專利名稱：荷葉離褶傘食用菌菌種的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種彷野生食用菌。
背景技術：
荷葉離褶傘{Lyophyllum decastes(Fr.Fr.)sing.}是一種十分珍貴的野生食用菌，它口感脆滑、味道鮮美、營養豐富、以鮮食為主但干制后營養和口感不變，市場前景廣闊。近年來，由于過度的采摘，野生的荷葉離褶傘已經非常稀少。為了挽救這種頻臨滅絕的野生食用菌，對該菌進行馴化栽培研究是擺在科技工作者面前的一項重大課題。
發明內容
本發明的目的是提供一種荷葉離褶傘食用菌菌種，并對其進行了生理、生化特性測定，進行了碳源、氮源及碳氮比對荷葉離褶傘菌絲生長、子實體分化與發育的影響的測定。
本發明的目的是通過以下措施來達到荷葉離褶傘(Lyophyllum decastes)食用菌菌種，它采集于祁連山野生荷葉離褶傘，通過組織分離或孢子分離，在培養基上培養而獲得。
其形態特征荷葉離褶傘在PDA可以生長，菌落圓形、致密、白色、邊緣整齊；子實體灰白色，幼時菌蓋半球形，成熟后平展，中央略下凹，表面光滑無黏液無鱗片，菌蓋邊緣光滑幼時內卷；菌褶與菌肉同為白色，菌褶直生不等長，孢子無色、球形、光滑；菌柄柱形、中實、光滑白色；其生理、生化特征荷葉離褶傘菌絲生長的溫度范圍是5-35℃，最適溫度25℃；子實體分化的溫度范圍13-22℃，最適溫度19℃；0-3℃的溫差有利于子實體的分化，溫差大于9℃子實體不能形成；孢子萌發的溫度范圍是10-25℃，最適溫度20℃；菌絲能在pH4-11范圍內生長，最適pH4-5；菌絲和孢子的致死溫度分別是45℃30min和50℃15min。
碳源、氮源的利用及碳氮比對荷葉離褶傘菌絲生長、子實體分化與發育的影響能利用淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、玉米粉、乳糖和甘露糖作碳源，但蔗糖和葡萄糖為碳源生長勢強，果糖生長勢弱；甘氨酸、蛋白胨、硫酸銨、黃豆粉、硝酸銨、谷氨酸和麥麩均可作為氮源，在麥麩上生長速度快，長勢旺盛；硫酸銨、硝酸銨和谷氨酸雖能作為氮源，但長勢很弱；能在C/N15/1-50/1的范圍內生長，C/N為50/1時生長速度最快。在完全黑暗的條件下不能形成子實體，連續光照和12h光暗交替兩種處理都可形成子實體，且兩種處理間差異不顯著。
該菌種已2005年10月31日于保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號CGMCC No1518，本發明的優點和產生的有益效果是菌絲
圖1是溫度對荷葉離褶傘菌絲生長和孢子萌發的影響圖2是溫度對荷葉離褶傘子實體分化的影響圖3是溫差對荷葉離褶傘子實體分化的影響圖4pH值對荷葉離褶傘菌絲生長和孢子萌發的影響具體實施方式
實驗例1溫度對荷葉離褶傘菌絲生長和孢子萌發的影響按李彩萍等(2004白雷蘑菌絲生物學特性的初步研究.食用菌學報，11(3)24-29.)和楊新美(1988中國食用菌栽培學.北京農業出版社.1-584)的方法進行。
先將荷葉離褶傘菌種用PDA平板在22℃條件下連續培養20d，使其形成可供試驗的菌落，用無菌的打孔器取直徑5mm的菌落塊，置于PDA平板的中央，每四皿一組，分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40℃的恒溫培養箱中，連續培養15d，用十字交叉法測量菌落直徑，并觀察菌落形態，菌絲長勢和菌絲生長速度，菌絲生長速度用(mm/d)表示，菌絲長勢濃密健壯用“+++”表示，生長較濃密用“++”表示，生長稀疏用“+”表示，不生長用“-”表示。
