專利名稱：柴油食烷菌及其降解酶系的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，具體地說是涉及一新種食烷菌。
背景技術：
柴油是各種輪船的燃料油，它主要是由直鏈烷烴、支鏈烷烴、環烷烴以及少量的芳香烴組成的混合物。目前全世界各國有近8萬艘遠洋商船穿梭于全球各港口，它們在航行期間向海洋排放的油污每年可達百萬噸以上。另外，海上溢油事故近年來在各地也頻繁發生，海洋油污染已嚴重威脅到海洋生態環境的安全。
海洋溢油將經歷溶解、揮發、光化學氧化分解、吸附與沉降以及生物降解等一系列過程。其中，生物降解是徹底消除油污的最重要途徑，而利用微生物降解作用來主動清除溢油的生物修復技術是當今一種非常重要的環境生物技術。其中，食烷菌是海洋中一類非常重要的石油降解優勢菌。在本發明被公布之前，尚沒有任何人公開過本申請中涉及的柴油食烷菌。本發明將可能為石油烴類污染生物修復提供重要的菌種。
發明內容
本發明提供了一種能夠用于石油烴類污染生物修復的新的微生物—柴油食烷菌。其命名為柴油食烷菌Alcanivorax dieselollei(die.sel.o′le.i，N.L.masc.n.dieseliuslatinized family name of Rudolf Diesel，L.gen.neut.n.olei of oil，N.L.gen neut.n.dieselolei of diesel oil，the sole carbon source used in the isolation procedure of thisstrain)。其保藏登記號為CCTCC NOM205024。
本發明所述的柴油食烷菌系由東太平洋深海結核區站點A(7°13′46″N，153°52′19″W，5027米深)的底泥采集，在實驗室中分離培養獲得。
本發明所述的微生物為0.8-2.0μm長、0.3-0.7μm寬，叢生鞭毛，不產孢子的葛蘭氏陰性桿菌。在NaCl濃度為3％的LB瓊脂培養基上28℃培養3天能夠形成特征性的菌落形態微小、無色、半透明、中央突起、邊緣帶有不規則且透明的暈環。吐溫酶、催化酶和氧化酶陽性，酯酶、精氨酸雙水解酶、淀粉酶和白明膠酶陰性。能夠把硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。對多粘菌素B敏感。不能利用糖類。能夠利用以下碳源吐溫40、吐溫80、甲基丙酮酸、單甲基琥珀酸、p-羥基乙酸苯酯、乙酸、檸檬酸、乳酸、β-羥基丁酸、γ-羥基丁酸、丙酸和2，3-丁二醇。能夠很好利用的碳源有烷烴、檸檬酸、p-羥基乙酸苯酯、丙酮酸和乳酸。能夠利用碳鏈長度5C～36C的直鏈烷烴，在8C～28C中生長迅速。主要的脂肪酸是C16:0，C18:1 ω7c，C16:ω7c，C19:0 cyclo ω8c，C12:0和C12:0 3OH。
表1為本發明所述柴油食烷菌與現存的同屬其它種的區別。
圖1為本發明所述柴油食烷菌的透射電子顯微鏡照片。圖的下半部分中，箭頭所指示的是叢生鞭毛。
具體實施例方式
下列實施例旨在進一步闡明本發明，而不是對本發明之范圍的限定。
實施例柴油食烷菌NO1A的分離從東太平洋結核區站點A采集深海底泥表層土樣，在實驗室中按下列條件培養即可獲得本發明所述的柴油食烷菌NO1A。
人工海水培養基NaCl＝24g/L；MgSO4·7H2O＝7.0g/L；NH4NO3＝1g/L；KCl＝0.7g/L；KH2PO4＝2.0g/L；Na2HPO4＝3.0g/L，pH7.4，滅菌后補加適量微量元素混合液，并補以柴油作為唯一碳源。柴油及微量元素經0.22μM濾膜過濾除菌。將土樣接種于柴油含量1％(v/v)的100mL人工海水培養集中。28℃、200r/min搖床培養4～5天后，從培養液中取出1mL轉入100mL新鮮培養基中。如此富集6次后，將最終的富集物梯度稀釋、涂布平板，28℃培養48小時后分離、純化單菌落。
SEQ ID N0.1為本發明所述柴油食烷菌的16S rDNA序列。本領域內的普通技術人員可以理解到，從其它環境樣品中也可能分離到基本同樣的微生物。這些16S rDNA序列與SEQ ID No.1中核苷酸序列同源性至少達98％或者DNA-DNA雜交相關性達到70％以上的微生物亦應視為屬于本發明范圍之內。
表1
序列表SEQ ID No.1的信息(1)序列特征(A)長度1504bp(B)類型核酸(C)拓撲結構線性(2)分子類型tDNA(3)序列描述SEQ ID No.11AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG ATTGAACGCT GGCGGCAGGC CTAACACATG CAAGTCGAGC61 GGAAACGATG GGAGCTTGCT CCCAGGCGTC GAGCGGCGGA CGGGTGAGTA ACACGTGGGA121 ATCTGCCCAT TAGTGGGGGA TAACTCGGGG AAACTCGAGC TAATACCGCA TAATCCCTAC181 GGGGGAAAGC