TCG AGC ATC CTG TAGTTC TTG TTT CC 3’(含有XhoI位點)。將擴增的PCR產物以BamHI和XhoI酶切，將酶切產物(約315bp)分別與被同樣酶切的prGH/PEX/hismyc、pIg/PEX/hismyc、pM9/PEX/hismyc相連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆，得到prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc、pM9/IGF-Ipre/hismyc重組體。
prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc被BamHI和Xho I酶切，樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察各克隆均釋放出315bp片段，說明pcDNA3.0插入了315bp的外源基因，經測序證明插入序列正確。
1.2 RT-PCR半定量細胞內目的基因mRNA表達水平1.2.1瞬時轉染QM7細胞內PEX mRNA表達水平PEX的表達載體prGH/PEX/hismyc、pIg/PEX/hismyc和pM9/PEX/hismyc瞬時轉染QM7細胞后6h，提取細胞總RNA，以逆轉錄的cDNA為模板，反應體系中同時加入PEX和GAPDH的引物進行PCR擴增，擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在近500bp和600bp處均出現特異條帶，分別與GAPDH和PEX的分子量大小相符。PCR產物純度較高，無明顯非特異條帶。運用AlphaImagerTM2200凝膠成像系統控制的AlphaEaseTM獨立軟件包照相、進行密度掃描半定量比較PEX片段和內對照GAPDH產物的含量。結果顯示三種載體轉染后6h QM7細胞中PEX和GAPDH光密度的比值沒有差異，說明帶有不同信號序列的PEX的表達載體瞬時轉染后PEX的mRNA水平沒有差別。
1.2.2瞬時轉染后QM7細胞內IGF-I的mRNA表達水平IGF-I的表達載體pIGF-I/hismyc、prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc和pM9/IGF-I/hismyc瞬時轉染QM7細胞后6h，提取細胞總RNA，以逆轉錄的cDNA為模板，反應體系中同時加入IGF-I和GAPDH的引物進行PCR擴增，擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在近500bp和200bp處均出現特異條帶，分別與與GAPDH和IGF-I的分子量大小相符。PCR產物純度較高，無明顯非特異條帶。運用AlphaImagerTM2200凝膠成像系統控制的AlphaEaseTM獨立軟件包照相、進行密度掃描半定量比較對IGF-I片段和內對照和GAPDH產物的含量。結果顯示三種載體轉染后6h QM7細胞中IGF-I和GAPDH光密度的比值沒有差異，說明不同載體瞬時轉染后IGF-I的mRNA水平沒有差別。
1.2.3瞬時轉染后QM7細胞內IGF-Ipre的mRNA表達水平IGF-Ipre的表達載體pIGF-Ipre/hismyc、prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc瞬時轉染QM7細胞后6h，提取細胞總RNA，以逆轉錄的cDNA為模板，反應體系中同時加入IGF-Ipre和GAPDH的引物進行PCR擴增，擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在近500bp和300bp處均出現特異條帶，分別與與GAPDH和IGF-Ipre的分子量大小相符。PCR產物純度較高，無明顯非特異條帶。運用AlphaImagerTM2200凝膠成像系統控制的AlphaEaseTM獨立軟件包照相、進行密度掃描半定量比較對IGF-Ipre片段和內對照和GAPDH產物的含量。結果顯示三種載體轉染后6h QM7細胞中IGF-Ipre和GAPDH光密度的比值沒有差異，說明不同載體瞬時轉染后IGF-Ipre的mRNA水平沒有差別。