孢子萌發試驗選取成熟度達到90％的子實體，剝下菌褶，投入10ml無菌水管中，每管投菌褶10片，振蕩搖勻制成孢子懸液。然后將孢子懸液滴加在載玻片上，置于0、5、10、15、20、25、30、35℃下保濕、黑暗培養24h，在顯微鏡下觀察記載孢子萌發數，計算孢子萌發率。孢子萌發率＝已萌發孢子數/已查孢子總數×100％實驗結果(圖1)表明，荷葉離褶傘菌絲體在0℃和35℃下不能生長，菌絲可以生長的溫度范圍是5-35℃，最適溫度25℃；孢子萌發的溫度范圍是10-25℃，最適溫度20℃。
實驗例2溫度與溫差刺激對荷葉離褶傘子實體分化與發育的影響在150ml三角瓶中加入30ml PDA培養基，121℃40min滅菌，冷凝之后每瓶接入直徑5mm的菌落一塊，在22℃、黑暗條件下培養30d，當菌落長滿三角瓶后，分五瓶一組，分別給予0、3、6、9、12℃的溫差刺激，每天持續10h連續刺激6d，結束刺激后把經過不同溫差刺激的菌絲體置于相同的條件(溫度20℃、空氣相對濕度80％、弱光照)下培養15d，觀察記載子實體分化數量，即菇蕾數，求出不同溫差處理下的平均菇蕾數。另將35瓶長滿菌絲的三角瓶分為7組，每組5瓶，分別置于10、13、16、19、22、25、28℃等7個不同溫度但散射光照和空氣相對濕度完全相同的條件下，培養15d觀察記載不同溫度下的菇蕾數量。
實驗結果(圖2)表明荷葉離褶傘子實體分化的溫度范圍13-25℃，最適溫度19℃，在10℃以下25℃以上不能形成子實體。說明該菌子實體分化需要較低的溫度，應屬于低溫型菌類實驗結果(圖3)表明，0-3℃的溫差有利于荷葉離褶傘子實體的分化，溫差大于9℃子實體不能形成。說明荷葉離褶傘具有恒溫結實的特點。
實驗例3pH對菌絲生長和孢子萌發的影響用10％NaoH和10％HCL將PDA培養基的pH值調節為4、5、6、7、8、9、10、11、12共9種。倒在90mm的培養皿中，制成固體平板，用無菌打孔器取直徑5mm的菌落一塊，放在PDA平板中央。同一pH值作4次重復，置于22℃恒溫箱中連續培養15d。用十字交叉法測定菌落直徑，觀察記載菌絲生長勢和菌絲生長速度。
在pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的無菌水管中，投入成熟度90％的菌褶5片，振蕩搖勻制作成孢子懸液，之后將孢子懸液滴加在載玻片上，置于20℃恒溫培養箱中培養24h，觀察記載孢子萌發率。
實驗結果(圖4)表明，在pH4-11范圍內荷葉離褶傘菌絲能夠生長、孢子能夠萌發，菌絲生長的最適pH4-5，孢子萌發的最適pH4-6。由于瓊脂在pH＜4的環境中不能凝固，本實驗未測得菌絲在pH4以下培養基上的生長狀況。
實驗例4碳源對荷葉離褶傘菌絲生長的影響供試碳源可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖、果糖。
測定碳源的基本培養基(NH4)2SO43g，NaCl 1g，KH2PO42g、瓊脂20g、水1000ml。裝入250ml三角瓶中，每瓶裝入150ml。121℃ 40min滅菌后，分別加入1g碳素的不同碳源(依碳源分子量換算成碳源的量分別加入)，再經1.0kg/cm210min滅菌后倒平板。在每一平板的中央接入直徑5mm的菌落一塊，每一碳源設四皿重復，置于22℃恒溫培養箱中，連續培養10d、測菌落直徑。
