專利名稱：從鹽膚木篩選漆酶內生菌及通過固態發酵制漆酶的方法
技術領域：
本發明屬于植物內生菌的分離與篩選及微生物發酵領域，特別涉及從鹽膚木中篩選漆酶高產內生菌和篩選的方法，以及通過固態培養、分離、純化制備漆酶的方法。
背景技術：
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，它廣泛存在于自然界的多種植物和菌類的分泌物中，根據來源一般將其分為漆樹漆酶和真菌漆酶。漆酶能夠催化多種底物，如酚類化合物及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及甾醇類化合物等；在ABTS，HBT等介質存在下，漆酶也可以催化一些包括木質素在內的非酚底物。漆酶是目前公認的木素分解酶之一，可以直接從底物吸收電子，使之形成自由基，它具有780mV的氧化還原電勢，在沒有H2O2和其他次級代謝產物存在下，能夠使第二底物O2直接變成水，而自身脫去羥基上的電子或質子形成自由基。該自由基不穩定，可進一步發生聚合或解聚反應。該特性使得漆酶在生物制漿及漂白、廢水處理以及高分子材料生物轉化等方面都具有重要的環保應用價值和開發潛力，因而成為國內外研究的焦點。
真菌是漆酶的主要來源，目前的真菌漆酶主要包括擔子菌綱、子囊菌綱和半知菌綱。擔子菌中普遍都能產漆酶，如革菌屬，栓菌屬，蜜環菌屬，多孔菌屬，猴頭菌屬，鬼傘屬，皮傘屬，口蘑屬等中都發現了漆酶，其中研究最多、漆酶產量普遍較高的主要是彩絨革蓋菌(Coriolus versicolor)。最近，Givaudan等從稻根分離出來產生漆酶的細菌生脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)，從而擴大了漆酶的來源。但是眾多微生物菌種中高產菌株不多，從而使得尋找漆酶高產菌株仍然是非常必要的。
漆酶廣泛存在于多種高等植物中，目前已經從多種植物中分離得到漆酶或發現漆酶的基因如漆樹(Rhus vernicifera)、芒果(Mandifera Indica)、加州胡權樹(Schinus molle)、巴勒斯坦黃連木(Pistacia)、萜木李(Pleiogynium timoriensa)、黃楊(Populus trichocarpa)、火炬松(Pinus taeda)、水稻(Oryza sativa)以及歐亞槭樹(Acer pseudolantanus)等物種中也有報道。
植物內生真菌是指生活在植物體內或生活史的一定階段處于植物體內的真菌。由于長期處于植物微生態系統中，內生真菌與宿主建立了和諧的聯合關系，有大量研究表明，植物內生真菌能產生與其宿主相同的次級代謝產物。近年來，國內外已經有大量從植物中分離具有生物活性代謝產物的內生真菌的報道，如從短葉紫杉、云南紅豆杉、南方紅豆杉等中分離得到能夠產生紫杉醇的內生真菌，從傳統藥用植物雷公藤的內生真菌Rhinocladiellaspp.中發現了生物堿等。
固態發酵是指微生物在沒有或基本沒有游離水的固體基質上的生長過程。固態基質中，氣、液、固三相同時存在，即多孔性的固態基質中含有水和水不溶性物質。該物理條件非常適合絲狀真菌的生長。另外固態發酵產酶可以選用任何天然的纖維素廢棄物，并且產量一半比液體發酵高出2～3倍，因而是發酵成本大大降低。因而采用固態發酵制酶比較適合我國的國情。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從鹽膚木植物中分離出高產漆酶的內生菌，漆酶內生菌名稱為YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.1462；并提供一種分離及篩選高產漆酶的內生菌的方法，從而拓寬微生物產漆酶的菌種來源。
本發明的另一目的，還提供一種將分離得來的產漆酶內生菌YY-5，保藏號為CGMCCNo.1462，經過固態發酵、硫酸銨沉淀、離子交換柱層析工藝來制備漆酶的方法。
本發明的目的是這樣實現的本發明提供的漆酶內生菌名稱為YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.1462。
本發明所提供的漆酶高產菌株YY-5，是從漆樹科植物鹽膚木中分離得到的內生真菌。經過形態學初步鑒定屬于真菌門的無孢菌群(Mycelia Sterilia)。具有以下的形態特征菌落圓形，不產生孢子，菌絲較短、生長密集、并呈灰褐色，顯微鏡下觀察菌絲有隔。最適生長溫度28～30℃，在產酶過程中發酵培養基黏度增大，并伴隨有黑色素的生成，到發酵結束時菌體呈黑色球狀。在碳源利用方面蔗糖優于葡萄糖。
