專利名稱：一個和棉花纖維啟始基因緊密連鎖的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一個和棉花纖維啟始基因緊密連鎖的分子標記及其應用。
背景技術：
棉花纖維是世界上最具經濟價值的自然纖維，棉花遺傳改良的最終目標是提高棉花纖維的產量和品質.
每一根棉纖維是由棉花胚珠外珠被上的單個表皮細胞分化和發育而成的，但并不是所有的胚珠表皮細胞都分化形成纖維細胞，據報道只有約30％胚珠表皮細胞分化和發育成纖維(Tiwavi SC，Wilkins TA.Cotton(Gossypium hirsutum)seedtrichomes expand via diffuse growing mechanism.Can J Bot，1995，73746-757)，棉纖維的發育大致可分4個有重疊的階段表皮細胞的起始，伸長(初生細胞壁的合成)，次生細胞壁的合成和纖維的成熟.成熟棉纖維的90％是纖維素，果膠，半纖維素，蠟質，蛋白質和無機鹽等其他物質也參與纖維的組成.纖維發育過程中，因此表皮細胞(纖維)突起的數目，纖維素沉積的量及其與其他物質結合的特性直接影響棉纖維的產量和品質.這些生物大分子在纖維細胞中的合成和積累，不但受到環境因素的影響，而且還受到相關基因特別是纖維特異表達基因的調控.前人已經對棉纖維發育進行了大量的研究，尤其是超微結構的分析使我們對棉纖維的形態發育有了比較完整的了解(Ryser，U.1999.Cotton fiberinitiation and histodifferentiation.In A.S.Basra(ed).Cotton Fibers.Haworth Press，New York，pp.1-45.)因此纖維也是研究細胞命運決定、植物細胞伸長和細胞壁生物合成的理想模式材料(Kim HJ and Triplett BA(2001)CottonFiber Growth in Planta and in Vitro.Models for Plant Cell Elongation andCell Wall Biogenesis.Plant Physiology，1271361-1366，)。但迄今為止我們對棉纖維發育的機制尤其是分子機制還知之甚少。克隆棉花纖維相關基因，尤其是控制纖維原始細胞起始和纖維快速伸長的基因，對于棉花纖維發育的分子生物學研究，以及為基因工程改良纖維產量和品質具有重要義.
因為纖維細胞在細胞形態上發生變化之前，細胞內部已經發生一系列生理生化變化，所有纖維細胞開始分化的時間通常在形態學上難以確定，已經報道的分化啟始時間也隨所用鑒定的方法而不同。Aiyangar(Aiyangar G S.1951.Originand development of lint andfuzz in cotton.Indin J Agr Sci，21293-312.)觀察到開花前16h，胚珠合點端發生了纖維分化，開花前10-12h珠孔端細胞才分化。Stewart(Stewart，J.M.1975.Fiber initiation on the cotton ovule(G.hirsutum).Am.J.Bot.62723-730.)通過掃描電鏡觀察到在開花當天陸地棉處在纖維啟始的球型膨脹期。后來Ramsey和Berlin(1976)觀察了開花前16d到開花當天胚珠的亞顯微結構，發現開花前16d到前3d的表皮細胞變化不大，其細胞核和細胞質均顯示出密集的電子物質，透射電鏡下觀察細胞呈現的黑暗程度相近。有的研究結果則認為開花前三天就已經開始發生纖維啟始(Graves，D.A.，andJ.M.Stewart.1988a.Chronology of the differentiation of cotton(Gossypiumhirsutum L.) fiber cells.Planta 175254-258.)。生化分析暗示在開花之前幾天就可以檢測到纖維啟始相關的變化(Graves，D.A.，and J.M.Stewart.1988b.Analysis of the protein constituency of developing cotton fibers.J.Exp.Bot)。總之，纖維原始細胞在開花以前已經分化形成這點是可以確定的。
