專利名稱：一種骨骼肌特異性MYHC-II b啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子遺傳學領域，具體涉及了ー種骨骼肌特異性表達基因5'調控區特異性MYHC-II b啟動子及其在轉基因豬中的應用。
背景技術：
真核生物基因表達的時間和水平嚴格按照發育順序進行。某些特定基因表達模式的調節能夠引起轉錄因子與相關元件的特異性結合，成為轉錄起始的關鍵步驟，并最終導致基因的時間和空間表達。編碼組織特異蛋白的系列家族基因嚴格按照組織特異性和發育階段性表達，為基因表達調控機制提供了很好的研究模式。在轉基因動物中，獲得能廣泛應用的特異性啟動子顯得非常重要。但啟動子的特異性由多個元件控制，在不同種類和不同發育時期起關鍵作用的調控元件并不相同，調控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復雜。因此要使外源基因能夠在動物組織中特異高效地表達，必須構建ー個可以特異高效表達的動物表達載體，其中啟動子的選擇是重要的條件之一。肌球蛋白(myosin)是ー組肌肉和非肌肉細胞收縮裝置中的蛋白質，具有ATP酶活性。重鏈的大部分是a螺旋，其頭部具有ATP酶活性，并與肌動蛋白結合，而輕鏈具有激酶活性。肌肉中的肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成単位。頭部具有ATP酶活性，屬于可與肌動蛋白絲相互作用的馬達蛋白質；肌球蛋白也是肌肉的主要組成蛋白質，占肌原纖維總蛋白質的60%。豬的骨骼肌肌球蛋白重鏈基因MYHC-I、MYHC-II a、MYHC_II b、MYHC_II x都位于12號染色體。其中MYHC-II b由38個外顯子和37個內含子組成，編碼1937個氨基酸。通過克隆該基因啟動子區并在體外分析其啟動特性，利用相關序列構建骨骼肌特異性表達載體是ー種有效的方法，但是上述的研究均還處在起步階段，對于轉基因豬的培育和品質提高均沒有起到較好的促進作用。
發明內容
基于上述的原因，本發明的發明人經過研究發現豬骨骼肌肌球蛋白重鏈基因MYHC-II b基因5'調控區具有骨骼肌特異性啟動特性，并利用這ー特性設計了ー種骨骼肌特異性MYHC-II b啟動子載體，該啟動子可以在轉基因豬的培育中應用。該啟動子載體具有骨骼肌特異性啟動特性，而在除骨骼肌外的多種細胞中均無啟動活性，可見該啟動子在骨骼肌中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達的要求，為轉基因載體提供了ー種重要的元件。本發明所提供的骨骼肌特異性表達基因5'調控區特異性啟動子，其基因序列如Seq ID No 1 所示；除了上述的啟動子之外，還可以是該啟動子變體或者片段，但均具有如Seq IDNo I所不的基因序列。“變體”是指對豬骨骼肌MYHC-II b啟動子Seq ID No : I序列進行ー個或者多個堿基的任何取代、變異、修飾、替換、缺失或者添加所產生的序列，該序列仍然表現出類似于Seq ID No :1DNA序列的活性。“片段”是指基本豬骨骼肌MYHC-II b啟動子Seq ID No :1序列的一個或者多個區域，其仍然類似于基本DNA序列的活性。具有上述序列的啟動子或其變體，或者片段，具有骨骼肌特異性啟動特性，而在骨骼肌之外的多種細胞中均無啟動活性，可見該基因啟動子在骨骼肌中特異性地啟動下游基因的表達，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達的要求，并能應用于轉基因豬的培育中。應用上述的啟動子時，一般采用重組核酸序列，該序列中含有上述的啟動子或其變體，或者片段，這樣就可以使啟動子下游的目的基因在骨骼肌中特異性表達，作為分析、開發、改造骨骼肌特性的研究模型。還可以利用已有的分子生物學操作技術獲得包含目的 基因的重組核酸，通過顯微注射等基因導入技術獲得轉基因胚胎，用于建立轉基因動物。重組核酸序列中的目的基因，含有下列的至少ー種功能基因，主要包括提高肌肉品質基因，カロ快生長速度基因，抗病基因，提聞詞料報酬的基因以及生廣特定藥物的基因，這樣就可以在獲得骨骼肌特異性啟動特性之外，提高該重組核酸序列的性能，為轉基因豬的培育提供更多的功能性方向，増加其附加產值，如將去飽和脂肪酸酶基因在該啟動子指導下表達可以特異性提高骨骼肌中不飽和脂肪酸的含量，提高肉品營養價值。在獲得了上述的重組核酸序列之后，還可以用其建立特殊的表達系統，以便更好的應用于轉基因豬的培育過程中。將目的基因重組至該啟動子下游，通過基因轉入技術使調控區與目的基因共同整合進染色體中，獲得轉基因動物，在該啟動子作用下目的基因僅在骨骼肌中表達，在其他組織器官中不表達，降低目的基因對動物的影響，提高轉基因的效果。本發明主要通過報告基因分析確定該啟動子的啟動特征。首先獲得無啟動子紅色熒光蛋白載體。然后通過PCR或者基因捕獲等技術獲得骨骼肌中特異性表達的豬骨骼肌肌球蛋白重鏈II b型5'調控區，長度為2. lkb，插入紅色熒光蛋白上游，得到啟動子報告基因分析載體，將CMV啟動子(589 bp)連入空載體中作為陽性對照，空載體為陰性對照。質粒去內毒素后，轉染C2C12小鼠成肌細胞系，同時轉染H9c2大鼠心肌細胞和豬腎上皮細胞系PK15為對照，轉染24h后更換含馬血清的誘導培養基至成肌細胞，誘導細胞分化融合，48h后用倒置熒光顯微鏡觀察紅色熒光蛋白表達情況，分析啟動子特性。