專利名稱：凋亡特異性elF－5AsiRNA和反義多核苷酸在抑制/阻抑炎癥反應中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及到凋亡特異性真核起始因子(eIF-5A)，或者稱為“凋亡特異性eIF-5A”或“eIF-5A1”和腐胺縮賴氨酸(deoxyhypusine)合酶(DHS)。本發明涉及到凋亡特異性eIF-5A和DHS核酸和多肽，以及抑制凋亡特異性eIF-5A和DHS表達的方法。
背景技術：
凋亡是由基因決定的細胞程序性死亡，可通過明確的形態學特征加以鑒定，例如細胞收縮、染色質凝縮、核破碎和膜起泡。(Kerr etal.(1972)Br.J.Cancer，26，239-257；Wyllie et al.(1980)Int.Rev.Cytol.，68，251-306)凋亡在常規組織的發展和內環境穩定(homeostasis)中起重要作用，并且凋亡程序中的缺陷被認為與許多種人體紊亂有關，其范圍包括從神經退行性疾病和自身免疫紊亂直到腫瘤。(Thompson(1995)Science，267，1456-1462；Mullauer et al.(2001)Mutat.Res，488，211-231)盡管凋亡細胞的形態學特征已被充分鑒定，但對調節這個過程中的分子途徑的闡明還剛剛開始。
有一組蛋白被認為在凋亡過程中起關鍵作用，即半胱氨酸蛋白酶，術語為胱冬酶，大多數凋亡途徑似乎都需要該酶。(Creagh&Martin(2001)Biochem.Soc.Trans，29，696-701；Dales et al.(2001).Leuk.Lymphoma，41，247-253)。通過裂解多種細胞蛋白，胱冬酶在響應凋亡刺激的過程中引發凋亡。裂解多種細胞蛋白引起典型的凋亡表現，包括細胞收縮、膜起泡和DNA破碎。(Chang&Yang(2000)Microbiol.Mol.Biol.Rev.，64，821-846)促凋亡蛋白例如Bax或Bak也在凋亡途徑中起重要作用，它們通過釋放胱冬酶-活化分子，例如線粒體細胞色素c，從而啟動通過凋亡途徑的細胞死亡。(Martinou&Green(2001)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，2，63-67；Zou et al.(1997)Cell，90，405-413)抗凋亡蛋白例如Bcl-2通過拮抗前凋亡蛋白(Bax或Bak)的活性來啟動細胞存活(survival)。(Tsujimoto(1998)Genes Cells，3，697-707；Kroemer(1997)Nature Med.，3，614-620)BaxBcl-2的比值被認為是決定細胞命運的因素之一；過量的Bax啟動凋亡而過量的Bcl-2啟動細胞存活。(Salomons et al.(1997)Int.J.Cancer，71，959-965；Wallace-Brodeur&Lowe(1999)CellMol.Life Sci.，55，64-75)。
另一參與凋亡的關鍵蛋白由腫瘤抑制基因p53所編碼。這個蛋白是一種調節細胞生長并在受損細胞中引起凋亡的轉錄因子，其途徑推測是增量調節Bax。(Bold et al.(1997)Surgical Oncology，6，133-142；Ronen et al.，1996；Schuler&Green(2001)Biochem.Soc.Trans.，29，684-688；Ryan et al.(2001)Curr.Opin.Cell Biol.，13，332-337；Zrnig et al.(2001)Biochem.Biophys.Acta，1551，F1-F37)。
據信凋亡途徑中的變化在多種疾病過程中起重要作用，包括癌癥。(Wyllie et al.(1980)Int.Rev.Cytol.，68，251-306；Thompson(1995)Science，267，1456-1462；Sen&D′Incalci(1992)FEBS Letters，307，122-127；McDonnell et al.(1995)Seminars in Cancer and Biology，6，53-60)對癌癥發展和演進的研究傳統上著眼于細胞增殖。但是最近已經明確了凋亡在腫瘤發生中所起的重要作用。事實上由于在腫瘤細胞中的一些途徑中的凋亡控制總是發生變化，目前許多已知的凋亡相關信息正是通過腫瘤模型得到的。(Bold et al.(1997)Surgical Oncology，6，133-142)細胞因子也參與了凋亡途徑。生物系統的調節需要細胞間的相互作用，而細胞間的交互作用通常涉及到許多種細胞因子。許多種類的細胞在響應多種刺激時都產生細胞因子，它是介導因子(mediators)。細胞因子是多效性分子，它可對多種不同細胞產生多種不同的作用，尤其在調節免疫反應及造血細胞增殖和分化中起重要作用。根據細胞因子具體種類、相對濃度和其它介導因子的存在與否，細胞因子對靶細胞的作用可以起始細胞存活、增殖、活化、分化或凋亡。
通過抗細胞因子來治療自身免疫紊亂如牛皮癬、風濕性關節炎和Crohn病的方法正在得到普及。促炎細胞因子IL-1和TNF在這些慢性疾病的病理學中扮演了重要角色。減小這兩種細胞因子生物活性的抗細胞因子治療方法具有臨床優勢(Dinarello and Abraham，2002)。
白介素-1(IL-1)是一種重要的細胞因子，它介導局部和系統性炎癥反應，并且在許多疾病的發病機理中與TNF協同作用，這包括脈管炎、骨質疏松、神經退行性疾病、糖尿病、狼瘡腎炎和自身免疫疾病如風濕性關節炎。最近發現，在向IL-1β敲除小鼠體內注射黑素瘤細胞時，小鼠對腫瘤轉移和血管形成具有抗性，從而闡明了IL-1β在腫瘤血管形成和入侵過程中的重要性(Voronov et al.，2003)。
最近發現白介素-18(IL-18)是IL-1家族的成員，并且在結構、受體和功能上都與IL-1相關。由于IL-18具有誘導干擾素γIFN-γ、TNF-α和IL-1的功能，所以它是參與炎癥和自身免疫疾病的中樞細胞因子。IL-1β和IL-18都可引起TNF-α的生成，而已知TNF-α參與心肌局部缺血過程中的心肌紊亂(Maekawa et al.，2002)。已發現在超融合(suprafused)人心房心肌的缺血/再灌注模型中，通過使用IL-18結合蛋白的中和作用來抑制IL-18可減小缺血引起的心肌功能紊亂(Dinarello，2001)。在膠原質引起的關節炎小鼠模型中，使用鼠IL-18結合蛋白來中和IL-18的功能也可減少IFN-γ、TNF-α、IL-1β的轉錄，并減小聯合損壞(Banda et al.，2003)。在小鼠黑素瘤模型中通過注射IL-18結合蛋白成功抑制了癌癥轉移，IL-18生成或供應得減少也提供了控制癌癥轉移的功能(Carrascal et al.，2003)。作為促炎細胞因子IL-18具有更進一步的重要性，測量慢性肝臟疾病患者的血漿IL-18濃度水平，該水平的提高被認為與疾病的嚴重性相關((Ludwiczek etal.，2002)。與此類似，對糖尿病腎病患者的血清IL-18和TNF-α的濃度水平(Moriwaki et al.，2003)。大腦外傷后的神經炎癥也由促炎細胞因子介導，使用IL-18結合蛋白抑制IL-18活性改善了腦外傷小鼠的神經恢復(Yatsiv et al.，2002)。
TNF-α是TNF細胞因子家族的成員，也是一種多效性促炎細胞因子，其功能包括對造血細胞的促有絲分裂作用、引發炎癥反應和引起多種細胞死亡等。TNF-α通常由細菌脂多糖、寄生蟲、病毒、惡性細胞所誘導，細胞因子通常產生有益作用以保護細胞抵御感染和癌癥。但對TNF-α的不當誘導卻是機體紊亂的主要參與因素，會引起急性和慢性炎癥，例如自身免疫紊亂，也可能參與癌癥、AIDS、心臟病和膿血癥(Aggarwal和Natarajan進行了綜述，1996；Sharma&Anker，2002)。實驗性動物疾病模型(即膿毒性休克和風濕性關節炎)和人體疾病(即腸道炎癥疾病和急性移植物抗宿主病)都證明了阻遏TNF-α的有益作用(Wallach et al.，1999)。抑制TNF-α也可減輕自身免疫疾病患者(例如Crohn病(van Deventer，1999)和風濕性關節炎(Richard-Miceli and Dougados，2001))的痛苦。也認為TNF-α起始B淋巴細胞的存活和生長的功能在B細胞慢性淋巴白血病(B-CLL)的發病機理中起作用，并且在B-CLL中T細胞表達TNF-α的水平肯定與腫瘤質量(mass)和疾病發展階段有關(Bojarska-Junak et al.，2002)。已知白介素-1β(IL-1β)是一種誘導TNF-α生成的細胞因子。
因此既然細胞因子和的過量積累會引起對機體有害的結果包括細胞死亡，那么就需要有降低體內細胞因子水平、抑制或減少凋亡的方法。本發明正是為了滿足這個需要。
已知腐胺縮賴氨酸合酶(DHS)和包含羥腐胺縮賴氨酸的真核翻譯起始因子-5A(eIF-5A)在許多細胞活動中(包括細胞生長和分化)起重要作用。在所有檢測過的真核生物和古細菌中都發現有羥腐胺縮賴氨酸的存在，而真細菌中則不存在，eIF-5A也是已知僅有的包含羥腐胺縮賴氨酸的蛋白。(Park(1988)J.Biol.Chem.，263，7447-7449；Schümann&Klink(1989)System.Appl.Microbiol.，11，103-107；Bartiget al.(1990)System.Appl.Microbiol.，13，112-116；Gordon et al.(1987a)J.Biol.Chem.，262，16585-16589)活性eIF-5A形成包括兩個翻譯前步驟首先腐胺縮賴氨酸合酶的催化下，通過將亞精胺的4-氨基丁基轉移到eIF-5A前體上的特定賴氨酸殘基上，以形成腐胺縮賴氨酸殘基；然后在腐胺縮賴氨酸羥化酶的作用下使4-氨基丁基發生羥基化反應以形成羥腐胺縮賴氨酸。
種間的eIF-5A氨基酸序列是高度保守的，并且羥腐胺縮賴氨酸殘基周圍的氨基酸序列具有嚴格保守性，這說明形成羥腐胺縮賴氨酸的修飾對存活來說可能是重要的。(Park et al.(1993)Biofactors，4，95-104)。這一假設倍以下發現所進一步證實，酵母中兩種同工eIF-5A的失活或者DHS基因的失活(它催化同工eIF-5A活化步驟的第一步)都會阻遏細胞分裂。(Schnier et al.(1991)Mol.Cell.Biol.，11，3105-3114；Sasaki et al.(1996)FEBS Lett.，384，151-154；Park et al.(1998)J.Biol.Chem.，273，1677-1683)但是在酵母中刪除eIF-5A蛋白僅引起總蛋白合成的少量下降，說明eIF-5A可能對翻譯特定mRNA亞組來說是必須的，而不是所有蛋白合成都需要。(Kang et al.(1993)，″Effectof initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and proteinsynthesis，″“刪除起始因子eIF-5A對細胞增殖和蛋白合成的影響”inTuite，M.(ed.)，Protein Synthesis and Targeting in Yeast，NATO Series H)最近發現結合eIF-5A的配體也共同具有高度保守的基序，這進一步說明了eIF-5A的重要性。(Xu&Chen(2001)J.Biol.Chem.，276，2555-2561)另外發現，修飾后eIF-5A中的羥腐胺縮賴氨酸殘基對序列特異性結合RNA來說是必需的，而這種結合并不產生針對核糖核酸酶的保護作用。
此外刪除胞內eIF-5A會引起核內特定mRNA的顯著累積，這說明eIF-5A可能負責將特定種類的mRNA從胞核穿梭運輸到胞質。(Liu&Tartakoff(1997)Supplement to Molecular Biology of the Cell，8，426a.Abstract No.2476，37th American Society for Cell BiologyAnnual Meeting)eIF-5A在核孔-相連的核內絲體(filaments)上的積累以及它與普通核運出受體間的相互作用都進一步說明eIF-5A是一種胞核-胞質穿梭蛋白，而不是多核糖體的成分。(Rosorius et al.(1999)J.Cell Science，112，2369-2380)。
Smit-McBride等在1989年首次從人體克隆到eIF-5A的cDNA，隨后從多種真核生物中克隆出eIF-5A cDNA或基因，包括酵母、大鼠、雞胚胎、苜蓿和西紅柿。(Smit-McBride et al.(1989)J.Biol.Chem.，264，1578-1583；Schnier et al.(1991)(酵母)；Sano，A.(1995)in Imahori，M.et al.(eds)，Polyamines，Basic and Clinical Aspects，VNU SciencePress，The Netherlands，81-88(大鼠)；Rinaudo&Park(1992)FASEB J.，6，A453(雞胚胎)；Pay et al.(1991)Plant Mol.Biol.，17，927-929(苜蓿)；Wang et al.(2001)J.Biol.Chem.，276，17541-17549(西紅柿))已經在多種人體組織和哺乳動物細胞系中研究了eIF-5A mRNA的表達。例如在去掉血清又添加血清后，發現在人纖維原細胞中eIF-5A的表達發生變化。(Pang&Chen(1994)J.Cell Physiol.，160，531-538)在開始衰老的纖維原細胞中也發現羥腐胺縮賴氨酸合酶的活力下降及eIF-5A前體數量的減少都與年齡有關，雖然并沒有確定這一發現是否反映了同工體分化的平均變化。(Chen&Chen(1997)J.Cell Physiol.，170，248-254)研究表明eIF-5A可能是病毒蛋白的靶細胞蛋白，例如人免疫缺陷病毒第一類Rev蛋白和人T細胞淋巴病毒1型Rev蛋白。(Ruhl et al.(1993)J.Cell Biol.，123，1309-1320；Katahira et al.(1995)J.Virol.，69，3125-3133)初步研究表明eIF-5A可能通過與其它RNA結合蛋白(如Rev)間的相互作用來靶作用于RNA，這說明這些病毒蛋白可能會募集(recruit)eIF-5A以進行病毒RNA加工。(Liu et al.(1997)Biol.Signals，6，166-174)因此雖然已知eIF-5A和DHS，但仍然需要了解這些蛋白是如何參與凋亡途徑和細胞因子活化，以調節凋亡和細胞因子表達的。本發明即滿足了這種需求。
發明概述本發明涉及到凋亡特異性真核起始因子(eIF-5A)，或者稱為“凋亡特異性eIF-5A”或“eIF-5A1”。本發明也涉及到凋亡特異性eIF-5A的核酸和多肽，以及使用反義核酸或siRNA來抑制或阻抑凋亡特異性eIF-5A的表達，從而抑制或阻抑細胞的凋亡的方法。本發明也涉及到將siRNA體內導入到哺乳動物肺細胞的方法。也涉及到通過抑制或阻抑凋亡特異性eIF-5A的表達來阻抑或抑制促炎細胞因子的方法。此外，本發明也涉及到通過抑制或阻抑凋亡特異性eIF-5A的表達來抑制或阻抑p53基因的表達。本發明也涉及到使用反義核酸或siRNA來抑制或阻抑凋亡因子5A的表達，從而提高Bcl-2表達的方法。本發明也提供了抑制細胞因子生成的方法，尤其是在人上皮細胞內抑制TNF-α的方法。在另一實施方案中，使用靶作用于凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸來阻抑凋亡特異性eIF-5A的表達，如此提供了防止青光眼眼的視網膜中心細胞死亡的方法。
附圖簡述
圖1描繪了大鼠凋亡特異性eIF-5A3’末端的核苷酸序列(SEQ IDNO11)和相應氨基酸序列(SEQ ID NO12)。
圖2描繪了大鼠凋亡特異性eIF-5A5’末端的核苷酸序列(SEQ IDNO15)和相應氨基酸序列(SEQ ID NO16)。
圖3描繪了大鼠黃體的凋亡特異性eIF-5A的全長cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO1)和相應氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖4描繪了大鼠凋亡特異性DHS cDNA的3’末端核苷酸序列(SEQ ID NO6)和相應氨基酸序列(SEQ ID NO7)。
圖5描繪了大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A cDNA的全長核苷酸序列(SEQ ID NO20)與人eIF-5A核苷酸序列間的比對(SEQ ID NO3)(檢索號為BC000751或NM_001970，SEQ ID NO3)。
圖6描繪了大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A cDNA的全長核苷酸序列(SEQ ID NO20)與人eIF-5A核苷酸序列間的比對(SEQ ID NO4)(檢索號為NM-020390，SEQ ID NO4)。
圖7描繪了大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A cDNA的全長核苷酸序列(SEQ ID NO20)與小鼠eIF-5A核苷酸序列間的比對(SEQ IDNO5)(檢索號為BC003889)。
圖8描繪了大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A全長氨基酸序列(SEQ IDNO2)與人eIF-5A氨基酸序列間的比對(SEQ ID NO21)(檢索號為BC000751或NM_001970)。
圖9描繪了大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A全長氨基酸序列(SEQ IDNO2)與人eIF-5A氨基酸序列間的比對(SEQ ID NO22)(檢索號為NM_020390)。
圖10描繪了大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A全長氨基酸序列(SEQID NO2)與小鼠eIF-5A氨基酸序列間的比對(SEQ ID NO23)(檢索號為BC003889)。
圖11描繪了大鼠黃體凋亡特異性DHS的部分長度cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO6中的1-453位殘基)與人DHS核苷酸序列間的比對(SEQ ID NO8)(檢索號為BC000333)。
圖12描繪了大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A cDNA的限制性圖譜。
圖13描繪了大鼠黃體凋亡特異性DHS部分長度cDNA的限制性圖譜。
圖14描繪了使用32P-dCTP標記的大鼠黃體凋亡特異性eIF-5AcDNA3’末端序列作為探針，得到的總RNA Northern印跡分析結果(頂端)和溴化乙錠染色凝膠結果(底端)。
圖15描繪了使用32P-dCTP標記的大鼠黃體凋亡特異性DHScDNA3’末端序列作為探針，得到的總RNA Northern印跡分析結果(頂端)和溴化乙錠染色凝膠結果(底端)。
圖16描繪了DNA成梯試驗實驗結果，其中在注射PGF-2α后，檢測排卵過度的大鼠黃體的凋亡程度。
圖17為分離自大鼠黃體的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，描繪了用PGF-2α處理大鼠后的DNA成梯試驗分析結果。
圖18描繪了DNA成梯試驗實驗結果，其中在先用亞精胺處理再用PGF-2α處理后，檢測排卵過度的大鼠黃體分散細胞的凋亡程度。
圖19描繪了DNA成梯試驗實驗結果，其中在用亞精胺和/或PGF-2α處理后，檢測排卵過度的大鼠黃體分散細胞的凋亡程度。
圖20描繪了使用32P-dCTP標記的大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A部分長度cDNA的3’末端序列作為探針，得到的大鼠基因組DNASouthern印跡分析結果。
圖21描繪了pHM6載體，一種哺乳動物表位標簽表達載體(RocheMolecular Biochemicals)。
圖22描繪了通過去血清誘導凋亡后，使用32P-dCTP標記的大鼠黃體凋亡特異性DHS cDNA3’非翻譯區域序列作為探針，得到的分離自COS-7細胞的總RNA Northern印跡分析結果(頂端)和溴化乙錠染色凝膠結果(底端)。
圖23為瞬時轉染COS-7細胞步驟的流程圖。
圖24為用pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，細胞表達外源蛋白的Western印跡分析結果。
如圖25，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，增強的胱冬酶酶活性反映了凋亡作用的增強。
如圖26，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，DNA片段的增多反映了凋亡作用的增強。
如圖27，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，通過胞核破碎的增多反映凋亡作用來探測凋亡。
如圖28，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，胞核破碎的增多反映了凋亡作用的增強。
如圖29，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，通過磷脂酰絲氨酸的顯現反映凋亡作用來探測凋亡。
如圖30，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，磷脂酰絲氨酸顯現的增多反映了凋亡作用的增強。
如圖31，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，胞核破碎的增多反映了凋亡作用的增強。
如圖32描繪了用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，細胞凋亡作用提高。
如圖33，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，Bcl-2受到減量調控。頂端照片為蛋白印跡的考馬斯藍染色，底端照片為相應的Western印跡結果。
圖34為用包含反義方向的凋亡特異性eIF-5A3’末端序列的pHM6轉染COS-7細胞后，得到的蛋白印跡考馬斯藍染色，和使用Bcl-2為探針得到的相應印跡的western印跡。
圖35為用包含正義方向的全長凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，得到的蛋白印跡考馬斯藍染色，和使用c-Myc為探針得到的相應印跡的western印跡。
圖36為用包含正義方向的全長凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，得到的蛋白印跡考馬斯藍染色，和使用p53為探針得到的相應印跡的western印跡。
圖37為分別使用抗-[HA]過氧化物酶和p53為探針時，得到的COS-7細胞中pHM6-全長大鼠凋亡特異性eIF-5A表達的蛋白印跡的考馬斯藍染色，和相應印跡的Western印跡結果。
圖38為分離自RKO細胞的人eIF-5A序列(SEQ ID NO24)和人eIF-5A2序列(SEQ ID NO22)(Genbank accession numberXM_113401)間的比對。其中共有序列見SEQ ID NO28。
圖39描繪了瞬時轉染RKO細胞和RKO-E6細胞后，發生凋亡的百分比。使用pHM6-LacZ或pHM6-凋亡特異性eIF-5A轉染這兩種細胞。用pHM6-凋亡特異性eIF-5A轉染并用放線菌素D處理的RKO細胞相比用pHM6-LacZ轉染但未被放線菌素D處理的RKO細胞，凋亡發生提高了240％。用pHM6-凋亡特異性eIF-5A轉染并用放線菌素D處理的RKO-E6細胞相比用pHM6-LacZ轉染但未被放線菌素D處理的RKO-E6細胞，凋亡發生提高了105％。
圖40描繪了瞬時轉染RKO細胞后發生凋亡的百分比。使用pHM6-LacZ、pHM6-凋亡特異性eIF-5A、pHM6-eIF5A2或pHM6-部分長度凋亡特異性eIF-5A轉染細胞。用pHM6-凋亡特異性eIF-5A轉染的細胞相比用pHM6-LacZ轉染的細胞，凋亡發生提高了25％。這種提高在用pHM6-eIF5A2或pHM6-部分長度凋亡特異性eIF-5A轉染的細胞中不明顯。
圖41描繪了瞬時轉染RKO細胞后發生凋亡的百分比。使用pHM6-LacZ或pHM6-凋亡特異性eIF-5A轉染細胞，或者不處理。在校正轉染效率后，發現用pHM6-凋亡特異性eIF-5A轉染的細胞中有60％發生凋亡。
圖42描繪了瞬時轉染RKO細胞的流式細胞分析結果。使用pHM6-LacZ、pHM6-凋亡特異性eIF-5A、pHM6-eIF5A2或pHM6-部分長度凋亡特異性eIF-5A轉染細胞，或者不處理。表格描述了根據每個窗口(gate)的峰(peak)下區域計算的凋亡細胞所占的百分比。在校正轉染效率后，發現用pHM6-凋亡特異性eIF-5A轉染的細胞中有80％發生凋亡。使用pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A2或pHM6-部分長度凋亡特異性eIF-5A轉染的細胞僅發生背景水平的凋亡。
圖43為用0.25μg/ml放線菌素D處理RKO細胞0、3、7、24和48h后，所提取蛋白的Western印跡結果。頂端部分為使用抗p53抗體作為一級抗體的Western印跡結果。中間部分為使用抗凋亡特異性eIF-5A抗體作為一級抗體的Western印跡結果。底端部分化學發光探測后使用考馬斯藍染色的膜，它被用于抗凋亡特異性eIF-5A抗體印跡實驗，以證明上樣的等量性。用放線菌素D處理后p53和凋亡特異性eIF-5A都受到增量調控。
圖44為柱狀圖，說明凋亡特異性eIF-5A和增殖eIF-5A都在心臟組織中有表達。從接受冠狀動脈旁路移植術(″CABG″)的病人體內獲取心臟組織。將凋亡特異性eIF-5A基因的表達水平(淺灰色柱)和增殖eIF-5A表達水平(深灰色柱)進行了比較。X軸代表病人編號，Y軸代表pg/ng(18S)(mRNA量(單位pg)/18S核糖體RNA量(單位ng))。
圖45為柱狀圖，說明凋亡特異性eIF-5A和增殖eIF-5A都在心臟組織中有表達。從接受瓣膜移植的病人體內獲取心臟組織。將凋亡特異性eIF-5A基因的表達水平(淺灰色柱)和增殖eIF-5A表達水平(深灰色柱)進行了比較。X軸代表病人編號，Y軸代表pg/ng(18S)(mRNA量(單位pg)/18S核糖體RNA量(單位ng))。
圖46為柱狀圖，描繪了通過實時熒光定量PCR測量的凋亡特異性eIF-5A(eIF-5a)和增殖eIF-5A(eIF-5b)在缺血/缺血再灌注心臟組織中的表達。從接受冠狀動脈旁路移植術(″CABG″)的病人體內獲取心臟組織。Y軸代表pg/ng(18S)(mRNA量(單位pg)/18S核糖體RNA量(單位ng))。
圖47描繪了在心臟組織上進行的實驗。首先向心臟組織導入正常氧氣水平并測量凋亡特異性eIF-5A和增殖eIF-5A的表達水平。然后降低導入氧氣量，由此引起供氧不足和缺血并最終在心臟組織中模擬心臟病發作，測量此時的凋亡特異性eIF-5A和增殖eIF-5A的表達水平，并與缺血損傷前的表達水平進行對比。
圖48為心臟組織在缺血前和缺血后的EKG圖。
圖49描繪了圖47實驗中所用的實驗臺。
圖50A-F報道了病人相關數據，其中凋亡特異性eIF-5A的含量水平與IL-1β和IL-18含量水平有關。圖50A是來自冠狀動脈旁路移植術(CABG)病人的數據表格。圖50B是來自瓣膜移植病人的數據表格。圖50C描繪了CABG病人的凋亡特異性eIF-5A含量水平與IL-18含量水平間的關系。圖50D描繪了CABG病人的增殖eIF-5A含量水平與IL-18含量水平間的關系。圖50E描繪了瓣膜移植病人的凋亡特異性eIF-5A含量水平與IL-18含量水平間的關系。圖50F描繪了瓣膜移植病人的增殖eIF-5A含量水平與IL-18含量水平間的關系。
圖51為從圖50A-F中病人得到的數據表格。
圖53描繪了對熒光標記反義寡核苷酸的攝取。
圖54-58表明了與未用凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸處理的細胞相比，處理細胞的凋亡百分比下降。
如圖59，用TNF-α和/或或喜樹堿處理篩板細胞引起凋亡細胞數目的增加。
圖60和61表明與未用凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸處理的細胞相比，處理細胞的凋亡百分比下降。
圖62描繪了在存在血清或不存在血清時篩板細胞對被標記siRNA的攝取。
如圖63，用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的細胞產生凋亡特異性eIF-5A蛋白量下降并產生更多的Bcl-2蛋白。凋亡特異性eIF-5A表達的下降與Bcl-2表達的提高相關。
圖64描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的細胞產生凋亡因子5A的蛋白量下降。
圖65-67顯示用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的細胞群相比未作處理的細胞群，在用喜樹堿和TNF-α處理后發生凋亡的細胞比例更低。
圖68為圖67和實施例13實驗中用siRNA轉染并用喜樹堿和TNF-α處理的篩板細胞#506的Hoescht染色照片。凋亡細胞的染色亮度更高，它們的外形更小也不規則，并且由于染色體凝縮它們的胞核更小。
如圖69，用凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸轉染的HepG2細胞相比未轉染細胞，在被IL-1處理后分泌TNF-α量減少。
圖70描繪了人凋亡特異性eIF-5A序列(SEQ ID NO29)和本發明的5種siRNA序列(SEQ ID NO30、31、32、33、34)。
圖71描繪了人凋亡特異性eIF-5A序列(SEQ ID NO29)和本發明的三種反義寡核苷酸序列(SEQ ID NO35、37、39，分別按照在文中的出現順序)。
圖72描繪了三種靶作用于人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸(SEQ ID NO25-27，分別按照在文中的出現順序)的結合位點。全長核苷酸序列見SEQ ID NO19。
圖73A和B分別描繪了人凋亡特異性eIF-5A和人增殖eIF-5A的核苷酸序列(SEQ ID NO41和42，分別按照在文中的出現順序)比對和氨基酸序列(SEQ ID NO43和42，分別按照在文中的出現順序)比對。
圖74A為Western印跡結果，其中針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA在轉染的HT-29細胞減少了(如果沒有抑制)TNF-α的生成。圖74B為EILSA結果。
圖75為EILSA照片，與對照細胞相比，用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA處理的細胞生成TNF-α量減少。
圖76描繪了U-937細胞分化實驗的時程，見實施例16。
圖77為Western印跡結果，表明凋亡特異性eIF-5A在單核細胞分化和TNF-α分泌過程中受到增量調控。
圖78描繪了干細胞分化，和使用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA來抑制細胞因子生成。
圖79為柱狀圖，表明在響應TNF-α和干擾素時都產生IL-8。該圖表明針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA幾乎全部阻抑了響應干擾素時的IL-8生成，并顯著阻抑了響應干擾素和TNF聯合處理時的IL-8生成。