1.3測定蛋白含量1.3.1細胞培養上清中PEX蛋白的檢測PEX的表達載體prGH/PEX/hismyc、pIg/PEX/hismyc和pM9/PEX/hismyc及載體pcDNA3.0瞬時轉染QM7細胞后48h，取細胞培養基5μl SDS-PAGE電泳后，用PEX抗體進行Westem雜交分析，結果如圖2所示(圖中顯示載體條帶1，pM9/PEX；條帶2，pIg/PEX；條帶3，prGH/PEX；條帶4，pcDNA3.0)，三種PEX載體轉染后的細胞培養基中均可檢測到約26KD的陽性條帶，與理論推導的PEX分泌蛋白的分子量吻合，空載體轉染的培養基內未檢測到條帶。其中以pM9/PEX/hismyc的條帶信號最強，提示三種信號肽均可有效引導PEX蛋白分泌，MMP9的信號肽引導蛋白分泌的效率最高。
1.3.2細胞培養上清中IGF-I蛋白的檢測人IGF-I的四種表達載體pIGF-I/hismyc、prGH/IGF-I/hismyc、pIg/IGF-I/hismyc和pM9/IGF-I/hismyc及載體pcDNA3.0瞬時轉染QM7細胞后48h，取細胞培養基5μl用myc抗體進行Westem雜交分析，結果如圖3所示(圖中顯示載體條帶1，pcDNA3.0；條帶2，prGH/IGF-I/hismyc；條帶3，pIg/IGF-I/hismyc；條帶4，pM9/IGF-I/hismyc；條帶5，pIGF-I/hismyc)，IGF-I載體轉染后的細胞培養基中均可檢測到約7.7KD的陽性條帶，與理論值一致。空載體轉染的培養基內未檢測到條帶。其中以pM9/IGF-I/hismyc的條帶信號最強，prGH/IGF-I/hismyc的條帶信號其次，提示四種信號肽均可有效引導IGF-I蛋白分泌，MMP9的信號肽引導蛋白分泌的效率最高。
1.3.3細胞培養上清中IGF-Ipre蛋白的檢測取人IGF-I前肽的四種載體pIGF-Ipre/hismyc、prGH/IGF-Ipre/hismyc、pIg/IGF-Ipre/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc及載體pcDNA3.0瞬時轉染QM7細胞后48h的細胞培養基5μl用myc抗體進行Western雜交分析，結果顯示IGF-Ipre載體轉染后的細胞培養基中均可檢測到約14.9KD左右有陽性條帶，與預測的分子量一致。其中也以pM9/IGF-Ipre/hismyc的條帶信號最強。空載體轉染的培養基內未檢測到條帶。
綜上所述，首先用融合有以上不同信號序列的PEX表達載體瞬時轉染QM7細胞，比較三種信號序列的分泌效率，篩選最佳引導外源蛋白分泌的信號序列。Western雜交分析表明，三種信號肽均成功引導PEX蛋白分泌到細胞上清中，以融合有MMP-9信號肽的載體信號最強。為了驗證信號序列引導其它外源蛋白分泌的通用性，以IGF-I和IGF-I前肽和不同信號序列的表達載體轉染QM7細胞，Westem雜交檢測它們引導IGF-I和IGF-I前肽的分泌效率，結果與PEX相同。由于轉染后6h，RT-PCR檢測細胞內外源基因的mRNA水平，結果顯示融合不同信號序列的載體mRNA水平沒有差異，提示上清中重組蛋白含量的差異確實是分泌效率不同所引起的，并不是表達量的不同所引起。以上結果顯示三種信號肽均可成功引導不同的外源蛋白分泌，其中MMP-9的信號肽引導外源蛋白分泌效率最高。
實施效果例2、QM7表達體系的優越性2.1瞬時轉染后QM7與COS7表達體系的比較2.1.1兩種細胞培養上清中蛋白含量的比較pM9/PEX/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc載體瞬時轉染COS7和QM7細胞后48h，取培養上清進行ELISA蛋白定量，結果表明，QM7上清中三種蛋白的含量分別為PEX，2.4mg/L；IGF-I，4.3mg/L；IGF-I前肽3.7mg/L。COS7上清中三種蛋白的含量分別為PEX，1.6mg/L；IGF-I，2.6mg/L；IGF-I前肽2.2mg/L。QM7上清中蛋白產量大約為COS7的1.5倍。