本發明從鹽膚木植物分離及篩選產漆酶植物內生菌(漆酶內生菌名稱為YY-5，保藏號為CGMCCNo.1462)的方法，包括以下步驟(1)清洗新鮮鹽膚木用自來水清洗新鮮鹽膚木植物組織表面，干燥后將其根、莖切成段，葉、果實不切，用濃度為75％(W/V)的酒精漂洗1分鐘，無菌水沖洗3～4次，再用0.1％(V/V)的升汞浸泡10～60秒，最后再用無菌水沖洗3～4次；(2)按常規無菌操作的工藝接種培養將步驟(1)清洗得到的漆樹科植物的根的韌皮部、莖、葉、果實切成小片，其中根韌皮部、莖及果實的切片厚度與葉片厚度相當，接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(以下簡稱PDA)固體培養基上，置于25～30℃溫箱中，進行培養5～7天，待各植物組織切面長出菌絲后，挑取菌絲移至另一塊PDA固體培養基上；(3)將步驟(2)中所得到的內生真菌接種到PDA固體培養基上，置于25～30℃溫箱中培養5～10天，待菌落生長良好后，用0.1～1.0mM的丁香醛連氮滴定到菌絲體，選擇出現粉紅色變色圈的菌株，即為產漆酶內生菌。
還包括步驟(4)，再將步驟(3)得到的菌株在液體培養基中進行復篩液體培養基為添加了木質纖維素類固體物質的馬鈴薯葡萄糖液體培養基；培養基組成為馬鈴薯葡萄糖液體培養基中添加2％(W/V)木質纖維素類固體基質，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4；發酵培養條件為25～30℃，在恒溫振蕩培養箱中，以110～200轉/分鐘(r/min)培養5～10天，即得到漆酶高產內生菌，命名為YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.1462。
本發明還包括一種漆酶內生菌通過固態發酵制漆酶方法，其特征在于a.將上述的步驟4)復篩得到的漆酶內生菌YY-5接種到固體培養基中，進行固體發酵產酶培養，其中固體培養基由固態發酵基質與馬鈴薯葡萄糖液體培養基按1∶2～1∶10比例配制，以25～30℃繼續培養5～10天；b.將步驟a)中的固態發酵產物加入蒸餾水浸泡并攪拌后，以濾紙過濾除去固體殘渣，液體離心分離，取上清液得到本發明的粗酶液。
在上述的技術方案中，還在步驟(b)中得到的粗酶液中加入硫酸銨至80％飽和度，進行鹽析沉淀，鹽析液離心后，用0.01mM pH6.5磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀，并進行透析脫鹽，用聚乙二醇濃縮，濃縮后的樣品進行離子交換柱層析，所用離子交換劑為DEAESephadex A-25，緩沖體系為20mM pH6.0緩沖液，洗脫體系為含0.1～1.0M NaCl的緩沖液，洗脫速度為1mL/2min，收集具有漆酶活性的洗脫液，濃縮后即得到純化的本發明的漆酶液。
在上述的技術方案中，所述的木質纖維素類固體物質包括麩皮，稻草，麥草，玉米秸稈等。
本發明的優點在于利用本發明提供的篩選方法得到了高產漆酶的內生菌，漆酶內生菌名稱為YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.1462，本發明菌株YY-5產生的漆酶分泌于細胞外，在本發明提供的固態培養條件下，YY-5最高產酶活力可以達到288.46IU/g固體基質。發酵培養物中無木質素過氧化物酶及錳過氧化物酶活力，以濾紙酶活表示纖維素酶活力表明，培養物中纖維素酶活力非常低。從而有利于漆酶的分離及純化。另外利用固態發酵進行漆酶的發酵生產，可以充分利用廉價的農業廢棄物，既可以減少其造成的環境污染，又大大降低了漆酶的生產成本。
圖1是實施例4的液態培養條件下得到的YY-5發酵產酶的曲線2本發明制備純化后漆酶的電泳圖具體實施方式
下面通過實施例對本發明的技術方案作進一步說明。
需要說明的是本發明的實施例中漆酶的測定方法，是采用國際公認的丁香醛連氮測定方法(摩爾消光系數65000M·cm-1)進行測定的。其中3mL反應液中包括0.1M、pH6.5磷酸緩沖液2.20mL，粗酶液0.5mL，0.2mM丁香醛連氮溶液0.3mL。測定30℃下，反應液在530nm處吸光度的變化。定義每分鐘氧化1μmol底物所需要的酶量為一個酶活力單位(U·mL-1)。
