專利名稱：用于檢測整合酶φc31功能的真核細胞系統及其制備方法
技術領域：
本發明屬生物技術和基因治療技術領域，具體涉及一種在哺乳動物細胞中，用于檢測整合酶ΦC31功能和活性的真核細胞系統及其制備方法。
背景技術：
噬菌體整合酶ΦC31可將外源核苷酸序列定點整合到哺乳動物細胞基因組的特異性位點上，近年來已成為在哺乳動物細胞中進行轉基因位點特異性重組操作和基因治療的有用工具。
2000年Calos等人最先進行應用噬菌體整合酶ΦC31在哺乳動物細胞中介導定點整合的研究，隨后在小鼠的動物模型中實現了整合酶ΦC31介導凝血因子IX的基因治療，并在果蠅等動物中實現了高效率的轉基因動物的構建工作，從而開辟了基因治療領域的高效定點基因組整合研究的新方向。然而對于整合酶ΦC31在哺乳動物細胞中表達和功能的研究，在其使用pBCBP+質粒的基礎上建立的檢測系統，只能定性的說明整合酶ΦC31在哺乳動物細胞中的活性，不能定量的表征不同的酶突變體和環境因素對整合酶ΦC31功能的影響。2001年，Kuhn等人建立了小鼠細胞的整合酶ΦC31的檢測系統，他們利用整合酶ΦC31介導分子內重組的特性，用β-半乳糖苷酶(LacZ)作為標記基因，通過顯微鏡下的計算顯色的細胞數目定量檢測整合酶ΦC31的活性。該方法可以定量的說明整合酶ΦC31在小鼠細胞中的功能，但是操作步驟繁復和誤差比較大。
發明內容
本發明的目的在于提供一種準確性高、重復性好、操作簡便的整合酶ΦC31功能和活性檢測系統及其制備方法。
本發明提出的整合酶ΦC31功能和活性檢測系統，是由ΦC31重組報告質粒PB[EGFP]轉染人胚胎腎細胞系293，然后用新霉素G418篩選，挑選出單克隆細胞，發展而成的293-PB{[EGFP]}報告細胞系；其中，ΦC31重組報告質粒PB[EGFP]是利用pEGFP-N2載體，在增強型煙草花葉病毒啟動子(CMVIE)之后，順序插入特異序列attP和attB，然后在其間加上一段牛生長因子的多聚腺苷酸(BGH polyA)組成。其結構見圖1所示。其構成元件的順序排列如下增強型煙草花葉病毒啟動子(CMVIE)，attP序列(見SEQ.ID NO.1)，牛生長因子的多聚腺苷酸序列(BGH polyA，見SEQ.ID NO.3)，attB序列(見SEQ.ID NO.2)，增強型綠色熒光蛋白序列(EGFP)。在整合酶ΦC31活性作用下，半個attP和半個attB序列及其之間的牛生長因子的多聚腺苷酸的序列被刪除，則牛生長因子的多聚腺苷酸序列的阻斷作用消失，增強型綠色熒光蛋白得以表達。
本發明提出的上述整合酶ΦC31功能和活性檢測系統的制備方法如下1.構建重組報告質粒PB[EGFP]整合酶ΦC31可以識別的特異性的DNA序列(attP序列見SEQ.ID NO.1和attB序列見SEQ.ID NO.2)，當attP和attB序列同時位于一個DNA分子中，并且排列的方向相同時，整合酶ΦC31可以介導分子內的重組，刪除attP和attB序列之間的DNA片斷。根據上述原理，本發明構建了包含有特異性序列attP和attB的報告質粒PB[EGFP]。使用常規方法(分子克隆指南，1998年第二版，薩姆布魯克等著，科學出版社)，首先利用pEGFP-N2載體(Clontech公司產品)，在增強型煙草花葉病毒啟動子CMVIE之后，順序插入attP和attB序列，然后在其間加上一段牛生長因子的多聚腺苷酸BGH polyA，用來阻斷attB序列后的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達。當存在活性的整合酶ΦC31時，經過重組反應，半個attP和半個attB序列以及他們之間的DNA片斷BGH polyA被刪除，而從其后的增強型綠色熒光蛋白得到表達，表現綠色熒光(見圖1)。
2.建立穩定的檢測整合酶ΦC31的真核細胞系293-PB{[EGFP]}利用上述構建的ΦC31重組報告質粒PB[EGFP]使用常規方法(分子克隆指南，1998年第二版，薩姆布魯克等著，科學出版社)，轉染人胚胎腎細胞系293，然后用新霉素G418篩選，挑選出單克隆細胞，發展成為293[PB-EGFP]報告細胞系。當沒有ΦC31整合酶時，該細胞系沒有綠色熒光蛋白(GFP)的表達；當存在有活性的ΦC31整合酶時，該細胞系有綠色熒光蛋白(GFP)的表達，表現出綠色熒光，可以在熒光顯微鏡觀察(見圖2)和用流式細胞儀計數熒光細胞數量(圖3)，從而評估出轉染，轉導，轉化等多種途徑表達的ΦC31整合酶，及其突變體等的活性和功能的定量比較。