圖80為柱狀圖，表明在響應TNF-α和干擾素時都產生IL-8。該圖表明針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA幾乎全部阻抑了響應干擾素時的IL-8生成，并顯著阻抑了響應干擾素和TNF聯合處理時的IL-8生成。
圖81為用IFNγ處理HT-29細胞8和24h后的western印跡結果。說明HT-29細胞在響應干擾素γ時，凋亡特異性eIF-5A受到增量調控(在8h時增加了4倍)。
如圖82，通過免疫熒光鑒定篩板細胞。從一名83歲男性的視神經乳頭分離篩板細胞#506，并通過免疫熒光進行鑒定。所用的一級抗體為a)肌動蛋白；b)纖粘連蛋白；c)層粘連蛋白；d)GFAP。所有圖片均為400倍放大率。
圖83描繪了篩板細胞系#506在響應喜樹堿和TNF-α聯合處理時，發生凋亡的百分比。將篩板細胞系#506接種在8孔培養片上，每孔40000個細胞。三天后用10ng/ml TNF-α或者50μM喜樹堿處理細胞，或同時使用二者處理細胞。向不處理的對照細胞中加入等體積的DMSO，一種表達載體作為喜樹堿的對照。處理后用Hoescht33258染色細胞48h，并在熒光顯微鏡下用熒光濾光片觀察。被明亮染色或發生染色體凝縮或胞核破碎的細胞作為凋亡細胞而記錄。
圖84描繪了在喜樹堿處理或聯用喜樹堿和TNF-a處理的過程中，凋亡特異性eIF-5A的表達水平。將篩板細胞系#506接種在8孔培養片上，每孔40000個細胞。三天后用10ng/ml TNF-α處理細胞，或同時使用50μM喜樹堿和10ng/ml TNF-α處理細胞，并在1、4、8和24h后收集細胞裂解物。向不處理的對照細胞中加入等體積的DMSO作為對照載體，并在1、24h后收集細胞裂解物。取每個樣品的5μg總蛋白SDS-PAGE上電泳，并轉移到PVDF膜上。使用抗凋亡特異性eIF-5A抗體為一級抗體進行Western印跡。通過化學發光探測固定抗體，并放在X射線感光膠片上曝光。然后將膜剝離，再用抗β-肌動蛋白抗體作為內部上樣對照而進行印跡。
圖85描繪了在用siRNA磚然后，篩板細胞系#506和#517中凋亡特異性eIF-5A的表達水平。將篩板細胞#506和#517接種在24孔板上，每孔10000個細胞。三天后用GAPDH siRNA或凋亡特異性eIF-5A siRNA#1-4(SEQ ID NO30-33)或對照siRNA#5(SEQ IDNO34)轉染細胞。轉染3d后收集裂解物蛋白，并取每個樣品的5μg總蛋白SDS-PAGE上電泳，并轉移到PVDF膜上。使用抗凋亡特異性eIF-5A抗體進行Western印跡。通過化學發光探測固定抗體，并放在X射線感光膠片上曝光。然后將膜剝離，再用抗β-肌動蛋白抗體作為內部上樣對照而進行印跡。該圖表明用凋亡特異性eIF-5AsiRNA處理的細胞生成更少的凋亡特異性eIF-5A蛋白。
圖86描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染并用喜樹堿和TNF-α處理的篩板細胞#506發生凋亡的百分比。將篩板細胞系#506接種在8孔培養片上，每孔7500個細胞。三天后用GAPDH siRNA或凋亡特異性eIF-5A siRNA#1-4(SEQ ID NO30-33)或對照siRNA#5(SEQ ID NO34)轉染細胞。72h后用1同時使用50μM喜樹堿和10ng/ml TNF-α處理轉染細胞。24h后用Hoescht 33258染色細胞，并在熒光顯微鏡下用熒光濾光片觀察。被明亮染色或發生染色體凝縮或胞核破碎的細胞作為凋亡細胞而記錄。本圖描繪了平均n＝4的獨立實驗，表明在面對喜樹堿和TNF處理時，用凋亡特異性eIF-5AsiRNA轉染的細胞相比未轉染細胞，發生凋亡的百分比更低。
圖87描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA#1轉染并用喜樹堿和TNF-α處理的篩板細胞#517發生凋亡的百分比。將篩板細胞系#517接種在8孔培養片上，每孔7500個細胞。三天后用GAPDH siRNA或凋亡特異性eIF-5A siRNA#1(SEQ ID NO30)或對照siRNA#5(SEQID NO34)轉染細胞。72h后用1同時使用50μM喜樹堿和10ng/mlTNF-α處理轉染細胞。24h后用Hoescht33258染色細胞，并在熒光顯微鏡下用熒光濾光片觀察。被明亮染色或發生染色體凝縮或胞核破碎的細胞作為凋亡細胞而記錄。這里為兩個獨立實驗的結果，表明用siRNA處理的細胞發生凋亡的百分比更低。
圖88描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA#1轉染并用喜樹堿和TNF-α處理被TUNEL標記的篩板細胞#506。將篩板細胞系#506接種在8孔培養片上，每孔7500個細胞。三天后用GAPDH siRNA或凋亡特異性eIF-5A siRNA#1(SEQ ID NO30)或對照siRNA#5(SEQID NO34)轉染細胞。72h后用1同時使用50μM喜樹堿和10ng/mlTNF-α處理轉染細胞。24h后用Hoescht33258染色細胞，并用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶介導的dUTP-地高辛配基切口末端標記法(insituterminal terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling(TUNEL))測量DNA破碎程度。A部分為在熒光顯微鏡下使用熒光濾光片(以使被TUNEL標記的凋亡細胞破碎DNA顯形)觀察的玻片。B部分為使用UV濾光片(以顯現被Hosescht染色的胞核)觀察的同一玻片。這里為兩個獨立實驗的結果。所有圖片均為400倍放大率。
圖89描繪了所設計的針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA，它們具有SEQ ID NO45、48、51和56中的序列，全長核苷酸序列在SEQID NO29中列出。
如圖90，直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA在干擾素γ和LPS的存在下，降低NKkB的活化作用。
圖91描繪了PBMC實驗的時程(見實施例18)。
圖92為在一個時間段內從兩個捐贈者處收集的PBMC的細胞裂解物的Western印跡結果。使用PMA處理PBMC，然后用LPS刺激以提高凋亡特異性eIF-5A的表達。
如圖93，使用PMA處理并用LPS刺激的PBMC具有提高的凋亡特異性eIF-5A表達，這與TNF產量提高一致。
圖94描繪了PBMC響應LPS，沒有PMA分化。
如圖95，用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的PBMC中的凋亡特異性eIF-5A表達被阻抑。
如圖96，用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染并用LPS刺激的PBMC相比未轉染細胞產生TNF量更少。
圖97為用干擾素γ處理或未處理HT-29細胞的裂解物western印跡結果。
圖98為用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染或用對照siRNA轉染的HT-29細胞的裂解物western印跡結果。該圖表明凋亡特異性eIF-5A siRNA抑制凋亡特異性eIF-5A的表達。
圖99描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的HT-29細胞中TNF產量水平下降。
如圖100，用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的HT-29細胞相比對照細胞凋亡發生下降。對照轉染和siRNA轉染細胞都被干擾素γ處理，并且也被TNF-α處理。
圖101描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的HT-29細胞相比對照細胞，表達更少的TLR4蛋白。
圖102描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的HT-29細胞相比對照細胞，表達更少的TNFR1蛋白。
圖103描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的HT-29細胞相比對照細胞，表達更少的iNOS蛋白。
圖104描繪了用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的HT-29細胞相比對照細胞，表達更少的TLR4 mRNA。
圖105描繪了U937實驗的時程。
如圖106，U937細胞中凋亡特異性eIF-5A受到PMA的增量調控。
如圖107，U937細胞中凋亡特異性eIF-5A受到LPS的增量調控。
如圖108，在用siRNA處理數小時后，凋亡特異性eIF-5A蛋白的表達仍然下降。
如圖109，siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A的減量調控與TLR4生成量的減少一致。
如圖110，siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A的減量調控與U937細胞中糖基化形式的干擾素γ受體減少一致。
如圖111，siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A的減量調控與U937細胞中TNFR1減少一致。
如圖112，siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A的減量調控與U937細胞中TNF-α生成(由LPS所誘導)減少一致。
如圖113，siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A的減量調控與U937細胞中IL-1β生成(由LPS所誘導)減少一致。
如圖114，siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A的減量調控與U937細胞中IL-18生成(由LPS所誘導)減少一致。
如圖115，U937細胞中IL-6的生成與siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A的減量調控無關。
如圖116，通過靜脈注射導入直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA引起血清中TNF-α含量水平的下降。
如圖117，通過鼻腔導入直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA引起肺臟中TNF-α含量水平的下降。
如圖118，通過鼻腔導入直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA引起肺臟中MIP-1含量水平的下降。
如圖119，通過鼻腔導入直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA引起IL-1α含量水平的下降。
如圖120，用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA轉染HT-29細胞并用IFN-γ和LPS處理，引起NFκB p50活化作用的降低和TNF-α生成的減少。
如圖121，針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA在HT-29細胞中阻抑了內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。
如圖122，HT-29細胞中由siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A表達阻抑降低了響應IFN-γ時IFN-γα-受體的積累。
如圖123，HT-29細胞中由siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A表達阻抑降低了響應IFN-γ時Toll受體4(TLR4)的積累。
如圖124，HT-29細胞中由siRNA介導的凋亡特異性eIF-5A表達阻抑降低了響應IFN-γ時JAK1和STAT1的磷酸化作用。
發明詳述已經分離了若干種同工真核起始因子5A(eIF-5A)，相關數據可在公開數據庫中查得。一般認為這些同工體在功能上是冗余的。本發明的發明者們發現在凋亡誘導前一種同工體受到瞬時增量調控，他們稱這種eIF-5A為凋亡特異性eIF-5A或eIF-5A1。本發明的主題是凋亡特異性eIF-5A和DHS(它參與eIF-5A的活化)。
因為凋亡特異性eIF-5A的作用表現為下游效應器的轉錄后調控和參與凋亡途徑的轉錄因子，所以它可能是凋亡所致疾病中的合適干涉靶點。具體來說，凋亡特異性eIF-5A表現為選擇性的促進編碼下游效應器和凋亡轉錄因子的mRNA從胞核到胞質(mRNA在這里被翻譯)的轉運，從而促進翻譯。起始凋亡的最終決定依賴于內部/外部的促-和抗-凋亡信號間復雜的相互作用。(Lowe&Lin(2000)Carcinogenesis，21，485-495)憑借其促進下游凋亡效應器和轉錄因子翻譯的能力，凋亡特異性eIF-5A似乎可以推動這些信號間的平衡向凋亡方向移動。
因此，本發明提供了通過分別導入抑制或減少凋亡特異性eIF-5A或DHS表達的物質，來阻抑或減少細胞凋亡的方法。通過減少DHS的表達，可用來活化凋亡特異性eIF-5A的DHS蛋白量就會減少。一種可抑制或減少凋亡特異性eIF-5A或DHS表達的物質是凋亡特異性eIF-5A或DHS的反義寡核苷酸。通過降低凋亡特異性eIF-5A的活化或減少/抑制凋亡特異性eIF-5A的表達，細胞凋亡可以被推遲或被抑制。
反義寡核苷酸已被成功用來在體外和體內進行基因特異性抑制。反義寡核苷酸是與特定靶DNA或RNA互補(或反義)的人工合成短鏈DNA(或DNA類似物)、RNA(或RNA類似物)，或DNA/RNA雜交分子。設計反義寡核苷酸以通過與靶mRNA結合并在轉錄、翻譯或拼接水平停止表達，來阻遏靶DNA或RNA編碼的蛋白表達。通過使用能夠抵抗降解的骨架(Blake et al.，1985)，例如用硫代磷酸酯連接來替換寡核苷酸中的磷酸二酯鍵以抵抗核酸酶的降解(Matzuraand Eckstein，1968)，反義寡核苷酸已在細胞培養物和動物疾病模型中被成功應用(Hogrefe，1999)。本領域技術人員也了解其它修飾反義寡核苷酸以提高其穩定性和抗降解能力的方法。本文所用的反義寡核苷酸包括雙鏈或單鏈DNA、雙鏈或單鏈RNA、DNA/RNA雜交分子、DNA/RNA類似物，和堿基、糖基或骨架分子被修飾的寡核苷酸。可使用本領域已知的方法來修飾寡核苷酸，以提高其穩定性，提高其抵抗核酸酶降解的能力或其它類似能力。本領域技術人員了解這些修飾方法，包括(但不僅限于)修飾寡核苷酸的骨架、修飾糖基部分獲修飾堿基。
本發明的反義寡核苷酸優選包含凋亡特異性eIF-5A多肽或DHS多肽的部分或全部編碼核酸序列。發明者們按下文所述使用編碼部分凋亡特異性eIF-5A多肽的反義核酸轉染了多種細胞系，并測量了發生凋亡的細胞數目。與未用反義寡核苷酸轉染的同種細胞群相比，轉染的細胞群中發生凋亡的細胞數目減少了。圖54-58表明了與未用反義凋亡特異性eIF-5A寡核苷酸處理的細胞相比，處理細胞發生凋亡數目的百分比減少。
本發明關注許多種合適的編碼凋亡特異性eIF-5A多肽或DHS多肽的核酸序列。例如，本發明提供了下列凋亡特異性eIF-5A核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，4，5，11，12，15，16，19，20，21)和DHS序列(SEQ ID NOS6，7，8)的反義寡核苷酸。本發明的寡核苷酸并不需要有這些序列的全長序列，它們只需要有足以結合的長度，以抑制或減少凋亡特異性eIF-5A或DHS的表達。“抑制或減少表達”或“阻抑表達”指靶基因(凋亡特異性eIF-5A或DHS基因)的蛋白產物或mRNA產物不存在或數量發生可探測性減少。
不包含全部編碼序列的凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸例如包含SEQ ID NO35、37和39序列的凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸。
“凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸”包括與凋亡特異性eIF-5A具有基本(substantial)序列同一性或基本同源性的寡核苷酸。此外，本發明的凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸還包括那些與上文列舉的序列具有基本序列同一性(即90％的同源性)的寡核苷酸，或者是那些可以在高嚴緊條件下與上文列舉的SEQ ID Nos序列發生雜交的寡核苷酸。這里所用的術語“基本序列同一性”或者“基本同源性”指一個序列的結構或功能表現出與其它序列基本等同的性質。具有基本序列同一性或基本同源性的序列之間，任何結構或功能差異都是極其微小的；也就是說，這些差異不會影響這些序列在所需使用中發揮預定作用的能力。差異可能是由于如不同種間對密碼子的使用不同而引起的。如果兩個或更多不同序列間具有相當數量的序列重疊或相似，或者不同序列即使長度/結構不同也表現出相似物理特性，那么就認為序列間的結構差異是極其微小的。這種物理特性包括如，在限定條件下發生雜交的能力，或者是蛋白的免疫交互反應能力，相似的酶活力等。技術人員可通過本領域已知方法來方便的確定所有這些特性。
此外如果兩個核苷酸序列具有至少70％或更高、更優選80％或更高、更優選90％或更高、最優選95％或更高的序列相似性，那么這兩個序列就“基本互補”。如果兩個氨基酸序列在活性或相關功能、或多肽部分上具有至少70％、更優選至少80％、更優選至少90％、最優選至少95％的相似性，那么這兩根序列就基本同源。
為確定兩個序列間的同一性百分比，對它們進行序列比對以達到最優比較(comparison)目的(為得到最優比對(alignment)，可在第一個和第二個氨基酸或核苷酸上單獨或同時引入缺口(gap)，為達到比較目的可忽略非同源性序列)。在首選的實施方案中，比對參考序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大長度，以達到比較的目的。然后比較在相應氨基酸或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。如果第一個序列中某位置上的氨基酸殘基或核苷酸與第二個序列中相應位置相同，那么兩個序列在這個位置上就是等同的(這里所用的氨基酸殘基或核苷酸“同一性”與氨基酸或核酸“同源性”的意思等同)。兩個序列間的同一性百分比是兩個序列間等同位置數目的函數，要考慮到缺口數目和并需要將每個缺口的長度引入到兩個序列間的最優比對中。
可使用數學算法來比較序列，確定兩個序列間同一性和相似性百分比。(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；BiocomputingInformatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)可進一步將本發明的核酸和蛋白序列用作“查詢序列(querysequence)”以在序列數據庫中進行搜索，來鑒別如其它家族成員或相關序列。可使用NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)進行這種搜索(Altschul，et al.(1990)J.Mol Biol.215403-10)。可使用XBLAST程序進行核苷酸BLAST搜索。可使用XBLAST程序進行蛋白BLAST搜索，以得到與發明中蛋白同源的氨基酸序列。為得到帶缺口的比對(gapped alignments)以進行比較，可使用Gapped BLAST(Altschul etal.(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402)。當使用BLAST和gapped BLAST程序時，可分別使用程序的默認參數(如XBLAST和NBLAST)。
術語“凋亡特異性eIF-5A”包括它們的功能性衍生物。這里所用的術語“功能性衍生物”指氨基酸或核苷酸序列的同源物或相似物。功能性衍生物保留了給定基因的功能，這使其可在發明中使用。這里所用的凋亡特異性eIF-5A多肽的“功能性衍生物”，或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸的功能性衍生物，包括凋亡特異性eIF-5A的片段、變異體、類似物或化學衍生物，它們并且保持了凋亡特異性eIF-5A的活性，或與凋亡特異性eIF-5A的特異抗體進行免疫交互反應的活性。凋亡特異性eIF-5A多肽的片段指該分子的任何亞單位。
功能性變異體也可包含用相似氨基酸進行的替換，這樣不引起功能變化或僅引起不顯著的功能變化。可通過本領域已知方法鑒別功能必需的氨基酸，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham et al.(1989)Science 2441081-1085)。后一種方法在分子的每個殘基損傷引入單個丙氨酸突變。然后對所得突變分子進行生物活性檢測，例如激酶活性或實驗中的體外增殖活性。可通過結構分析如晶體分析、核磁共振或光親和標記，來確定結合配體/底物的關鍵位置(Smith et al.(1992)J.Mol.Biol.224899-904；de Vos et al.(1992)Science 255306-312)。
“變異體”指與整個基因或其片段基本相似的分子，例如替換了一個或多個核苷酸的核苷酸替換變異體，但它必須保持與特定基因雜交的能力，或者它編碼的mRNA轉錄物能與天然DNA進行雜交。“同源物”指來自不同屬或種動物的片段或變異序列。“相似物”指與整個分子基本相似或發揮相關功能的非天然分子(也包括其變異體或片段)。
變異肽包括天然變異體，也包括那些通過本領域已知方法操作形成的變異體。可使用分子技術和本文公開的序列信息，方便的鑒別/制備這些變異體。此外可根據它們與本發明eIF-5A或DHS蛋白的序列和/或結構同源性，方便的將這些變異體與其它蛋白分辨開來。同源性/同一性程度主要基于蛋白是否是功能性變異體或非功能性變異體，側向同源物家族中的趨異數量和直向同源物間的進化距離。
可使用重組技術方便的制備本發明eIF-5A或DHS的多核苷酸、反義寡核苷酸或蛋白的非天然變異體。這些變異體包括(但不僅限于)在核苷酸或氨基酸序列中進行刪除、添加和替換所得的產物。例如一種替換是保守性氨基酸替換。這種替換是將蛋白中的給定氨基酸用具有相似性質的其它氨基酸進行替換。可視為保守性替換的典型替換為發生在脂肪組氨基酸(Ala、Val、Leu、Ile)間的一個或多個替換；發生在羥基氨基酸Ser和Thr間的互換；發生在酸性氨基酸Asp和Glu間的互換；發生在具氨基氨基酸Asn和Gln間的替換；發生在堿性氨基酸Lys和Arg間的替換；發生在芳香族氨基酸Phe和Tyr間的替換。關于哪些氨基酸替換可能形成表型沉默(phenotypicallysilent)的闡述，可見文獻Bowie et al.，Science 2471306-1310(1990)。
這里所用的術語“雜交”通常指在合適嚴緊性條件下核酸之間的雜交，本領域技術人員可根據探針序列和靶序列特征方便的確定雜交嚴緊性。雜交條件和洗滌方法在本領域被熟知，可根據所需嚴緊性通過改變孵育時間、溫度和/或溶液離子強度來方便的調解雜交條件。參見如Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，2ndedition，Cold Spring Harbour Press，Cold Spring Harbor，New York，1989。
根據帶雜交序列長度(尤其是探針序列長度)，核酸的相對G-C含量和允許的錯配數量來確定雜交條件。當需要互補性較低的序列發生部分雜交時，首選用低嚴緊性條件。當需要完全或幾乎完全的互補時，受選用高嚴緊性條件。高嚴緊性條件意味著雜交溶液含有6X S.S.C.、0.01M EDTA、1X Denhardt溶液和0.5％SDS。進行克隆DNA片段雜交時，在68℃下進行約3-4h，進行總真核DNA雜交時進行約12-16h。為了降低嚴緊性，可將溫度調節到42℃，低于雙鏈體的熔解溫度(Tm)。已知Tm是雙鏈體G-C含量和雙鏈體長度及溶液離子強度的函數。
這里所用的“雜交到(DNA或RNA分子的)相應部分”指雜交分子(如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列，以正義或反義方向)識別并雜交到其它核酸分子中的一段與其大小近似并具有足夠序列相似性的序列上，以影響在合適條件下進行的雜交。例如一個長100個核苷酸的正義分子將識別并雜交到另一核酸分子中一個長約100核苷酸的序列上，只要這兩個序列間有約70％或更高的序列相似性。當然“相應部分”的大小將容忍一些雜交錯配，所以“相應部分”可以比雜交到其上的分子更短或更長，例如長或短20-30％，長度差異優選不超過12-15％。
另外，多肽的功能性變異體也可含有用相似氨基酸進行的替換，這樣就不會引起功能變化或者只引起不顯著的功能變化。可使用本領域已知方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變來鑒別功能必需的氨基酸(Cunningham et al.，Science2441081-1085(1989))。后者方法在分子的每個殘基上引入單獨丙氨酸突變。然后檢測所得突變分子的生物活性，或者在實驗中進行檢測(or in assays)。
本發明也提供了其它可抑制或減少凋亡特異性eIF-5A或DHS表達的物質。其中之一是小干涉RNA(siRNA)。SiRNA技術是作為反義寡核苷酸的一個可行改變而出現的，因為可用比寡核苷酸更低濃度的siRNA，來得到與用反義寡核苷酸所得的抑制水平相當或更高的抑制效果(Thompson，2002)。已經使用長雙鏈RNA在多種生物中，例如植物、線蟲和果蠅使得特定基因發生沉默。Dicer酶(RNase-III家族成員)將這些長雙鏈RNA消化為長21-23核苷酸的小干涉RNA，然后此小RNA被包含進RNA引起的沉默復合體(RISC)中。siRNA的展開活化RISC并允許單鏈siRNA通過堿基配對將RISC引導到內生mRNA上。RISC對內生mRNA的識別引起mRNA的裂解，從而使其不能被翻譯。向哺乳動物細胞導入長雙鏈RNA引發有力的抗病毒反應，這一效果也可使用siRNA來達到(Elbashir et al.，2001)。SiRNA已在細胞培養物中廣泛使用，并都取得了使特定基因表達減少90％或更高的效果。
在動物疾病模型中使用siRNA抑制基因表達已開始普及。最近的一項研究表明在出生后小鼠的多個器官中，針對螢光素酶的siRNA可通過質粒共轉染阻遏熒光素酶的表達。(Lewis et al.，2002)將針對Fas(TNF家族的一個受體)的siRNA的水溶液(hydrodynamically)注射進小鼠的尾靜脈，此siRNA能夠轉染80％以上的肝細胞并使得肝臟中Fas的表達降低90％，并在最后一次注射后持續作用達10天之久(Song et al.，2003)。Fas siRNA也能夠防止小鼠發生肝纖維化和感染肝炎。用致死劑量脂多糖處理的小鼠的膿血癥，可被直接針對TNF-α的siRNA所抑制(Srensen et al.，2003)。由于其在細胞培養物中的長效性，其能夠在體內轉染細胞的能力以及其在體內血清中對降解作用的抗性(Bertrand et al.，2002)，siRNA可能是一種可在體內有力抑制特定基應表達的藥物。
發明者們用凋亡特異性eIF-5A的siRNA轉染細胞并研究了此siRNA對凋亡特異性eIF-5A表達的影響。圖64顯示用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的細胞產生更少的凋亡特異性eIF-5A蛋白。圖65-67顯示用凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的細胞群相比未作處理的細胞群，在用喜樹堿(amptothecin)和TNF-α處理后發生凋亡的細胞比例更低。因此，本發明的一個實施方案提供了通過用包含有凋亡特異性eIF-5A siRNA的載體轉染細胞，來抑制胞內凋亡特異性eIF-5A的方法。首選的凋亡特異性eIF-5A siRNA包括那些包含SEQID NO31、31、32、33所述序列的序列。此外還包括那些與上文列舉序列具有基本序列同一性(即90％的同源性)的序列，或那些所包含的序列能在高嚴緊性條件下與所列SEQ ID NO進行雜交的序列。基本序列同一性和同源性的含義在上文本發明反義寡核苷酸的相關內容中已經闡明。術語“凋亡特異性eIF-5A siRNA”包括上述的本發明反義寡核苷酸的功能性變異體和衍生物。
本領域技術人員了解導入SiRNA和表達包含SiRNA的構建體/載體的方法。美國專利申請2004/106567和2004/0086884(均通過引用結合到本文)提供了許多導入方法和構建體/載體表達方法，能說出一些的(to name a few)包括病毒載體、非病毒載體、脂質體導入載體、質粒注射系統、人工病毒包膜和多賴氨酸偶聯物(poly-lysineconjugates)。
本領域技術人員應了解，在包含反義寡核苷酸或SiRNA的構建體/載體的表達中，可有用的調節序列。例如，調節序列可以是組成型啟動子、可誘導啟動子、組織特異性啟動子，或者將它們聯合使用。
許多重要的人體疾病都是由凋亡控制異常所引起的。這種異常可引起細胞數量的病態增加(例如癌癥)或者細胞的損傷性死亡(例如退行性(degenerative)疾病)。本發明的方法和組合物可被用來通過降低或抑制凋亡特異性eIF-5A來預防或治療患有以下(但不僅限于)凋亡相關疾病和失調的對象，神經/神經退行性疾病(如Alzheimer’s病、帕金森病、Huntington’s病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(Lou Gehrig’s病))，自身免疫疾病(如風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、多發性硬化)，杜興氏肌營養不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy(DMD))，運動神經元病，缺血，心肌缺血，慢性心力衰竭，中風，嬰兒型脊肌萎縮癥，心臟停跳，腎衰竭，異位性皮炎，嚴重感染和膿毒性休克，AIDS，肝炎，青光眼，糖尿病(1型和2型)，哮喘，視網膜色素變性，骨質疏松，異體排斥和燒傷。
由凋亡控制異常所引起的疾病其中之一是青光眼。多種眼組織的凋亡是導致青光眼患者使命的重要因素。青光眼是一系列由視神經損傷引起的眼部狀態，這種狀態會引起進行性(progressive)失明。而已經證實凋亡是這種視神經損傷的直接誘因。