其中之所以選擇CMV連入的空載體中作為陽性對照，主要是因為CMV為已知公認的強啟動子，將強啟動子連入無啟動子的載體上游可以啟動報告基因RFP的表達，該載體轉染入細胞作為陽性對照，可以證明實驗中所用的細胞以及轉染試劑、轉染技術等不存在問題，證明明性對照無RFP表達是由于沒有啟動子的存在，而不是其他因素造成。進而更有力的證明連入實驗啟動子的載體轉入細胞后啟動RFP的表達是因為該啟動子的作用。與現有技術相比，本發明選用了獨特的載體DsRed載體(商業載體全稱為pDsRed-Express2-lvector),以適應本發明所米用的報告基因RFP(紅色突光蛋白)，同時本發明為MYHC-II b特別設計了引物、啟動子序列以及酶切位點等供研究使用，均具有獨特的代表性，因此與現有的骨骼肌特異性啟動子相比，本發明的技術具有明顯的不同和顯著的進步和針對性。當上述的啟動子，或者重組核酸序列或者表達系統被應用到轉基因豬的培育中后，可以有效的提高培育的效果，且通過添加各種功能性基因，使得轉基因豬可以獲得更好的肌肉品質，更高的生長速度，更好的抗病性以及降低飼養成本，還可以在特定藥物的生產中得到更為廣泛的應用，對于該領域的研究有著很好的參考價值。
圖I為MYHC-II bF和MYHC-11 bR引物PCR擴增MYHC-11 b啟動子片段電泳圖，圖中泳道I為PCR產物，M為MassRuler Maker ；圖2為無啟動子的DsRed載體圖譜；圖3為轉染MYHC-II b promoter DsRed 48h小鼠C2C12細胞照片灰度圖，圖中左側為40倍光鏡下照片，細胞狀態良好；右側為綠光激發下照片，可見RFP表達，MYHC-II b promoter有啟動活性；圖4為轉染MYHC-II b promoter DsRed 48h大鼠心肌H9c2細胞照片灰度圖，圖中左側為40倍光鏡下照片，細胞狀態良好；右側為綠光激發下照片，無RFP表達，MYHC-II b promoter無啟動活性；圖5為轉染CMV Promoter DsRed 48h豬心細胞照片灰度圖，圖中左側為40倍光鏡下照片，細胞狀態良好；右側為綠光激發下照片，可見RFP表達，轉染技術有效；圖6為轉染MYHC-IIb promoter DsRed 48hPK15豬腎細胞照片灰度圖，圖中左側為40倍光鏡下照片，細胞狀態良好；右側為綠光激發下照片，無RFP表達，MYHC-II b promoter無啟動活性；圖7為轉染CMV Promoter DsRed 48hPK15豬腎細胞照片灰度圖，圖中左側為40倍光鏡下照片，細胞狀態良好；右側為綠光激發下照片，可見RFP表達，轉染技術有效。
具體實施例方式在本說明書的上下文中，除非特別指明否則本說明書所用的任何術語具有本領域技術人員在本領域中通常理解的含義，而未注明詳細條件的實驗方法是按照常規試驗方法或按照供應商所建議的操作說明書進行的。實施例I啟動子報告基因載體的構建基因組提取取大約克夏豬耳組織,按照TIANamp genomic DNA (天根)試劑盒說明書進行基因組DNA提取。無啟動子的DsRed載體作為陰性對照；以DsRed為骨架用Sma I (Fermentas)酶切，回收4107bp片段，得到無啟動子片段。將完整的CMV啟動子正向連入該載體中，得到該載體的陽性對照載體。將包含陰性對照和陽性對照載體的菌液按照I : 500的比例分別接種至含卡那霉素100 Ii g/ml LB培養基中,200rpm劇烈搖晃14h。4°C 6000g收集菌體至50ml離心管中，用于無內毒素質粒提取，具體操作按照EndoFree Plasmid Maxi (QIAGEN)說明書進行,純化得到的質粒A260/280在I. 8-1. 9之間。根據NCBI (Gene ID :100144306)設計如下引物，MYHC-II bF 基因序列如 Seq IDNo 2所示，MYHC-II bR基因序列如Seq ID No 3所示,它包含了從轉錄起始位點下游8bp到上游2090bp的范圍。
權利要求
1.ー種骨骼肌特異性MYHC-IIb啟動子，其特征在干該啟動子的基因序列如Seq IDNo 1所示。
2.一種重組核酸序列，其特征在干序列中包含有基因序列如Seq ID No : I所示的啟動子或者該啟動子的變體，或者片段。
3.根據權利要求2所屬的重組核酸序列，其特征在于序列中還包含有至少ー種功能基因，所述功能基因包括提聞肌肉品質基因或加快生長速度基因或抗病基因或提聞詞料報酬的基因或生產特定藥物的基因或其組合。
4.ー種表達系統，其特征在于包含有如權利要求2或3所述的重組核酸序列。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及一種骨骼肌特異性MYHC-IIb啟動子及其應用，特別提供了一種骨骼肌特異性表達基因5′調控區特異性啟動子及其在轉基因豬中的應用，該啟動子只在骨骼肌中具有啟動特性，而在除骨骼肌外的多種細胞中均無啟動活性，可見該基因啟動子只在骨骼肌中特異性地啟動下游基因的表達，因此能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達的要求，為通過轉基因技術來提高豬肉的品質提供了一種重要的元件。
文檔編號C12N15/113GK102649960SQ201210171830
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月29日 優先權日2012年5月29日
發明者姜運良, 季相山, 康麗, 張旭, 王鵬飛 申請人:山東農業大學