2.2.2兩種細胞裂解液中蛋白含量的比較pM9/PEX/hismyc、pM9/IGF-I/hismyc和pM9/IGF-Ipre/hismyc載體瞬時轉染COS7和QM7細胞后48h，取細胞裂解液進行ELISA蛋白定量，結果表明，QM7細胞裂解液中三種蛋白的含量分別為PEX，0.9mg/L；IGF-I，1.4mg/L；IGF-I前肽1.3mg/L。COS7上清中三種蛋白的含量分別為PEX，1.95mg/L；IGF-I，2.4mg/L；IGF-I前肽2.0mg/L。COS7細胞裂解液中蛋白含量均高于COS7。
2.2穩定表達PEX的QM7與COS7細胞系的比較2.2.1Western印跡檢測目的蛋白pM9/PEX/hismyc載體瞬時轉染后的QM7與COS7細胞用G418篩選得到穩定表達PEX的細胞系，細胞匯片換培養基后48h，取細胞培養基5μlSDS-PAGE電泳后，用PEX抗體進行Western雜交分析，兩種細胞培養基中均可檢測到約26KD的陽性條帶，與理論推導的PEX分泌蛋白的分子量吻合。QM7的PEX含量明顯高于COS7。
2.2.2ELISA檢測PEX含量pM9/PEX/hismyc載體瞬時轉染后的QM7與COS7細胞用G418篩選得到到陽性克隆的細胞POOL，細胞匯片換培養基后48h，采用ELISA檢測細胞培養基中PEX蛋白的含量。QM7細胞上清蛋白含量約3.6mg/L；COS7細胞上清蛋白含量約1.6mg/L。
綜上所述，COS7細胞中蛋白表達量高于QM7而蛋白分泌量低于QM7，可能是因為存在蛋白分泌的瓶頸問題。清除這個瓶頸問題的關鍵在于新宿主細胞類型的篩選。通過和COS7表達體系的比較發現，QM7引導蛋白分泌的效率高于COS7，提示QM7細胞內用于蛋白成熟和分泌的組分優于COS7。
實施效果例3、QM7細胞分化培養條件的優化本文配制了含胰島素3μg、5μg/ml的M199培養基、含0.5％血清的M199傳統分化培養基和用于CHO細胞培養的CHO-S-SFM II無血清培養基。從形態學和生化學兩方面比較它們對QM7分化的影響。Giemsa染色結果表明，含胰島素3μg、5μg/ml的M199培養基和含0.5％血清的M199培養基均可以促進細胞分化融合形成肌管，在時相和分化程度上沒有顯著差別。肌酸激酶CK是肌細胞特有的酶，隨分化程度增高活性增強，檢測結果表明CK活性和形態學指標變化一致。進一步證實含胰島素的M199培養基可以促進細胞分化。含3μg/ml insulin的培養基促細胞分化程度和含5μg/ml insulin的培養基沒有明顯差別，因此可以選用含3μg/ml insulin的無血清分化培養基培養細胞，從而使后續純化工作簡單易行，同時又防止了外源蛋白的污染，為細胞作為表達體系提供了優化的培養體系。
實施效果例4、QM7表達體系可用于Pull-Down檢測蛋白間相互作用的檢測對于研究蛋白功能非常重要，而這有賴于蛋白的結構和生物活性。為了驗證QM7表達體系用于Pull-Down檢測的可行性，我們以編碼SV40大T抗原和小鼠p53蛋白的載體轉染QM7細胞，利用Pull-Down技術檢測細胞上清中二者的結合情況。
材料和方法1.載體構建1.1p53-his-pcDNA3的構建以酵母雙雜交的質粒pVA3(Matchmaker yeast two-hybrid system，Clontech)為模板，上游引物為5’CGGGATCC(BamH I)CTGTCACCGAGACCCC 3’；下游引物為5’CGTCTAGA(XbaI)GTCTGAGTCAGGCCCC 3’進行PCR擴增，得到的PCR產物編碼小鼠p53蛋白(a.a.72-390)。PCR產物以BamH I和XbaI酶切，與同樣酶切的pM9/PEX/hismyc載體連接，得到p53/his/pcDNA3，編碼C末端融合6xHis的小鼠p53蛋白。