實施例1從鹽膚木(Rhus Chinensis Mill)的枝干來分離篩選高產漆酶的內生菌，其具體分離篩選步驟如下1.自來水清洗新鮮鹽膚木樹種枝干的表面，晾干后將其切成約2cm的小段，用75％(W/V)的酒精漂洗1min，無菌水沖洗3～4次，再用0.1％(V/V)升汞浸泡1min，無菌水沖洗3～4次；2.按無菌操作的方法取枝干的韌皮部，將其切成厚度約為1mm的薄片，接種到PDA固體培養基上，置于25～28℃溫箱培養5～7天，待各植物組織切面長出菌絲后，將其移至新的固體培養基上，經純化后即得內生真菌；3.待菌落生長良好后，用0.5mM的丁香醛連氮滴定到菌絲體邊緣，選擇出現粉紅色變色圈的菌株，得到產漆酶的內生真菌。
實施例2本實施例從鹽膚木(Rhus Chinensis Mill)樹的葉做原料，來分離內生真菌的方法如下步驟1.自來水清洗新鮮樹種葉子的表面，晾干后用濃度為75％(W/V)的酒精漂洗1min，無菌水沖洗3～4次，再用0.1％(V/V)的升汞浸泡15s，無菌水沖洗3～4次；2.按無菌操作的方法將葉子切成薄片，接種到PDA固體培養基上，置于25～28℃溫箱培養5～7天，待各葉的切面長出菌絲后，將其移至新的固體培養基上，經純化后即得內生真菌；3.待菌落生長良好后，用0.5mM的丁香醛連氮滴定到菌絲體邊緣，選擇出現粉紅色變色圈的菌株，即為產漆酶的內生真菌。
實施例3本實施例從鹽膚木(Rhus Chinensis Mill)的莖做原料，來分離內生真菌的方法包括如下步驟1.自來水清洗新鮮樹種葉子的表面，晾干后用濃度為75％(W/V)的酒精漂洗1min，無菌水沖洗3～4次，再用0.1％(V/V)的升汞浸泡30s，無菌水沖洗3～4次；2.按無菌操作的方法將莖切成厚度約1mm的薄片，接種到PDA固體培養基上，置于25～28℃溫箱培養5～7天，待各莖的切面長出菌絲后，將其移至新的固體培養基上，經純化后即得內生真菌；3.待菌落生長良好后，用0.5mM的丁香醛連氮滴定到菌絲體邊緣，選擇出現粉紅色變色圈的菌株，即為產漆酶的內生真菌。
實施例4利用實施例1、2或3得到的產漆酶的內生真菌，分別進行液體培養基復篩漆酶高產菌的具體操作為菌株接種在PDA固體培養基上，30℃培養3天，從菌落邊沿取直徑為1cm的菌片3個，接入液體培養基中2％(W/V)葡萄糖，2％(W/V)麩皮，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4。裝液量為250mL三角瓶裝50mL培養基。在30℃溫度下，以160r/min(轉/分鐘)在恒溫振蕩培養箱中培養5～10天；采用國際公認的丁香醛連氮測定方法測定上清液中漆酶的活力。即得到的高產漆酶的內生真菌，漆酶內生真菌名稱為YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.1462。在此液態培養條件下得到的YY-5發酵產酶的曲線圖見附圖1。
實施例5利用實施例4得到的高產漆酶的內生真菌，進行漆酶固態發酵具體操作為菌株YY-5接入液體培養基中2％(W/V)葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4，30℃下，以160r/min在恒溫振蕩培養箱中培養3天作為固體發酵的液體種子。液體種子按照1ml/g固體基質接至麥草固體培養基中(250ml三角瓶中放入5g麥草)，使接種后固態培養基的固液比為1∶3，30℃培養7天，即得到較高的漆酶活力。
實施例6利用實施例4得到的高產漆酶的內生真菌，進行漆酶固態發酵具體操作為菌株YY-5接入液體培養基中2％(W/V)葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4，30℃下，以160r/min在恒溫振蕩培養箱中培養3天作為固體發酵的液體種子。液體種子按照1ml/g固體基質接至麩皮固體培養基中(250ml三角瓶中放入5g麩皮)，使接種后固態培養基的固液比為1∶4，30℃培養7天，即得到較高的漆酶活力。
實施例7利用實施例4得到的高產漆酶的內生真菌，進行漆酶固態發酵具體操作為菌株YY-5接入液體培養基中2％(V/V)葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4，30℃下，以160r/min在恒溫振蕩培養箱中培養3天作為固體發酵的液體種子。液體種子按照1ml/g固體基質接至玉米秸稈固體培養基中(250ml三角瓶中放入5g玉米秸稈)，使接種后固態培養基的固液比為1∶5，30℃培養7天，即得到較高的漆酶活力。