Lang(1938)很早就發現胚珠不同部位纖維細胞的分化有早有遲，開花后首先在胚珠的合點端出現纖維突起，隨后在珠孔端出現纖維突起。后來Joshi(1963)報道了相同的觀察結果，Stewart(1975)用掃描電鏡觀察則發現，纖維細胞首先在胚珠的珠柄分化，然后向四周發展，最后在珠孔端。單廣福等(1999)也發現纖維細胞的突起一股首先在胚珠脊突處開始，再向四周發展，最后延至珠孔端。開花前1天的胚珠，其表面只能看到氣孔，未見纖維突起。長纖維細胞突起的時間，一般在開花當天。必須強調的是不能把纖維突起時間與纖維細胞分化時間混為一談，纖維分化發生在突起之前(杜雄明等，2000)。另外，胚珠表面會發生若干輪次的纖維細胞的啟始(Stewart，J.M.1975.Fiber initiation on the cotton ovule(G.hirsutum).Am.J.Bot.62723-730.)。
纖維細胞啟始或者說分化的早晚直接影響胚珠上成熟纖維的長度，早期分化的纖維形成長纖維(lint)，而后期分化的纖維成為短絨(fuzz or linters)，短絨的分化過程與長纖維基本相似，但其分化時間較晚，常在開花后5-10d才出現，長度僅為0.5cm。短絨細胞的液泡內累積有色素物質，變得較暗，細胞壁相對較薄。而長纖維具有厚的細胞壁，細胞大的中央液泡內不存在色素物質，變得更加透明。在干燥時，長纖維變得扁平，中央液泡消失；長纖維的次生壁厚度是均勻的，在纖維基部，細胞壁逐漸變薄，有至胚珠表皮下面，幾乎或完全沒有了次生壁加厚；長纖維在干燥時，沒有次生壁把細胞固定在表皮之下，所以纖維著生在胚珠上是不牢固的，容易軋掉；而短絨纖維的較厚次生壁，一直延伸到胚珠表皮下的細胞根部，次生細胞壁與相鄰的無纖維細胞緊密結合、牢固地植根于表皮里，軋花時不易軋掉。
纖維原始細胞核仁在大小和結構上都發生巨烈的變化，細胞核的體積增大。核仁增大，環形的(ring-shaped)核仁是纖維原始細胞分化過程后期的典型特征，很大部分纖維伸長時需要的核糖體可能在這個時期形成。開花當天.纖維原始細胞內質網、高爾基體和核糖體數目明顯增加，這可能與細胞壁多糖的生物合成有關(Berlin，J.1976.The outer epidermis of the cotton seed. In J.Mauneyand J.M.Stewart(ed.)Cotton physiology.The Cotton Foundation，Memphis，TN.p.375-414.)。
纖維原始細胞的數量關系到棉于上著生纖維的根數，也關系到每粒棉子的纖維重量。盡管所有的表皮細胞(除氣孔保衛細胞和珠孔細胞外)都是潛在的纖維原始細胞，但并非所有的都能分化成纖維。每一個胚珠大約有10％-25％的表皮細胞最終分化發育成單細胞的表皮毛(trichome)也就是棉纖維(Ryser，U.1999.Cottonfiber initiation and histodifferentiation.In A.S.Basra(ed.).CottonFibers.Haworth Press，New York，pp.1-45)。胚珠上的纖維數隨棉種和品種不同有較大差別。胡競良指出，亞洲棉一粒種子上纖維為1200-3300根，海島棉為8000-16000根(胡競良，1958)。亞洲棉棉子上纖維分布比較均勻，陸地棉棉子上纖維分布在合點端較密，在珠孔端較少。海島棉則中部較多，兩端較少。
植物激素對棉花胚珠和纖維的發育有很大影響。棉花胚珠離體培養技術的使用大大促進了激素對纖維分化與發育的作用的研究。激素的影響主要從兩個方面進行研究，一是從棉鈴或胚珠中分離和鑒定內源激素；二是用外源激素處理完整植株或離體培養胚珠與器官。早期有關激素的研究主要集中在棉鈴的發育和脫落兩個方面。Beasley和Ting(1974)通過對受精和未受精胚珠的離體研究認為未受精胚珠需要額外添加IAA才能長出纖維，而受精胚珠自身可以產生IAA，因而認為生長素(Auxins)對纖維的產生起著重要的作用。生長素和赤霉素(Gibberelins)，這兩種激素單獨或協同都可以促進未受精胚珠的纖維啟始，他們的效應是累加的(Beasley等，1974)。把未受精胚珠離體培養在含有赤霉素生物合成抑制劑的條件下，即使在有生長素的情況下也不會發生纖維起始(Sharma等，1995)，這表明在缺乏內源赤霉素的情況下，生長素并不足以發動纖維的啟始(Ryser，1995)。而近來有研究者發現，未受精胚珠在不添加任何激素的條件下即可見大量纖維的啟始，開花前進行IAA處理可以大大的增加纖維的啟始，他們認為植物激素和受精也許是纖維的生長所必需的，但卻并不為纖維的啟始所必需(Gialvalis和Seagull，2001)。這種觀點與以往的研究結果截然相反，期待更多證據的支持。
棉花原產亞熱帶，溫度是制約棉纖維分化和發育的主要因素，低溫會對纖維分化和發育產生不利影響。同一品種的不同棉株間，同一棉株的不同部位的棉鈴間，同一棉鈴的不同瓣位的棉子間，甚至同一棉籽的不同部位，其纖維發育的差異主要由發育期間的溫度差異引起的(杜雄明和潘家駒，2000)。