表1碳源對荷葉離褶傘菌絲生長的影響
注表中數字為3次重復的平均數；表中不同英文字母，大寫表示1％顯著水平，小寫表示5％顯著水平。下表同。
從表1看出，荷葉離褶傘在供試的7種碳源上都可生長，但在以乳糖為碳源的培養基上的生長量顯著小于分別以甘露糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、玉米粉等6種碳源上的生長量，且菌絲稀疏，生長勢明顯較弱；乳糖之外的6種碳源之間生長量差異不顯著；菌絲在果糖上生長勢最弱；而在蔗糖和葡萄糖上菌絲濃密健壯，生長勢旺盛。
實驗例5氮源對荷葉離褶傘菌絲生長的影響供試氮源硝酸銨、硫酸銨、黃豆粉、麩皮、甘氨酸、蛋白胨、谷氨酸。
測定氮源利用的基本培養基是酵母膏1g、KH2PO42g、瓊脂20g、水1000ml。其它做法同碳源測定。
表2氮源對荷葉離褶傘菌絲生長的影響
實驗結果(表2)表明，在參試的7種氮源中，荷葉離褶傘的菌絲在麥麩為氮源的培養基上生長速度最快，菌絲濃密，長勢最旺盛，與其他6種氮源之間存在極顯著差異；甘氨酸與蛋白胨之間差異不顯著，但與硫酸銨、黃豆粉、硝酸銨、谷氨酸之間差異顯著；硝酸銨與谷氨酸之間差異不顯著；菌絲在硫酸銨、硝酸銨、谷氨酸為氮源時雖能生長，但長勢很弱。
實驗例6碳氮比對荷葉離褶傘菌絲生長的影響按楊新美(1988白雷蘑菌絲生物學特性的初步研究.食用菌學報，11(3)24-29.)，常明昌(2003.12.食用菌栽培學.北京中國農業出版社.1-173和陳士瑜(1998.食用菌生產大全.北京中國農業出版社.)的方法進行測定。
以葡萄糖為碳源以谷氨酸作為氮源，以KH2PO42g、酵母膏2g、瓊脂20g、水1000ml作基礎培養基，配制成碳氮比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、55∶1、60∶1共13種配方，121℃30min滅菌后倒平板。在平板中央接入直徑5mm的菌落一塊。同一碳氮比處理設四皿重復，置于22℃恒溫培養箱中連續培養10d，測量菌落直徑觀察菌絲生長勢。同時將不同碳氮比的培養基分別加入150ml的三角瓶中，每瓶30ml。接菌后在20℃及黑暗條件下培養，菌絲長滿三角瓶后，把溫度控制在18℃，同時給予散射光刺激，15d、20d觀察記載子實體分化數量。
表3碳氮比對荷葉離褶傘菌絲生長的影響
實驗結果(表3)表明，荷葉離褶傘能夠在C/N15/1-50/1的范圍內生長，最適C/N為50/1，菌絲生長速度快，菌絲濃密健壯，長勢旺盛。C/N＞50/1的生長狀況還需進一步研究。
實驗例7不同光照對荷葉離褶傘子實體分化與發育的影響在150ml三角瓶中加入30mlPDA培養基制成平板，用無菌打孔器取直徑5mm的菌落一塊接入三角瓶中央，置于恒溫、22℃及黑暗的條件下培養30d。當菌絲完全長滿平板后，取4瓶一組，分別置于完全黑暗、12h光(3000lx日光燈)暗交替、連續光照(3000lx日光燈)條件下連續培養15d，觀察記載現蕾數目(原基數量)，求出不同光照條件下的平均數。
表4不同光照對荷葉離褶傘子實體分化的影響
實驗結果(表4)說明，在完全黑暗的條件下荷葉離褶傘不能形成子實體，在連續光照和12h光暗交替條件下荷葉離褶傘都可形成子實體，且兩種處理間差異不顯著。說明該菌子實體分化需要光照刺激。
