專利名稱：一種連作障礙自毒物質降解菌及其制備的復合微生物肥料的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種連作障礙土壤中自毒物質降解菌改良作物品質的應用，屬于微生物肥料，更具體的說，是涉及一種連作障礙自毒物質降解菌及其制備的復合微生物肥料。
背景技術：
隨著栽培年限的增加，土壤自毒物質累計、次生鹽潰化現象不斷出現并日益加重，嚴重影響了作物的產量和品質，阻礙作物生產的可持續發展。此外，土壤中自毒物質的連年累計使得土壤微生態環境趨于惡性循環。總之，一種可以改善土壤團粒結構，營造有益菌群的連作障礙自毒物質降解菌及其制備的復合微生物肥料尚未見報道。
發明內容
本發明就是針對上述問題，提供了一種連作障礙自毒物質降解菌及其制備的復合微生物肥料。為了實現本發明的上述目的，本發明采用如下技術方案一種自毒物質降解菌的保藏機構為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6896，保藏日期為2012年11月28日，分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，所述自毒物質降解菌的分離方法包括如下步驟(I)菌株的分離采用逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法，將連作10年的番茄根系土壤懸液按10%的接種量接種于含有IOOmg / L苯甲酸的無機鹽培養基中，30°C下搖床150r / min，培養3天后，以10%接種量轉至苯甲酸濃度為300mg / L的無機鹽培養基中，繼續培養。按此方式連續循環3次，三次所用的無機鹽培養基，苯甲酸的濃度依次為300mg / L、600mg / L、IOOOmg / L，然后進行平板涂布，將培養皿放于30°C恒溫培養箱中培養72h，挑取單菌落，轉接入苯甲酸濃度為IOOOmg / L的無機鹽培養基中，反復涂布，得到苯甲酸降解菌菌懸液；所述的無機鹽培養基的組成為(NH4)2SO42g / L7KH2PO4 2g / L，Na2HPO41. 3g /L，苯甲酸100 IOOOmg / L，NaCl 5g / L，余量為水；培養基的ΡΗ=6· 8 7· 2 ;(2)菌株的篩選與鑒定a.初篩將5ml步驟(I)所述的無機鹽培養基加到15mm X 150mm試管中，121 °C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml步驟(I)得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到試管中，每株菌重復2管，28°C下避光培養5天，每24h觀察記錄I次生長情況；b、復篩將50ml步驟(I)所述的無機鹽 培養基加到250ml三角瓶中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml初篩得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到三角瓶中，加入Iml無菌水，每處理重復3次，28 V下避光培養10天，檢測苯甲酸殘留量，同時設立空白對照組，空白對照組中用水代替無菌水，計算降解率。
c.鑒定對復篩獲得的菌株進行16SrDNA序列測定，采用通用引物進行PCR擴增，反應總體系為，取PCR產物Iul進行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測.用瓊脂糖凝膠純化試劑盒(購自大連寶生物公司)切膠回收PCR產物進行測序分析，菌株的16SrDNA序列測序結果登錄GenBank,并用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進行同源性比較，將得到的相似菌株的16SrDNA，利MEGA4. O軟件，構建系統發育樹，分析各分離菌株的進化地位。復合微生物肥料由重量比為2 3 :7 8的復合微生物菌劑和腐植酸氨組成。所述的復合微生物菌劑的制備方法為，將自毒物質降解菌、固氮菌、硅酸鹽細菌按照1:1:2的菌株比例置于培養基中，在pH=7. O 7. 2，溫度為35 39°C的條件下培養12-18小時，得到的產物復合微生物菌劑。所述肥料的制備方法為，(I)將自毒物質降解菌、固氮菌、硅酸鹽細菌按照1:1:2的菌株比例置于培養基中，在pH=7. O 7. 2，溫度為35 39°C的條件下培養12-18小時，得到的復合微生物菌劑；