早期的青光眼領域研究已證實眼壓(″IOP″)增大引起篩板細胞(一種穿孔、膠體連接組織)水平上對軸突運輸的干擾，隨后就發生視網膜神經節細胞的死亡。(Quigley and Anderson(1976)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，15，606-16；Minckler，Bunt，and Klock，(1978)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，17，33-50；Anderson and Hendrickson，(1974)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，13，771-83；Quigley et al.，(1980)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，19，505-17)對動物青光眼模型和死亡后人體組織的研究表明視網膜神經節細胞的死亡是經由凋亡途徑發生的。(Garcia-Valenzuela et al.，(1995)Exp.Eye Res.，61，33-44；Quigley etal.，(1995)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，36，774-786；Monard，(1998)InHaefliger IO，Flammer J(eds)Nitric Oxide and Endothelin in thePathogenesis of Glaucoma，青光眼發病機制中一氧化氮和內皮素的作用，New York，NY，Lippincott-Raven，213-220)IOP提高所引的軸突運輸中斷可能會通過引起營養因素缺乏而參與視網膜神經節細胞的死亡。(Quigley，(1995)Aust N Z J Ophthalmol，23(2)，85-91))發現在患青光眼眼睛中，頭(head)視神經星狀膠質細胞也產生更多的某些毒害神經的物質。例如發現在患青光眼眼睛中，視神經乳頭星狀膠質細胞產生更多的腫瘤壞死因子(TNF-α)(Yan et al.，(2000)Arch.Ophthalmol.，118，666-673)、一氧化氮合酶(引起一氧化氮生產的酶)(Neufeld et al.，(1997)Arch.Ophthalmol.，115，497-503)。此外在大鼠遺傳性視網膜疾病模型中觀察到，活化的視網膜神經膠質細胞表達可誘導形式的一氧化氮合酶(iNOS)和TNF-α的水平提高。(Cotinet et al.，(1997)Glia，20，59-69；de Kozak et al.，(1997)Ocul.Immunol.Inflamm.，5，85-94；Goureau et al.，(1999)J.Neurochem，72，2506-2515.)已發現在青光眼視神經乳頭中，過量的一氧化氮于是神經節細胞軸突的損傷有關。(Arthur and Neufeld，(1999)Surv Ophthalmol，43(Suppl 1)，S129-S135)最后，已發現視網膜神經膠質細胞在響應刺激性缺血或靜力壓(hydrostatic pressure)提高時產生TNF-α量的提高，會引起共培養視網膜神經節細胞的凋亡。(Tezel and Wax，(2000)J.Neurosci.，20(23)，8693-8700.)正在研究如何保護視網膜神經節細胞不發生凋亡引起的損傷，并將此作為治療青光眼所致失明的可能新型療法。已經在動物疾病模型中成功應用了反義寡核苷酸。瞬時視網膜缺血模型中的缺血過程中，主要在胞核內和視網膜神經節細胞層中胱冬酶的表達提高。通過視網膜電流圖確定，使用反義寡核苷酸抑制胱冬酶引起顯著的組織病理學和功能改善。(Singh et al.，(2001)J.Neurochem.，77(2)，466-75)其它研究發現通過轉染視神經，視網膜神經節細胞增量調控前凋亡蛋白Bax生成并發生凋亡。重復注射Bax反義寡核苷酸到大鼠顳上(temporal superior)視網膜中抑制了局部的Bax表達，并在處理視神經后提高了視網膜神經節細胞存活的數量。(Isenmann et al.，(1999)Cell Death Differ.，6(7).673-82)將反義寡核苷酸包埋在脂質體微囊中，然后通過融合用失活的日本血凝性病毒(HVJ；仙臺病毒)包膜包被微囊(HVJ脂質體)，如此對反義寡核苷酸的導入方法進行了改進。將反義寡核苷酸用FITC標記然后包埋在HVJ脂質體中，玻璃體腔(Intravitreal)注射后引起44％以下的神經節細胞產生高亮熒光，并且持續3天，而裸FITC標記的反義寡核苷酸產生的熒光在一天后就消失了。(Hangai et al.，(1998)Arch Ophthalmol，116(7)，976)本發明的一種方法是用以預防或減少眼組織和細胞的凋亡，例如(但不僅限于)星細胞、視網膜神經節、視網膜神經膠質細胞和篩板細胞。青光眼視網膜神經節細胞經由凋亡途徑發生死亡并引起失明。因此如果一種方法抑制或減少視網膜神經節細胞的凋亡，或者保護視網膜神經節細胞免受凋亡引起的退化，那么這種方法就提供了預防青光眼所致失明的新型療法。這種方法包括抑制凋亡特異性eIF-5A的表達以減少凋亡。凋亡特異性eIF-5A是一種表現出可有力調節整個凋亡過程的基因。因此通過阻遏凋亡特異性eIF-5A表達來控制視神經乳頭中的凋亡是一種治療青光眼的方法。
通過將人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸或siRNA導入眼部細胞，例如(但不僅限于)篩板細胞、星細胞、視網膜神經節細胞或視網膜神經膠質細胞，來抑制凋亡特異性eIF-5A的表達。反義寡核苷酸或siRNA定義如上文所書，即至少編碼部分凋亡特異性eIF-5A多肽的核酸序列。可用于本發明反義寡核苷酸包括如SEQ ID NO26或27，或者是在高嚴緊性條件下能結合到與SEQ ID NO26或27互補的序列上，并且抑制凋亡特異性eIF-5A表達的寡核苷酸。
本發明的另一實施方案提供了在篩板細胞、星細胞、視網膜神經節細胞或視網膜神經膠質細胞中抑制凋亡特異性eIF-5A表達的方法。將靶作用于人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸或siRNA(如(但不僅限于)SEQ ID NO26或27)導入篩板細胞、星細胞、視網膜神經節細胞或視網膜神經膠質細胞。這些細胞可以來自人體。
發明者們發現在缺血心臟組織中，凋亡特異性eIF-5A的含量水平與兩種細胞因子(白細胞介素1-β“IL-1β”和白細胞介素18“IL-18”)含量水平的提高有關，從而進一步證實當凋亡特異性eIF-5A存在于缺血心臟組織中時，也參與細胞死亡。而在非缺血性心臟組織中沒有發現這種凋亡特異性eIF-5A/白細胞介素間的相關性。見圖50A-F和51。使用PCR測量了多種缺血性心臟組織中(來自冠狀動脈旁路移植和瓣膜移植(二尖瓣和房室瓣(atrial valve))病人)凋亡特異性eIF-5A和增生eIF-5A(“eIF-5A2”-另一種異構體)、IL-1β和IL-18的水平。
凋亡特異性eIF-5A與這些有力白細胞介素間的關系進一步證實通過控制凋亡特異性eIF-5A水平可能會控制缺血組織的炎癥和凋亡途徑。人外周血單個核細胞((PBMC)正常狀態下低水平表達eIF-5A，但在T-淋巴特異性刺激下表達eIF-5A的水平急劇提高，這一事實進一步證實凋亡特異性eIF-5A參與免疫反應(Bevec et al.，1994)。這說明了凋亡特異性eIF-5A在T細胞增殖和/或活化中的作用。因為活化的T細胞能夠產生許多種細胞因子，所以細胞因子mRNA也可能需要凋亡特異性eIF-5A作為核-質穿梭運輸載體。上文參考文獻的作者也發現，由于eIF-5A被證實是HIV Rev蛋白的細胞結合因子并且HIV復制需要eIF-5A，所以在HIV-1病人的PBMC中eIF-5A含量水平的提高可能與這些細胞中HIV的有效復制相關(Ruhl et al.，1993)。
新近發現在樹突狀細胞成熟過程中eIF-5A表達的水平提高(Kruse et al.，2000)。樹突狀細胞是抗原呈遞細胞，它敏感化助T細胞和殺傷T細胞以誘發T細胞介導的免疫活性(Steinman，1991)。不成熟的樹突狀細胞缺乏刺激T細胞的能力并需要有適合的刺激(即驗證細胞因子和/或微生物產物)來成熟為能夠活化T細胞的細胞。腐胺縮賴氨酸合酶(凋亡特異性eIF-5A活化必需的酶)的抑制物被發現可通過防止CD83的表面表達來抑制T淋巴細胞經由樹突狀細胞的活化(Kruse et al.，2000)。因此凋亡特異性eIF-5A作為CD83 mRNA的核-質穿梭運輸蛋白，可能會促進樹突狀細胞的成熟。
有文獻報道(Bevec et al.，1994；Kruse et al.，2000)eIF-5A在免疫系統中的作用，但作者并未明確或鑒別出他們研究的是哪一種eIF-5A異構體，也沒有作出推斷。如上文所述，已知人具有兩種eIF-5A異構體，凋亡特異性eIF-5A(eIF-5A1)和增殖eIF-5A(eIF-5A2)，二者分別在不同的染色體上所編碼。在本發明以前，人們相信這兩種異構體在功能上是重復的。Bevec等人所描述的被用來在刺激后PBMC中探測eIF-5A的寡核苷酸，與人凋亡特異性eIF-5A具有100％的同源性，這項研究還在此前進行(pre-date)了增殖eIF-5A的克隆。與此相似，Kruse等人所述的被用來通過反轉錄聚合酶鏈式反應探測樹突狀細胞成熟過程中eIF-5A的引物，具有與人凋亡特異性eIF-5A100％的同源性。
本發明涉及到通過控制凋亡特異性eIF-5A表達來控制樹突狀細胞成熟速率和PBMC的活化，并可能以此控制T-細胞介導免疫活性的速率。單核細胞和巨噬細胞在免疫系統中其主要作用，它們能夠識別外來物并被活化/刺激，然后產生細胞因子以警告其余的免疫系統。發明者們使用U-937細胞系(因為已知U-937細胞系表達eIF-5AmRNA(Bevec et al.，1994))研究了凋亡特異性eIF-5A在單核細胞分化為粘著巨噬細胞過程中的作用。U-937是一種懸浮生長的人單核細胞系，在PMA的刺激下會變粘著并分化為巨噬細胞。當通過改變培養基除去PMA，細胞變成非活動性，并隨后能夠產生細胞因子(Barrios-Rodiles et al.，J.Immunol.，163963-969(1999))。已知在響應脂多糖(一種在許多細菌外膜上存在的因子)時誘發了一般炎癥反應，巨噬細胞同時產生TNF-α和IL-1β(Barrios-Rodiles et al.，1999)。見圖78，顯示了干細胞分化和所產生的細胞因子。在LPS刺激后，U-937細胞也產生IL-6和IL-10(Izeboud et al.，J.Receptor&SignalTransduction Research，19(1-4)191-202.(1999))。
使用U-937細胞，發現凋亡特異性eIF-5A在單核細胞分化和TNF-α分泌過程中受到增量調控。見圖77。凋亡特異性eIF-5A siRNA抑制了凋亡特異性eIF-5A蛋白的表達。用Western印跡比較用對照siRNA和凋亡特異性eIF-5A siRNA分別處理的細胞表達凋亡特異性eIF-5A、toll-樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子受體(TNF-R1)和干擾素γ受體(IFNγ-Rα)的特性。用ELISA和液相電化學發光法(ECL)對細胞因子、TNF、白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6和IL-8進行定量。
結果表明相比用對照siRNA處理的細胞，用凋亡特異性eIF-5AsiRNA處理的細胞特異性減量調節了凋亡特異性eIF-5A蛋白的表達80％以上。PMA、LPS、、IFN-γ處理會誘導凋亡特異性eIF-5A蛋白的表達。減量表達凋亡特異性eIF-5A的細胞也減量表達TLR4、TNF-R1和IFNγ-Rα。最初的實驗也說明，減量表達凋亡特異性eIF-5A的細胞中，LPS誘導的TNF表達在3h減少，LPS誘導的IL-1β和IL-8生成在24h減少。這些研究說明凋亡特異性eIF-5A可能參與了許多重要細胞因子信號分子(包括受體(TLR4、TNF-R1、IFNγ-Rα)和細胞因子(TNFα、IL-1β、IL-8))的轉錄后調控。
因此一方面本發明提供了抑制或延遲巨噬細胞成熟以抑制或減少細胞因子生成的方法。這種方法包括提供一種能夠減少DHS或凋亡特異性eIF-5A表達的物質。通過減少或禁止DHS的表達，凋亡特異性eIF-5A活化將被抑制或禁止。因為在單核細胞分化和TNF-α分泌過程中凋亡特異性eIF-5A受增量調控，所以相信在這些過程中需要有凋亡特異性eIF-5A。因此通過抑制或禁止凋亡特異性eIF-5A活化或直接減少或禁止凋亡特異性eIF-5A表達，可抑制或禁止單核細胞分化和TNF-α分泌。任何能夠減少DHS或凋亡特異性eIF-5A表達的物質都可使用，這包括(但不僅限于)本文所述的針對凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸(優選)或siRNA。
發明者們使用已知在響應特定刺激時會產生細胞因子的細胞系，在體外研究了人凋亡特異性eIF-5A作為細胞因子mRNA的核-質穿梭運輸載體，啟動細胞因子翻譯的能力。最近的一些研究發現人肝臟細胞系能夠響應細胞因子刺激，誘發其它細胞因子的生成。HepG2是一種人肝臟癌細胞系，它被發現對細胞因子敏感。在響應IL-1β時，HepG2以劑量依賴方式，迅速產生TNF-αmRNA和蛋白((Frede et al.，1996；Rowell et al.，1997；Wordemann et al.，1998)。所以HepG2被用作研究TNF-α生成的模型系統。發明者們發現在HepG2細胞中用直接針對凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸抑制人凋亡特異性eIF-5A的表達后，細胞產生的TNF-α會減少。
因此，本發明的一個實施方案提供了降低細胞因子水平的方法。該方法包括導入一種能夠減少凋亡特異性eIF-5A表達的物質的步驟。凋亡特異性eIF-5A表達的減少也減少了細胞因子的表達，因此引起細胞產生細胞因子數量的下降。這種細胞因子優選是一種促炎細胞因子，包括(但不僅限于)IL-1、IL-18、IL-6、TNF-α。
合適的用于減少凋亡特異性eIF-5A的物質包括上文所述的反義寡核苷酸。人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸包括如以下物質，SEQ ID NO35、37、39序列，或者是能在高嚴緊性條件下與SEQ IDNO35、37、39序列發生雜交的反義核酸。
其它的合適物質包括上文所述的人凋亡特異性eIF-5A的siRNA。人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸包括如以下物質，SEQID NO30、31、32和33序列，或者是能在高嚴緊性條件下與SEQ IDNO0、31、32和33序列發生雜交的反義核酸。如圖65-67所示，用人凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的細胞在與喜樹堿(amptothecin)和TNF-α接觸后，發生凋亡比例更低。
發明者們也研究了減少p53表達的方法。該方法包括導入能夠減少凋亡特異性eIF-5A表達的物質這一步驟，例如上文所述的反義寡核苷酸或siRNA。如圖52和實施例10所示，減少凋亡特異性eIF-5A表達也減少了p53的表達。
發明者們也研究了提高Bcl-2表達的方法。該方法包括導入能夠減少人凋亡特異性eIF-5A表達的物質這一步驟。優選使用上文所述的反義寡核苷酸或siRNA。如圖63和實施例13所示，減少凋亡特異性eIF-5A的表達提高了Bcl-2的表達。如圖63，用人凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染的細胞產生凋亡特異性eIF-5A的量減少，并且產生更多的Bcl-2蛋白。凋亡特異性eIF-5A表達的減少與Bcl-2表達的提高相關。
本發明也提供了在有需要的病人體內降低TNF-α水平的方法，包括向所述病人導入上文所述的凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸或siRNA這一步驟。如圖69和實施例14所示，用本發明的人凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸轉染的細胞相比未轉染細胞，在被IFN-γ誘導后產生凋亡特異性eIF-5A的量減少。
此外，本發明提供了治療特征為IL-1、TNF-α、IL-6或IL-18水平提高的病理狀態的方法，包括向處于所述病理狀態的哺乳動物導入上文所述物質(反義寡核苷酸和siRNA)，以減少凋亡特異性eIF-5A表達。已知的特征為IL-1、TNF-α、IL-6或IL-18水平提高的病理狀態包括(但不僅限于)風濕性關節炎骨關節炎，哮喘，過敏，脈管炎，crohn’s病，腸炎(ibd)，潰瘍性結腸炎，冠心病，囊胞性纖維癥，糖尿病，狼瘡，多發性硬化，Graves病，牙周炎，青光眼&黃斑變性，眼表疾病包括圓錐形角膜疾病，器官(心臟、腎臟)缺血，缺血再灌注損傷，膿毒癥，多發性骨髓瘤，器官移植排斥，牛皮癬和濕疹。例如，腸道炎癥疾病的特征為(部分由腸道上皮細胞分泌的)促炎細胞因子和趨化因子所引起的組織損傷。
干擾素γ(IFN-γ)由天然殺傷細胞(NK)和T淋巴細胞產生，它在細胞因子途徑網中起到中樞作用。IFN-γ在敏感性細胞中引起多種反應，包括抗病毒、抗增殖和免疫調節活性。IFN-γ與其受體(IFN-γR)的結合引起Janus激酶JAK1和JAK2的自磷酸化。相信JAK1在1022和1023兩個酪氨酸殘基上的磷酸化參與了催化活性(Liu et al.，Curr.Biol.(7)817-826(1997))。IFN-γR至少有兩條鏈組成，名為IFN-γRα和IFN-γRβ。IFN-γR配基與其受體的結合，引起JAK1的自磷酸化從而導致信號轉導和轉錄活化蛋白(STAT)轉錄因子的募集和酪氨酸磷酸化。STAT轉錄因子的磷酸化引起STAT的二聚化和核定位，然后STAT與靶啟動子的上游元件結合以調節轉錄。JAK-STAT途徑是良好的抗炎癥療法靶點的代表，因為改變JAK-STAT信號可減少細胞因子引起的促炎癥反應，而且認為不適當的IFN-γ表達參與了自身免疫紊亂。
腸道上皮細胞在正常生理狀態下，對天然腸道菌群產物(包括脂多糖(LPS))是低敏感性的。因為引起細胞因子如IL-8和TNF-α的產生，IFN-γ表現出具有賦予腸道上皮細胞響應LPS能力的性質。IFN-γ可能使腸道上皮細胞恢復對LPS敏感性的一種機制，是通過提高MD-2和Toll受體4(TLR4)(兩種LPS識別必需的蛋白)表達來提高對LPS的攝取(Suzuki et al.，Infection and Immunity；(71)3503-3511(2003))。增加的Th1細胞因子例如IFN-γ產生量(引起腸道上皮細胞對共生細菌的微生物產物的響應發生改變)，被認為參與了特征為腸道炎癥的慢性炎癥。
另一參與炎癥的分子是NFκ-β(也稱為NKκ-β或NFkB)。NFκ-β是一種主要的炎癥細胞信號分子，它的活化引起COX-2的表達，從而導致組織炎癥。COX-2編碼基因的表達(相信這響應炎癥位點的前列腺素大分子產物)，被NFkB在轉錄水平上所調控。NFkB位于細胞質內，并被其抑制物所限制。NFkB移動到胞核內并活化相應基因以表達COX-2。因此可通過減少NFkβ表達來減輕炎癥。
在本發明的一個實驗中，用靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA處理人上皮細胞(HT-29細胞)。然后添加TNF(干擾素γ)和LPS來使得NFkB誘導炎癥1h。此實驗的結果表明使用siRNA來抑制凋亡特異性eIF-5A表達降低了NFkB(它被干擾素γ和LPS所活化)的水平。見圖90。
發明者們證實HT-29細胞中在響應IFN-γ刺激時，凋亡特異性eIF-5A siRNA阻遏了TLR4和IFN-γRα蛋白的增量調控(見圖123)。如圖121，也表現了直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA阻抑了內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。圖124也表現了由siRNA所介導的凋亡特異性eIF-5A表達的阻抑，引起在IFN響應處理時STAT1α和JAK1磷酸化的降低。用凋亡特異性eIF-5A siRNA處理得到的TLR4增量調控(在IFN-γ刺激)的降低，與以往的數據相符，即證實了凋亡特異性eIF-5A siRNA降低了HT-29細胞中(在響應IFN-γ和LPS時)NF-κB p50的活化和TNF-α的產生。這些數據與凋亡特異性eIF-5A通過JAK-STAT途徑調節IFN-γ信號的理論相符。干擾凋亡特異性eIF-5A從而防止IFN-γ刺激的TLR4增量調控(結腸上皮細胞探測LPS所必需)，因此細胞保持對LPS的低敏感性。因此，在響應TLR4結合LPS時NFκB p50不被活化，同時細胞因子(TNF-α和IL-8)生成被抑制。
凋亡特異性eIF-5A siRNA急劇降低了STAT1α和JAK1的磷酸化(兩個重要的IFN-γ信號傳導步驟)，這一發現進一步支持了凋亡特異性eIF-5A調控IFN-γ信號這一觀點。雖然發現在IFN-γ刺激時IFN-γ受體α增量調控被降低，但不管用對照siRNA還是用凋亡特異性eIF-5A siRNA處理，IFN-γ量表現出與IFN-γ處理以前相同。雖然IFN-γRβ鏈可以受到凋亡特異性eIF-5A siRNA影響，但這些數據說明IFN-γ與其受體的結合可能沒有受到凋亡特異性eIF-5A siRNA影響。這說明JAK1的翻譯后調節，或調控JAK1表達或磷酸化的蛋白可能需要凋亡特異性eIF-5A。顯然JAK-STAT途徑的正常功能(至少通過JAK1和STAT1α)需要凋亡特異性eIF-5A，因此IFN-γ信號也同樣需要。
值得指出的是，對照siRNA能夠在HT-29細胞中引起反應，這可能是通過TLR3的雙鏈RNA探測的結果。具體來說，用對照siRNA處理的HT-29細胞相比未處理細胞，明顯產生更多的TNF-α和IL-8。而凋亡特異性eIF-5A siRNA不引起該反應。在用對照siRNA轉染而未用IFN-γ(見圖124)處理的細胞中，Jak1也被磷酸化。這可能反映了JAK-STAT途徑的活化，此作用參與由TLR3識別雙鏈RNA所引起的干擾素反應。這些數據說明在凋亡特異性eIF-5A siRNA處理細胞中，即使在用IFN-γ處理后JAK1也不被磷酸化，而這說明凋亡特異性eIF-5A siRNA可能阻遏了由探測雙鏈RNA所引發的干擾素反應(在Jak-STAT途徑中也發生)。
發明者們使用siRNA抑制了HT-29細胞中的凋亡特異性eIF-5A的表達，以檢測對干擾素γ(IFN-γ)信號的作用。凋亡特異性eIF-5AsiRNA使得HT-29細胞在響應IFN-γ和LPS時，分泌TNF-α的能力下降了90％以上。凋亡特異性eIF-5A siRNA也抑制了在響應IFN-γ時(但沒有抑制響應TNF-α時)IL-8的分泌。同樣的，發現凋亡特異性eIF-5A siRNA以IFN-γ特異性方式降低NF-κB p50的活化，也降低了IFN-γ刺激的TLR4和TNR1表達。更讓人感興趣的是，發現用對照siRNA轉染的細胞相比假轉染對照細胞，在受到IFN-γ刺激時分泌TNF-α顯著提高，并且凋亡特異性eIF-5A siRNA能夠顯著降低此反應。這些結果說明凋亡特異性eIF-5A可能是FN-γ信號途徑的翻譯后調節物，并且可能參與細胞對雙鏈RNA的反應。siRNA對凋亡特異性eIF-5A的抑制干擾了信號，并削弱了腸道上皮細胞分別經由TLR4和TNFR1響應LPS和TNF-α的能力。因此，對凋亡特異性eIF-5A的抑制表現出具有對腸道上皮細胞的直接免疫調節影響，并可能是腸道炎癥疾病的治療靶點。
因此，本發明第一個實施方案提供了通過抑制或減少內源性凋亡特異性eIF-5A的表達，來抑制或減輕促炎癥反應的方法。優選使用本發明的凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸或siRNA按上文所述來抑制凋亡特異性eIF-5A的表達。發明者們已說明了內源性凋亡特異性eIF-5A表達的減少對細胞結果的多種影響。這些影響包括多種參與炎癥級聯反應的生物分子(例如p53、促炎細胞因子(見圖112、113、114)、活性NFκβ、TLR4(見圖109和123)、TNFR-1(見圖111)、IFN-γRα(見圖122)和iNOS，還包括TNF-α)的減少，還包括降低STAT1α和JAK1的磷酸化。這些炎癥級聯反應所必需的生物分子水平的減少或活性的降低，導致炎癥的減輕。削弱細胞進入炎癥級聯反應的能力，可能會被證實為可有效治療慢性炎癥相關疾病/癥狀(例如(但不僅限于)腸道炎癥疾病、關節炎、Chron′s病和狼瘡)。
因此，本發明也提供了通過使用直接針對凋亡特異性eIF-5A的反義核酸或siRNA來抑制或阻抑凋亡特異性eIF-5A表達，來降低p53水平、降低促炎細胞因子水平(見圖112、113、114)、降低活性NFκβ、TLR4、TNFR-1、IFN-γRα、iNOS、TNF-α的水平，和減少STAT1和JAK1磷酸化的方法。
本發明也提供了在體內向哺乳動物肺臟導入siRNA的方法。通過鼻腔將直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA(與水混合)導入小鼠體內。導入24h后，向小鼠體內導入脂多糖(LPS)。LPS是一種細菌生物大分子細胞表面抗原，它在體內應用時引發炎癥反應網絡。通過鼻腔導入LPS引起肺臟內嗜中性細胞數量的增加。主要事件之一是單核噬菌細胞經由受體介導途徑的活化，這引起許多細胞因子包括TNF-α的釋放。然后TNF-α引起的嗜中性細胞對上皮細胞粘著作用的增強，導致肺臟空間內的大量(massive)滲透。
24h后取出右肺，并測量髓過氧化物酶。髓過氧化物酶(MPO)是嗜中性細胞中的溶菌酶。MPO使用氫過氧化物酶將氯化物轉化為次氯酸。次氯酸與細菌發生反應并摧毀細菌。當動脈發炎時，也生成MPO。因此，MPO顯然與嗜中性細胞和炎癥反應相關。與對照siRNA相比，小鼠凋亡特異性eIF-5A siRNA阻抑了近90％的髓過氧化物酶。在研究中，每個小組中有5只小鼠。該研究的結果說明siRNA可被成功在體內導入哺乳動物的肺臟組織，也說明直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA抑制了凋亡特異性eIF-5A的表達，從而阻抑髓過氧化物酶的生成。
發明者們也證實了用siRNA進行的凋亡特異性eIF-5A減量調控，降低了肺臟組織在接觸LPS(它通常引起有髓過氧化物酶參與的炎癥反應)后產生髓過氧化物酶的水平，并從而降低或阻抑了炎癥反應。因此，本發明的一個實施方案提供了通過導入針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA來抑制或減少凋亡特異性eIF-5A siRNA的表達，來降低肺臟組織中MPO水平的方法。凋亡特異性eIF-5A siRNA表達的減少導致MPO的減少。可以通過鼻腔導入凋亡特異性eIF-5AsiRNA。
MPO水平是自身免疫紊亂引起的心臟病發作和細胞因子-炎癥的關鍵預測物。降低或阻抑炎癥反應的能力可能會在治療炎癥相關紊亂(例如自身免疫紊亂)的過程中發揮作用。此外，降低MPO水平的能力可能意味著可在局部缺血的事件發生時和心臟病發作時保護病人。
如圖116所示，用凋亡特異性eIF-5A siRNA在小鼠體內進行實驗，結果說明它能夠降低小鼠血清中的TNF-α含量。通過靜脈注射將siRNA導入小鼠尾部血管。在導入LPS 90min后和在靜脈注射凋亡特異性eIF-5A siRNA轉染48h后，測量血清TNFα水平。圖117顯示了通過鼻腔向小鼠體內導入siRNA(如上文所述)的實驗結果。在小鼠血清中測量總TNF-α水平。凋亡特異性eIF-5A siRNA導致TNF-α含量的下降。因此，本發明的一個實施方案提供了通過導入針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA來抑制或減少凋亡特異性eIF-5A表達，來減少血清TNF-α含量的方法。凋亡特異性eIF-5A表達的減少導致血清TNF-α含量的減少。
如圖118所示，巨噬細胞炎癥蛋白1-α(MIP-1α)的水平也降低。MIP-1α是一種低分子量趨化因子，它屬于細胞因子的RANTES(活化后可調節的、正常T細胞表達和分泌的(因子)(regulated on activationnormal T cell expressed and secreted))家族，并與受體CCR1、CCR5、CCR9結合。因此，本發明的一個實施方案提供了通過導入針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA來抑制或減少凋亡特異性eIF-5A表達，來減少肺臟組織中MIP-1α含量的方法。凋亡特異性eIF-5A表達的減少導致MIP-1α含量的減少。
圖119顯示了用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA處理小鼠(通過鼻腔/靜脈注射導入)的實驗結果。結果顯示，在用LPS處理90min后和用siRNA處理后48h，與未用siRNA處理的小鼠肺臟相比，用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA處理的小鼠肺臟中Il-1的水平顯著下降。因此本發明的一個實施方案提供了通過導入針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA來抑制或減少凋亡特異性eIF-5A表達，來減少肺臟組織中Il-1α含量的方法。凋亡特異性eIF-5A表達的減少導致Il-1α含量的減少。
因此發明者們展示了凋亡特異性eIF-5A與免疫反應間的關系，也展示了針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA可阻抑髓過氧化物酶(這是免疫反應的一部分)。發明者們也展示了可以簡便的通過鼻腔在體內向肺臟組織導入siRNA。此siRNA僅與水混合即可。這代表了在本領域技術人員一直試圖優化的siRNA導入方法上的一大突破和發現。
與此相似，在另一實驗中用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA處理小鼠。向小鼠體內導入脂多糖(LPS)以誘發炎癥和免疫系統反應。在對照條件下，LPS殺死了胸腺細胞，而胸腺細胞是胸腺產生的一種可抵御感染的重要的免疫系統前體分子。但是使用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA使得胸腺細胞在LPS存在時具有約90％的存活率。因為胸腺細胞是T細胞的前體分子，它們被摧毀后機體的天然免疫活力就不能產生T細胞，因此就不能抵御細菌感染之類的攻擊。因此可是使用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA來減輕炎癥(如實施例1中MPO水平降低)，同時并不摧毀機體的天然免疫防御系統。
本發明的反義核酸和siRNA在用預防或治療動物疾病時，可以組合物形式導入，其間另外添加制藥學上可行的載體。合適的制藥學上可行的載體包括如，水、鹽、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、甘油和乙醇等物質中的一種或多種，或聯合使用這些物質。制藥學上可行的載體可進一步包含較小量的輔助物(auxiliary substance)，如潤濕或乳化劑、防腐劑或緩沖液，這些物質提高了結合蛋白的保存時間或效能。可按本領域技術人員已知的方法來制備注射組合物，以在將組合物導入哺乳動物體內后，有效成分快速、持續或延時釋放。
本發明的組合物可以為多種形式，這包括如固體、半固體和液體形式，如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液、分散液或懸浮液、脂質體、栓劑、可注射且可輸注溶液。優選的制劑形式依賴于目的導入方式和治療用途。
可用制藥學領域熟知方法來制備這種組合物。在組合物制備過程中，活性成分通常與載體混合，稀釋于載體中，和/或由載體包被，這些載體能夠形成如膠囊、小袋、紙質或其它容器形式。當載體作為稀釋劑時，它可以是固體、半固體、或液體物質，同時載體還發揮了活性成分的載體、賦形劑或介質的作用。因此，組合物可以是片劑、含片、小袋(sachets)、膠囊、酏劑、懸浮液、氣霧劑(固體形式或存于液體介質中)、藥膏(其中包含的有效成分重量含量可高至(如)10％)、柔軟和堅硬凝膠膠囊、栓劑、注射液、懸浮液、包裝好的無菌粉劑、局部膏藥的形式。