本發明利用ΦC31整合酶介導分子內重組的原理，制備了新型的人類胚胎腎細胞(293)的真核細胞檢測系統，該系統在活性的ΦC31整合酶存在時有綠色熒光蛋白(GFP)的表達，表現出綠色熒光。可以用流式細胞儀計數熒光細胞數量和強度，從而計算出不同途徑(轉染，轉導，轉化等)表達的ΦC31整合酶，及其突變體等在哺乳動物細胞中的功能的定量比較和定性說明。該檢測系統操作簡便，步驟少，準確性高，重復性好，是ΦC31整合酶在哺乳動物細胞中應用的重要評估定量系統。
圖1為重組報告質粒PB[EGFP]的構成及其受整合酶ΦC31作用后的機理簡圖。
圖2為熒光顯微鏡檢測整合酶ΦC31功能的真核細胞的結果檢測整合酶ΦC31的真核細胞在轉染整合酶ΦC31的cDNA后，48小時后熒光顯微鏡下的結果(見圖2-A)，60小時后熒光顯微鏡下的結果(見圖2-B)。淡灰色表示DAPI染色的細胞核，亮白色表示表達綠色熒光蛋白的細胞。
圖3為流式細胞儀檢測整合酶ΦC31功能的真核細胞的結果檢測整合酶ΦC31的真核細胞在沒有整合酶ΦC31表達，有整合酶ΦC31的表達，48小時后流式細胞儀的結果(圖3-A，B)。陽性對照樣品是只轉染帶綠色熒光蛋白表達的質粒(見圖3-C)。
具體實施例方式
下面結合具體實施例子，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例子僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如薩姆布魯克等人(分子克隆指南實驗室手冊，1998年第二版，科學出版社)，又如斯佩克特等人(細胞實驗指南，實驗室手冊，1998年第二版，科學出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
1、構建重組報告質粒PB[EGFP]通過常規的DNA重組技術，重組報告質粒PB[EGFP]的構建按照以下的步驟首先將attB克隆到pEGFP-N2載體(Clontech公司產品)上，以EcoRI-5′-ACCGGAATTCGTCGACATGCCCGCC-3′和KpnI-5′-AATAACGGTACCGTCGACGATGTAGGTC-3′作為引物，pBCBP+(Calos等構建)質粒為模板，PCR擴增attB序列。用EcoRI和KpnI分別對擴增產物和載體pEGFP-N2進行雙酶切，分別回收DNA片段，并用T4連接酶(TAKARA公司產品)連接。連接產物轉化用氯化鈣法大腸桿細菌Top10，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養過夜后，篩選陽性克隆后用限制性內切酶鑒定，并進行DNA序列測定(Invitrogen公司)。DNA序列分析結果表明PCR產物的attB的DNA序列與SEQ.ID NO.1所示的1-240bp完全相同。命名為attB-EGFP-N2質粒。
其次，將attP克隆到attB-EGFP-N2質粒上，以SpeI-5′-CTAGACTAGTTCGCGCTCGCG-3′和BamHI-5′-CGCGGATCCATCCCCAGAAGCGGTTTTCGGGAG-3′作為引物。pBCBP+(Calos等構建)質粒為模板，PCR擴增attP序列。用SpeI和BamHI分別對擴增產物和質粒attB-EGFP-N2進行雙酶切，分別回收DNA片段，并用T4連接酶連接。連接產物轉化后，篩選陽性克隆后用限制性內切酶鑒定，進行DNA序列測定結果表明PCR產物的attP的DNA序列與SEQ.ID NO.2所示的1-283bp完全相同。命名為attP-attB-EGFP-N2質粒。