(2)將有機質大于45wt%的煤炭腐殖酸、硫酸銨、水按重量比為4 6 :0· 8 1. 2 :O. 4 O. 6混拌均勻后封閉起來，在25°C下進行氨化螯合反應，反應5 10天得到腐植酸氨；(3)將復合微生物菌劑和腐植酸氨按照2 3 :7 8的重量比混合后得到終產物復合微生物肥料。步驟(I)中培養基的組成及重量配比為，豆餅粉2 3%，麥麩O. 5 1%，(NH4)2SO4O. 5 1%，K2HPO4 O. 07 O. 1%，KH2PO4 O. 03 O. 5%, MgSO4 · 7H20 O. 01 O. 05%，余量為水；步驟(I)中培養基的組成及重量配比為，豆餅粉2%，麥麩O. 5%, (NH4)2SO4 O. 5%，K2HPO4 O. 07%, KH2PO4 O. 03%, MgSO4 · 7Η200· 01%，余量為水。步驟(2)中煤炭腐殖酸、硫酸銨、水的重量比為5 1 0. 5。步驟(2)中煤炭腐殖酸的細度為100 120目。步驟(3)中，復合微生物菌劑和腐植酸氨的重量比為3:7。本發明的優點是1、本發明通過降解土壤中自毒物質，改善土壤團粒結構，營造有益菌群優勢，促進了土壤團粒結構的形成，極大地改善了土壤的微生態系統，增強了土壤透氣性，提高了土壤保水保肥能力。2、本發明使土壤有了可持續增產增收的發展潛力。并且有效轉化底肥，釋出小分子養份與活性因子，改良土壤肥力，解除化肥、農藥及有害因子對土壤的破壞，克服連作障礙。3、本發明生產的肥料產品離子活性較強，具有調酸堿能力、緩釋、長效的特點，成本低廉，施用后可以有效改善改良土壤理化性狀，提高種子出苗率，增強秧苗的抗旱、抗寒、病蟲害的能力，可以顯著提高農產品中微量元素的含量，滿足人們對農產品品質的需求。4、本發明可單獨使用，也可按照一定的比例加入到單元素和多元素的大量肥料中。加入到復合肥料中制成高端多元素復合肥料；加入到單元素的肥料中，能提高單元素的利用率和有效性。5、本發明以豆餅粉、麥麩等有機物料為培養基主要成分，以分離篩選到的自毒物質降解菌、PGPR菌株為原始菌種，發酵培養后形成具有調節作物營養平衡及生長態勢，增強抗病性，降低病蟲害的發生率，減少農藥用量的作用。促進有益菌大量繁殖，有效抑制土壤傳染性病害的發生，增強植株抗病能力，延緩植株老化多種天然抑菌酵素強效防治土壤傳染性病蟲害的發生。6、本發明將微生物和腐殖酸熬合劑相結合。本發明生產的復合微生物肥料，適用于各種農作物，提高肥料利用率15%以上，增產10%。可作為底肥一次性施入，省工省時省力省錢。7、本發明生產工藝極其簡單。本發明所提到的粒狀肥料，生產工藝極易于現代的復合肥生產工藝相結合，在原有的復合肥生產設備基礎上進行生產造粒。工藝方法簡單，有利于在肥料工業生產中推廣使用。8、本發明制得的產物可提高作物的營養成分如氨基酸、維生素C、糖類等成分的含量，促進植株根系旺盛，降低硝酸鹽含量，改善農產品品質。9、本發明制得的產物可調節作物營養平衡及生長態勢，增強抗病性，降低病蟲害的發生率，減少農藥用量。促進有益菌大量繁殖，有效抑制土壤傳染性病害的發生，增強植株抗病能力，延緩植株老化多種天然抑菌酵素強效防治土壤傳染性病蟲害的發生，如猝倒病、枯萎病、青枯病、線蟲、根腐病等。
具體實施例方式一種自毒物質降解菌的保藏機構為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6896，保藏日期為2012年11月28日，所述自毒物質降解 菌的分離方法包括如下步驟(I)菌株的分離采用逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法，將連作10年的番茄根系土壤懸液按10%的接種量接種于含有IOOmg / L苯甲酸的無機鹽培養基中，30°C下搖床150r / min，培養3天后，以10%接種量轉至苯甲酸濃度為300mg / L的無機鹽培養基中，繼續培養。按此方式連續循環3次，三次所用的無機鹽培養基，苯甲酸的濃度依次為300mg / L、600mg / L、IOOOmg / L，然后進行平板涂布，將培養皿放于30°C恒溫培養箱中培養72h，挑取單菌落，轉接入苯甲酸濃度為IOOOmg / L的無機鹽培養基中，反復涂布，得到苯甲酸降解菌菌懸液；所述的無機鹽培養基的組成為(NH4)2SO42g / L，KH2PO4 2g / L，Na2HPO41. 3g /L，苯甲酸100 IOOOmg / L，NaCl 5g / L，余量為水；培養基的ΡΗ=6· 8 7· 2 ;(2)菌株的篩選與鑒定a.