徐楚年等(1987)通過分期取樣發現溫度影響纖維分化。纖維細胞的分化隨溫度的升高而加強，纖維分化的最適溫度為25-30℃，當溫度達到40℃或低于15℃時纖維細胞的分化受到抑制，甚至完全停止分化(董合忠等，1989)。
基因型與纖維分化和發育有密切關系。纖維細胞突起時間，種和品種間有很大差異，品種鈴期早晚與分化關系尤為密切，鈴期越短，纖維分化越早(杜雄明和潘家駒，2000；董合忠等，1989)。然而，Applequist等(2001)研究結果卻認為在不同的種之間，纖維啟始的時間是相似的，并且纖維原始細胞的形狀、大小和密度都是比較相似的。
到目前為止，控制纖維原始細胞啟始的基因仍然沒有得到鑒定。一般正常的棉花上會產生長纖維和短絨，人們也發現了一些不產生長纖維或短絨或既無長纖維也無短絨的突變體。已鑒定N1和n2兩個位點控制短絨的表現，N1_和n2n2的基因型都可以產生光子即無短絨的性狀(Fuzzless)，但是可以產生長纖維(Percyand Kohel 1999)。N1和n2分別位于一對同源的染色體(homologous chromosomes)12和26上。Turley和Kloth(2002)報道了控制短絨的表現第三個位點n3。至少12，17，18，20和26五條染色體上包括有控制短絨的性狀的位點，短絨的性狀的遺傳控制是相當復雜的，對不同位點的互作目前也知之甚少(Turley和Kloth，2002)。
目前已報道的無絨無絮突變體包括Line L40(Musaev and Abzalov 1972)，Mcu。5(Nadarajan and Rangasamy 1988)and XZ142w(張天真和潘家駒，1991)，SL-171(Percival，1987)，MD17(Turley，2002)。Mcu.5的無纖維性狀可能由兩至四對基因控制(Nadarajan and Rangasamy 1988)。
徐州142無絨無絮突變體是從陸地棉徐州142中發現的。除了種子無短絨無纖維外，突變體在表型上與野生型徐州142沒有區別。張天真和潘家駒(1991)認為是由兩對隱性互作基因控制，其中一對基因控制長纖維的表現，另一對控制短絨的表現，并且它的顯性等位基因對控制無纖維性狀的隱性基因有顯性上位作用。等位性測驗結果表明，無絮棉的隱性無短絨基因和N1表現為非等位.但表現出是n2的等位基因。Du等(2001)認為突變體的無纖維性狀由兩個位點Li3和Li4所控制，TM-1基因型為Li3Li3Li4Li4，突變體基因型為li3li3 li4li4，他們認為長纖維的發育至少需要這兩對基因中的一對，這兩對基因也調節短絨的表現，因此，li3li3li4li4抑制長纖維的發生，也不產生短絨，并且不存在長纖維而不產生短絨的表現型。
fls突變體(SL-171)不能產生長纖維也不產生短絨，但是除了在所有的器官中有更多的紅色色素的沉積外，在生長速率，發育，開花時間以及種子和鈴的大小等方面都和正常的植株是相似的(Ruan和Chourey，1998)。Ruan和Chourey(1998)在開花前一天對正常的長纖維的品種FLS和無纖維去雄，在花后15天觀察未受精的種子，FLS的種子產生了大量的纖維而fls的種子沒有纖維，從而證明了FLS長纖維和fls不長纖維這兩個性狀都是由母方基因型所控制野生型胚珠中蔗糖合酶基因的表達產物含量較高，而在突變體胚珠中未檢測到其表達產物(Ruan和Chourey，1998)。通過正常的棉花品種與無纖維棉花品種SL-171的蛋白譜的比較，Turley和Ferguson(1996)找到5個能產生纖維品種在開花當天或開花后胚珠特有的蛋白質。
胚珠可溶性蛋白質譜的復雜性在開花前三天開始增加，自這時候至2dpa，可溶性蛋白質譜相比來說比較相似，到2dpa蛋白質譜的復雜性再一次增加(Gravesand Stewart，1988b)。蛋白質譜的復雜性在開花前三天的這次增加與纖維的啟始相對應，而2dpa的這次增加與纖維細胞伸長的開始相對應(Graves andStewart，1988a)。
圖位克隆(map-based clonig)，又稱定位克隆(positoinal cloning)，1986年首先由劍橋大學的Coulson提出(Coulson等，1986)。圖位克隆方法可以在基因產物未知的情況下，根據功能基因在基因組中的位置進行的，在利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因定位到染色體的1個具體位置的基礎上，通過構建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標記，不斷縮小候選區域進而克隆該基因。