實施例8實施例5，6，7中得到的粗酶液100ml中加入硫酸銨至80％飽和度，進行鹽析，鹽析液離心后，沉淀用20ml 10mM pH6.5磷酸鹽緩沖液懸浮，并透析脫鹽。以DEAE SephadexA-25進行離子交換柱層析，緩沖體系為20mM pH6.0緩沖液，洗脫體系為含0.1～1.0MNaCl的緩沖液，洗脫速度為1mL/2min，收集具有漆酶活性的洗脫液，濃縮后即得到純化的本發明的漆酶液。附圖2為本發明實施例純化后漆酶的電泳圖。
權利要求
1.一種從鹽膚木植物分離篩選的漆酶內生真菌菌株，名稱為YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.1462。
2.一種從鹽膚木植物分離篩選漆酶內生真菌的方法，分離得到的漆酶內生菌的名稱為YY-5，保藏號為CGMCCNo.1462，包括以下步驟1)清洗新鮮鹽膚木植物用自來水清洗植物組織表面，干燥后將其根、莖切成段，連同葉一起用濃度為75％(w/v)的酒精漂洗1分鐘，無菌水沖洗3～4次，再用0.1％(V/V)的升汞浸泡10～60秒，最后再用無菌水沖洗3～4次；2)按常規無菌操作的工藝接種培養將步驟1)清洗得到的產漆酶植物的根的韌皮部、莖、葉、果實切成小片，其中根韌皮部、莖及果實的切片厚度與葉片厚度相當，接種到PDA固體培養基上，置于25～30℃溫箱中，進行培養5～7天，待各植物組織切面長出菌絲后，挑取菌絲移至另一塊PDA固體培養基上；3)將步驟2)中所得到的內生真菌接種到PDA固體培養基上，置于25～30℃溫箱中培養5～10天，待菌落生長良好后，用0.1～1.0mM的丁香醛連氮滴定到菌絲體，選擇出現粉紅色變色圈的菌株，得到產漆酶內生真菌；4)將步驟3)得到的產漆酶內生菌，在液體培養基中進行復篩所述的培養基組成為馬鈴薯葡萄糖液體培養基中添加2％(W/V)木質纖維素類固體基質，5g/L牛肉膏，3g/L K2HPO4，1.5g/L MgSO4；發酵培養條件為25～30℃，在恒溫振蕩培養箱中以110～200轉/分鐘，培養5～10天，按照丁香醛連氮法測定上清液中漆酶的酶活，篩選得到高產的漆酶內生真菌，命名為YY-5，已于2005年9月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCC No.1462。
3.一種漆酶內生菌通過固態發酵制漆酶方法，其特征在于a.將權利要求2中的步驟4)復篩得到的漆酶內生菌YY-5接種到固體培養基中，進行固體發酵產酶培養，其中固體培養基由固態發酵基質與馬鈴薯葡萄糖液體培養基按1∶2～1∶10比例配制，以25～30℃繼續培養5～10天；b.將步驟a)中的固態發酵產物加入蒸餾水浸泡并攪拌后，以濾紙過濾除去固體殘渣，液體離心分離，取上清液得到本發明的粗酶液。
4.按權利要求3所述的漆酶內生菌通過固態發酵制漆酶方法，其特征在于還包括再在步驟b)得到的粗漆酶液中加入硫酸銨至80％飽和度，進行鹽析沉淀，鹽析液離心后，用0.01mM pH 6.5磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀，并進行透析脫鹽，用聚乙二醇濃縮，濃縮后的樣品進行離子交換柱層析，所用離子交換劑為DEAE SephadexA-25，緩沖體系為20mM pH6.0緩沖液，洗脫體系為含0.1～1.0M NaCl的緩沖液，洗脫速度為1mL/2min，收集具有漆酶活性的洗脫液，濃縮后得到純化的漆酶液。
5.按權利要求3所述的漆酶內生菌通過固態發酵制漆酶方法，其特征在于，所述的木質纖維素類固體物質選自麩皮，稻草，麥草或玉米秸稈。
全文摘要
本發明涉及從漆樹科植物分離篩選產漆酶內生真菌和方法，以及利用固態發酵進行漆酶發酵生產的方法。分離篩選得到的高產漆酶內生菌命名為YY－5，已于2005年9月26日保藏在“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，保藏號為CGMCCNo.1462。該方法從植物中分離得到內生真菌，將內生真菌接種到PDA固體培養基上，然后以氧化底物產生變色圈的方法篩選漆酶內生菌；在含麩皮的液體培養基中進行復篩得到漆酶高產菌株YY－5，將YY－5接種到固體培養基中，以25～30℃培養5～10天；發酵產物加入蒸餾水浸泡過濾，離心取上清液得到漆酶液。本方法高產漆酶內生菌分泌的漆酶酶活達288.46IU/g固體基質。
文檔編號C12N9/02GK1948453SQ20051008658
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月11日 優先權日2005年10月11日
發明者陳洪章, 邱衛華 申請人:中國科學院過程工程研究所