實驗例8荷葉離褶傘菌絲與孢子致死溫度測定用無菌的打孔器取直徑5mm在PDA培養基上生長形成的菌落75塊，平均分裝在25支10ml無菌水管中。另取25支10ml無菌水管，每管中加入5片菌褶攪動，振蕩制成孢子懸液。然后將孢子懸液和含有菌落塊的試管置于30、35、40、45、50℃恒溫水浴鍋中分別處理5、10、15、20、30min，迅速冷卻，將孢子懸液分別均勻涂布于PDA平板上。將菌落塊接入菌的PDA培養基上，連續培養10d，觀察菌絲和孢子生長情況，生長濃密用“++”表示，生長稀疏用“+”表示，不生長用“-”表示。
表5荷葉離褶傘致死溫度測定
從表5數據看出，荷葉離褶傘菌絲的致死溫度是45℃30min，孢子的致死溫度是50℃15min。
權利要求
1.荷葉離褶傘(Lyophyllum decastes)食用菌菌種，該菌種已于2005年10月31日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號CGMCC No1518，它是采集祁連山野生荷葉離褶傘，通過組織分離或孢子分離，在培養基上培養而獲得，其特征在于(a)形態特征荷葉離褶傘在PDA培養培養基上可以生長，菌落圓形、致密、白色、邊緣整齊；子實體灰白色，幼時菌蓋半球形，成熟后平展，中央略下凹，表面光滑無黏液無鱗片，菌蓋邊緣光滑幼時內卷；菌褶與菌肉同為白色，菌褶直生不等長，孢子無色、球形、光滑；菌柄柱形、中實、光滑白色；(b)生理、生化特征荷葉離褶傘菌絲生長的溫度范圍是5-35℃，最適溫度25℃；子實體分化的溫度范圍13-22℃，最適溫度19℃；0-3℃的溫差有利于子實體的分化，溫差大于9℃子實體不能形成；孢子萌發的溫度范圍是10-25℃，最適溫度20℃；菌絲能在pH4-11范圍內生長，最適pH4-5；菌絲和孢子的致死溫度分別是45℃30min和50℃15min。(c)碳源、氮源的利用及碳氮比對荷葉離褶傘菌絲生長、子實體分化與發育的影響能利用淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、玉米粉、乳糖和甘露糖作碳源，但蔗糖和葡萄糖為碳源生長勢強，果糖生長勢弱；甘氨酸、蛋白胨、硫酸銨、黃豆粉、硝酸銨、谷氨酸和麥麩均可作為氮源，在麥麩上生長速度快，長勢旺盛；硫酸銨、硝酸銨和谷氨酸雖能作為氮源，但長勢很弱；能在C/N15/1-50/1的范圍內生長，C/N為50/1時生長速度最快。在完全黑暗的條件下不能形成子實體，連續光照和12h光暗交替兩種處理都可形成子實體，且兩種處理間差異不顯著。
全文摘要
荷葉離褶傘(Lyophyllum decastes)食用菌菌種，它采集于祁連山野生荷葉離褶傘，通過組織分離或孢子分離，在培養基上培養而獲得。荷葉離褶傘在PDA培養基上可以生長，形態特征是菌落圓形、致密、白色、邊緣整齊；子實體灰白色，幼時菌蓋半球形，成熟后平展，中央略下凹，表面光滑無黏液無鱗片，菌蓋邊緣光滑幼時內卷；菌褶與菌肉同為白色，菌褶直生不等長，孢子無色、球形、光滑；菌柄柱形、中實、光滑白色；荷葉離褶傘菌絲生長的溫度范圍是5－35℃，最適溫度25℃；子實體分化的溫度范圍13－22℃，最適溫度19℃；0－3℃的溫差有利于子實體的分化，溫差大于9℃子實體不能形成；孢子萌發的溫度范圍是10－25℃，最適溫度20℃；菌絲能在pH4－11范圍內生長，最適pH4－5；菌絲和孢子的致死溫度分別是45℃30min和50℃15min。
文檔編號C12N1/14GK1923997SQ20051009640
公開日2007年3月7日 申請日期2005年11月17日 優先權日2005年11月17日
發明者魏生龍 申請人:魏生龍