一種高產桿狀病毒的甜菜夜蛾幼蟲脂肪體細胞系的制作方法

專利名稱：一種高產桿狀病毒的甜菜夜蛾幼蟲脂肪體細胞系的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種昆蟲細胞系，尤其是一種來源于昆蟲脂肪體組織，并且對桿狀病毒高敏感的細胞系，本發明還涉及該細胞系的建立方法，以及該細胞系在桿狀病毒規模化生長上的用途。
背景技術：
據報道，在1965年第一株昆蟲細胞系成功建立后至今，近40年的時間內，已經建立的昆蟲細胞系超過500種。它們分別來源于鱗翅目、雙翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多種昆蟲，其中大部分來源于鱗翅目和雙翅目昆蟲。昆蟲細胞系作為研究材料，一直是生理學、發育生物學、細胞生物學、分子生物學和生物化學等科學研究的重要工具，而且昆蟲細胞作為桿狀病毒表達載體系統的重要組成部分，表達了大量的具有重大經濟意義或科學意義的外源蛋白質；同時作為生物反應器，擴增昆蟲桿狀病毒用作生物殺蟲劑，特別是擴增含有外源基因的重組桿狀病毒殺蟲劑，昆蟲細胞也發揮了重要的作用。
大量的來源于鱗翅目昆蟲商品化的細胞系已得到人們廣泛的應用，比如，來源于草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf-21和其克隆株Sf-9，來源于粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn-368和其克隆株Tn-5B1-4(商品名為High Five)等，已經成功的應用于表達和生產重組蛋白。
鱗翅目的細胞系來源于很多組織，包括卵巢、胚胎、血細胞、脂肪體等。然而，值得一提的是，由于昆蟲細胞不完全的去分化，有的已經建立的昆蟲細胞系仍然保持一定原始組織和器官的特征。來源于不同種類昆蟲的細胞系或來源于同一種昆蟲不同組織部位的細胞系擴增病毒或重組蛋白的表達能力各有不同。因此建立和篩選新的、更多的桿狀病毒敏感細胞系(株)是一項非常有必要而且有理論和實踐意義的工作。
到目前為止，來自甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的細胞系共有4株。Gelernter和Federici(Gelernter，W.D.and B.A.Federici J.Invertebr.Pathol.1986，48199～207)從剪碎的甜菜夜蛾初孵幼蟲組織中，建立了甜菜夜蛾第一個細胞系UCR-SE-1。經克隆形成法，他們又從UCR-SE-1細胞系中分離了SE-UCR-1A細胞系。在SE-UCR-1A細胞系的基礎上，Mccarthy和Mckedy(Mccarthy W J，Mckedy D.Dev.Biol.，1990，26(8)824～828)篩選獲得一個缺失了核苷激酶的細胞系。Hara等(Hara，K.，K.Tsuda，M.Funakoshi and T.Kawarabata In Vitro Cell. Dev.Biol.1993，29A(12)904～907)也從甜菜夜蛾初孵幼蟲組織中建立了第二株細胞系Se3FH。Se3FH對SeNPV敏感，生長速度比UCR-SE-1快。經克隆分離的Se301細胞系100％能被SeNPV感染，生長速度比Se3FH快，產生的空斑比Se3FH大。第三株Le-H-HNU7細胞系是通過甜菜夜蛾血細胞建立的，該細胞系對斜紋夜蛾核多角體病毒敏感。第四株SeHe920-1a細胞系也是來源于甜菜夜蛾血細胞，接入微孢子蟲(Vairimorpha sp.)的孢子后，比其它來源于鱗翅目昆蟲非血細胞的細胞系具有更高的感染細胞能力。其12個克隆株SeHe920Y1至SeHe920Y12中SeHe920Y7感染微孢子蟲的能力最強。
盡管前述文獻已有甜菜夜蛾細胞系的有關報道，然而到目前為止，還沒有來源于甜菜夜蛾脂肪體的細胞系。昆蟲的脂肪體同哺乳動物的肝臟具有相似的功能，是重要的生理代謝組織，也是是桿狀病毒主要的侵染、復制部位之一。更多種類的昆蟲細胞系仍存在很大的需求，建立新的來源于昆蟲脂肪體的細胞系，構建更加高效的桿狀病毒表達載體系統是十分有意義的。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的甜菜夜蛾脂肪體組織來源的并具有高度病毒敏感性的細胞系，該細胞系名稱為Spex II，已于2005年7月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1411。