初篩將5ml步驟(I)所述的無機鹽培養基加到15mmX 150mm試管中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml步驟(I)得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到試管中，每株菌重復2管，28°C下避光培養5天，每24h觀察記錄I次生長情況；b、復篩將50ml步驟(I)所述的無機鹽培養基加到250ml三角瓶中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml初篩得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到三角瓶中，加入Iml無菌水，每處理重復3次，28 V下避光培養10天，檢測苯甲酸殘留量，同時設立空白對照組，空白對照組中用水代替無菌水，計算降解率。c.鑒定對復篩獲得的菌株進行16SrDNA序列測定，采用通用引物進行PCR擴增，反應總體系為，取PCR產物Iul進行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測.用瓊脂糖凝膠純化試劑盒(購自大連寶生物公司)切膠回收PCR產物進行測序分析，菌株的16SrDNA序列測序結果登錄GenBank,并用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進行同源性比較，將得到的相似菌株的16SrDNA，利MEGA4. O軟件，構建系統發育樹，分析各分離菌株的進化地位。實施例1將自毒物質降解菌、固氮菌、硅酸鹽細菌按照1:1:2的菌株比例置于培養基中，在pH=7. O,溫度為39°C的條件下培養16小時，得到的復合微生物菌劑；培養基的組成及重量配比為，豆餅粉 2%，麥麩 O. 5%, (NH4)2SO4 O. 5%, K2HPO4 O. 07%, KH2PO4 O. 03%, MgSO4 · 7H20O. 01%，余量為水。接著將有機質大于45wt%的煤炭腐殖酸、硫酸銨、水按重量比為5 1 0. 5混拌均勻后封閉起來，在25°C下進行氨化螯合反應，反應10天得到腐植酸氨。最后，將復合微生物菌劑和腐植酸氨按照3 7的重量比混合后得到終產物復合微生物肥料。肥料的PH=I 3、腐殖酸含量為5_10wt%，有效活菌數達到108。實施例2將10公斤實施例1制得的復合微生物肥料加入到40公斤的復合肥15-15-15(即氮、磷和鉀的質量含量各為15%)中，混均并基施到I畝番茄大棚中，對照組為復合肥15-15-15,同樣的施用量、培養條件和培養時間，本發明產品的番爺總產量比對照組增產17. 8%，經濟效益也相應提高了，詳見表I。表I不同處理對番爺產量的影響
權利要求
1.一種自毒物質降解菌，其特征在于，其保藏機構為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6896，保藏日期為2012年11月30日。
2.—種自毒物質降解菌的分離篩選方法，其特征在于， 所述自毒物質降解菌的分離方法包括如下步驟， (1)菌株的分離 采用逐漸提高苯甲酸濃度的馴化方法，將連作10年的番茄根系土壤懸液按10%的接種量接種于含有IOOmg / L苯甲酸的無機鹽培養基中，30°C下搖床150r / min，培養3天后，以10%接種量轉至苯甲酸濃度為300mg / L的無機鹽培養基中，繼續培養； 按此方式連續循環3次，三次所用的無機鹽培養基，苯甲酸的濃度依次為300mg / L、600mg / LUOOOmg / L，然后進行平板涂布，將培養皿放于30°C恒溫培養箱中培養72h，挑取單菌落，轉接入苯甲酸濃度為IOOOmg / L的無機鹽培養基中，反復涂布，得到苯甲酸降解菌菌懸液； 所述的無機鹽培養基的組成為(NH4)2SO4 2g / LjKH2PO4 2g / LjNa2HPO4L 3 g /L，苯甲酸100 1000m g / L，NaCl 5 g / L，余量為水；培養基的PH=6. 8 7. 2 ; (2)菌株的篩選與鑒定 a.初篩將5ml步驟(I)所述的無機鹽培養基加到15mmX150mm試管中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將I ml步驟(I)得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到試管中，每株菌重復2管，28°C下避光培養5天，每24h觀察記錄I次生長情況； b.