最后，將BGH polyA多核苷酸序列克隆到attP-attB-EGFP-N2質粒上，以5′-CCGCTCGAGCATGCATCTAG-3′和5′-CCGGAATTCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTC-3′為引物，pCDNA3.0(Invitrogen公司產品)為模板，PCR擴增BGH polyA的序列。用XhoI和ECoRI分別對擴增產物和質粒attP-attB-EGFP-N2進行雙酶切，分別回收DNA片段，用TG連接酶連接。連接產物轉化后，篩選陽性克隆后用限制性內切酶鑒定，進行DNA序列測定分析結果表明BGH polyA的DNA序列與SEQ.ID NO.3所示的1-329bp完全相同。這樣就構建出了CMVIE-attP-BGH polyA-attB-EGFP的重組報告載體，命名為PB[EGFP]質粒。(見圖1)2.篩選檢測ΦC31重組酶功能的穩定的單克隆真核細胞系293PB[EGFP]通過常規的細胞培養技術，檢測整合酶ΦC31功能的真核細胞的制備按照如下的方法人胚胎腎細胞293細胞系來源于美國細胞保存中心(ATCC，Rockville，MD)，在高糖的10％牛血清的DMEM(Gibcol產品)細胞培養液中，37℃，5％CO2細胞培養箱中培養。當3.5CM的細胞培養板中細胞鋪板率在70％以上時，利用脂質體(Invitrogen公司產品)轉染質粒PB[EGFP]后，經過0.5mg/ml新霉素(G418)篩選16天，挑選出若干個單克隆的細胞系。對那些單克隆報告細胞系293PB[EGFP]用表達整合酶ΦC31cDNA轉染表現綠色熒光的細胞作為驗證方法，確定穩定的單克隆報告細胞系293PB[EGFP]的建立。在沒有整合酶ΦC31存在時，報告細胞在熒光顯微鏡下顯示陰性的結果，在存在活性的整合酶ΦC31時，報告細胞在熒光顯微鏡下顯示陽性的結果(見圖2-A和B)。
3.流式細胞儀檢測整合酶ΦC31功能的真核細胞的結果檢測整合酶ΦC31功能的真核細胞細胞293PB[EGFP]，在高糖的DMEM(Gibcol產品)細胞培養液中，含氨芐青霉素50ug/ml，鏈霉素25ug/ml，小牛血清10％，0.5mg/ml新霉素(G418)，在5％CO2，37℃的細胞培養箱培養。當3.5CM的細胞培養板中細胞鋪板率達到90％時，利用脂質體試劑(Invitrogen公司產品)混合4ug的pCMVint質粒轉染細胞，4-6小時后換新的細胞培養液，培養48-60小時后，PBS清洗細胞，胰蛋白酶消化細胞后，離心收獲細胞。同時設立陰性和陽性的實驗對照，經流式細胞儀檢測，沒有整合酶ΦC31表達細胞顯示GFP陰性結果，有整合酶ΦC31表達細胞顯示GFP陰性結果，熒光細胞的數量與比率可以定量的表示整合酶ΦC31在真核細胞中的活性與功能(見圖3)。
1.SEQ.ID NO.1attB多核苷酸序列1 GTCGACATGC CCGCCGTGAC CGTCGAGAAC CCGCTGACGC TGCCCCGCGT ATCCGCACCC61 GCCGACGCCG TCGCACGTCC CGTGCTCACC GTGACCACCG CGCCCAGCGG TTTCGAGGGC121 GAGGGCTTCC CGGTGCGCCG CGCGTTCGCC GGGATCAACT ACCGCCACCT CGACCCGTTC181 ATCATGATGG ACCAGATGGG TGAGGTGGAG TACGCGCCCG GGGAGCCCAA GGGCACGCCC241 TGGCACCCGC ACCGCGGCTT CGAGACCGTG ACCTACATCG TCGAC2.SEQ.ID NO.2attP多核苷酸序列1 TACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACG61 GGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCA121 ACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCG181 TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGTC3.SEQ.ID NO.3BGH polyA多核苷酸序列1 CTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGC61 TGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTG121 CCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATT181 GCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGC241 AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCT301 TCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGAATTC
權利要求
1.一種用于檢測整合酶ΦC31功能的真核細胞系統，其特征在于是由ΦC31重組報告質粒PB[EGFP]轉染人胚胎腎細胞系293，然后用新霉素G418篩選，挑選出單克隆細胞，發展而成的293-PB{[EGFP]}報告細胞系；其中，ΦC31重組報告質粒PB[EGFP]是利用pEGFP-N2載體，在增強型煙草花葉病毒啟動子CMVIE之后，順序插入特異序列attP和attB，然后在其間加上一段牛生長因子的多聚腺苷酸BGH polyA組成。
2.一種如權利要求1所述的用于檢測整合酶ΦC31功能的真核細胞系統的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)構建重組報告質粒PB[EGFP]首先利用pEGFP-N2載體，在增強型煙草花葉病毒啟動子CMVIE之后，順序插入attP和attB序列，然后在其間加上一段牛生長因子的多聚腺苷酸BGH polyA；(2)建立穩定的檢測整合酶ΦC31的真核細胞系293-PB{[EGFP]}利用上述構建的ΦC31重組報告質粒PB[EGFP]，轉染人胚胎腎細胞系293，然后用新霉素G418篩選，挑選出單克隆細胞，發展成為293[PB-EGFP]報告細胞系。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述構建重組報告質粒PB[EGFP]的步驟如下首先將attB克隆到pEGFP-N2載體上，以EcoRI-5′-ACCGGAATTCGTCGACATGCCCGCC-3′和KpnI-5′-AATAACGGTACCGTCGACGATGTAGGTC-3′作為引物，pBCBP+質粒為模板，PCR擴增attB序列；用EcoRI和KpnI分別對擴增產物和載體pEGFP-N2進行雙酶切，分別回收DNA片段，并用T4連接酶連接，命名為attB-EGFP-N2質粒；其次，將attP克隆到attB-EGFP-N2質粒上，以SpeI-5′-CTAGACTAGTTCGCGCTCGCG-3′和BamHI-5′-CGCGGATCCATCCCCAGAAGCGGTTTTCGGGAG-3′作為引物，pBCBP+質粒為模板，PCR擴增attP序列；用SpeI和BamHI分別對擴增產物和質粒attB-EGFP-N2進行雙酶切，分別回收DNA片段，并用T4連接酶連接；連接產物轉化后，命名為attP-attB-EGFP-N2質粒；最后，將BGH polyA多核苷酸序列克隆到attP-attB-EGFP-N2質粒上，以5′-CCGCTCGAGCATGCATCTAG-3′和5′-CCGGAATTCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTC-3′為引物，pCDNA3.0為模板，PCR擴增BGH polyA的序列；用XhoI和ECoRI分別對擴增產物和質粒attP-attB-EGFP-N2進行雙酶切，分別回收DNA片段，用TG連接酶連接；命名為PB[EGFP]質粒。
全文摘要
本發明屬生物技術和基因治療技術領域，具體涉及一種用于檢測整合酶ΦC31功能的真核細胞系統及其制備方法。該檢測系統由重組報告PB[EGFP]轉染人胚胎腎細胞系293后用G418篩選，挑選出單克隆細胞而獲得，其中，PB[EGFP]是利用pEGFP－N2載體，在增強型煙草花葉病毒啟動子(CMVIE)之后，順序插入特異序列attP和attB，然后在其間加上一段牛生長因子的多聚腺苷酸而構成。該細胞系統可以評估出轉染、轉導、轉化等多種途徑表達的ΦC31整合酶，及其突變體等的活性和功能。該檢測系統操作簡便，準確性高，重復性好，是整合酶ΦC31在哺乳動物細胞中應用的重要定量評估系統。
文檔編號C12Q1/04GK1827781SQ200510112200
公開日2006年9月6日 申請日期2005年12月29日 優先權日2005年12月29日
發明者張茂祥, 朱煥章, 陳金中, 王韌誠, 賈韋國, 薛京倫 申請人:復旦大學