AGGGGATCTT CGGACCTTGC GCTGATGGAT GAGCCCGCGT CGGATTAGCT241 TGTTGGTGGG GTAATGGCCC ACCAAGGCGA CGATCCGTAA CTGGTCTGAG AGGATGGCCA301 GTCACACCGG GACTGAGACA CGGCCCGGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATCTTG361 GACAATGGGC GCAAGCCTGA TCCAGCCATG CCGCGTGTGT GAAGAAGGCC TTCGGGTTGT421 AAAGCACTTT CAGTAGGGAG GAAGGCTTTG GGCTAATACC CTGGAGTACT TGACGTTACC481 TACAGAAGAA GCACCGGCTA ATTTCGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGAA AGGTGCGAGC541 GTTAATCGGA ATTACTGGGC GTAAAGCGCG CGTAGGCGGT GTGTTAAGTC GGATGTGAAA601 GCCCAGGGCT CAACCTTGGA ATTGCATCCG ATACTGGCAC GCTAGAGTGC AGTAGAGGGA661 GGTGGAATTT CCGGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATCG GAAGGAACAC CAGTGGCGAA721 GGCGGCCTCC TGGACTGACA CTGACGCTGA GGTGCGAAAG CGTGGGGAGC AAACAGGATT781 AGATACCCTG GTAGTCCACG CTGTAAACGA TGTCTACTAG CCGTTGGGGT CCTTAGTGAC841 TTTGGTGGCG CAGCTAACGC GATAAGTAGA CCGCCTGGGG AGTACGGCCG CAAGGTTAAA901 ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGATGCA961 ACGCGAAGAA CCTTACAGGC CTTGACATCC TGCGAACTTT CTAGAGATAG ATTGGTGCCT1021 TCGGGAACGC AGTGACAGGT GCTGCATGGC TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG1081 TTAAGTCCCG TAACGAGCGC AACCCTTGTC CTTAGTTGCC AGCACTTCGG GTGGGAACTC1141 TAGGGAGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAC GACGTCAAGT CATCATGGCC1201 CTTACGGCCT GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGTTGGTAC AGAGGGTTGC GAAGTCGCGA1261 GGCGGAGCTA ATCTCTCAAA GCCAATCGTA GTCCGGATTG GAGTCTGCAA CTCGACTCCA1321 TGAAGTCGGA ATCGCTAGTA ATCGCGGATC AGAATGCCGC GGTGAATACG TTCCCGGGCC1381 TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCATGGGAG TGGATTGCAC CAGAAGTAGT TAGTCTAACC1441 TTCGGGAGGA CGATTACCAC GGTGTGGTTC ATGACTGGGG TGAAGTCGTA ACAAGGTAGC1501 CGTA
權利要求
1.一種烷烴食烷菌，其特征在于命名為柴油食烷菌Alcanivorax dieselolei，其保藏登記號為CCTCC NOM205024。
2.如權利要求1所述的柴油食烷菌，其特征在于其16S rDNA序列與SEQ IDNo.1中的核苷酸序列有至少98％的同源性，或者所述的柴油食烷菌的基因組DNA與菌株CCTCC NOM205024的DNA-DNA雜交相關性達到70％以上。
全文摘要
本發明提供一種來源于深海的新種柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei) NO1ACCTCC NOM205024，其能夠降解碳鏈長度為5C～36C直鏈烷烴。
文檔編號C12N15/31GK1904033SQ20051008589
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月20日 優先權日2005年7月20日
發明者邵宗澤, 劉陳立 申請人:國家海洋局第三海洋研究所