現在已在總體上描述了本發明，下面將通過實施例形式來進一步描述本發明，這些實施例以說明的方式給出。這些實施例是用以幫助讀者理解本發明，而不是為了對本發明的范圍進行任何限定。并且這些實施例沒有包括常規方法的詳細描述。這些方法被本領域技術人員所熟知，也在許多公開文獻中都有描述。常規方法的詳細描述，例如載體和質粒的構建，將編碼多肽核酸插入到載體和治理，將質粒導入到宿主細胞，表達并確定基因產物等，可以從許多公開文獻中查到，這些文獻包括Sambrook，J.et al.，(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，2nded.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。所有文獻通過引用結合到本文。
實施例實施例1使用DNA成梯試驗(laddering)在大鼠黃體中觀察凋亡可使用DNA成梯試驗確定凋亡程度。使用QIAamp DNA BloodKit(Qiagen)按照使用說明書從分散黃體細胞中或從離體黃體組織中分離基因組DNA。在誘導凋亡(使用PGF-2α處理1h)之前和誘導凋亡之后1h和24h取出黃體組織。取500ng基因組DNA，與0.2μCi[α-32P]dCTP、1mM Tris、0.5mM EDTA、3U Klenow酶，以及dATP、dGTP、dTTP各0.2pM在室溫下共孵育30min，從而對分離的DNA進行末端標記。根據Sambrook等人所述，將樣品用一根1ml SepadexG-50層析柱進行層析，除去未標記核苷酸。然后對樣品進行Tris-醋酸鹽-EDTA(1.8％)凝膠電泳。室溫下真空干燥凝膠30min，并在-80℃下將凝膠放在X射線感光膠片上曝光24h。
在一個實驗中，在注射PGF-2α后的0、1、2或24h，分別檢測過度排卵的大鼠黃體的凋亡程度。0h對照不用注射PGF-2α，即取出卵巢。低分子量DNA片段的成梯狀條帶(反映了與凋亡相關的核酸酶的活性)在對照黃體組織中(PGF-2α處理前即取出)不明顯，但是在誘導凋亡后的1h時間內即可辨認，并且在誘導凋亡后的24h后就非常清晰了，如圖16所示。此圖中，頂端部分是Northern印跡(以用32P-dCTP標記的大鼠黃體凋亡特異性DHS cDNA的3′-非翻譯區域作為探針)的放射自顯影圖，下面是總RNA的EB染色凝膠圖，每個泳道含有10μg RNA。數據表明在血清停藥后，凋亡特異性eIF-5A的轉錄受到減量調控。
另一實驗中，用鹽水代替PGF-2α處理相應的對照動物。用鹽水或PGF-2α處理15min后，從動物體內取出黃體。在取出后的3h和6h，分別從黃體組織中分離基因組DNA。在用PGF-2α處理的動物組織取出后6h提取樣品中，可明顯觀察到DNA成梯狀且基因組DNA末端標記增強，但在取出后3h提取樣品中沒有此發現，見圖17。PGF-2α處理后15min取出的動物黃體樣品中也可明顯觀察到反應凋亡的DNA成梯現象，并在體外條件下(EBSS(Gibco)中)保持6h之久。從更強的基因組DNA末端標記中也可明顯的觀察到與凋亡相關的核酸酶活性。
另一實驗中通過皮下注射500μg PGF-2α來誘導過度排卵。對照大鼠用等體積的鹽溶液處理。15-30min后，取出卵巢并用膠原酶切碎。用PGF-2α處理的大鼠的分散細胞與10mm谷氨酰胺加10mm亞精胺共孵育1h，再與10mm谷氨酰胺(無亞精胺)共孵育5h(泳道2)，或者與10mm谷氨酰胺加10mm亞精胺共孵育1h，再與10mm谷氨酰胺加10mm亞精胺共孵育5h(泳道3)。用鹽水處理的對照大鼠細胞用膠原酶分散后，與10mm谷氨酰胺加10mm亞精胺共孵育1h，再與10mm谷氨酰胺(無亞精胺)共孵育5h(泳道1)。分別取來自每個樣品的500ng DNA，使用klenow酶進行[α-32P]-dCTP標記，并在1.8％的瓊脂糖凝膠上分離，再放在X射線感光膠片上曝光24h。結果見圖18。
還有一個實驗中，分別在500μg PGF-2α皮下注射處理前的24h、12h和2h向過度排卵的大鼠皮下注射亞精胺，每100g體重共注射1mg，每次注射0.333mg/100g體重。對照大鼠分為3組無注射，3次注射亞精胺但不用PGF-2α處理，以及在PGF-2α處理前同時間點3次注射等體積的鹽溶液。在用前列腺素處理后的95min或3h又45min時，取出大鼠卵巢，并用以分離DNA。分別取來自每個樣品的500ng DNA，使用klenow酶進行[α-32P]-dCTP標記，并在1.8％的瓊脂糖凝膠上分離，再放在X射線感光膠片上曝光24h泳道1，無注射(在與泳道3-5同樣的時間點處死動物)；泳道2，注射3次亞精胺(在與泳道3-5同樣的時間點處死動物)；泳道3，3次注射鹽溶液后注射PGF-2α(動物在PGF-2α處理后95min處死)；泳道4，3次注射亞精胺后注射PGF-2α(動物在PGF-2α處理后95min處死)；泳道5，3次注射亞精胺后注射PGF-2α(動物在PGF-2α處理后95min處死)；泳道6，3次注射亞精胺后注射PGF-2α(動物在PGF-2α處理后3h又45min處死)；泳道7，3次注射亞精胺后注射PGF-2α(動物在PGF-2α處理后3h又45min處死)。結果見圖19。
RNA分離在用PGF-2α誘導凋亡后的不同時間點從大鼠體內取出黃體，并分離RNA。將組織(5g)在液氮中快速磨碎，然后將碎粉與30ml胍鹽緩沖液(4M異硫氰酸胍、2.5mM NaOAc，pH8.5、0.8％β-巰基乙醇)混合。用四層Miracloth濾膜過濾混合物，并在10000g、4℃下離心30min。取上清液，進行氯化銫密度梯度離心，11200g，20h。用75％乙醇漂洗RNA沉淀，再用600ml DEPC-處理水重懸浮，然后在-70℃用1.5ml 95％乙醇和60ml 3M NaOAc沉淀RNA。
基因組DNA分離和成梯試驗按照使用說明書使用QIAamp DNA Blood Kit(Qiagen)從提取的黃體組織或分散黃體細胞中分離基因組DNA。取500ng基因組DNA，與0.2μCi[α-32P]dCTP、1mM Tris、0.5mM EDTA、3U Klenow酶，以及dATP、dGTP、dTTP各0.2pM在室溫下共孵育30min，從而對分離的DNA進行末端標記。根據Maniatis等人所述方法，將樣品用一根1ml Sepadex G-50層析柱進行層析，除去未標記核苷酸。然后對樣品進行Tris-醋酸鹽-EDTA(1.8％)凝膠電泳。室溫下真空干燥凝膠30min，并在-80℃下將凝膠放在X射線感光膠片上曝光24h。
質粒DNA分離，DNA測序根據上文Sambrook等人所述用堿解法(alkaline lysis)提取質粒DNA。用雙脫氧測序法對全長陽性cDNA克隆進行測序(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)。使用BLAST(GenBank，Bethesda，MD)進行開放閱讀框的搜集和分析，并使用BCM SearchLauncher(多序列比對模式-誘導的多重比對方法，Multiple SequenceAlignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method，F.Corpet，Nuc.Acids Res.，1610881-10890，(1987))進行序列比對。序列和序列比對見圖5-11。
大鼠黃體RNA的Northern印跡在1％的變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離來自大鼠黃體凋亡不同階段的20mg總RNA，并固定在尼龍膜上。使用隨機引物試劑盒(Boehringer)用32P-dCTP標記全長大鼠凋亡特異性eIF-5A cDNA(SEQID NO1)，并用以探測膜(7×107cpm)。或者使用隨機引物試劑盒(Boehringer)用32P-dCTP標記全長大鼠DHS cDNA(SEQ ID NO6)，并用以探測膜(7×107cpm)。然后在室溫下用1x SSC、0.1％SDS洗膜一次，再于65℃下用0.2x SSC、0.1％SDS洗膜三次。膜干燥后，在-70℃下放在X射線感光膠片上曝光過夜。
可見凋亡特異性eIF-5A和DHS在凋亡中的黃體組織中均受到增量調控。在用PGF-2α處理誘導凋亡后，凋亡特異性eIF-5A的表達顯著提高-在零時較低，在處理后的1h內即顯著提高，處理后8h內提高到更高水平，處理后24h內輕微提高(圖14)。DHS的表達在零時較低，在處理后的1h內即顯著提高，處理后8h內提高到更高水平，處理后24h內也輕微提高(圖15)。
使用基于酵母、真菌和人eIF-5A序列的引物，得到凋亡中大鼠黃體的RT-PCR產物使用一對根據酵母、真菌和人凋亡特異性eIF-5A序列設計的寡核苷酸引物，以凋亡中的大鼠黃體RNA為模板進行RT-PCR，得到了部分長度的凋亡特異性eIF-5A序列(SEQ ID NO11)，它相應于基因3’末端。用以分離大鼠凋亡特異性eIF-5A基因3’末端的上游簡并引物長20個核苷酸5′TCSAARACHGGNAAGCAYGG 3′(SEQ IDNO9)，其中的S為C或G；R為A或G；H為A、T或C；Y為C或T；N可為任意核苷酸。用以分離大鼠凋亡特異性eIF-5A基因3’末端的下游引物長42個核苷酸5′GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′(SEQ ID NO10)。進行反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。簡短來說，使用5mg下游引物合成cDNA的第一鏈。然后用第一鏈作為RT-PCR的模板，并同時使用上游和下游引物。
將RT-PCR產物用瓊脂糖凝膠分離，得到900bp的片段，通過用平末端連接將該片段亞克隆到pBluescriptTM載體中(StratageneCloning Systems，LaJolla，CA)并測序(SEQ ID NO11)。cDNA的3’末端序列是SEQ ID NO11，3’末端氨基酸序列是SEQ ID NO12，見圖1-2。
以凋亡中的大鼠黃體RNA為模板進行RT-PCR，得到了部分長度的凋亡特異性eIF-5A序列(SEQ ID NO15)，它相應于基因5’末端并與3’末端重疊。根據人eIF-5A設計5’引物，長24個核苷酸5′CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3′(SEQ ID NO13)。根據人RT-PCR的3’末端設計3’引物，長30個核苷酸5′ATATCTCGAGCCTT GATTGCAACAGCTGCC3′(SEQ ID NO14)。進行反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。簡短來說，使用5mg下游引物合成cDNA的第一鏈。然后用第一鏈作為RT-PCR的模板，并同時使用上游和下游引物。
將RT-PCR產物用瓊脂糖凝膠分離，得到500bp的片段，通過用分別存在于上游和下游引物中的XbaI和XhoI克隆位點，將該片段(SEQ ID NO11)亞克隆到pBluescriptTM載體中(Stratagene CloningSystems，LaJolla，CA)并測序(SEQ ID NO15)。cDNA的5’末端序列是SEQ ID NO15，5’末端氨基酸序列是SEQ ID NO16，見圖2。
大鼠凋亡特異性eIF-5A的3’和5’末端(分別為SEQ ID NO11和SEQ ID NO15)互相重疊并形成全長cDNA(SEQ ID NO1)。將此全長序列與GeneBank中的數據進行比較，見圖1-2。該cDNA克隆編碼一個長154個氨基酸的分子量計算值為16.8KD的多肽(SEQ IDNO2)。圖3中描繪了通過RT-PCR得到的大鼠黃體凋亡特異性eIF-5A基因的全長cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，相應的氨基酸序列為SEQ ID NO9。將該全長eIF-5A氨基酸序列與人和小鼠eIF-5A序列進行比對，見圖7-9。
使用基于人DHS序列的引物，得到凋亡中大鼠黃體的RT-PCR產物使用一對根據人DHS序列設計的寡核苷酸引物，以凋亡中的大鼠黃體RNA為模板進行RT-PCR，得到了部分長度的DHS序列(SEQID NO6)，它相應于基因3’末端。5’引物長20個核苷酸5′GTCTGTGTATTATTGGGCCC 3′(SEQ ID NO17)；3’引物長42個核苷酸5′GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′(SEQ ID NO18)。進行反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。簡短來說，使用5mg下游引物合成cDNA的第一鏈。然后用第一鏈作為RT-PCR的模板，并同時使用上游和下游引物。
將RT-PCR產物用瓊脂糖凝膠分離，得到606bp的片段，通過用平末端連接將該片段亞克隆到pBluescriptTM載體中(StratageneCloning Systems，LaJolla，CA)并測序(SEQ ID NO6)。圖4中描繪了通過RT-PCR得到的部分長度的大鼠黃體凋亡特異性DHS基因序列(SEQ ID NO6)，相應的氨基酸序列為SEQ ID NO7。
基因組DNA的分離和Southern分析從離體的大鼠卵巢分離得到基因組DNA，并進行southern印跡法試驗。將約100mg的卵巢組織碎成小塊并置于一支15ml試管中。用1ml PBS洗滌組織兩次(對組織懸浮液輕輕振蕩，然后用吸管除去PBS)。然后用2.06ml DNA緩沖液(0.2M Tris-HCl，pH 8.0，0.1mMEDTA)重懸組織，并添加240μl 10％SDS、100μl蛋白酶K(Boehringer Manheim；10mg/ml)。再將試管置于45℃振搖水浴中過夜。第二天再向試管內組織懸液中加入100μl蛋白酶K(10mg/ml)，然后將組織懸浮液在45℃水浴中孵育4h。隨后用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液萃取組織懸浮液一次，完成后再用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液萃取一次。萃取后加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH 5.2)和兩倍體積的乙醇。用本生燈將一根玻璃吸管一端燒熔密封并形成一個鉤子，用它從溶液中勾出細線狀的DNA并轉移到一個干凈的微離心管中。用70％乙醇洗滌DNA一次，并風干10min。用500μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶解DNA沉淀，再加入10μl RNaseA(10mg/ml)，然后在37℃下孵育1h。用苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液萃取DNA一次，然后加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH 5.2)和兩倍體積的乙醇沉淀DNA。以13,000xg在4℃下離心10min。再用70％乙醇洗滌DNA沉淀一次，然后重新溶解于200μl 10mMTris-HCl(pH 8.0)中，4℃下旋轉過夜。
為進行southern印跡分析，將分離自大鼠卵巢的基因組DNA用多種限制性酶消化，這些酶或者在內源性基因中不切割，或者僅切割一次。為此，將10μg基因組DNA，20μl 10X反應緩沖液和100U限制性酶在總體積為200μl的反應體系里反應5-6h。消化后的DNA在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳，電壓40v進行6h或15v電泳過夜。電泳后將凝膠在0.2N HCl中脫嘌呤(depurinated)10min，隨后用變性溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)洗滌兩次，每次15min，再用中和緩沖液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH7.4)洗滌兩次，每次15min。將DNA轉移到尼龍膜上，然后將膜置于雜交溶液中(40％甲酰胺，6X SSC，5X Denhart′s溶液(1X Denhart′s溶液含0.02％Ficoll，0.02％PVP和0.02％BSA)，0.5％SDS和1.5mg變性鮭魚精子DNA)進行預雜交。通過隨機引物用[α-32P]-dCTP標記大鼠eIF-5A cDNA的3’UTR的700bp PCR片段，然后將該片段以1×106cpm/ml加到膜上。
類似的，通過隨機引物用[α-32P]-dCTP標記大鼠DHScDNA(450bp的編碼序列和156bp的3’UTR)，然后以1×106cpm/ml加到另一個相同的膜上。42℃下印跡雜交過夜，然后在42℃下用2XSSC和0.1％SDS洗滌兩次，再在同樣溫度下用1X SSC和0.1％SDS洗滌兩次。然后將印跡顯影3-10d。
用限制性酶切開大鼠基因組DNA，如圖20所示，并用32P-dCTP標記的全長eIF-5A cDNA為探針進行探測。高嚴緊條件下的雜交實驗揭示了全長eIF-5A cDNA探針與每個限制性酶消化DNA樣品的若干限制性片段間的雜交，說明了若干eIF-5A異構體的存在。需要特別指出的是，當用EcoRV(它在凋亡特異性eIF-5A開放閱讀框內有限制性識別位點)消化基因組DNA時，在southern印跡實驗中探測到兩個凋亡特異性eIF-5A異構體的限制性片段。在圖20中用雙箭頭標出。在標為EcoR I和BamH I(它們在開放閱讀框中沒有酶切位點)的泳道中，用單箭頭標出相應于凋亡特異性eIF-5A異構體的限制性片段。這些結果說明凋亡特異性eIF-5A在大鼠中是一個單拷貝基因。如圖5-13所示，不同種間的eIF-5A基因高度保守，所以可以預測任意種內的異構體之間有相當高的保守性。
如圖21，顯示了以用32P-dCTP標記的部分大鼠黃體DHS cDNA作為探針得到的大鼠基因組DNA的southern印跡結果。用EcoRV處理基因組DNA，該酶對部分長度的cDNA探針不起作用。可明顯辨別出兩個限制性片段，這說明該基因有兩個拷貝或該基因含有一個具有EcoRV位點的內含子。
實施例2
本實施例闡述了凋亡特異性eIF-5A對凋亡的調節(正義方向的凋亡特異性eIF-5A增強了凋亡作用)。
培養COS-7細胞，RNA分離COS-7細胞是用SV40(編碼野生T抗原)的突變體轉化的非洲綠猴腎臟成纖維細胞樣細胞系，它被用于所有的轉染實驗。用Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)(含有0.584g/L的L-谷氨酰胺、4.5g/L的葡萄糖和0.37％碳酸氫鈉)培養COS-7細胞。在培養基中添加10％胎牛血清(FBS)和100單位的青霉素/鏈霉素。在37℃、5％CO2和95％空氣、加濕環境中培養細胞。每3-4d用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA溶液分離貼壁細胞來進行傳代。分離的細胞按1∶10分流比分配到含有新鮮培養基的新培養皿中。
在150mm組織培養皿(Corning)中培養用以分離RNA的COS-7細胞。用胰蛋白酶EDTA溶液分離細胞來收集細胞。用離心管收集分離的細胞，3000rpm轉速離心5min。除去上清液，用液氮速凍細胞沉淀。按照使用說明書使用GenElute Mammalian Total RNAMiniprep kit(Sigma)從冷凍細胞中分離RNA。
構建重組質粒并轉染COS-細胞使用哺乳動物表位標簽表達載體pHM6(Roche MolecularBiochemicals)構建重組質粒，其中攜帶有正義方向的大鼠凋亡特異性eIF-5A全長編碼序列，以及反義方向的大鼠凋亡特異性eIF-5A3’非翻譯區域(UTR)，如圖21所示。此載體包含以下元件CMV啟動子-人巨細胞病毒的立即-早期(immediate-early)啟動子/增強子，來自流感病毒血凝素的HA-九肽表位標簽，BGH pA-牛生長激素聚腺苷酸化信號，f1 ori-f1復制起點，SV40 ori-SV40早期啟動子和復制起點，新霉素抗性基因(G418)，SV40 pA-SV40聚腺苷酸化信號，Col E1-ColE1復制起點，氨芐青霉素抗性基因。從pBluescript載體中的原始大鼠凋亡特異性eIF-5A RT-PCR片段(SEQ ID NO1)出發，PCR擴增得到大鼠凋亡特異性eIF-5A全長編碼序列和大鼠凋亡特異性eIF-5A3’UTR。擴增全長eIF-5A的引物為，正向5′GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG3′(SEQ ID NO59)(Hind3)，反向5′CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG 3′(SEQ IDNO60)(EcoR1)。擴增大鼠凋亡特異性eIF-5A 3’UTR的引物為，正向5′AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC 3′(SEQ ID NO61)(EcoR1)，反向5′GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′(SEQ ID NO62)(Hind3)。
大鼠凋亡特異性eIF-5A全長序列PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后長度為430bp，大鼠凋亡特異性eIF-5A 3’UTR PCR產物為697bp。將這兩個片段亞克隆到pHM6的Hind3和EcoR1位點間，以構建pHM6-全長凋亡特異性eIF-5A和pHM6-反義3’UTR eIF-5A。將全長大鼠凋亡特異性eIF-5A PCR產物亞克隆與處于多克隆位點的上游的流感病毒血凝素(HA)九肽表位標簽置于同一閱讀框內，從而使得重組蛋白能夠使用抗-[HA]-過氧化物酶抗體來探測。使用人巨細胞病毒的立即-早期啟動子/增強子來驅動表達，以確保在哺乳動物細胞系中獲得高水平表達。這個質粒也含有新霉素抗性基因(G148)(從而能夠選擇穩定轉化子)和SV40早期啟動子和復制起點，這使得在表達SV40大(large)T抗原的細胞(如COS-7)中可進行附加型復制。
轉染實驗待用的COS-7細胞的培養如下進行，在24孔培養板(Corning)上培養將用于蛋白提取的細胞，在4格培養片上(Falcon)培養將要染色的細胞。在添加有10％FBS(缺少青霉素/鏈霉素)的DMEM培養基中培養細胞，直至細胞融合達50-70％。將0.32μg質粒DNA稀釋在42.5μl無血清DMEM培養基中，并在室溫下孵育15min，以制備足以用在24孔板上一個孔或培養片上的轉染液。將1.6μl轉染試劑LipofectAMINE(Gibco，BRL)稀釋在42.5μl無血清DMEM培養基中，并在室溫下孵育5min。然后將LipofectAMINE混合物添加到DNA混合物中，并在室溫下孵育30-60min。用無血清DMEM培養基洗滌待轉染細胞一次，然后用轉染液覆蓋細胞，再將細胞放回培養4h。
孵育后，向細胞中加入0.17ml DMEM+20％FBS。然后培養細胞40h，再進行凋亡誘導(然后染色)或收集細胞以進行Western印跡分析。進行假轉染作為對照，其中在轉染液中沒有加入質粒DNA。
蛋白提取和Western印跡分析從轉染細胞中提取蛋白以進行Western印跡，首先用PBS(8g/LNaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/L KH2PO4)洗滌細胞兩次，然后加入150μl熱SDS凝膠上樣緩沖液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫蘇糖醇，2％SDS，0.1％溴酚藍，和10％甘油)。將細胞溶出物收集在微離心管中，95℃加熱10min，然后再13000xg轉速離心10min。將上清液轉移到新微離心管中并于-20℃下儲存待用。
為進行Western印跡，將2.5或5μg的總蛋白在12％SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將分開的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與封阻溶液(5％脫脂奶粉、0.02％疊氮化鈉的PBS溶液)孵育1h，然后用PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)洗滌三次共15min。將膜保存在PBS-T溶液中，4℃過夜。第二天在膜恢復到室溫后，用1μg/ml聚乙烯醇封阻30s。用去離子水漂洗膜5次，然后用5％牛奶PBS溶液封阻30min。將一級抗體在5％牛奶PBS溶液中預孵育30min，然后與膜共孵育。
使用若干一級抗體。使用抗-[HA]過氧化物酶抗體(RocheMolecular Biochemicals，稀釋度1∶5000)來探測重組蛋白的表達。因為這個抗體與過氧化酶偶聯，所以不需要二級抗體，洗滌印跡并通過化學發光來辨認。使用的另一一級抗體為來自癌基因的單抗，它識別p53(Ab-6)、Bcl-2(Ab-1)、c-Myc(Ab-2)。識別p53的單抗使用稀釋度為0.1μg/ml，識別Bcl-2和c-Myc的單抗為0.83μg/ml。與一級抗體孵育60-90min后，用PBS-T溶液洗滌三次共15min。然后將二級抗體稀釋在1％牛奶PBS中，并與膜共孵育60-90min。當使用p53(Ab-6)為一級抗體時，使用與堿性磷酸酶偶聯的羊抗鼠IgG(Rockland)作為二級抗體，稀釋度1∶1000。當使用Bcl-2(Ab-1)和c-Myc(Ab-2)作為一級抗體時，使用與過氧化物酶偶聯的兔抗鼠IgG(Sigma)作為二級抗體，稀釋度1∶5000。與二級抗體共孵育后，將膜用PBS-T洗滌三次。
使用兩種探測方法來顯現印跡，比色法和化學發光法。比色法只在p53(Ab-6)作為一級抗體，用偶聯有堿性磷酸酶的二級抗體時才能夠使用。將印跡在黑暗中與0.33mg/mL硝基四唑藍、0.165mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚磷脂、100mM NaCl、5mM MgCl2、和100mMTris-HCl溶液(pH9.5)孵育，以顯現結合的抗體。將膜與2mM EDTA的PBS溶液共孵育以停止顏色反應。使用其它所有二級抗體時均可使用化學發光探測法，包括抗-[HA]-過氧化物酶、Bcl-2(Ab-1)、c-Myc(Ab-2)。使用ECL Plus Western印跡探測試劑盒(AmershamPharmacia Biotech)來探測過氧化物酶-偶聯的固定抗體。簡短來說，將膜輕輕吸干，然后在黑暗中與試劑A和B的混合液(40∶1)孵育5min。將膜吸干，夾在醋酸纖維膜之間，然后放在X射線感光膠片上曝光，時間為10s-10min。
在COS-7細胞中誘導凋亡使用兩種方法在轉染的COS-7細胞中誘導凋亡，即去血清法和鏈霉菌(streptomyces sp)放線菌素D(Calbiochem)處理法。兩種方法中，均在轉染后除去培養基并保持40h。在去血清實驗中，用無血清無抗體的DMEM代替培養基。在添加有10％FBS的無抗體DMEM中生長的細胞用作對照。在放線菌素D誘導凋亡方法中，用添加了10％FBS和1μg/ml的放線菌素D甲醇溶液的無抗體DMEM代替培養基。對照細胞在添加了10％FBS和等體積甲醇的無抗體DMEM中培養。兩種方法中，均使用Hoescht或膜聯蛋白V-Cy3染色在48h后確定發生凋亡的細胞百分比。也通過Northern印跡確認凋亡誘導，如圖22所示。
Hoescht染色使用Hoescht核染色來標記轉染COS-7細胞的胞核，以通過形態學特征鑒別凋亡細胞，如核破碎和凝縮。A固定劑由無水甲醇和冰醋酸的混合液(3∶1)組成，即用即配。將等體積的固定劑加入到培養片上的COS-7細胞培養基中，孵育2min。然后從細胞中移出培養基/固定劑混合物并棄去，再向細胞加入1ml固定劑。5min后棄去固定劑，再加入1ml新鮮固定劑孵育5min。隨即棄去固定劑，風干細胞4min，再加入1ml Hoescht染色液(0.5μg/ml Hoescht33258溶于PBS)。在黑暗中孵育10min后棄去染色液，用去離子水洗滌培養片三次共1min。然后向細胞加入1ml McIlvaine′s緩沖液(0.021M檸檬酸、0.058M Na2HPO4.7H2O，pH5.6)，在黑暗中孵育20min。除去緩沖液，在黑暗中風干細胞5min，然后除去培養片上分開孔的隔板。向片上滴幾滴Vectashield封片液(Vector Laboratories)，蓋上蓋玻片。使用UV濾光片在熒光顯微鏡下觀察染色細胞。被明亮染色或具有核破碎片段的細胞作為凋亡細胞而記錄。
膜聯蛋白V-Cy3染色使用膜聯蛋白V-Cy3凋亡探測試劑盒(Sigma)對凋亡細胞上外化的磷脂酰絲氨酸進行熒光標記。對使用說明進行以下修改，其余操作按說明書進行。簡短來說，將生長于四格培養片上的COS-7細胞用PBS洗滌兩次，用1x結合緩沖液洗滌三次。加入150μl染色溶液(1μg/ml AnnCy3溶于1X結合緩沖液中)，在黑暗中孵育10min。然后除去染色溶液，用1x結合緩沖液洗滌5次。從培養片上除去隔板，在細胞上滴幾滴1x結合緩沖液，蓋上蓋玻片。用熒光顯微鏡分析熒光，使用綠色濾光片以辨別發紅色熒光的陽性染色(凋亡)細胞。在可見光下數出細胞數目以確定整個細胞群。
實施例3
本實施例闡明了凋亡特異性eIF-5A對凋亡的調控。
使用上文實施例中描述的常規步驟和方法，圖23是瞬時轉染COS-7細胞步驟的流程圖，其中生長于無血清培養基中的細胞與lipofect AMINE中的質粒DNA孵育4h，然后加入血清再孵育40h。隨后將細胞置于含有血清的正式培養基中繼續孵育48h，再進行分析(即無后續處理)，去血清48h以誘導凋亡并進行分析，或者用放線菌素D處理48h以誘導凋亡并進行分析。
圖22描繪了用pHM6轉染后COS-7細胞中外源蛋白的瞬時表達。用pHM6-LacZ、pHM6-反義3′rF5A(pHM6-反義大鼠凋亡特異性eIF-5A 3’UTR)、pHM6-正義rF5A(pHM6-全長凋亡特異性eIF-5A)，轉染細胞或者假轉染。48h后，從COS-7細胞中分離蛋白。取每個樣品的5μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后轉移到PVDE膜上，用抗-[HA]-過氧化物酶進行western印跡分析。通過化學發光探測結合的抗體并放在X射線感光膠片上曝光30s。LacZ(泳道2)和正義大鼠凋亡特異性eIF-5A(泳道4)的表達清晰可見。
如上文所述，用pHM6-正義rF5A(pHM6-全長凋亡特異性eIF-5A)轉染COS-7或者進行假轉染。轉染40h后，通過去血清以誘導凋亡。使用熒光同質胱冬酶試驗試劑盒(Roche Diagnostics)來測量轉染細胞提取物的胱冬酶溶蛋白活性。也使用FragEL DNA FragmentationApoptosis Detection kit試劑盒(Oncogene)測量DNA片段，該試劑盒將DNA片段暴露的3’-OH末端用標記有熒光的脫氧核苷酸進行標記。
另外的COS-7細胞用pHM6-正義rF5A(pHM6-全長凋亡特異性eIF-5A)轉染或假轉染。40h后，將細胞在含有血清的正常培養基中培養(無進一步處理)，通過去血清誘導凋亡48h，或者通過用0.5μg/ml的放線菌素D處理48h誘導凋亡。用Hoescht33258對細胞染色(它描繪伴隨凋亡的胞核破碎)，或者用膜聯蛋白V-Cy3染色(它描繪了伴隨凋亡的磷脂酰絲氨酸顯現)。也通過熒光顯微鏡使用綠色濾光片來觀察染色細胞，并計算確定發生凋亡的細胞百分比。在可見光下計算細胞群總數目。
如圖25，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，增強的胱冬酶酶活性反映了凋亡作用的增強。大鼠凋亡特異性eIF-5A的表達使得胱冬酶酶活提高60％。