圖位克隆方法的應用需要具備以下幾個條件具有高密度的分子標記圖譜；具有YAC或BAC文庫及物理圖譜；親本間具有較高多態性的分離群體等。圖位克隆技術主要包括以下6個步驟
I.尋找與目標基因緊密連鎖的分子標記。利用目標基因的近等基因系或分離群體分組分析法(BSA)進行連鎖分析，篩選出目標基因所在局部區域的分子標記，最好兩側都能找到緊密連鎖的標記。培育特殊的遺傳群體是篩選與目標基因緊密連鎖的分子標記的關鍵環節。
II.篩選含有大插入片段的基因組文庫。常用的載體有柯斯質粒(cosmid)，酵母人工染色體(YAC)以及P1，BAC，PAC等幾種以細菌為寄主的載體系統。用與目標基因連鎖的分子標記為探針篩選基因組文庫，得到陽性克隆。
III.構建目的基因區域跨疊克隆群(contig)。以陽性克隆的末端作為探針基因組文庫，并進行染色體步行，直到獲得具有目標基因兩側分子標記的大片段跨疊群。
IV.目的基因區域的精細作圖。通過整合已有的遺傳圖譜和尋找新的分子標記，提高目的基因區域遺傳圖譜和物理圖譜的密譜的密度。
V.目的基因的精細定位和染色體登陸。利用側翼分子標記分析和混合樣品作圖精確定位目的基因。接著以目標基因兩側的分子標記為探針通過染色體登陸獲得含目標基因的陽性克隆。
VI.目標基因的鑒定。陽性克隆中可能含有多個候選基因，待找出侯選基因后，把這些侯選基因進行下列分析以確定目標基因(1)精確定位法檢查cDNA是否與目標基因共分離；(2)檢查cDNA時空表達特點是否與表型一致；(3)測定cDNA序列，查詢數據庫，以了解該基因的功能；(4)篩選突變體文庫，找出DNA序列上的變化及與功能的關系；(5)進行功能互補實驗，通過轉化突變體觀察突變體表型是否恢復正常或發生預期的表型變化。最直接的證明是進行功能互補實驗。
近幾年來隨著擬南芥基因組測序工作的完成，各種分子標記的日趨豐富和各種數據庫的完善，在擬南芥中克隆一個基因所需要的努力已經大大減少了，目前整個擬南芥的圖位克隆過程可以在一年內完成(Jander等，2002)。圖位克隆技術(Map-based cloning)已經發展成熟，成為克隆植物基因的常規方法，在擬南芥，水稻等模式植物和重要農作物的重要性狀基因克隆上發揮著重要的作用。
棉花上已經建立了一些的分子標記連鎖圖，目前已有多套棉花分子遺傳圖譜報道。Reinisch等在1994年報道了的第一張詳盡的棉花種間圖譜，Shappley等(1996)的第一張陸地棉種內棉花圖譜，Altaf等(1997)的第一張根據棉花三種雜交后代分離群體繪制的基因圖譜，Zhang等利用其培育的第一個異源四倍體栽培棉種加倍單倍體永久性分離群體繪制的路SSR及RAPD分子圖譜。Kohel等利用陸地棉(TM-1)與海島棉(3-79)種間雜種分離群體，構建了含355個DNA標記，覆蓋4766cM，分布有50個連鎖群的遺傳圖譜。Lacape等(2003)利用陸地棉與海島棉種間回交群體構建的遺傳圖譜，包括465個AFLPs，229個SSRs，192個RFLPs以及2個形態標記共888個位點，總長4400cM。Zhang等(2002)利用栽培陸地棉和海島棉分離群體構建的具有489個標記位點，覆蓋3314.5cM遺傳距離的分子圖譜。最近，Rong等(2004)報道了一個迄今為止最為詳盡的圖譜，四倍體圖譜包含了2584個位點，分布在26個連鎖群，與單倍體的染色體數相同，26條染色體中有20條染色體已經鑒定。圖譜總長4447.9cM，平均圖距1.72cM，相當于標記之間的距離為660kb(估計基因組大小在2700MB的基礎上)。目前，已構建了海島棉Pima S6和陸地棉Acala Maxxa和Tamcot GCNH，以及二倍體DD基因組G.raimondii的BAC文庫(Tomkins等，2001；http://www.plantgenome.uga.edu/cotton/CottonDBFrames.htm)。因此，進行棉花基因的圖位克隆的基本條件也基本具備，但是僅僅有少部分性狀被初步定位，南京農業大學棉花研究所在國際上首次報道篩選到一個與胞質雄性不育育性恢復基因Rf1連鎖的分子標記OPV15300(郭旺珍等，1997)，近來獲得更緊密的5個標記(Liu等，2003)；Karaca等(2002)把Ligon無纖維性狀定位在到22號染色體上，一個SSR標記與性狀相距12.5(cM)；還有眾多的QTL性狀已經進行分子標記定位(見郭旺珍和張天真，2003)。然而，迄今為止在棉花上卻并沒有成功利用圖位克隆方法克隆到基因的例子。