本發明的另一目的在于提供該細胞系的構建方法。
本發明的又一目的在于提供該細胞系在桿狀病毒的大規模生產及使用桿狀病毒表達載體表達重組蛋白上的用途。
本發明利用甜菜夜蛾幼蟲脂肪體細胞為實驗材料，采用一種能夠快速建立昆蟲細胞系的方法，建成了一株對甜菜夜蛾核型多角體病毒高敏感的甜菜夜蛾脂肪體細胞系，命名為Spex II。保藏號為CGMCC No.1411。
本發明建立該細胞系的具體方法如下(1)將甜菜夜蛾末齡幼蟲浸沒在乙醇溶液中10-20分鐘，進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水清洗昆蟲，再吸干蟲體表面；(2)解剖昆蟲，取出完整甜菜夜蛾脂肪體組織；(3)用生理鹽水清洗(2)中獲得的組織2-3次，再用細胞培養液清洗，清洗后把該組織放入含有1mL細胞培養液潤洗過的細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27℃無光照的細胞培養箱中培養24小時；(4)加入適量的細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中，在與步驟(3)同樣條件下培養；(5)每7-10天吸出半量的培養液，并同時換入半量新的細胞培養液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶；(6)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入新的細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液，兩個培養瓶放入培養箱中培養，細胞開始傳代，細胞系建立成功；整個過程都是在無菌條件下進行的。
本發明方法所使用細胞培養液的說明本發明所使用的細胞培養液是常規采用的昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細胞培養液pH在6.0-6.8之間。昆蟲細胞培養液可以是各種商品化的昆蟲細胞培養液，如TNM-FH，Grace’s，Sf900，TC-100，IPL-41，Ex-Cell 400等等。
通常，細胞培養液中青霉素含量為100U/mL；鏈霉素含量為優選100U/mL；動物血清含量為細胞培養液的10％(體積比)。
本發明中兩株甜菜夜蛾脂肪體細胞系的生物學特征觀察和測定1.經實驗觀察，該細胞系大部分懸浮于培養液中，也有部分貼壁細胞。細胞的形狀有3種類型大部分細胞圓形、少部分梭形，較少似巨噬細胞形(圖1)。
2.按照McIntosh and Ignoffo，1989(McIntosh，A.H.and C.M.IgnoffoJ.Invertebr. Pathol.1989，5497～102)的方法，測定第10代細胞生長曲線和群體倍增時間。以3×105細胞/mL的濃度接種到T-12.5cm2培養瓶中，27℃培養，每24h測定細胞濃度，繪制生長曲線，并按公式T＝tlg2/[lg(N/N0)]計算，第10代的細胞群體倍增時間為108.8小時。
其中T＝在對數期平均增長一倍所需的時間t＝接種到測定細胞數的時間N0＝接種時的細胞數N＝時刻t所測定的細胞總數3.按照Takahashi et al.(Takahashi，Mitsuhashi and Ohtaki(1980)Develop.Growth and Differ.2211-19)的方法，測定了第7代細胞的核型。由于甜菜夜蛾的染色體數目n＝31(Hara，Tsuda，Funakoshi andKawarabata In Vitro Cell.Dev.Biol.1993，29A(12)904～907)，而Spex II的染色體數目在116-131之間，因此，新建立的細胞系Spex II由4倍體細胞組成(圖2)。
4.使用DAF-PCR的方法(McIntosh，Grasela and Matteri(1996)，InsectMol.Biol.5187～195)鑒定了細胞系Spex II確是來源于甜菜夜蛾，而非其它細胞系的污染(圖3)。由Spex II提取的DNA與甜菜夜蛾幼蟲DNA擴增后主要的帶型相同，而與對照來源于果蠅的SL2細胞帶型明顯不同。