如圖26，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，DNA破碎程度的提高反映了凋亡作用的增強。大鼠凋亡特異性eIF-5A的表達使得DNA破碎程度提高了273％。如圖27，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，通過胞核破碎的增多反映凋亡作用來探測凋亡。大鼠凋亡特異性eIF-5A的表達使得胞核破碎比例增大。如圖28，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，胞核破碎的增多反映了凋亡作用的增強。大鼠凋亡特異性eIF-5A的表達使得細胞相比非血清饑餓和血清饑餓對照，胞核破碎分別增強了27％和63％。
如圖29，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，通過磷脂酰絲氨酸的顯現反映凋亡作用來探測凋亡。如圖30，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，磷脂酰絲氨酸顯現的增多反映了凋亡作用的增強。大鼠凋亡特異性eIF-5A的表達使得細胞相比非血清饑餓和血清饑餓對照，磷脂酰絲氨酸的顯現分別增多了140％和198％。
如圖31，用包含正義方向的全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，胞核破碎的增多反映了凋亡作用的增強。大鼠凋亡特異性eIF-5A的表達使得細胞相比未處理和處理樣品對照，胞核破碎分別增強了115％和62％。圖32描繪了用包含正義方向的全長凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，無進一步處理誘導凋亡的細胞和被進一步處理誘導凋亡的細胞中，凋亡作用提高情況之間的比較。
實施例4本實施例說明了導入凋亡特異性eIF-5A后對凋亡活力的調控。
用pHM6-LacZ、pHM6-正義rF5A(pHM6-全長凋亡特異性eIF-5A)，轉染細胞或者假轉染，孵育40h。從每個樣品提取5μg蛋白，進行SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜上，使用識別Bcl-2的單抗進行western印跡分析。使用與過氧化物酶偶聯的兔抗鼠IgG作為二級抗體，通過化學發光探測固定抗體，并放在X射線感光膠片上曝光。結果見圖33。相比用pHM6-LacZ轉染的細胞，在用pHM6-正義rF5A轉染的細胞中探測到更少的Bcl-2；因此說明Bcl-2受到pHM6-正義rF5A的減量調控。
另外，用pHM6-反義3′rF5A(pHM6-反義大鼠凋亡特異性eIF-5A3’UTR)、pHM6-正義rF5A(pHM6-全長凋亡特異性eIF-5A)轉染COS-7細胞或者進行假轉染。轉染40h后，通過去血清誘導凋亡48h。從每個樣品提取5μg蛋白，進行SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜上，使用識別Bcl-2的單抗進行western印跡分析。使用與過氧化物酶偶聯的兔抗鼠IgG作為二級抗體，通過化學發光探測固定抗體，并放在X射線感光膠片上曝光。
此外，用pHM6-LacZ、pHM6-正義rF5A(pHM6-全長凋亡特異性eIF-5A)，轉染COS-7細胞或者假轉染，孵育40h。從每個樣品提取5μg蛋白，進行SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜上，使用識別p53的單抗進行western印跡分析。使用與堿性磷酸酶偶聯的羊抗鼠IgG作為二級抗體，通過比色法探測固定抗體。
最后，用pHM6-LacZ、pHM6-正義rF5A(pHM6-全長凋亡特異性eIF-5A)，轉染COS-7細胞或者假轉染，孵育40h。從每個樣品提取5μg蛋白，進行SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜上，使用識別p53的單抗進行western印跡分析。用抗-[HA]-過氧化物酶探測相應的蛋白印跡，以確定大鼠凋亡特異性eIF-5A的表達水平。使用與堿性磷酸酶偶聯的羊抗鼠IgG作為二級抗體，通過化學發光探測固定抗體。
如圖33，用包含正義方向的全長凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，Bcl-2受到減量調控。上面為蛋白印跡的考馬斯藍染色；下面為相應的western印跡。相比用pHM6-LacZ轉染的細胞，在用pHM6-正義rF5A轉染的細胞中探測到更少的Bcl-2。
如圖34，用包含反義方向的凋亡特異性eIF-5A 3’末端的pHM6轉染COS-7細胞后，Bcl-2受到增量調控。上面為蛋白印跡的考馬斯藍染色；下面為相應的western印跡。相比用pHM6-正義rF5A轉染的細胞或假轉染細胞，用pHM6-反義3’rF5A轉染的細胞中探測到更多的Bcl-2。
如圖35，用包含正義方向的全長凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，c-Myc受到增量調控。上面為蛋白印跡的考馬斯藍染色；下面為相應的western印跡。相比用pHM6-LacZ轉染的細胞或假轉染細胞，在用pHM6-正義rF5A轉染的細胞中探測到更高水平的c-Myc。
如圖36，用包含正義方向的全長凋亡特異性eIF-5A的pHM6瞬時轉染COS-7細胞后，p53受到增量調控。上面為蛋白印跡的考馬斯藍染色；下面為相應的western印跡。相比用pHM6-LacZ轉染的細胞或假轉染細胞，在用pHM6-正義rF5A轉染的細胞中探測到更高水平的p53。
如圖37，COS-7細胞中p53的增量調控依賴于pHM6-全長大鼠凋亡特異性eIF-5A的表達。在第一種轉染方案的細胞中探測到比第二種轉染方案的細胞中更多的大鼠凋亡特異性eIF-5A。用抗-p53抗體進行的western印跡實驗，一部分為相應的蛋白考馬斯藍染色，一部分為p53的western印跡結果。在第一種轉染方案中，相比用pHM6-LacZ轉染的細胞或假轉染細胞，在用pHM6-正義rF5A轉染的細胞中探測到更高水平的p53。在第二種轉染方案中(大鼠凋亡特異性eIF-5A表達更低)，用pHM6-LacZ轉染的細胞，用pHM6-正義rF5A和假轉染細胞中p53水平沒有可探測性差異。
實施例5如圖47，在心臟組織上進行實驗以模擬人心臟跳動和隨后的心臟病發作。圖49描述了實驗臺的安裝。在心臟瓣膜置換手術過程中取出一片人心臟組織，勾在電極上。在心臟組織下吊一小重量物，以在測量心臟跳動力量時固定組織。電極對心臟組織加以電流刺激以起始跳動。在誘導缺血之前，測量心臟組織中凋亡特異性eIF-5A和增殖eIF-5A的表達水平。見圖46。在缺血前的心臟組織中凋亡特異性eIF-5A和增殖eIF-5A的表達水平都較低，并且兩者之間保持相對平衡。這時，通過緩沖液向心臟組織輸送氧和二氧化碳，濃度分別為92.5％和7.5％。隨后減少氧含量并提高氮含量，以誘導組織缺血，最終引起“心臟病發作”。心臟組織停止跳動。氧含量水平隨即恢復正常，在電流刺激下心臟組織又開始跳動。在“心臟病發作”之后，再次測量凋亡特異性eIF-5A和增殖eIF-5A的表達水平。這時凋亡特異性eIF-5A的表達水平顯著提高，而增殖eIF-5A表達水平的提高程度則明顯低于前者。見圖46。
“心臟病發作”之后，心臟組織的跳動力度減弱，從附加重物的緊張/運動程度降低即可看出，因此也說明凋亡特異性eIF-5A的存在迅速殺死了心臟細胞。
EKG結果見圖8。左側為正常心臟跳動情況(缺血前心臟組織)。“心臟病發作”(直線)并且重新起始跳動后，由于肌肉細胞死亡EKG活力降低。EKG結果表明了心臟跳動力度的相對減少量。
實施例6本實施例說明了細胞培養條件。
人篩板和星細胞培養從加拿大眼庫安大略分部(Eye Bank of Canada，Ontario Division)獲得死亡48h內的人雙眼。取出視神經乳頭(和附著極(pole))并置于添加有抗生素/抗真菌素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培養基中(Dulbecco改進的Eagle培養基)3h。從每個組織樣本中得到視神經盤(ONH)鈕(button)，并用手術剪剪切成四小塊。用DMEM培養基在12.5cm2塑料培養瓶中培養組織塊。一個月內可觀察到組織塊生長。一旦細胞達到90％融合，就用胰蛋白酶處理并進行差別傳代，以產生篩板(LC)和星細胞群。具體來說，用添加有慶大霉素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培養基和25cm2培養瓶傳代培養LC細胞，而用不含FBS的EBM完全培養基(Clonetics)將星細胞擴展在25cm2培養瓶中。傳代10d后向星細胞培養瓶中添加FBS。按照上述方案維持和傳代培養細胞。
在8孔培養片上使用差別熒光抗體染色來對通過差別傳代進行的細胞群的均一性和細胞群純度進行鑒定。將細胞固定在10％的福爾馬林溶液中并用DPBS液(Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液)洗滌三次。用含2％脫脂牛奶的DPBS液封阻后，將抗體稀釋在含1％BSA的DPBS中，并將此用于8孔片上的6個孔中。剩下的兩個孔僅用1％牛血清白蛋白(BSA)溶液處理，不添加一級抗體作為對照。室溫下將細胞與一級抗體孵育1h，然后用DPBS洗滌三次。將合適的二級抗體稀釋在含1％BSA的DPBS中，然后加入到所有孔中并孵育1h。用DPBS洗滌后，從培養片上出去分隔小孔的格子，然后將培養片浸在雙蒸水中并隨后風干。在所用玻片上均用Fluoromount(VectorLaboratories)處理，并用22×60mm蓋玻片覆蓋。
用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察免疫熒光染色結果，并與未用一級抗體處理的對照孔進行比較。除非特別指出所有一級抗體均從Sigma公司獲得。所有二級抗體均購買自Molecular Probes公司。用以鑒別LC細胞的一級抗體為抗I型膠原抗體、抗IV型膠原抗體、抗層粘連蛋白抗體、抗纖粘連蛋白抗體。用以鑒別星細胞的一級抗體為抗半乳糖腦苷脂(Chemicon International)抗體、抗A2B5抗體(Chemicon International)、抗NCAM抗體、抗人血管性血友病因子抗體。在兩種細胞都使用的抗體包括抗膠質纖維抗體(GFAP)和抗α平滑肌肌動蛋白抗體。如果細胞群發生抗I型膠原抗體、抗IV型膠原抗體、抗層粘連蛋白抗體、抗纖粘連蛋白抗體和抗α平滑肌肌動蛋白抗體陽性染色，并且發生抗膠質纖維抗體(GFAP)陰性染色，那么認為該細胞群由LC細胞組成。如果細胞群發生抗NCAM抗體、抗膠質纖維抗體(GFAP)陽性染色，并且發生抗半乳糖腦苷脂抗體、抗A2B5抗體、抗人血管性血友病因子抗體和抗人α平滑肌肌動蛋白抗體陰性染色，那么認為該細胞群由星細胞組成。
在預備研究中，使用三對人眼以起始培養。從一個83歲男子、一個17歲男子和26歲女子眼睛的視神經乳頭建立LC細胞系，命名為#506、#517和#524。所有細胞系都經過充分鑒定并發現其中LC細胞的含量超過90％。
RKO細胞培養RKO細胞(American Type Culture Collection CRL-2577)是一種表達野生型p53的人結腸癌細胞系。用該細胞系來測試反義寡核苷酸阻抑凋亡特異性eIF-5A表達的能力。用Minimum Essential MediumEagle(MEM)培養基(含非必需氨基酸、Earle’s salts和L-谷氨酰胺)培養RKO細胞。培養基添加有10％胎牛血清(FBS)和100單位的青霉素/鏈霉素。在37℃下的加濕環境(5％CO2和95％空氣)中培養細胞。每3-4d用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA溶液分離貼壁細胞來進行傳代。分離的細胞按1∶10到1∶12的分流比分配到含有新鮮培養基的新培養皿中。
HepG2細胞培養HepG2細胞是一種人肝癌細胞系，用它來測試直接針對人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸對在響應IL-1β時產生TNF-α的阻遏能力。用添加有慶大霉素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培養基在37℃下的加濕環境(5％CO2和95％空氣)中培養HepG2細胞。
實施例7
凋亡誘導分別使用放線菌素D(RNA聚合酶抑制物)和喜樹堿(拓撲異構酶抑制物)誘導RKO和篩板細胞發生凋亡。放線菌素D的使用濃度為0.25μg/ml，喜樹堿的使用濃度為20、40、或50μM。也聯合使用喜樹堿(50μM)和TNF-α(10ng/ml)誘導篩板細胞發生凋亡。發現聯合使用喜樹堿和TNF-α的凋亡誘導效率高于單獨使用喜樹堿或TNF-α的誘導效率。
反義寡核苷酸通過Molecula Research Labs設計并購買了一套(共三種)靶作用于人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸。第一種靶作用于人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸(#1)序列為5’CCT GTC TCG AAG TCCAAG TC3’(SEQ ID NO63)，第二種靶作用于人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸(#2)序列為5′GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC3′(SEQ ID NO64)，第三種靶作用于人凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸(#3)序列為5’CTC GTA CCT CCC CGC TCT CC3’(SEQ ID NO65)。對照寡核苷酸序列為5′CGT ACC GGT ACG GTT CCA GG3′(SEQ ID NO66)。用異硫氰酸熒光素(FITC)標記反義寡核苷酸(5′GGA CCT TGG CGT GGC CGT GCX3′(SEQ ID NO67)，其中X為FITC標記)，用以監測轉染效率。所有反義寡核苷酸都全部硫代磷酸酯化。
反義寡核苷酸轉染在RKO細胞中測試凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸阻抑凋亡eIF-5A蛋白表達的能力。使用轉染試劑Oligofectamine(Invitrogen)和反義寡核苷酸轉染RKO細胞。在24孔板上加入MEM培養基(添加10％FBS但缺少青霉素/鏈霉素)，在轉染前的24h將細胞加到孔中，每孔157000個。24h后細胞總體上達到約50％融合。用100nM或200nM反義寡核苷酸轉染細胞或進行假轉染。將0、1.25或2.5μl的20μM反義寡核苷酸稀釋在無血清MEM中，終體積為42.5μl，制備足以用于24孔板上一個孔的轉染液，混合物在室溫下孵育15min。將1.5μl Oligofectamine稀釋在6μl無血清MEM中，并在室溫下孵育7.5min。5min后，將稀釋的Oligofectamine混合物添加到DNA混合物中，并在室溫下孵育20min。用無血清MEM洗滌細胞一次，然后添加200μl MEM到細胞中，并用50μl轉染液覆蓋。將細胞轉移回生長室中，保持4h。孵育后添加125μl MEM+30％FBS。然后再培養細胞48h，用0.25μg/ml放線菌素D處理24h，然后收集細胞提取物并進行western印跡分析。
也使用轉染試劑Oligofectamine和100n或200nM反義寡核苷酸，按上文轉染RKO細胞同樣的步驟，測試篩板細胞的轉染。但是通過添加反義寡核苷酸(用無血清培養基稀釋為1μM到10μM)到細胞中，并隨后每24h用稀釋有反義寡核苷酸的新鮮含血清培養基替換一次，共進行2-5的，來簡便的有效轉染篩板細胞。
用標記有FITC的反義寡核苷酸(與凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO64)有相同序列，但在3’末端與FITC偶聯)進行轉染，以最優化和監測反義寡核苷酸轉染的效率。用標記有FITC的反義寡核苷酸在8孔培養片上轉染RKO細胞和篩板細胞。48h后用PBS洗滌細胞并用含3.7％氯仿的PBS固定10min。除去孔并添加封片液(Vectashield)，然后蓋上蓋玻片。使用熒光顯微鏡和熒光濾光片(Green H546，第48915套濾光片)，在UV光線下觀察細胞核，確定攝取了寡核苷酸的細胞的亮綠色熒光。
凋亡探測用反義寡核苷酸轉染篩板細胞并用喜樹堿誘導凋亡后，確定用對照寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸(SEQ ID NO26)轉染的細胞發生凋亡的百分比。用兩種方法探測篩板細胞的凋亡-Hoescht染色和DeadEndTMFluorometric TUNEL。Hoescht染色是對胞核染色，用它標記篩板細胞以根據形態學特征(實施例如胞核破碎和凝縮)來鑒別凋亡。將等體積的固定劑(無水甲醇和冰醋酸3∶1的混合物，即用即配)添加到培養片上的細胞培養基中并孵育2min。然后除去并棄去培養基/固定劑混合物，再加入1ml固定劑。5min后除去固定劑，再加入1ml新鮮固定劑孵育5min。除去固定劑并風干細胞4min，然后加入1ml Hoescht染色劑(0.5μg/ml Hoescht33258溶于PBS)。黑暗中孵育10min后，除去染色劑，除去培養片上分開孔的隔板，用去離子水洗滌培養片三次每次1min。洗滌后加入幾滴McIlvaine’s緩沖液(0.021M檸檬酸，0.058M Na2HPO4.7H2O；pH5.6)，并蓋上蓋玻片。使用UV濾光片在熒光顯微鏡下觀察染色細胞。被明亮染色或具有胞核碎片的細胞即作為凋亡細胞而記錄。每孔中最少記錄了200個細胞。
使用DeadEndTMFluorometric TUNEL(Promega)探測DNA片段(這是鑒定凋亡細胞的特征)。進行Hoescht染色后，用雙蒸水粗略洗滌培養片，并進一步將玻片浸于PBS(137mM NaCl，2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4)中以進行清洗，兩次每次5min，其間用紙巾吸干玻片。將細胞浸透在0.2％Triton X-100的PBS溶液中5min。然后將細胞浸于PBS中兩次每次5min，其間用紙巾吸干玻片。每孔中加入25μl平衡緩沖液(200mM二甲砷酸鉀(pH6.6)，25mM Tris-HCl(pH6.6)，0.2mM二硫蘇糖醇，0.25mg/ml BSA，2.5mM氯化鈷)，并孵育5-10min。平衡過程中為每孔制備30μl反應混合液，將平衡緩沖液、核苷酸混合物(50μM熒光素-12-dUTP、100μM dATP、10mM Tris-HCl(pH7.6)、1mM EDTA)和末端脫氧核苷酸轉移酶(Tdt，25U/μl)按45∶5∶1的比例混合。在平衡緩沖液中孵育后，每孔中加入30μl反應混合液并蓋上蓋玻片。在黑暗中37℃下反應1h。然后將玻片浸在2XSSC(0.3M NaCl、30mM檸檬酸鈉，pH7.0)中停止反應。再用PBS洗滌玻片三次每次5min。通過用Kim擦輕拍孔周圍來除去PBS，并在每孔中加入一滴封片液(Oncogeneresearch project，JA1750-4ML)，蓋上蓋玻片。使用UV濾光片(UV-G365，第487902套濾光片)在熒光顯微鏡下觀察細胞，對被Hoescht染色的胞核進行計數。被明亮染色或具有胞核碎片的細胞作為凋亡細胞而記錄。使用相同觀察視場，用熒光濾光片(Green H546，第48915套濾光片)觀察細胞，具有明亮熒光的細胞作為凋亡細胞而記錄。熒光濾光片下記錄的具有明亮綠色的胞核數目除以在UV濾光片下記錄的總胞核數目，得到觀察視場中凋亡細胞的百分比。每孔中最少記錄200個細胞。
圖54-57描繪了這些研究的結果。轉染了凋亡特異性eIF-5A的細胞發生凋亡的比例遠低于用對照寡核苷酸進行轉染的細胞。
蛋白提取和western印跡從轉染的RKO細胞中提取蛋白以進行western印跡分析，用PBS洗滌細胞，每孔加入40μl裂解緩沖液(0.5％SDS，1mM二硫蘇糖醇，50mM Tris-HCl，pH8.0)。將細胞裂解后的提取物轉移到微離心管中，-20℃下保存。根據使用說明書使用Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad)試劑盒對蛋白進行定量。
取5μg總蛋白在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后將分開的蛋白轉移到PVDF膜上。將膜與封阻緩沖液(5％的奶粉溶于PBS中)，然后用0.05％Tween-20/PBS洗滌三次每次15min。將膜保存在PBS-T中，4℃下過夜。第二天再恢復到室溫后，用1μg/ml聚乙烯乙醇封阻膜30s。用去離子水漂洗膜5次，然后用5％的牛奶0.025％Tween-20/PBS溶液封阻30min。將一級抗體在5％的牛奶0.025％Tween-20/PBS溶液預孵育30min，然后再與膜進行孵育。
使用若干種一級抗體。識別p53(Ab-6)的單抗(Oncogene)，直接針對合成肽(氨基-CRLPEGDLGKEIEQKYD羧基，SEQ ID NO68，它與人凋亡特異性eIF-5A的C末端同源)的多克隆抗體，從小雞培養獲得(Gallus Immunotech)。也使用抗β-肌動蛋白的抗體(Oncogene)來說明蛋白上樣的等量。抗p53的單抗使用稀釋度為0.05μg/ml，針對凋亡特異性eIF-5A的使用稀釋度為1∶20000。膜與一級抗體孵育60-90min后，用0.05％Tween-20/PBS洗滌三次每次15min。然后將二級抗體稀釋在1％的牛奶0.025％Tween-20/PBS溶液中，并與膜孵育60-90min。但使用抗p53(Ab-6)的單抗作為一級抗體時，使用與過氧化物酶偶聯的兔抗鼠IgG(Sigma)作為二級抗體，稀釋度為1∶5000。與抗肌動蛋白抗體聯合使用的二級抗體為與過氧化物酶偶聯的羊抗鼠IgM(Calbiochem)，稀釋度為1∶5000。與二級抗體孵育后，用PBS-T洗滌膜三次。
使用ECL Plus Western印跡探測試劑盒(Amersham PharmaciaBiotech)來探測與過氧化物酶偶聯的固定抗體。簡短來說，輕輕吸干膜，然后在黑暗中與試劑A和B的混合液(40∶1)孵育5min。將膜吸干，夾在醋酸纖維膜之間，然后放在X射線感光膠片上曝光，時間為10s-10min。將膜浸在剝離緩沖液(100mM 2-巰基乙醇、2％SDS、62.5mM Tris-HCl，pH6.7)中，并在50℃孵育30min以對膜進行剝離。然后用去離子水漂洗膜，并用大量0.05％Tween-20/PBS洗滌兩次每次10min。剝離并再印跡膜3次。
實施例8siRNA的構建直接針對人凋亡特異性eIF-5A的小干涉RNA(siRNA)被用來在RKO細胞和篩板細胞中特異性阻抑凋亡特異性eIF-5A的表達。使用SilencerTMsiRNA Construction Kit試劑盒(Ambion Inc.)通過體外轉錄制得6種siRNA。其中四種針對人凋亡特異性eIF-5A(siRNAs#1-#4)(SEQ ID NO30-33)，另兩種用作對照，試劑盒中提供了直接針對GAPDH的siRNA(siRNA#5)(SEQ ID NO34)，還有一種siRNA具有凋亡特異性eIF-5A siRNA#1(SEQ ID NO30)的反轉序列，但是其本身并不靶作用于凋亡特異性eIF-5A。所有siRNA都按照使用說明書進行制備。簡短來說，使用編碼目的siRNA鏈的DNA寡核苷酸作為模板，使用T7RNA聚合酶合成siRNA的單獨鏈，然后與T7啟動子退火，再用Klenow片段補平。正義鏈和反義鏈的轉錄反應都完成后，聯合反應并使兩個siRNA鏈退火，用Dnase和Rnase處理，通過層析柱純化。用來制備siRNA的DNA寡核苷酸序列為(T7啟動子的退火位點用下劃線標出)siRNA#1反義5’AAAGGAATGACTTCCAGCTGACCTGTCTC3’(SEQ ID NO69)，siRNA#1正義5’AATCAGCTGGAAGTCATTCCTCCTGTCTC3’(SEQ ID NO70)；siRNA#2反義5’AAGATCGTCGAGATGTCTACTCCTGTCTC3’(SEQ ID NO71)，siRNA#2正義5’AAAGTAGACATCTCGACGATCCCTGTCTC3’(SEQ ID NO72)；siRNA#3反義5’AAGGTCCATCTGGTTGGTATTCCTGTCTC3’(SEQ ID NO73)，siRNA#3s正義5’AAAATACCAACCAGATGGACCCCTGTCTC3’(SEQ ID NO74)；siRNA#4反義5’AAGCTGGACTCCTCCTACACACCTGTCTC3’(SEQ ID NO75)，siRNA#4正義5’AATGTGTAGGAGGAGTCCAGCCCTGTCTC3’(SEQ ID NO76)；siRNA#5反義5’AAAGTCGACCTTCAGTAAGGACCTGTCTC3’(SEQ ID NO77)，siRNA#5正義5’AATCCTTACTGAAGGTCGACTCCTGTCTC3’(SEQ ID NO78)。
使用SilencerTMsiRNA Labeling Kit-FAM(Ambion)試劑盒來用FAM標記GAPDH siRNA，以監測RKO細胞和篩板細胞對siRNA的攝取。在8孔培養片上進行轉染之后，用PBS洗滌細胞，并在3.7％的甲醛PBS溶液中固定10min。然后除去固定液并加入封片液(Vectashield)，蓋上蓋玻片。使用熒光濾光片在熒光顯微鏡的UV光線下顯現對FAM-標記siRNA的攝取。根據使用說明書對GAPDHsiRNA進行標記。
SiRNA轉染按照相同步驟使用siRNA轉染RKO細胞和篩板細胞。在轉染前一天，將RKO細胞接種于8孔培養片(密度為每孔46000個細胞)或24孔板(密度為每孔105000個細胞)上。當篩板細胞融合達到40-70％時，在轉染前的第三天將細胞接種在8孔培養片上(密度為每孔7500-10000個細胞)。將25.5pmol siRNA稀釋在Opti-Mem(Sigma)中，終體積為21.2μl，如此制備足以在一個孔中使用的轉染液。將0.425μl Lipofectamine 2000稀釋在Opti-Mem中，終體積為21.2μl，并在室溫下孵育7-10min。稀釋的Lipofectamine2000混合物被加到稀釋的siRNA混合物中，并在室溫下共孵育20-30min。用無血清培養基洗滌細胞一次，然后向細胞加入135μl無血清培養基，并用42.4μl轉染液覆蓋。將細胞放回生長室，培養4h。孵育后，向細胞加入65μl無血清培養基+30％FBS。在24孔板上進行的轉染步驟和條件與在8孔培養片上的步驟相同，只是溶液體積相應增加2.3倍。
轉染后孵育RKO細胞和篩板細胞72h，然后收集細胞提取物以進行Western印跡分析。為確定針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA阻遏凋亡的效率，在轉染后的48h或72h用50μM喜樹堿(Sigma)和10ng/ml TNF-α(Leinco Technologies)處理篩板細胞以誘導凋亡。24h或48h后對細胞進行Hoescht染色以確定凋亡細胞的比例。
實施例9確定HepG2 TNF-α的生成量將HepG2細胞接種在48孔板上，每孔20000個細胞。72h后除去培養基，并加入含有2.5μM對照反義寡核苷酸或2.5μM凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2的新鮮培養基。24h再加入含有反義寡核苷酸的新鮮培養基。與寡核苷酸共孵育48h后，除去舊培養基，加入含有白介素-1β(IL-1β，1000pg/ml，Leinco Technologies)的新鮮培養基，孵育6h。收集培養基并在-20℃下保存，以用于量化TNF-α。將另外平行孵育的未處理細胞(沒有用反義寡核苷酸和IL-1β處理)，和僅用IL-1β處理的細胞作為對照。所有實驗均進行兩次。通過ELISA(Assay Designs Inc.)根據使用說明書測量釋放到培養基中的TNF-α量。
實施例10本實施例說明凋亡特異性eIF-5A反義核苷酸能夠抑制凋亡特異性eIF-5A和p53的表達。
用200nM凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#1、#2、#3(SEQID NO25，26，27)轉染RKO細胞，或進行假轉染或不轉染。也用100nM凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)轉染RKO細胞。轉染48h后用0.25μg/ml放線菌素D處理細胞。24h后，收集細胞提取物，并將每個樣品的5μg蛋白在SDS-PAGE膠上電泳，然后轉移到PVDF膜上，并使用抗凋亡特異性eIF-5A的抗體進行Western印跡分析。化學發光探測后，剝離一層膜再用抗p53的抗體進行反應。化學發光檢測后，剝離一層膜后再用抗肌動蛋白的抗體進行反應。圖52描繪了用反義寡核苷酸1、2和3(針對凋亡特異性eIF-5A，分別是SEQ ID NO25、26、27)轉染后的RKO細胞產生蛋白的水平。用凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸轉然后，RKO細胞產生更少的凋亡特異性eIF-5A和更少的p53。
實施例11本實施例說明了凋亡特異性eIF-5A核苷酸能夠減少凋亡。
在一個實驗中，(A)用100nM FITC-標記的反義寡核苷酸和Oligofectamine轉染試劑轉染篩板細胞#506，(B)用直接稀釋在無血清培養基中的10μM裸FITC-標記的反義寡核苷酸轉染篩板細胞#506。24h后，將含有10％FBS和稀釋到10μM的新鮮反義寡核苷酸的新鮮培養基加入到細胞中。(A)或(B)處理的細胞總計固定48后，使用熒光濾光片在熒光顯微鏡UV光線下進行顯形。圖53描繪了對熒光標記反義寡核苷酸的攝取。
另一實驗中，用10μM對照反義寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)轉染篩板細胞#506，共4d。反義寡核苷酸處理后的48h，用20μM或40μM喜樹堿處理48h。每天用含有反義寡核苷酸和喜樹堿的培養基更換一次。通過Hoescht和TUNEL標記細胞來確定凋亡細胞比例。見圖54。
另一實驗中，用10μM對照反義寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)轉染篩板細胞#506。24h后，更換培養基并加入新鮮反義寡核苷酸。反義寡核苷酸處理后的48h，除去反義寡核苷酸，用20μM喜樹堿處理3d。每天用含有喜樹堿的培養基更換一次。通過Hoescht和TUNEL標記細胞來確定凋亡細胞比例。見圖55。
另一實驗中，用1μM對照反義寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)轉染篩板細胞#517，共5d。反義寡核苷酸處理后的48h，用20μM喜樹堿處理3或4d。每天用含有反義寡核苷酸和喜樹堿的培養基更換一次。通過Hoescht和TUNEL標記細胞來確定凋亡細胞比例。見圖56。
另一實驗中，用2.5μM對照反義寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)轉染篩板細胞#517，共5d。反義寡核苷酸處理后的48h，用40μM喜樹堿處理3d。每天用含有反義寡核苷酸和喜樹堿的培養基更換一次。通過Hoescht和TUNEL標記細胞來確定凋亡細胞比例。見圖57。
另一實驗中，用1μM或2.5μM對照反義寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)轉染篩板細胞#517，共5d。反義寡核苷酸處理后的48h，用40μM喜樹堿處理3或4d。每天用含有反義寡核苷酸和喜樹堿的培養基更換一次。通過Hoescht和TUNEL標記細胞來確定凋亡細胞比例。見圖58。