其中最主要的原因是不能有效地獲得與目標基因緊密連鎖的分子標記，Single nucleotidepolymorphism(SNP)是植物基因組高密度存在的DNA多態性，dCAPS(derivedcleaved amplified polymorphic sequence)標記正是一種簡單有效的檢測SNP的方法，((Neff MM dCAPS，a simple technique for the genetic analysis ofsingle nucleotide polymorphismsexperimental applications in Arabidopsisthaliana genetics.Plant J.1998 May；14(3)387-92.)已經被廣泛應用到在擬南芥和水稻等遺傳作圖，分子標記輔助育種和進化分析等方面。但是在棉花重要農藝性狀基因圖位克隆上的應用還很少見文獻報道。dCAPS技術不僅應用于遺傳作圖，還可以幫助育種家選擇優良品系。(Young-Hoon Park Detection of singlenucleotide polymorphism(SNP)controlling the waxy character in wheat byusing a derived cleaved amplified polymorphic sequence(dCAPS)marker(MolGen Genomics(2005))，該方法以PCR技術為基礎，具有簡單方便高效的特點，是一種共顯性標記，在精細定位基因時有著其他顯性標記無法比擬的優勢。
mRNA差異顯示技術(DD)是研究不同細胞、不同器官之間以及不同環境條件下基因表達差異的有效方法，近年來被廣泛應用于真核生物差異表達基因的規模化分離鑒定。
棉纖維生長和發育的遺傳機制，為棉花產量的提高和品質的改善打下基礎這個強大的動力作用下，棉纖維特異基因的分離一直以來都是棉纖維研究的重點和熱點。棉纖維的發育和品質形成可能與成百上千個基因的表達相關(John，1996)，但迄今為止，不同的研究者雖然得到了一些棉纖維特異或優先表達基因，但其中絕大多數基因的功能尚不清楚，而對與纖維啟始相關的基因則知道得更少。
孫杰等(2004)用以陸地棉品種TM-1開花后9d、21d、27d三個不同發育時期的棉花纖維為材料，利用mRNA熒光差異顯示技術，篩選到109個差異顯示的cDNA片段。然后利用反Northern和Northern分析，證實了20個克隆的差異表達，這些克隆多數是未見報道的新基因。
Ji等(2003)以陸地棉徐州142和它的無長纖維無短絨突變體(fuzless-lintless，fl)為實驗材料，選用開花后10天棉花纖維伸長速度最快的陸地棉纖維與fl突變體胚珠作為起始材料，用PCR-Select cDNA Subtraction方法獲得了纖維特異的cDNA減法庫；從減法庫隨機挑取616個克隆，測序得到280個獨立基因；PCR擴增出這些基因片段，用機械手點到尼龍膜上，形成Array；分別以纖維和胚珠的總cDNA為探針進行雜交，分離到172個纖維特異或高表達的基因，為闡明棉花纖維發育的分子機制，為基因工程改良棉花品質奠定了物質基礎。
秦治翔等(2003)以陸地棉品種“徐州142”為材料，用mRNA差異顯示技術分析其基因表達差異，找到5個cDNA片斷可能與棉纖維次生壁增厚相關。
這些基因的分離鑒定為研究棉纖維發育的分子機理增添了新的試驗依據。從cDNA文庫中篩選其全長cDNA，通過RNAi和過量表達技術等手段可以進一步探討這些基因的細胞內功能，并從中尋找與纖維伸長和次生壁合成密切相關的重要功能基因。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一個和棉花纖維啟始基因緊密連鎖的分子標記。
本發明所提供的和棉花纖維啟始基因緊密連鎖的分子標記，是一個dCAPS標記，名稱為dCAPS-366，來源于棉花，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №1由763個脫氧核苷酸組成。
含有dCAPS-366的表達載體、細胞系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。
本發明的分子標記dCAPS-366可用于棉花分子標記輔助育種，加速棉花纖維改良的進程。
圖1為棉花種子纖維表現型圖2為雙雜合體后代分離示意3為TM-1開花當天胚珠表皮細胞圖4為14-3無絮突變體開花當天胚珠表皮細胞圖5為cDNA-AFLP分析篩選有絮和無絮植株的特異表達基因片段結果圖6為電泳分析dCAPS產物具體實施方式