5.Spex II對甜菜夜蛾核型多角體病毒敏感，可以觀察到典型的細胞病理特征，即細胞核增大，內含大量的多角體顆粒(圖4)。并且至少可以連續傳代3代。使用細胞系生產的病毒多角體進行生物測定，得到LC50＝6.01×105PIB/mL，類似于用蟲體生產的病毒多角體測定的結果。
6.使用傳統細胞凍存的方法對一定代次的部分細胞進行凍存處理，保存細胞的種資，并成功復蘇。


圖1為Spex II的培養形態；圖2為Spex II的核型；圖3為DAF-PCR鑒定Spex II的DNA指紋擴增圖譜，同于甜菜夜蛾S.exigua的DNA指紋擴增圖譜，而不同于果蠅的細胞系SL2的圖譜；圖4為Spex II感染甜菜夜蛾核型多角體病毒后獲得大量的病毒多角體。
具體實施例方式
實施例1.甜菜夜蛾幼蟲脂肪體細胞系的建立取末齡的甜菜夜蛾幼蟲浸沒在70％的乙醇溶液中10分鐘，進行表面消毒。解剖該昆蟲取出脂肪體組織，操作時盡量保持其完整。用生理鹽水清洗該組織2-3次，再用細胞培養液(以TNM-FH為主，含100U/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.2)清洗1-2次，放入使用1mL培養液潤洗過的25cm2的細胞培養瓶中，放入攝氏27℃無光照的細胞培養箱中培養24小時。然后加入3mL上述細胞培養液，放入同樣條件下培養。注意該方法成功建立細胞系的關鍵是要使組織塊緊貼在細胞培養瓶底，勿使組織塊懸浮在細胞培養液中。以后每7-10天左右吸出半量的培養液，并同時換入半量的新培養液。在此操作第7-10天后可以觀察到組織塊周圍游離出大量單個的細胞，并逐漸向外圍擴展。第28天后見到細胞不斷增殖并充滿整個培養瓶，把含有新增殖出的細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入2mL新的細胞培養液。細胞系建立初步成功。在細胞開始傳代的第7天后開始第二次分瓶傳代，以后傳代時間逐漸縮短，傳到第8代時，細胞生長開始穩定，最終該細胞系被命名為Spex II。Spex II于2005年7月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1411。
實施例2.Spex II的生物學特性觀察和測定(1)形態特征經顯微鏡觀察，該細胞系通常懸浮于培養液中，細胞的形狀有3種類型圓形、梭形和似巨噬細胞形(圖1)。Spex II中圓形細胞占85.7％，平均直徑14.7μm；梭形細胞占12.7％，長約16.0-41.9μm(平均25.3μm)，寬約8.4-16.0μm(平均11.2μm)；約1.6％的細胞為似巨噬細胞，直徑范圍在18.2-31.4μm之間。
(2)細胞的生長27℃下，2個細胞系第10代在含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100U/mL的鏈霉素的TNM-FH培養液中，群體倍增時間分別為108.8hr和156.8hr。細胞最高密度約可達1.3×106個細胞/mL。
(3)核型分析Spex II第10代細胞是4倍體細胞，染色體數目范圍116-131(2n＝62)，見圖2。
(4)DAF-PCR鑒定細胞系Spex II確是來源于甜菜夜蛾，而非其它細胞系的污染(圖3)。由Spex II提取的DNA與甜菜夜蛾幼蟲DNA擴增后主要的帶型相同，而與對照來源于果蠅的SL2(Schneider′s Drosophila Line 2，ATCC保藏號CRL-1963)細胞的帶型明顯不同。
(5)凍存和復蘇使用傳統細胞凍存的方法對一定代次的部分細胞進行凍存處理，保存細胞的種資，并可以成功復蘇。
實施例3.病毒敏感性和產量的測定Spex II對甜菜夜蛾核型多角體病毒敏感將SeNPV出芽型病毒粒子BV以0.001幼蟲當量/毫升的濃度接種Spex II，培養10天后，收獲細胞及病毒多角體，用血球計數板在顯微鏡下計數病毒多角體數目，結果Spex II擴增SeNPV可達到每毫升培養液生產1.8×108PIB的產量。同時可以觀察到典型的細胞病理特征，即細胞核增大，內含大量的多角體顆粒(圖4)。并且至少可以連續傳代3代。