另一實驗中，用10ng/ml TNF-α或50μM喜樹堿處理篩板細胞#517，或用二者同時處理細胞，或者不處理。通過Hoescht和TUNEL標記細胞來確定凋亡細胞比例。見圖59。
另一實驗中，用2.5μM或5μM對照反義寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)轉染篩板細胞#506和#517，共2d。24h后，加入含有反義寡核苷酸的培養基。反義寡核苷酸處理后的48h，用50μM喜樹堿和10ng/ml TNF-α處理2d。通過Hoescht和TUNEL標記細胞來確定凋亡細胞比例。見圖60。
另一實驗中，用2.5μM對照反義寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)轉染篩板細胞#506、#517和#524，共2d。24h后，加入含有反義寡核苷酸的培養基。反義寡核苷酸處理后的48h，用50μM喜樹堿和10ng/ml TNF-α處理2d。通過Hoescht和TUNEL標記細胞來確定凋亡細胞比例。見圖61。
實施例12本實施例說明用靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA轉染多細胞表達更少的凋亡特異性eIF-5A，也說明靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA能夠減少凋亡。
在一個實驗中，用100nM FAM-標記的siRNA和Oligofectamine2000轉染試劑轉染篩板細胞#517，轉染過程中使用血清(A)或不使用血清(B)。(A)或(B)處理的細胞總計固定24h后，使用熒光濾光片在熒光顯微鏡UV光線下進行顯形。見圖62。
另一實驗中，使用兩種對照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一種靶作用于GAPDH)和四種靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ ID NO30-33)轉染RKO細胞，用量為100nM，轉染時有血清存在或無血清存在。轉染72h后，收集細胞提取物，取每個樣品的5μg蛋白在SDS-PAGE膠上電泳，然后轉移到PVDF膜上，并使用抗凋亡特異性eIF-5A的抗體進行Western印跡分析。化學發光探測后，剝離一層膜再用抗bcl-2的抗體再次探測。化學發光探測后使用抗肌動蛋白的抗體再次探測。見圖63。
再一實驗中，用100nM siRNA轉染篩板細胞系#506和#517。使用兩種對照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一種靶作用于GAPDH)和四種靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ ID NO30-33)進行轉染。轉染72h后，收集細胞提取物，取每個樣品的5μg蛋白在SDS-PAGE膠上電泳，然后轉移到PVDF膜上，并使用抗凋亡特異性eIF-5A的抗體進行Western印跡分析。化學發光探測后使用抗肌動蛋白的抗體再次探測。見圖64。
還一實驗中，用100nM siRNA轉染篩板細胞系#506。使用兩種對照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一種靶作用于GAPDH)和四種靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ IDNO30-33)進行轉染。轉染48h后，用含有50μM喜樹堿和10ng/mlTNF-α的培養基替換原有培養基。24h后，通過Hoescht染色細胞來確定凋亡細胞比例。見圖65。
另一實驗中，用100nM siRNA轉染篩板細胞系#506。使用兩種對照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一種靶作用于GAPDH)和四種靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ IDNO30-33)進行轉染。轉染72h后，用含有50μM喜樹堿和10ng/mlTNF-α的培養基替換原有培養基。24h后，通過Hoescht染色細胞來確定凋亡細胞比例。見圖66。
再一實驗中，用100nM siRNA轉染篩板細胞系#506，或者不轉染。使用兩種對照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一種靶作用于GAPDH)和四種靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ ID NO30-33)進行轉染。轉染72h后，用含有50μM喜樹堿和10ng/ml TNF-α的培養基替換原有培養基。向未轉染未處理細胞中加入新鮮培養基。48h后，通過Hoescht染色細胞來確定凋亡細胞比例。見圖67。
用siRNA轉染并用喜樹堿和TNF-α處理的篩板細胞#506的Hoescht染色照片見圖67，實施例13相關見圖68。
實施例13本實施例說明是用直接針對凋亡特異性eIF-5A的反義寡核苷酸處理人細胞系會導致細胞生成TNF-α量的減少。
用2.5μM對照反義寡核苷酸或凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2處理HepG2細胞，共2d。72h后除去培養基，并加入含有2.5μM對照反義寡核苷酸或2.5μM凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸#2的新鮮培養基。24h再加入含有反義寡核苷酸的新鮮培養基。另外的細胞不處理放置2d。處理開始48h后，用含有IL-1β(1000pg/ml)的新鮮培養基處理6h。實驗最后收集培養基并在-20℃下保存，以用于量化TNF-α。通過ELISA(Assay Designs Inc.)根據使用說明書測量釋放到培養基中的TNF-α量。見圖69。用凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸轉染的細胞產生更少的TNF-α。
實施例14用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA或具有相反序列的對照siRNA處理HT-29細胞(人結腸癌細胞)。使用如下siRNA690位(3′UTR)％G/C＝485′AAGCUGGACUCCUCCUACACA3′(SEQ ID NO79)；對照siRNA為％G/C＝395′AAACACAUCCUCCUCAGGUCG3′(SEQ ID NO80)48h后，用干擾素-γ(IFN-γ)處理細胞16h。16h后用新鮮培養基洗滌細胞并用脂多糖(LPS)處理8或24h。在每個時間點(8或24h)除去培養基，冷凍并通過ELISA確定培養基中TNF-α的含量。葉收集細胞裂解產物，確定蛋白含量，并用之調節TNF-α值到pg/mg蛋白(以調整不同孔中細胞數目的差異)。Western印跡結果和ELISA結果見圖74A和B。圖75描繪了除了細胞密度更高外其它相同的實驗結果。
實施例15U-937細胞系的組織培養條件U-937細胞(ATCC編號CRL-1593.2，細胞不是直接來自ATCC)是一種懸浮生長的人單核細胞系，它在PMA的刺激下會變為貼壁并分化為巨噬細胞。在RPMI1640培養基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES，1.0mM丙酮酸鈉，10％胎牛血清)中，37℃下的CO2(5％)孵育器中維持細胞。每周分流細胞兩次(分流比1∶4或1∶5)，細胞密度總保持在每毫升105-2×106細胞之間。在組織培養處理的塑料T-25培養瓶中懸浮培養細胞，實驗在24孔板上進行。
進行實驗的時間實驗開始前兩天將細胞密度調節到3×105個細胞/ml培養基。在實驗開始的當天收集對數期的細胞。將細胞懸液轉移到15ml離心管中并在室溫下400xg離心10min。吸出上清液，用新鮮培養基洗滌并重懸細胞沉淀。然后再次400xg離心10min，吸出上清然后最終將細胞沉淀重懸于新鮮培養基中。將等體積的細胞懸液和臺盼藍溶液(0.4％的臺盼藍PBS溶液)混合，并使用血球計和顯微鏡數出活細胞數量。將細胞稀釋到4×105個細胞/ml培養基。
在24孔板的每個孔中加入PMA或DMSO(對照載體)來預處理24孔板。向每個孔中加入1ml細胞懸液，使得每個孔中含有400000個細胞，0.1％DMSO+/-162nM PMA。在37℃、CO2(5％)孵育器中維持細胞。在0、24、48、72、96、99、102h的時間點收集分離孔中的細胞。圖76總結了實驗時間點和額外時間點。
在72h時更換培養基。因為一些細胞貼壁而其它細胞懸浮，必須小心操作以防止破壞貼壁細胞。將每個孔中的細胞小心轉移到相應的微離心管中，然后14,000xg離心3min。吸出上清液，然后用新鮮培養基(1ml，(-)DMSO，(-)PMA)重懸細胞沉淀，然后放回原來的相應孔中。在沒有PMA的新鮮培養基中細胞進入靜止期。96h時加入LPS(100ng/ml)，并在3h(99h)和6h(102h)后收集細胞。
在時間點上，細胞懸液和培養基被從孔中轉移到微離心管中。14,000xg離心3min。將培養基(上清液)轉移到干凈試管中并保存在-20℃下，以用于ELISA/細胞因子分析。剩余在孔中的細胞用PBS(1ml，37℃)洗滌，并且此P B S也用于洗滌相應微離心管中的細胞沉淀。然后再次14,000xg離心3min。用煮沸的裂解緩沖液(50mM Tris pH7.4+2％SDS)裂解細胞。將每個孔中的貼壁細胞和懸浮細胞混合。煮沸樣品并在-20℃下保存。
Western印跡使用BCA(bicinchoninic acid)法用BSA(牛血清白蛋白)作為標準蛋白確定每個細胞樣品的蛋白濃度。在SDS-PAGE膠上進行蛋白樣品(5μg總蛋白)的電泳然后轉移到PVDF膜上。用1μg/ml的聚乙烯乙醇封阻膜30s，再用5％的脫脂牛奶PBS-T溶液封阻1h。用鼠源抗人eIF-5A單抗(BD Biosciences cat#611976；1∶20000于5％脫脂牛奶中)對膜進行探測，反應1h。用PBS-T洗滌膜三次每次10min。二級抗體為與辣根過氧化物酶偶聯的抗鼠抗體(Sigma，1∶5000于1％脫脂牛奶中)，反應1h。用PBS-T洗滌膜三次每次10min。通過化學發光使蛋白條帶顯形(使用ECL探測系統，Amersham PharmaciaBiotech)。
為說明起見，將相同量的蛋白上樣在每個泳道中，剝離一層膜并用抗肌動蛋白抗體再次探測。膜被剝離(100mM 2-巰基乙醇，2％SDS，62.5mM Tris-HCl，pH6.7；50℃進行30min)，洗滌，然后如上文所述進行封阻。用抗肌動蛋白抗體作為一級抗體(在小鼠體內制的單抗；Oncogene，Ab-1；1∶20000于5％脫脂牛奶中)與膜反應。如上文所述用二級抗體探測、洗滌。
圖77描繪了在單核細胞(U-397)分化和隨后的TNF-α分泌過程中，凋亡特異性eIF-5A受到增量調控。
實施例16凋亡特異性eIF-5A阻抑響應干擾素γ時的IL-8生成。
使用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA轉染HT-29細胞(人結腸腺癌細胞)。轉染約48h后更換培養基，使得一些試驗樣品培養基含有干擾素γ，而一些試驗樣品培養基不含有干擾素γ。添加干擾素γ16h后，洗滌細胞，并將含有或不含有TNF-α的培養基加到細胞上。18或24h后收集培養基(用于ELISA探測IL-8)和細胞裂解產物。
如圖79和80，在響應TNF-α和干擾素時，都產生IL-8。用干擾素γ處理細胞后再用TNF處理所引起的IL-8生成量高于單獨用兩者處理引起的生成量。這可能是由于已知的在響應干擾素時，TNF受體1受到增量調控，所以用干擾素處理會使細胞含更多的受體從而更好的響應TNF。針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA對只響應TNF時的IL-8生成沒有作用(先前的實驗)，但是此siRNA幾乎阻抑了在響應干擾素時的IL-8的全部生成，也相當程度上阻抑了在響應干擾素和TNF聯合處理時的IL-8生成。這些結果說明，通過使用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA，發明者們掌握了通向IL-8的干擾素途徑，而不是TNF途徑。如圖81，western印跡分析結果說明HT-29細胞中在響應干擾素γ時，凋亡特異性eIF-5A受到增量調控(在8h時增加了4倍)。
實施例17人篩板細胞培養從加拿大眼庫安大略分部(Eye Bank of Canada，Ontario Division)獲得死亡48h內的人雙眼。取出視神經乳頭(和附著極(pole))并置于添加有抗生素/抗真菌素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培養基中(Dulbecco改進的Eagle培養基)3h。從每個組織樣本中得到視神經盤(ONH)鈕(button)，并用手術剪剪切成四小塊。用DMEM培養基在12.5cm2塑料培養瓶中培養組織塊。一個月內可觀察到組織塊生長。一旦細胞達到90％融合，就用胰蛋白酶處理并進行差別傳代，以產生篩板(LC)和星細胞群。用添加有慶大霉素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培養基和25cm2培養瓶傳代培養LC細胞。按照上述方案維持和傳代培養細胞。
在8孔培養片上使用差別熒光抗體染色來對通過差別傳代進行的細胞群的均一性和細胞群純度進行鑒定。將細胞固定在10％的福爾馬林溶液中并用DPBS液(Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液)洗滌三次。用含2％脫脂牛奶的DPBS液封阻后，將抗體稀釋在含1％BSA的DPBS中，并將此用于8孔片上的6個孔中。剩下的兩個孔僅用1％牛血清白蛋白(BSA)溶液和二級抗體處理，不添加一級抗體作為對照。室溫下將細胞與一級抗體孵育1h，然后用DPBS洗滌三次。將合適的二級抗體稀釋在含1％BSA的DPBS中，然后加入到所有孔中并孵育1h。用DPBS洗滌后，洗滌培養片并隨后風干，用Fluoromount封片液(Vector Laboratories)覆蓋。用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察免疫熒光染色結果，并與未用一級抗體處理的對照孔進行比較。除非特別指出所有一級抗體均從Sigma公司獲得。所有二級抗體均購買自Molecular Probes公司。用以鑒別LC細胞的一級抗體為抗I型膠原抗體、抗IV型膠原抗體、抗層粘連蛋白抗體、抗細胞纖粘連蛋白抗體、抗膠質纖維抗體(GFAP)、抗α平滑肌肌動蛋白抗體。如果細胞群發生抗I型膠原抗體、抗IV型膠原抗體、抗層粘連蛋白抗體、抗纖粘連蛋白抗體和抗α平滑肌肌動蛋白抗體陽性染色，并且發生抗膠質纖維抗體(GFAP)陰性染色，那么認為該細胞群由LC細胞組成。在這項研究中，使用兩對人眼以起始培養。從一個83歲男子和一個17歲男子眼睛的視神經乳頭建立LC細胞系，命名為#506、#517。所有細胞系都經過充分鑒定并發現其中LC細胞的含量超過90％。
對LC細胞的處理聯合使用50μM喜樹堿(Sigma)和10ng/ml TNF-α(LeincoTechnologies)處理人篩板細胞來誘導凋亡。發現與單獨使用兩者處理相比，聯合使用喜樹堿和TNF-α能更有效的誘導凋亡構建siRNA并用之轉染使用直接針對人凋亡特異性eIF-5A的小干涉RNA(siRNA)來特異性阻抑篩板細胞中凋亡特異性eIF-5A的表達。使用SilencerTMsiRNA構建試劑盒(Ambion Inc.)通過體外轉錄制得6種siRNA。其中四種針對人凋亡特異性eIF-5A(siRNA#1-#4)，另兩種用作對照(一種是試劑盒中提供的針對GAPDH的siRNA，和siRNA#5，它具有凋亡特異性eIF-5A特異siRNA#1的相反序列但本身并與靶作用于凋亡特異性eIF-5A。根據使用說明書制得siRNA。凋亡特異性eIF-5A和對照siRNA靶具有以下序列siRNA#15’AAAGGAATGACTTCCAGCTGA3’(SEQ ID NO81)；siRNA#25’AAGATCGTCGAGATGTCTACT3’(SEQ IDNO82)；siRNA#35’AAGGTCCATCTGGTTGGTATT3’(SEQ ID NO83)；siRNA#45’AAGCTGGACTCCTCCTACACA3’(SEQ ID NO84)；siRNA#5’AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA3’(SEQ ID NO85)。使用LipofectAMINE 2000和siRNA轉染篩板細胞。
當篩板細胞融合達到40-70％時，在轉染前的第三天將細胞接種在8孔培養片上(密度為每孔7500個細胞)。將25.5pmol siRNA稀釋在Opti-Mem(Sigma)中，終體積為21.2μl，如此制備足以在一個孔中使用的轉染液。將0.425μl Lipofectamine2000稀釋在Opti-Mem中，終體積為21.2μl，并在室溫下孵育7-10min。稀釋的Lipofectamine2000混合物被加到稀釋的siRNA混合物中，并在室溫下共孵育20-30min。用無血清培養基洗滌細胞一次，然后向細胞加入135μl無血清培養基，并用42.4μl轉染液覆蓋。將細胞放回生長室，培養4h。孵育后，向細胞加入65μl無血清培養基+30％FBS。在24孔板上進行的轉染步驟(待用于Western印跡分析)和條件與在8孔培養片上的步驟相同，只是溶液體積相應增加2.3倍。轉染后孵育篩板細胞72h，然后用50μM喜樹堿(Sigma)和10ng/ml TNF-α(LeincoTechnologies)處理義誘導凋亡。然后收集細胞裂解物以進行Western印跡分析，或檢測細胞以確定凋亡情況。
凋亡細胞探測轉染細胞經TNF-α和喜樹堿處理24h后，使用Hoescht3358進行染色以確定發生凋亡細胞的百分比。簡短來說，用無水甲醇和冰醋酸的混合物(3∶1)固定細胞，然后與Hoescht染色液(0.5μg/mlHoescht33258溶于PBS)在黑暗中孵育。10min后除去染色液，然后除去培養片上分開孔的隔板，用去離子水洗滌培養片三次每次1min。然后向細胞加入幾滴1ml McIlvaine′s緩沖液(0.021M檸檬酸、0.058M Na2HPO4.7H2O，pH5.6)，蓋上蓋玻片。使用UV濾光片在熒光顯微鏡下觀察染色細胞。被明亮染色或具有核破碎片段的細胞作為凋亡細胞而記錄。也使用DeadEndTMFluorometric TUNEL(Promega)探測DNA片段(這是鑒定凋亡細胞的特征)。進行Hoescht染色后，用雙蒸水粗略洗滌培養片，并進一步將玻片浸于PBS(137mMNaCl，2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4)中以進行清洗，兩次每次5min，其間用紙巾吸干玻片。將細胞浸透在0.2％TritonX-100的PBS溶液中5min。然后將細胞浸于PBS中兩次每次5min，其間用紙巾吸干玻片。每孔中加入25μl平衡緩沖液(200mM二甲砷酸鉀(pH 6.6)，25mM Tris-HCl(pH6.6)，0.2mM二硫蘇糖醇，0.25mg/ml BSA，2.5mM氯化鈷)，并孵育5-10min。平衡過程中為每孔制備30μl反應混合液，將平衡緩沖液、核苷酸混合物(50μM熒光素-12-dUTP、100μM dATP、10mM Tris-HCl(pH7.6)、1mM EDTA)和末端脫氧核苷酸轉移酶(Tdt，25U/μl)按45∶5∶1的比例混合。在平衡緩沖液中孵育后，每孔中加入30μl反應混合液并蓋上蓋玻片。在黑暗中37℃下反應1h。然后將玻片浸在2X SSC(0.3M NaCl、30mM檸檬酸鈉，pH 7.0)中孵育15min停止反應。再用PBS浸沒玻片三次每次5min。通過用Kim擦輕拍孔周圍來除去PBS，并在每孔中加入一滴封片液(Oncogene research project，JA1750-4ML)，蓋上蓋玻片。使用UV濾光片(UV-G365，第487902套濾光片)在熒光顯微鏡下觀察細胞，對被Hoescht染色的胞核進行計數。被明亮染色或具有胞核碎片的細胞作為凋亡細胞而記錄。使用相同觀察視場，用熒光濾光片(Green H546，第48915套濾光片)觀察細胞，具有明亮熒光的細胞作為凋亡細胞而記錄。熒光濾光片下記錄的具有明亮綠色的胞核數目除以在UV濾光片下記錄的總胞核數目，得到觀察視場中凋亡細胞的百分比。每孔中最少記錄200個細胞。
蛋白提取和Western印跡分析從生長于24孔板上的篩板細胞中提取蛋白以進行Western印跡，首先用PBS(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/LKH2PO4)洗滌細胞兩次，然后加入50μl裂解緩沖液(2％SDS，50mM Tris-HCl，pH 7.4)。將細胞溶出物收集在微離心管中，煮沸5min，然后在-20℃下儲存。使用Bicinchoninic Acid Kit(BCA；Sigma)試劑盒確定蛋白濃度。為進行Western印跡，將5μg的總蛋白在12％SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將分開的蛋白轉移到PVDF膜上。將膜與封阻溶液(5％去脂奶粉、0.02％疊氮化鈉的PBS溶液)孵育1h，然后用PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)洗滌三次共15min。將膜保存在PBS-T溶液中，4℃過夜。第二天在膜恢復到室溫后，用1μg/ml聚乙烯乙醇封阻30s。用去離子水漂洗膜5次，然后用5％牛奶PBS溶液封阻30min。將一級抗體在5％的牛奶PBS溶液中預孵育30min，然后與膜共孵育。使用的一級抗體為抗eIF-5A抗體(BD TransductionLaboratories，稀釋度1∶120000)和抗β-肌動蛋白抗體(Oncogene)。用PBS-T溶液洗滌三次共15min。然后將合適的偶聯有HRP的二級抗體稀釋在1％牛奶PBS溶液中，并與膜共孵育1h。洗滌印跡，并用ECL Plus Western印跡探測試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)來探測與過氧化物酶偶聯的固定抗體。
實驗結果從男性捐贈人(年級為83歲和17歲)的視神經乳頭建立兩個篩板細胞系(LC)(分別為#506和#507)。從人篩板分離的細胞與其它研究中發現的突出的胞核具有相同的大小(broad)和扁平(flat)的形態特征(Lambert et al.，2001)。與其它研究分組一樣，LC細胞表現出對α平滑肌肌動蛋白具有免疫反應活性(圖82a)，也對許多種胞外基質蛋白(包括細胞纖粘連蛋白(圖82b)、層粘連蛋白(圖82c)、膠原蛋白I、膠原蛋白IV)具有免疫反應活性(數據未列出)(Clark et al.，1995；Hernandez et al.，1998；Hernandez and Yang，2000；Lambert et al.；2001)。LC細胞對膠質纖維酸性蛋白(GFAP)具有陰性免疫反應活性，這一發現與以往發現一致(圖82d)(Lambert et al.，2001)。這些發現證明可將這些分離細胞鑒別為LC細胞，而不是視神經乳頭星細胞。
因為相信TNF-α在青光眼發病中起重要作用，所以檢測LC細胞對TNF-α的細胞毒素效果的敏感性。用喜樹堿、TNF-α處理融合的LC細胞，或聯合使用喜樹堿和TNF-α進行處理(均為48h，圖83d)。通過Hoescht染色發現單獨用TNF-α處理對LC細胞不產生細胞毒性。用喜樹堿處理大約引起30％的LC細胞死亡。但是發現聯合使用喜樹堿和TNF-α處理LC細胞會有互相促進的效果，48h內有45％的LC細胞死亡。這些結果說明但首先用喜樹堿引起凋亡后，LC細胞能夠響應TNF-α的細胞毒素作用。
已知eIF-5A是一種核-質穿梭蛋白，為細胞分裂所必需，最近也發現它參與凋亡過程。通過喜樹堿處理或者連用喜樹堿和TNF-α處理誘導LC細胞發生凋亡，這些細胞表達凋亡特異性eIF-5A蛋白。再用喜樹堿處理細胞時，凋亡特異性eIF-5A的表達沒有明顯變化，也許會稍微降低(圖84A)。但是當用喜樹堿和TNF-α聯合處理8h或24h后，凋亡特異性eIF-5A蛋白的表達受到明顯的增量調控(圖84B)。這些結果說明凋亡特異性eIF-5A的表達被TNF-α所特異性誘導，并且與凋亡誘導相關。這指出，凋亡特異性eIF-5A在凋亡途徑下游中扮演了TNF-α結合受體的角色。
為了檢測凋亡特異性eIF-5A表達在TNF-α誘導的LC細胞凋亡過程中的重要性，設計并通過體外轉錄合成了一系列靶作用于凋亡特異性eIF-5A的siRNA(siRNAs#1-#4)(SEQ ID NO81-84)。為確定這些siRNA在阻抑凋亡特異性eIF-5A蛋白表達上的效率，用每種siRNA轉染LC細胞系#506和#517，并在72h后檢測了細胞裂解物中的凋亡特異性eIF-5A蛋白表達量(圖85)。為進行比較，也用針對GAPDH的siRNA和/或對照siRNA(siRNA#5)(SEQ ID NO85)(它與siRNA#1具有相同化學成分但不識別凋亡特異性eIF-5A)轉染細胞。所有直接針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA都能夠在兩個LC細胞系中顯著阻抑凋亡特異性eIF-5A的表達(圖85)。因為GAPDHsiRNA不像siRNA#5那樣只是具有相反序列而并沒有細胞作用靶，它是一種活性siRNA并能夠阻抑其靶蛋白的表達(GAPDH，數據未列出)。所有4種針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA也都能夠保護轉染的LC細胞(#506)，在聯合使用TNF-α和喜樹堿處理24h時，不發生它們所引起的凋亡(圖86)。通過Hoescht染色發現，前4種siRNA降低凋亡發生的程度為，59％(siRNA#1)(SEQ ID81)，35％(siRNA#2)(SEQ ID NO82)，50％(siRNA#3)(SEQ ID NO83)，69％(siRNA#4)(SEQ ID NO.84)。有趣的是針對GAPDH的siRNA也將LC細胞的凋亡發生降低了42％(圖86)。已知GAPDH在其糖酵解酶的角色之外，還有其它細胞功能，包括推斷的在小腦神經元凋亡過程的作用(Ishitani and Chuang，1996；Ishitani et al.，1996a；Ishitani et al.，1996b)。在相似的實驗中，我們也發現siRNA#1(SEQ ID NO81)能夠將LC細胞系#517在響應TNF-α和喜樹堿時的凋亡發生降低53％。這說明凋亡特異性eIF-5A siRNA對分離自不同視神經乳頭的LC細胞具有保護作用(圖87)。這些結果說明凋亡特異性eIF-5A在凋亡過程中確實發揮作用，并且可能是LC細胞中通向TNF-α-誘導凋亡的途徑中的重要調節物。
使用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端原位標記法(TUNEL)，確認被喜樹堿和TNF-α處理的LC細胞確實是通過凋亡途徑死亡。用凋亡特異性eIF-5A siRNA(siRNA#1)(SEQ IDNO81)或對照siRNA(siRNA#5)(SEQ ID NO85)轉染LC細胞系(#506)，3d后再用喜樹堿和TNF-α處理處理24h。也對這些細胞進行Hoescht染色以促進胞核顯形。用對照siRNA轉染的LC細胞中有46％為TUNEL染色陽性，而用凋亡特異性eIF-5A siRNA#1(SEQID NO81)轉染的細胞僅有8％為陽性標記，這說明凋亡特異性eIF-5AsiRNA提供的針對凋亡的保護作用比對照高80％(圖88)。凋亡特異性eIF-5A siRNA#4所的結果與此相似，提供的針對凋亡的保護作用比對照高80％(數據未列出)。
實施例18收集血液并制備PBMC使用含有檸檬酸鈉(作為抗凝血劑)的采血管通過靜脈穿刺(venapuncture)從每個健康捐贈者處各收集約10ml血液，在收集后的24h內進行處理。
向15ml圓錐試管中加入60％SIP溶液(Percoll和1.5M NaCl按體積比9∶1混合制成)沉在底部，然后加入血液使血液層覆蓋在Percoll層之上，確保只有最低程度的混合發生。然后1000xg離心30min，在起始和最后的5min內要緩慢加速/減速。除去最上層的純血清，收集下方的白色PBMC層(1-2ml)。然后逐滴加入10m溫熱RPMI+15％FBS溶液，PBCM沉淀下來并對其進行計數。
在一個時間段內刺激PBMC以誘導細胞因子生成分離PBCM并接種在培養板上，密度為每孔2×105to5×105個細胞。用佛波酯(佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯)(PMA，每孔100ng)處理細胞。此后的第72h用不含任何刺激因子的培養基替換原有培養基。然后在第96h向板上加入脂多糖(LPS，每孔100ng，來自大腸桿菌，血清型0111)。在加入脂多糖(第96h)之前收集樣品，同時在不同階段中每次加入試劑后也收集樣品，如圖91所示。貼壁細胞(可能是單核細胞或巨噬細胞)和懸浮細胞(可能是淋巴細胞)都被收集。為分析樣品的細胞因子分泌，將每個樣品的培養基轉移到干凈的微離心管中，13000xg離心3min，使得上清液無任何殘渣存在。收集沉淀并與貼壁細胞混合。將培養基分裝為200-250μl一份，然后保存在-20℃下。用37℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，并用煮沸的裂解緩沖液(50mM Tris pH7，2％SDS，每孔加100μl)裂解細胞。煮沸細胞裂解物并保存在-20℃下。Western印跡分析結果見圖92，相應ELISA結果見圖93。
進行PBMC刺激以誘導凋亡特異性eIF-5A表達收集PBCM并接種在培養板上，密度為每孔2×105to5×105個細胞。為確定那種刺激誘導凋亡特異性eIF-5A，也為了確定它們是否有協同作用，用植物凝集素(PHA，100ng/ml)、佛波酯(佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯)(PMA，100ng/ml)、脂多糖(LPS，100ng/ml)處理細胞，或同時用三者處理細胞(均為100ng/ml)。刺激12或36h后收集樣品并分析凋亡特異性eIF-5A表達(圖94)。
PBMC轉染在制備PBMC的當天即對其進行轉染。接種細胞，密度為每孔2×105-5×105個細胞(24孔板上，每孔150μl以進行轉染)。在板上進行單獨轉染(77、78和79號捐贈者，圖95和96)或者在接種到板上之前在錐形管中同時轉染(80和84號捐贈者，圖96)。將15pmol siRNA稀釋在50μl Opti-MEM(Sigma)中。將1μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)稀釋在49μl Opti-MEM中，孵育7-10min，然后加到稀釋的siRNA溶液中孵育25min，即制得一個孔用量的轉染液。將轉染液覆蓋在細胞上，并置于37℃生長室中4h。終轉染液含有9％的血清。孵育后，向細胞加入50μl無血清RPMI+21％FBS溶液，以使終血清濃度達到15％。
轉染后刺激PBMC以誘導細胞因子生成如上文所述轉染72h后，含有脂多糖(LPS，每孔100ng，來自大腸桿菌，血清型0111)的500μl培養基被加到細胞上。刺激后的第24h收集樣品。用LPS處理孔中和僅進行轉染孔(即無刺激)中的細胞均被收集。為收集用于細胞因子分泌分析的樣品，將每個樣品的培養基轉移到干凈的微離心管中，13000xg離心3min，使得上清液無任何殘渣存在。收集沉淀并與貼壁細胞混合。將培養基分裝為200-250μl一份，然后保存在-20℃下。用1ml 37℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，并用煮沸的裂解緩沖液(50mM Tris pH7，2％SDS，每孔加100μl)裂解細胞。煮沸細胞裂解物并保存在-20℃下，以進行BCA蛋白定量。