實施例1、dCAPS-366的獲得一、實驗材料1、一個棉花纖維發育啟始突變體的及其近等基因系的產生2000年中國科學院遺傳研究所何鑒星課題小組在棉花種間雜交育種圃中，發現一個來自于種間雜種陸地棉×索馬里棉(G..somalense)的衍生后代14-3的變異單株，該單株種子短絨減少，長纖維及其他特征與正常的陸地棉相同。其自交呈15有絮1無絮(Fuzzless-lintless)的分離，推測無絮是由兩對隱性基因控制，14-3為雙雜合體。有絮的植株可分為有短絨有絮(Fuzzy-linted)和無短絨有絮(光子有絮，Fuzzless-linted)兩類(圖1；1.短絨減少有長纖維，2.有短絨有長纖維，3.無短絨有長纖維，4.無短絨無長纖維)，其中2/16的有絮無短絨經過自交子代驗證表現為單基因雜合體的分離，分離比為1短絨減少(Tufted)2光子有絮1無絮，子代驗證的結果表明短絨減少和無絮的植株為純合體，后代不分離，而光子有絮的植株為雜合體，后代仍按照1∶2∶1。控制無絮的基因暫定名為fi1和fi2，雙雜合體Fi1fi1Fi2fi2自交的遺傳如圖2。
14-3無絮突變體是一個纖維發育起始突變體，種植在北京的棉花開花當天早上8點，野生型棉花胚珠表皮細胞已經有大量的纖維原始細胞突起(圖3)，14-3無絮突變體幾乎沒有纖維突起(圖4)。
2、定位群體F2定位群體是由光子有絮自交而獲得(見圖1)，由何鑒星課題組構建。從2000株F2個體中，鑒定各單株纖維的表現型，并用采用卡方分析計算分離比例的統計顯著性，每株取3克左右的嫩葉，用來提取DNA。群體有株隱性純合個體，株顯性純合個體，株雜合個體構成。
二、cDNA-AFLP分析篩選有絮和無絮植株的特異表達基因片段1、棉花胚珠總RNA的提取和DNase處理為了分離和纖維啟始相關的特異表達基因，采用對開花前一天的有絮和無絮植株的胚珠進行差異表達分析。
棉花胚珠總RNA提取采用QIAGEN公司RNA提取試劑盒，按商家的流程操作并進行DNase I處理。
2、cDNA-AFLP分析1)雙鏈cDNA的合成雙鏈cDNA的合成采用Clonetech的試劑盒SMARTTMcDNA synthesis kit進行，所有的步驟按照試劑盒的程序操作，PCR擴增第二鏈時采用18個循環，雙鏈產物用酚和氯仿純化乙醇沉淀，最后用30μl滅菌雙菌水溶解，用eppendorf分光光度計測量濃度。
2)cDNA-AFLP步驟雙鏈cDNA用量為每反應800ng，采用的酶組合為PstI/MseI酶切每個反應總體積為20μL，其中包括cDNA 800 ng的PstI和MseI(Biolab)各2.5U，1.0×反應Buffer(緩沖液)。37℃溫浴3hr。
連接酶切反應后，每個cDNA樣品加入20μL連接混合液，包括復性的PstI雙鏈接頭(5μmol)和MseI雙鏈接頭(50μmol)各1μl，T4DNA連接酶0.4U(Takara，大連寶生物)，1×連接Buffer。常溫過夜，連接產物稀釋10倍，-20℃保存備用。
預擴增預擴增引物序列如下P00引物5’-GACTGCGTACATGCAGA-3’
M00引物5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’20μL的擴增體系包括5μL連接稀釋液，P00和M00各50ng，1×PCR Buffer，Taq酶(MBI)0.4 U，dNTP(2mmol)1μL。在PTC-220(MJ RESEARCH公司，美國)PCR儀上擴增94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，共20個循環。預擴增產物稀釋50倍，-20℃保存備用。
選擇性擴增選擇性擴增引物序列如下PstI引物5’-GAC TGC GTA CAT GCA GCA T-3’MseI引物5’-GAT GAG TCC TGA GTAA CTC-3’20μL的擴增體系包括5μL預擴增稀釋液，PstI引物30 ng，MseI引物60ng，dNTP(2mmol)2μL，Taq酶(TAKARA)1.0 U，1×PCR Buffer。按如下PCR程序擴增94℃30 s，65℃30 s，(每循環降低0.7℃)，72℃60 s，12個循環后變為94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，23個循環。
電泳擴增反應結束后，取4μl擴增產物在1.5％的瓊脂糖膠上檢測20min-30min，如果產物為一條橫跨溴酚蘭的彌散(Smear)則可以繼續下一步實驗。20μl的PCR產物加入12μl的上樣緩沖液，混勻取4-6μl上樣。在6％的變性聚丙烯酰胺凝膠(含1倍的TBE)上分離，恒定功率100W條件下，電泳2.5hr左右(或二甲苯氫指示劑距離凝膠底部約1/3處)。
試劑5％丙烯酰胺(19∶1)丙烯酰胺(Acr) 47.5gN’，N’-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)2.5g5×TBE 200尿素420g加ddH2O至1000ml10％過硫酸銨上樣緩沖液98％去離子甲酰胺10mM EDTA(pH8.0)0.01％二甲苯青