使用細胞系用上述方法生產的病毒多角體，對2齡末期的甜菜夜蛾幼蟲進行生物測定。其方法如下Spex II接種SeNPV病毒10天后，收集細胞及其培養液，加入十分之一體積的10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，劇烈震蕩，5000g離心5分鐘，沉淀用少量1％SDS懸浮，血球計數板計數SeNPV多角體的含量。用蒸餾水將獲得的SeNPV懸液配制成1×107PIB/mL、5×106PIB/mL、1×106PIB/mL、5×105PIB/mL、1×105PIB/mL、1×104PIB/mL的六個濃度的濃度梯度，用蒸餾水作空白對照。將甜菜夜蛾的飼料分別浸沒在不同濃度的病毒懸液中1分鐘，取出飼料，用吸水紙吸干飼料表面的液體，放入24格養蟲盒中，每格接入1頭2齡末期的甜菜夜蛾幼蟲，放入26℃、14小時光照10小時黑暗的光照培養箱中培養。24小時后換入新鮮的不含病毒的飼料繼續培養，每個濃度實驗72頭甜菜夜蛾。實驗四天后調查甜菜夜蛾的死亡率，計算LC50。結果第四天的LC50為1.99×105PIB/mL(95％CI＝1.68×105PIB/mL至8.65×105PIB/mL)，而用由甜菜夜蛾幼蟲擴增的多角體進行生物測定，其LC50為4.32×105PIB/mL(95％CI＝3.08×105PIB/mL至6.07×105PIB/mL)。用Spex II細胞擴增的SeNPV同用蟲體擴增的SeNPV，其LC50在統計學意義上沒有顯著差異，說明用Spex II生產的甜菜夜蛾核型多角體病毒(SeNPV)的毒力沒有改變，可以用于SeNPV的生產。
權利要求
1.一種昆蟲細胞系Spex II，于2005年7月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1411。
2.一種權利要求1所述昆蟲細胞的構建方法，步驟如下(1)將甜菜夜蛾末齡幼蟲浸沒在乙醇溶液中10-20分鐘，進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水清洗昆蟲，再吸干蟲體表面；(2)解剖昆蟲，取出完整甜菜夜蛾脂肪體組織；(3)用生理鹽水清洗(2)中獲得的組織2-3次，再用細胞培養液清洗，清洗后把該組織放入含有1mL細胞培養液潤洗過的細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27℃無光照的細胞培養箱中培養24小時；(4)加入適量的細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中，在與步驟(3)同樣條件下培養；(5)每7-10天吸出半量的培養液，并同時換入半量新的細胞培養液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶；(6)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入新的細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液，兩個培養瓶放入培養箱中培養，細胞開始傳代，細胞系建立成功；整個過程都是在無菌條件下進行的；其中所述的細胞培養液是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細胞培養液pH在6.0-6.8之間。
3.根據權利要求2所述的昆蟲細胞的構建方法，其中所述的昆蟲細胞培養液選自商品化的昆蟲細胞培養液TNM-FH，Grace’s，Sf 900，TC-100，IPL-41，或Ex-Cell 400。
4.根據權利要求2所述的昆蟲細胞的構建方法，其中細胞培養液中的青霉素含量為100U/mL；鏈霉素含量為100U/mL；動物血清含量為細胞培養液的10％(體積比)。
5.一種權利要求1所述昆蟲細胞系在桿狀病毒的大規模生產上的用途。
6.根據權利要求5所述的用途，其中的桿狀病毒是甜菜夜蛾核型多角體病毒。
全文摘要
本發明公開了一種來源于昆蟲脂肪體組織，并且對桿狀病毒高敏感的細胞系，本發明還公開了該細胞系的建立方法，以及該細胞系在桿狀病毒規模化生長上的用途。該細胞系可以用來復制這類病毒，用于桿狀病毒殺蟲劑的規模化生產，以及構建桿狀病毒表達載體系統，表達具商業或科學價值的蛋白質。因而具有極高的商業和科研價值。
文檔編號C12N7/00GK1940061SQ20051008652
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月27日 優先權日2005年9月27日
發明者張永安, 張寰, 秦啟聯, 王玉珠, 曲良建 申請人:中國林業科學研究院森林保護研究所