實施例19細胞培養在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培養基中維持HT-29細胞系，一種人結腸腺癌細胞系。用同樣培養基懸浮培養U937細胞系，一種人組織細胞性淋巴瘤細胞系。兩種細胞系均在37℃、5％CO2加濕環境中維持。在U937細胞實驗中，在實驗開始前的兩天將細胞密度調節為3×105個細胞/ml。在實驗到第一天收集細胞并400xg離心10min，然后用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培養基重懸細胞，再次離心，然后用不含FBS的RPMI培養基重懸細胞。對細胞進行計數，并調節到2×106個細胞/ml。
siRNA根據人凋亡特異性eIF-5A設計siRNA序列并在Dharmacon RNATechnologies處合成。凋亡特異性eIF-5A siRNA(h5A1)靶序列為5’NNGCUGGACUCCUCCUACACA3’(SEQ ID NO_)，相應的雙鏈siRNA序列為5’GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT3’，(SEQ ID NO_)3’dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU5’(SEQ ID NO_)。
對照siRNA(hcontrol)序列為5’NNACACAUCCUCCUCAGGUCG3’(SEQ ID NO_)。
相應的雙鏈siRNA序列為5’ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT3’(SEQ ID NO_)3’dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC5’(SEQ IDNO_)。
HT-29細胞轉染轉染前一天在24孔板上接種細胞，密度為每孔105000個細胞。將25.5pmol siRNA稀釋在50μl Opti-MEM(Sigma)中。將1μlLipofectamine 2000(Invitrogen)稀釋在49μl Opti-MEM中，孵育7-10min，然后加到稀釋的siRNA溶液中孵育25min，即制得一個孔用量的轉染液。用無血清RPMI洗滌細胞一次，然后向細胞加入300μl無血清RPMI，并覆蓋上100μ轉染液。再置于37℃生長室中4h。孵育后，向細胞加入300μl無血清RPMI+30％FBS溶液。
U937細胞電穿孔將凋亡特異性eIF-5A siRNA和對照siRNA稀釋在Opti-Mem培養基(Sigma)中。將400μl細胞(800000個細胞)和100pmol siRNA混合在0.4mm電穿孔杯中。使用ECM830 Electrosquare porator(BTX，San Diego，CA)，300V、10mSec、一次脈沖進行電穿孔。隨后輕輕混合細胞并加到含有RPMI和濃縮FBS的孔中，以使得FBS終濃度達到10％。
處理HT-29細胞根據Suzuki等人發展的方法(Suzuki et al.2003)在HT-29細胞中誘導TNF-α生成。轉染48h后用200U/ml的干擾素γ(Roche Diagnostics)處理HT-29細胞。16h后用培養基洗滌細胞并加入脂多糖(LPS，100ng/ml，來自大腸桿菌，血清型0111Sigma)使得濃度為100μg/ml。LPS刺激8或24h后，將每個孔的培養基轉移到微離心管中，在進行TNFα的ELISA試驗前保存在-20℃下。用1ml 37℃的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，并在煮沸的裂解緩沖液(50mM Tris pH7，2％SDS)中進行裂解。煮沸細胞裂解物并保存在-20℃下。用bicinchoninic acid方法(BCA)并使用牛血清白蛋白作為標準蛋白確定細胞裂解物中的蛋白濃度。
通過用IFNγ處理HT-29細胞來誘導IL-8的生成。轉染48h后用200U/ml的干擾素γ處理HT-29細胞。24h后將每個孔的培養基轉移到微離心管中，在進行IL-8的液相電化學發光(ECL)試驗前保存在-20℃下。用1ml 37℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，并在煮沸的裂解緩沖液(50mM Tris pH7，2％SDS)中進行裂解。煮沸細胞裂解物并保存在-20℃下。用二辛可寧酸(bicinchoninic acid)法(BCA)并使用牛血清白蛋白作為標準蛋白確定細胞裂解物中的蛋白濃度。
U937細胞分化的誘導電穿孔16h后收集U937細胞并計數，然后接種到24孔板上(密度為每孔接入1ml，含有200000個細胞)。通過加入佛波酯(佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯)(PMA；100ng/ml)來刺激巨噬細胞分化。48h后，超過80％的單核細胞已從懸浮(單核細胞)變化成貼壁狀態(巨噬細胞)。在第48h除去培養基和任何非貼壁細胞，并加入新鮮含10％FBS的RPMI培養基(每孔1ml)。然后靜置新鮮培養基中的細胞24h，以使其進入靜止期。
刺激U937細胞產生細胞因子向U937細胞加入PMA72h后，向孔中加入脂多糖(LPS，每孔100ng，來自大腸桿菌，血清型0111)或加入干擾素γ(IFNγ；100U/ml)，或同時加入兩者。在加入刺激之前(72h)收集樣品，同時在不同階段中每次加入試劑后也收集樣品，如圖108所示。為分析樣品的細胞因子分泌，將每個樣品的培養基轉移到干凈的微離心管中，13000xg離心3min，使得上清液無任何殘渣存在。收集沉淀并與貼壁細胞混合。將培養基分裝為200-250μl一份，然后保存在-20℃下。用37℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，并用煮沸的裂解緩沖液(50mM Tris pH7，2％SDS，每孔加75μl)裂解細胞。來自相似孔的裂解物被合并，煮沸細胞裂解物并保存在-20℃下。
定量細胞因子所有樣品保存在-20℃下。使用Assay Designs的ELISA試劑盒并使用其中附帶的0-250pg/ml TNFα作為標準蛋白按照使用說明書定量TNFα。為進行U937的TNFα實驗，將樣品培養基用RPMI+10％FBS溶液稀釋20倍(0h，3h LPS)或80倍(6h，24h，30h LPS)。使用液相電化學發光(ECL)法定量IL-1β、IL-8和IL-6。而HT-29實驗中的培養基不被稀釋。根據每孔細胞蛋白總量(mg)校正所有細胞因子測量結果。
使用液相電化學發光(ECL)法定量IL-1β、IL-8和IL-6。簡短來說，用生物素(Igen，Inc.，Gaithersburg，MD)標記純化的鼠抗-鼠抗-人IL-8、IL-6或IL-1β(R&D Systems)單克隆抗體。另外按照使用說明書用釕(Igen)標記羊抗-人IL-8、IL-6或IL-1β抗體(R&D)。用PBS(含有0.25％BSA、0.5％Tween-20、0.01％疊氮化物、pH7.4，(ECL buffer))稀釋生物素標記的抗體，終濃度達到1mg/ml。在每個實驗試管中，將25ml生物素酰化的抗體與25ml 1mg/ml的用鏈霉抗生物素包被的磁性小珠(Dynal Corp.，Lake Success，NY)溶液通過強烈攪拌在室溫下共孵育30min。向試管中加入已在RPMI中稀釋的待測樣品(25mL)或標準品，然后加入25ml用釕標記的抗體(終濃度1mg/mL，稀釋在ECL緩沖液中)。然后振蕩試管2h。通過向每只試管加入200ml PBS來停止反應，并使用Origen Analyzer(Igen)確定化學發光量。
SDS-PAGE和Western印跡使用BCA法和牛血清白蛋白作為標準蛋白來確定細胞裂解物中的蛋白濃度。取5μg細胞總蛋白在10％或14％SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)上電泳。用10％的凝膠分析分子量大于50kDa的蛋白(TLR4、IFNγ、TNF-R1、iNOS)，而14％的凝膠用于分析凋亡特異性eIF-5A蛋白(17kDa)。使用半干轉移單位將凝膠上的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(轉移緩沖液48mMTris、39mM甘氨酸、1.3mM SDS，pH9.2；15V進行18min)。用5％的脫脂牛奶PBS-T(含0.1％Tween20)溶液封阻1h。在封阻溶液中稀釋一級抗體，并在室溫下與所有印跡通過搖動進行孵育。使用的一級抗體為抗凋亡特異性eIF-5A抗體(BD Biosciences；稀釋度1∶20000；孵育1h。它識別凋亡特異性eIF-5A和eIF5-A2)，TLR4抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc；TLR4(H-80)sc-10741；稀釋度1∶1000；孵育2h)，IFN-γRα抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc；IFN-γRα(C-20)sc-700；稀釋度1∶1000；孵育1h)，TNF-R1抗體(SantaCruz Biotechnology Inc；TNF-R1(H-5)sc-8436；1∶200；incubate3hours)，iNOS(BD Transduction Laboratories610431；稀釋度1∶10000；孵育1h)和抗β-肌動蛋白抗體(Oncogene；actin(Ab-1)；稀釋度1∶20,000；孵育1h)。加入一級抗體并孵育后，用PBS-T洗滌印跡三次每次5-10min。將辣根過氧化物酶(HRP)二級抗體稀釋在1％脫脂牛奶中，與膜孵育反應1h。所用的二級抗體為抗鼠IgG-HRP(Sigma；稀釋度1∶5000；識別凋亡特異性eIF-5A和TNF-R1)，抗兔IgG-HRP(Amersham Pharmacia Biotech；稀釋度1∶2500；識別TLR4和IFNγ-Rα)，抗鼠IgM-HRP(Calbiochem；稀釋度1∶5000；識別肌動蛋白)。與二級抗體孵育后用PBS-T洗滌印跡四次每次5-10min。按照使用說明書使用增強的化學發光探測試劑(ECL；Amersham PharmaciaBiotech)促進印跡，并放在X射線感光膠片上曝光(Fuji)。
RT-PCR根據文獻(Medvedev et al.2002)所述進行RT-PCR，以觀察轉染的HT-29細胞在響應IFNγ時TLR4 mRNA表達的變化。使用GAPDH表達作為對照，以表明在樣品中使用了同等量的cDNA。增加PCR循環次數以確定最優的循環數目，從而在非飽和條件下得到可探測擴增產物。通過溴化乙錠染色和瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。從用siRNA轉染的HT-29細胞(用IFNγ處理6h或未處理)中分離總mRNA并進行RT-PCR，以探測TLR4和GAPDH轉錄。按上文所述用siRNA轉染HT-29細胞。轉染48h后，用200U/ml的IFNγ處理細胞，對照細胞不進行處理，僅更換培養基。使用GenElute MammalianRNA miniprep kit(Sigma)試劑盒按照使用說明書從貼壁細胞中分離總mRNA。除去培養基并用溫熱PBS洗滌兩次。向細胞中加入裂解緩沖液，將細胞裂解物轉移到微離心管中，然后按照使用說明書分離總mRNA。
擴增TLR4(NM_003266)所用引物為正向5’CGGATGGCAACATTTAGAATTAGT3’(SEQ ID NO_)反向5’TGATTGAGACTGTAATCAAGAACC3’(SEQ IDNO_)。預計擴增片段長674bp。
擴增GAPDH(BC023632)所用引物為正向5’CTGATGCCCCCATGTTCGTCAT3’(SEQ ID NO_)反向5’CCACCACCCTGTTGCTGTAG3’(SEQ ID NO_)預計擴增片段長599bp。
RT-PCR反應條件如下混合以下物質，RNA2.5μgPoly(T)引物6.25μl添加Depc水到總體積為 13.75μl70℃加熱5min，然后在冰上冷卻5min。
向上述混合物中加入，5X AMV緩沖液 5.0μldNTPs(10mM)2.5μlRnase抑制物1.25μlAMV RT 2.5μl42℃加熱60min，70℃加熱10min。
單次PCR反應體系條件為10X Tsg緩沖液 2.0μldNTP(10mM) 0.4μl正向引物(25pmol/μl) 0.4μl反向引物(25pmol/μl) 0.4μl
MgCl2(15mM)2.0μlcDNA 0.8μlH2O13.88μlTsg聚合酶 0.12μlTLR4的PCR條件為加熱到95℃ 5min，20、25、30或35個循環95℃ 1min55℃ 1min72℃ 2min最后72℃延伸10min，冷卻到4℃。
GAPDH的PCR條件為加熱到95℃ 5min，20、25、30或35個循環95℃ 1min57℃ 1min72℃ 2min最后72℃延伸10min，冷卻到4℃。
實施例20NFκB分析的材料與方法本實驗的結果說明用針對凋亡特異性eIF-5A的siRNA轉染HT-29細胞，并用IFN-γ和LPS處理后，NFκB p50的活化作用降低并且TNF-α生成減少。見圖120。
培養使用RPMI加10％FBS在37℃、5％CO2加濕環境中維持HT-29細胞系(一種人結腸腺癌細胞系)。
轉染在轉染前一天將HT-29細胞接種在6孔板上，每孔500000個細胞。將155pmol siRNA稀釋在240μl Opti-Mem(Sigma)中，即為用于一個孔的轉染量。將4.8μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)稀釋在240μl Opti-Mem中并孵育7-10min，然后將此溶液添加到稀釋的siRNA中并孵育25min。用無血清RPMI洗滌待轉染細胞一次，然后向細胞中加入1400μl無血清RPMI并用480μl轉染液覆蓋。將細胞置回生長室4h。孵育后向細胞加入720μl無血清RPMI加30％FBS。轉染24h后向細胞中加入新鮮培養基。
細胞處理轉染48h后用200U/ml的干擾素γ(Roche Diagnostics)處理HT-29細胞。并更換所有剩余孔中的培養基。加入干擾素γ16h后用TNF-α(20ng/ml；Leinco Technologies Inc.，St.Louis，MO)或脂多糖(LPS，100ng/ml，來自大腸桿菌，血清型0111；Sigma)處理細胞，或者用培養基假處理以作為對照。準備僅用干擾素γ處理的細胞在用干擾素γ處理過夜，并在16h后添加含有新鮮干擾素γ的培養基。
核提取和NFκB轉錄因子分析在用不同刺激處理1h后，從細胞中提取并收集核蛋白以用于測量NFκB活性。使用TransAM Nuclear Extract Kit(Active Motif，Carlsbad，CA)試劑盒按照使用說明書提取胞核。取20μg核提取物，使用TransAM NFκB Family Transcription Factor Assay Kit(ActiveMotif，Carlsbad，CA)試劑盒按照使用說明書測量NFκB p50亞基的DNA結合能力。
序列表<110>SENESCO TECHNOLOGIES，INC.
<120>凋亡特異性eIF-5A siRNA和反義多核苷酸在抑制/阻抑炎癥反應中的用途<130>10799.173<140>PCT/US2005/025766<141>2005-07-20<150>60/589，073<151>2004-07-20<160>85<170>PatentIn Ver.3.2<210>1<211>1139<212>DNA<213>人鼠種(Rattus sp.)<220>
<221>CDS<222>(33)..(494)<400>1caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc53Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe1 5gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca101Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser10 15 20gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag149Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys25 30 35atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag197Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys40 45 50 55gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat245Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp60 65 70atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat293
Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn75 80 85gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag341Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln90 95 100gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt389Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu105 110 115ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc437Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile120 125 130 135aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc485Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala140 145 150atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc534Met Ala Lysatgagcctac agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca 594atttatttga cgttttattt tggttttcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc 654ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc 714ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc 774cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg 834gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat agtccttcac 894ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa 954acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc 1014atctgggaag gccttgcccc catgggcttt accctttcct gtgggctttc tccctgacac 1074atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa 1134aaaaa 1139<210>2<211>154<212>PRT<213>大鼠種(Rattus sp.)<400>2
Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys145 150<210>3<211>462<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>3atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg60cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc120gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt180attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat240gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca300ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc360aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc420atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462<210>4<211>460<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)<400>4atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg60cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata120gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga180attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat240gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc300ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc360aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca420atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat 460<210>5<211>462<212>DNA<213>大鼠種(Rattus sp.)<400>5atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg60cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc120gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc180attgacattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taatatggat240gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc300ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc360aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc420atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462<210>6<211>606<212>DNA<213>大鼠種(Rattus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)..(453)<400>6gct gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro1 5 10 15gca ctc aca gac ggc tca ctg ggt gac atg atc ttt ttc cat tcc tat 96Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr20 25 30aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac atc gtt gaa gac ctg cgg ctc atc 144Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile35 40 45
aac atg cag gcc att ttc gcc aag cgc act ggg atg atc atc ctg ggt192Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly50 55 60gga ggc gtg gtc aag cac cac atc gcc aat gct aac ctc atg cgg aat240Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn65 70 75 80gga gct gac tac gct gtt tat atc aac aca gcc cag gag ttt gat ggc288Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly85 90 95tca gac tca gga gcc cgg cca gat gag gct gtc tcc tgg ggc aag atc336Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile100 105 110cgg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat gct gat gca tct ctg gtt384Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val115 120 125ttc ccc ttg ctg gtg gct gag aca ttc gcc caa aag gca gat gcc ttc432Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe130 135 140aga gct gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggcttctg 483Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp145 150ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag 543catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603aaa606<210>7<211>151<212>PRT<213>大鼠種(Rattus sp.)<400>7Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro1 5 10 15Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr20 25 30Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile35 40 45Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly
50 55 60Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn65 70 75 80Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly85 90 95Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile100 105 110Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val115 120 125Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe130 135 140Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp145 150<210>8<211>453<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>8tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac60ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac120atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg180atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac240ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt300gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag360gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag420atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<220>
<221>經修飾的核苷酸(modified_base)<222>(12)<223>a、t、c或g