0.01％溴酚藍6％的序列膠配制(90ml)5％Acr-Bis(19∶1) 90ml10％過硫酸銨450μlTEMED 45μl3)銀染電泳結束后，將帶膠的玻璃板放入固定液中，輕輕搖動至指示劑顏色褪去。用超純水沖洗膠板2次，每次3min。將沖洗后的膠板放入染色液(2升水中加入2克硝酸銀、3.0mL37％甲醛)中，輕輕搖動32min。將染色后的膠板放入超純水中漂洗5-10s后立即轉入裝有1升顯影液(2升水中加入60g的無水碳酸鈉，用前加3.0mL37％的甲醛和400μL濃度為10mg/ml的硫代硫酸鈉)的塑料盒中，輕輕搖動至第一條帶紋出現，更換另1升顯影液繼續顯影至帶紋清晰。放入前述固定液中，輕輕搖動約2min。用超純水沖洗2次，即可室溫下自然干燥。干燥后拍照或掃描。
干膠膠板置于室溫，避光，晾干。
試劑固定液10％冰乙酸2,000ml染色液硝酸 2g甲醛 3ml加ddH2O至2,000ml，顯影液Na2CO360g加ddH2O至2,000ml，冰浴，用前加入甲醛 3ml10％Na2S2O4·H2O 400μlcDNA-AFLP分析篩選有絮和無絮植株的特異表達基因片段結果如圖5所示，通過cDNA-AFLP在開花前一天近等位基因系間的表達分析，發現該基因片段在兩材料中擴增有差異，即圖5野生型材料中擴增出基因片段，在突變體中沒有擴增出該片段，但是進一步用該片段內部合成特異引物擴增兩個材料均有相同產物出現，由此推測cDNA-AFLP差異產物很可能由材料間SNP引起。
三、cDNA-AFLP差異片段RACE-PCR分析
1、差異顯示條帶的回收、克隆與序列測定將感興趣的條帶用手術刀切下置于0.5ml eppendorf管中，加入200μl的TE(pH 8.0)，60℃水浴放置1hr，10,000rpm離心2分鐘，取5-10μl做PCR，所用引物及反應條件同前。PCR產物經切膠純化后，克隆到pGEM-T vector(Promega)中。測序儀為ABI PRISMTM377 DNA Sequencer或ABI 3730 DNA Sequencer，序列由博亞公司(上海，中國)2、測序cDNA片段全長獲得依照(BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual Cat.No.634914or K1811-1)KIT說明書操作。
3、比較突變體和野生型序列差異在網站(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/)上完成序列比較分析。經cDNA-AFLP差異片段RACE-PCR分析證實引起cDNA-AFLP擴增差異的原因是突變體材料在PstI引物中第三個選擇性堿基由T轉變成C，其他序列均無變化。經驗證發現該轉錄產物的基因組序列和cDNA序列完全一致。
四、設計dCAPS引物并用作圖群體驗證1、引物設計和內切酶的選擇在網站(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)上用dCAPS Finder 2.0實現。dCAPS引物1CCATGTCTTCACGACCTGCAGCC；dCAPS引物2CTCTTCTCCCCTTTTCAGTCGGATG。
2、棉花總DNA的提取分別從153株個體構成的群體中提取基因組DNA。
2-3g幼嫩的棉吐從田間采回后貯存在液氮中，液氮研磨，加入15mL預熱的提取緩沖液和大約20mg活性炭，在70℃水浴中溫浴1小時。
加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1，v/v)，在室溫混合搖床混勻30分鐘到1小時，然后15 000×g4℃室溫離心10分鐘。
上清液轉移至新的離心管，加入等體積的異丙醇-80℃沉淀1hr或在-20℃過夜。
絮狀的DNA用槍頭挑出，用預冷的76％乙醇+0.2M醋酸鈉，和100％乙醇順序洗一篇，每次20min并置于搖床上輕微振蕩。
把DNA團風干，溶于5mL高鹽TE(在60℃水浴放置1to 2hr)。
溶于高鹽TE的DNA溶液加入等量的未加β-巰基乙醇的提取緩沖液，在搖床上至少振蕩2hr。
用異丙醇沉淀DNA，并對DNA重復第4步的處理。
把DNA團風干后重新溶解于50到250μL TE，(注不含NaCl)，包含RNaseA(20μg per 100μL of DNA solution)。
測OD230、OD260和OD280來計算DNA的含量和推測其質量，并在0.8％的瓊脂糖膠上進行電泳檢測。