1.2T-myc-pcDNA3的構建以酵母雙雜交的質粒pTD 1(Matchmaker yeast two-hybrid system，Clontech)為模板，上游引物為5’CGGGATCC(BamH I)GTGGAACTGATGAATGGGAGC 3’；下游引物為5’GGCTCGAG(XhoI)TGTTTCAGGTTCAGGGGGAG3’，進行PCR擴增，得到的PCR產物編碼SV40大T抗原(a.a.86-708)。PCR產物以BamH I和XhoI酶切，與同樣酶切的pM9/PEX/hismyc載體連接，得到T/hismyc/pcDNA3。再以T/hismyc/pcDNA3為模板，利用大T抗原的上游引物和引物5’GCGGGCCC(ApaI)TATCTAGA(XbaI)CAAGTCCTCTTCAG3，，進行PCR擴增的產物以BamH I和ApaI酶切，與同樣酶切的pM9/PEX/hismyc載體連接，得到T/myc/pcDNA3，編碼C末端融合myc的SV40大T抗原。
2.Pull-Down檢測p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3分別轉染和共轉染QM7細胞，基因轉染采用脂質體lipofectamine(GIBCO/BRL)。轉染后48h收集細胞上清，離心15000r，4oC，10min去除細胞沉淀，取1ml上清中加入Ni-NTA agrose(QIAGEN)20ul室溫振蕩2h后離心棄上清，沉淀用洗液洗三遍后加入咪唑洗脫液40ul振蕩1min，離心吸取上清做SDS-PAGE分析及Western印跡。一抗為抗myc的兔抗血清(11000稀釋)，室溫孵育1hr，II抗(HRP-Goat&rabit1∶40000稀釋)，室溫孵育1h。TTBS洗膜后，加入ECL化學發光試劑(Pharmacia公司)，曝光，沖片。
結果1.SDS-PAGE檢測SDS-PAGE結果表明p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3共轉染QM7的細胞上清與Ni-NTA agrose孵育后，洗脫液中有35KD和70KD左右的兩種分子量的蛋白，分別與p53和大T抗原的分子量相符；p53/his/pcDNA3轉染QM7的細胞上清與Ni-NTA agrose孵育后，洗脫液中有只有35KD分子量的蛋白，與p53分子量相符；T/myc/pcDNA3轉染QM7的細胞上清與Ni-NTA agrose孵育后，洗脫液中沒有這兩種分子量的蛋白。結果如圖4所示(圖中顯示載體條帶1，T/myc/pcDNA3；條帶2，p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3；條帶3，p53/his/pcDNA3)。
2.Western印跡分析Western印跡結果表明p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3共轉染QM7的細胞上清與Ni-NTA agrose孵育后的洗脫液中可檢測到分子量約70KD的蛋白，與預期的大T抗原的分子量相符；p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3分別轉染QM7的細胞上清與Ni-NTA agrose孵育后，其洗脫液中均未見陽性蛋白條帶。結果如圖5所示(圖中顯示載體條帶1，T/myc/pcDNA3；條帶2，p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3；條帶3，p53/his/pcDNA3)。