復篩將50ml步驟(I)所述的無機鹽培養基加到250ml三角瓶中，121°C下滅菌30min后冷卻，接著將Iml初篩得到的苯甲酸降解菌菌懸液加入到三角瓶中，加入Iml無菌水，每處理重復3次，28 V下避光培養10天，檢測苯甲酸殘留量，同時設立空白對照組，空白對照組中用水代替無菌水，計算降解率； c.鑒定對復篩獲得的菌株進行16SrDNA序列測定， 采用通用引物進行PCR擴增，反應總體系為，取PCR產物Iul進行I %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測.用瓊脂糖凝膠純化試劑盒切膠回收PCR產物進行測序分析； 菌株的16SrDNA序列測序結果登錄GenBank,并用BLAST與GenBank中的16SrDNA序列進行同源性比較，將得到的相似菌株的16SrDNA，利MEGA4. 0軟件，構建系統發育樹，分析各分離菌株的進化地位。
3.一種復合微生物肥料，其特征在于，其由重量比為2 3 :7 8的復合微生物菌劑和腐植酸氨組成。
4.根據權利要求3所述的復合微生物肥料，其特征在于，所述的復合微生物菌劑的制備方法為，將自毒物質降解菌、固氮菌、硅酸鹽細菌按照1:1:2的菌株比例置于培養基中，在pH=7. 0 7. 2，溫度為35 39°C的條件下培養12-18小時，得到的產物復合微生物菌劑。
5.一種復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，所述肥料的制備方法為， (1)將自毒物質降解菌、固氮菌、硅酸鹽細菌按照1:1:2的菌株比例置于培養基中，在pH=7. 0 7. 2，溫度為35 39°C的條件下培養12-18小時，得到的復合微生物菌劑； (2)將有機質大于45wt%的煤炭腐殖酸、硫酸銨、水按重量比為4 6:0. 8 1. 2 :0.4 0. 6混拌均勻后封閉起來，在25°C下進行氨化螯合反應，反應5 10天得到腐植酸氨； (3)將復合微生物菌劑和腐植酸氨按照2 3 :7 8的重量比混合后得到終產物復合微生物肥料。
6.根據權利要求5所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(I)中培養基的組成及重量配比為，豆餅粉2 3%，麥麩0. 5 1%, (NH4)2SO4 0. 5 1%, K2HPO4 0. 07 0.1%，KH2PO4 0. 03 0. 5%, MgSO4 7H20 0. 01 0. 05%,余量為水。
7.根據權利要求6所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于 步驟(I)中，培養基的組成及重量配比為，豆餅粉2%，麥麩0.5%，(NH4)2SO4 0.5%，K2HPO4 0. 07%, KH2PO4 0. 03%, MgSO4 7H20 0. 01%,余量為水。
8.根據權利要求5所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，煤炭腐殖酸、硫酸銨、水的重量比為5 1 :0. 5。
9.根據權利要求5所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，煤炭腐殖酸的細度為100 120目。
10.根據權利要求5所述的復合微生物肥料的制備方法，其特征在于步驟(3)中，復合微生物菌劑和腐植酸氨的重量比為3:7。
全文摘要
本發明涉及一種連作障礙自毒物質降解菌及其制備的復合微生物肥料。自毒物質降解菌其保藏機構為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.6896，保藏日期為2012年11月28日，分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。一種復合微生物肥料由重量比為2～3∶7～8的復合微生物菌劑和腐植酸氨組成。本發明通過降解土壤中自毒物質，改善土壤團粒結構，營造有益菌群優勢，促進了土壤團粒結構的形成，極大地改善了土壤的微生態系統，增強了土壤透氣性，提高了土壤保水保肥能力。本發明使土壤有了可持續增產增收的發展潛力。并且有效轉化底肥，釋出小分子養份與活性因子，改良土壤肥力，解除化肥、農藥及有害因子對土壤的破壞，克服連作障礙。
文檔編號C12R1/125GK103045506SQ201210532558
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月11日 優先權日2012年12月11日
發明者何志剛, 婁春榮, 安景文 申請人:遼寧省農業科學院