提取緩沖液0.1 M Tris-HCl，pH 8.0；M NaCl；0.02 M EDTA，pH 8.0；2％(w/v)CTAB(十六烷基二乙溴化銨)；2％(w/v)polyvinlypyrrol idone-40；1 mMl，10-phenanthroline；0.2％(v/v)β-巰基乙醇高鹽TE10mM Tris，pH 8.0；1mM EDTA，pH 8.0；1 M NaClPCR后內切酶選擇DdeI和AluI(排除另一PCR干擾產物)(NEB buffer2)目前對32株顯性純合個體，28株隱性純合個體和93株雜合個體進行連鎖分析部分結果如圖6所示，通過對由153株個體構成的群體分析，發現dCAPS標記(命名GhdCAPS-366(序列表中的序列1))為與棉花纖維啟始基因共分離，接下來的工作是擴大群體范圍，檢驗GhdCAPS-366在大群體中分離比例，希望證實GhdCAPS-366是一個和目標基因連鎖非常緊密的標記，為棉花纖維啟始基因的圖位克隆奠定堅實基礎，另外也在努力將該標記轉換成一個可以用于分子標記輔助育種程序的實用標記。也嘗試用cDNA-AFLP-EST去發展其他標記來服務于棉花纖維啟始基因的圖位克隆。
序列表<160>1<210>1<211>763<212>DNA<213>棉屬棉花(Gossypium L.)<400>1ttttttttag ggttttcaaa gtctgatcaa ttttgtaaga cccaatttgg cccggattat 60tcattcaaaa acccaaattt aaaccagatc atcaaatgag tccatttaca aataagccca120aatacccaat tacataaaac aacccaaaat acaagccaag ttacaaatgg cccaacaaca180ctaggcccaa attcgaaaac tctagggttt cgcgccgcag caatggccac caacagcctc240catacaccac gcacgacctc cgactcgcgc attgctctcc ccacgtccgt attctccgcc300cccatgtctt cacgacctgc agcataagca aaatggccaa aaaccgcatg ttttggggta360taaagcctct gaattttgat tgtaaagggt ttttttttta ctcttttttt tgagagaaat420tgaatatgga ttgagtacga aaaagcacgg aaacaaaatt gattcaaaca agatcttttg480aaggtgatta tttttctatc tttgattttc tttcggtttt tttatttcat tctttttata540tacgaatttc aaaaagtaag agaagggaag tacctgttat cgtgagctcg tcgccggaat600cgggccttca tcagtggcca tggcgcgaca aatcttcgac aggatcggtg ccgactgaaa660aggggagaag aggaggcgtg agttaaaagt atctcaaaag ttttttttaa agaaaaaaac720aaacaagaat tgaaatgttt ttaagcaaaa agttttcccg cgt 76權利要求
1.一個和棉花纖維啟始基因緊密連鎖的分子標記，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的分子標記，其特征在于所述分子標記具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.含有權利要求1所述的分子標記的表達載體。
4.含有權利要求1所述的分子標記的細胞系。
5.含有權利要求1所述的分子標記的宿主菌。
6.權利要求1或2所述的分子標記在棉花育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一個和棉花纖維啟始基因緊密連鎖的分子標記及其應用。該和棉花纖維啟始基因緊密連鎖的分子標記，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發明的分子標記可用于棉花分子標記輔助育種，加速棉花纖維改良的進程。
文檔編號C12N5/10GK1952128SQ200510113000
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月18日 優先權日2005年10月18日
發明者陳明生, 石金鋒 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所