綜上所述，已知SV40大T抗原可以和小鼠p53蛋白結合(Li，B.and S.Fields.1993.Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40large T antigen by using the yeast twohybrid system.FASEB J.7957-963.)，本實驗構建的質粒使p53蛋白C端融合6xHis，大T抗原C端融合myc標簽。由于p53蛋白C端融合6xHis因此可以與Ni-NTA agrose結合從而作為bait蛋白，大T抗原為prey蛋白。SDS-PAGE結果表明p53/his/pcDNA3和T/myc/pcDNA3共轉染QM7的細胞上清與Ni-NTA agrose孵育后，洗脫液中有35KD和70KD左右的兩種分子量的蛋白，分別與p53和大T抗原的分子量相符；Western印跡結果表明在70KD處有陽性條帶。以上結果證實以QM7作為宿主細胞時，MMP9的信號序列可以引導SV40大T抗原和小鼠p53蛋白成功分泌至細胞培養液中，并且其具備生物活性，二者可以相互作用結合，驗證了QM7表達體系用于Pull-Down檢測的可行性。
序列表<110>北京市腫瘤防治研究所<120>一種體外培養骨骼肌表達體系<130>ZBC1F050229<160>1<210>1<211>57<212>DNA<213>人<400>1atgagcctct ggcagcccct ggtcctggtg ctcctggtgc tgggctgctg ctttgct5權利要求
1.一種體外培養骨骼肌表達體系，主要包括含目的基因的表達載體的構建、表達載體轉染宿主細胞群及篩選、目的基因在宿主細胞中的表達和表達產物的分離純化、表達產物的活性檢測的步驟，其特征在于所述的表達載體是在pcDNA3.0基礎上，構建的帶有myc10檢測標簽及6×his純化標簽的表達載體；且在所述的表達載體中插入人基質金屬蛋白酶9(MMP-9)信號序列(見序列1)。
2.根據權利要求1所述的一種體外培養骨骼肌表達體系，其特征在于在表達PEX的載體的N端的HindIII和BamH I位點之間插入所述的信號序列，在C末端XhoI位點處融合有myc10肽抗原標簽和6×his純化標簽的編碼序列。
3.根據權利要求1所述的一種體外培養骨骼肌表達體系，其特征在于所述的真核表達載體用以表達基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)C末端片段PEX基因重組蛋白。
4.根據權利要求1所述的一種體外培養骨骼肌表達體系，其特征在于所述的真核表達載體用以表達人胰島素樣生長因子I(IGF-I)。
5.根據權利要求1-4任一權利要求所述的一種體外培養骨骼肌表達體系，其特征在于所述的宿主細胞是QM7細胞。
6.根據權利要求5所述的一種體外培養骨骼肌表達體系，其特征在于在轉染宿主細胞及純化目的蛋白時，使用含3～5μg/ml insulin的無血清分化培養基培養宿主細胞。
7.根據權利要求6所述的一種體外培養骨骼肌表達體系，其特征在于所述的無血清分化培基是M199培養基。
8.根據權利要求6所述的一種體外培養骨骼肌表達體系，其特征在于在轉染宿主細胞及純化目的蛋白時，使用含3μg/ml insulin的無血清M199分化培養基培養宿主細胞。
9.根據權利要求5所述的一種體外培養骨骼肌表達體系，其特征在于所述的表達體系用于外分泌表達二種蛋白以檢測相互間的作用。
全文摘要
本發明涉及了一種體外培養骨骼肌表達體系，包括含目的基因的表達載體的構建、表達載體轉染宿主細胞群及篩選、目的基因在宿主細胞中的表達和表達產物的分離純化等步驟，其特征在于所述的表達載體是在pcDNA3.0基礎上，構建的帶有myc10檢測標簽及6×his純化標簽的表達載體；且在所述的表達載體中插入人基質金屬蛋白酶9(MMP－9)信號序列。本發明在表達載體中插入了基質金屬蛋白酶9(MMP－9)信號序列，增大了蛋白的分泌量；采用了QM7細胞作為宿主細胞表達蛋白，增大了蛋白的表達量；篩選出適合QM7細胞分化的無血清分化培養基，培養基造價低并且利于后期純化工作，且為PEX作為重組蛋白藥物進行大規模生產奠定了前期基礎。
文檔編號C12N15/65GK1724677SQ20051008435
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月19日 優先權日2005年7月19日
發明者張志謙, 宋琳 申請人:北京市腫瘤防治研究所