<400>9tcsaarachg gnaagcaygg 20<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>10gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42<210>11<211>972<212>DNA<213>大鼠種(Rattus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)..(327)<400>11tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att48Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile1 5 10 15gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat atc tgc ccg tcg act cat96Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His20 25 30aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc144Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly35 40 45atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag gac agt ggg gag gta cga192Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg50 55 60gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag240Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln65 70 75 80aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc aca gtg ctg tcc gcc atg288Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met85 90 95aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc atg gca aaa taactggctt 337
Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys100 105ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc397tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct457caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga517gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag577ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg637gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca697tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca757gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag817ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt877accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact937acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972<210>12<211>109<212>PRT<213>大鼠種(Rattus sp.)<400>12Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile1 5 10 15Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His20 25 30Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly35 40 45Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg50 55 60Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln65 70 75 80Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met85 90 95Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys
100 105<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>13caggtctaga gttggaatcg aagc 24<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>14atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc 30<210>15<211>489<212>DNA<213>大鼠種(Rattus sp.)<220>
<221>CDS<222>(33)..(485)<400>15caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc53Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe1 5gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca101GluThr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser10 15 20gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag149Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys25 30 35atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag197
Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys40 45 50 55gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat245Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp60 65 70atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat293Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn75 80 85gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag341Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln90 95 100gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt389Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu105 110 115ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc437Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile120 125 130 135aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gct485Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala140 145 150cgag 489<210>16<211>151<212>PRT<213>大鼠種(Rattus sp.)<400>16Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80
Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala145 150<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>17gtctgtgtat tattgggccc20<210>18<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>18gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42<210>19<211>1299<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>19ggcacgaggg cggcggcggc ggtagaggcg gcggcggcgg cggcagcggg ctcggaggca60gcggttgggc tcgcggcgag cggacggggt cgagtcagtg cgttcgcgcg agttggaatc120gaagcctctt aaaatggcag atgacttgga cttcgagaca ggagatgcag gggcctcagc180caccttccca atgcagtgct cagcattacg taagaatggc tttgtggtgc tcaaaggccg240
gccatgtaag atcgtcgaga tgtctacttc gaagactggc aagcacggcc acgccaaggt300ccatctggtt ggtattgaca tctttactgg gaagaaatat gaagatatct gcccgtcaac360tcataatatg gatgtcccca acatcaaaag gaatgacttc cagctgattg gcatccagga420tgggtaccta tcactgctcc aggacagcgg ggaggtacga gaggaccttc gtctccctga480gggagacctt ggcaaggaga ttgagcagaa gtacgactgt ggagaagaga tcctgatcac540ggtgctgtct gccatgacag aggaggcagc tgttgcaatc aaggccatgg caaaataact600ggctcccagg atggcggtgg tggcagcagt gatcctctga acctgcagag gccccctccc660cgagcctggc ctggctctgg cccggtccta agctggactc ctcctacaca atttatttga720cgttttattt tggttttccc caccccctca atctgtcggg gagcccctgc ccttcaccta780gctcccttgg ccaggagcga gcgaagctgt ggccttggtg aagctgccct cctcttctcc840cctcacacta cagccctggt gggggagaag ggggtgggtg ctgcttgtgg tttagtcttt900tttttttttt tttttttttt tttaaattca atctggaatc agaaagcggt ggattctggc960aaatggtcct tgtgccctcc ccactcatcc ctggtctggt cccctgttgc ccatagccct1020ttaccctgag caccacccca acagactggg gaccagcccc ctcgcctgcc tgtgtctctc1080cccaaacccc tttagatggg gagggaagag gaggagaggg gaggggacct gccccctcct1140caggcatctg ggagggccct gcccccatgg gctttaccct tccctgcggg ctctctcccc1200gacacatttg ttaaaatcaa acctgaataa aactacaagt ttaatatgaa aaaaaaaaaa1260aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1299<210>20<211>462<212>DNA<213>大鼠種(Rattus sp.)<400>20atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg60cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca agggccggcc atgtaagatc120gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggt180attgatattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taacatggat240gtccccaaca tcaaaaggaa tgatttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc300ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaggg agaccttggc360aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtccgcc420atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462<210>21<211>154<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45
Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys145 150<210>22<211>153<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser1 5 10 15Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn115 120 125
Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu130 135 140Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys145 150<210>23<211>154<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>23Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys145 150<210>24<211>153<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24
Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser1 5 10 15Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp85 90 95Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn115 120 125Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu130 135 140Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys145 150<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>25gacttggact tcgagacagg 20<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸
<400>26gcacggccac gccaaggtc19<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>27ggacagcggg gaggtacgag 20<210>28<211>153<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明說明性共有序列<400>28Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser1 5 10 15Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp85 90 95Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn115 120 125Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu130 135 140
Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys145 150<210>29<211>1309<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>29ggcacgaggg tagaggcggc ggcggcggcg gcagcgggct cggaggcagc ggttgggctc60gcggcgagcg gacggggtcg agtcagtgcg ttcgcgcgag ttggaatcga agcctcttaa120aatggcagat gacttggact tcgagacagg agatgcaggg gcctcagcca ccttcccaat180gcagtgctca gcattacgta agaatggctt tgtggtgctc aaaggccggc catgtaagat240cgtcgagatg tctacttcga agactggcaa gcacggccac gccaaggtcc atctggttgg300tattgacatc tttactggga agaaatatga agatatctgc ccgtcaactc ataatatgga360tgtccccaac atcaaaagga atgacttcca gctgattggc atccaggatg ggtacctatc420actgctccag gacagcgggg aggtacgaga ggaccttcgt ctccctgagg gagaccttgg480caaggagatt gagcagaagt acgactgtgg agaagagatc ctgatcacgg tgctgtctgc540catgacagag gaggcagctg ttgcaatcaa ggccatggca aaataactgg ctcccaggat600ggcggtggtg gcagcagtga tcctctgaac ctgcagaggc cccctccccg agcctggcct660ggctctggcc cggtcctaag ctggactcct cctacacaat ttatttgacg ttttattttg720gttttcccca ccccctcaat ctgtcgggga gcccctgccc ttcacctagc tcccttggcc780aggagcgagc gaagctgtgg ccttggtgaa gctgccctcc tcttctcccc tcacactaca840gccctggtgg gggagaaggg ggtgggtgct gcttgtggtt tagtcttttt tttttttttt900tttttttttt aaattcaatc tggaatcaga aagcggtgga ttctggcaaa tggtccttgt960gccctcccca ctcatccctg gtctggtccc ctgttgccca tagcccttta ccctgagcac1020caccccaaca gactggggac cagccccctc gcctgcctgt gtctctcccc aaaccccttt1080agatggggag ggaagaggag gagaggggag gggacctgcc ccctcctcag gcatctggga1140gggccctgcc cccatgggct ttacccttcc ctgcgggctc tctccccgac acatttgtta1200aaatcaaacc tgaataaaac tacaagttta atatgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1260aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa1309<210>30<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>30aaaggaatga cttccagctg att23<210>31<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>31aagatcgtcg agatgtctac ttc23
<210>32<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>32aaggtccatc tggttggtat tga 23<210>33<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>33aagctggact cctcctacac aat 23<210>34<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>34aaagtcgacc ttcagtaagg att 23<210>35<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>35cctgtctcga agtccaagtc 20<210>36<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>36gacttggact tcgagacagg 20<210>37<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)
<400>37ggaccttggc gtggccgtgc20<210>38<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>38gcacggccac gccaaggtcc20<210>39<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>39ctcgtacctc cccgctctcc20<210>40<211>19<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>40ggacagcggg gaggtacga 19<210>41<211>465<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>41atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg60cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc120gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt180attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat240gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca300ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc360aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc420atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aataa465<210>42<211>462<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)<400>42atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg60cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata120gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga180attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat240gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc300ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc360aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca420atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat aa 462<210>43<211>154<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>43Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Trp Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Ala Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Pro Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Leu Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys145 150<210>44
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>44aaaggaatga cttccagctg a 21<210>45<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>45aaaggaauga cuuccagcug att23<210>46<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>46ucagcuggaa gucauuccuu utt23<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>47aagatcgtcg agatgtctac t 21
<210>48<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>48aagaucgucg agaugucuac utt23<210>49<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>49aguagacauc ucgacgaucu utt23<210>50<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>50aaggtccatc tggttggtat t 21<210>51<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸
<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>51aagguccauc ugguugguau utt23<210>52<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>52aauaccaacc agauggaccu utt23<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>53aagctggact cctcctacac a 21<210>54<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>54aagcuggacu ccuccuacac att23<210>55
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>55uguguaggag gaguccagcu utt23<210>56<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>56aaagtcgacc ttcagtaagg a 21<210>57<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>57aaagucgacc uucaguaagg att23<210>58<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA結合分子的說明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸
<400>58uccuuacuga aggucgacuu utt23<210>59<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>59gccaagctta atggcagatg atttgg 26<210>60<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>60ctgaattcca gttattttgc catgg 25<210>61<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>61aatgaattcc gccatgacag aggaggc27<210>62<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成引物<400>62gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42
<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>63cctgtctcga agtccaagtc20<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>64ggaccttggc gtggccgtgc20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>65ctcgtacctc cccgctctcc20<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>66cgtaccggta cggttccagg20<210>67
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>67ggaccttggc gtggccgtgc20<210>68<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成肽<400>68Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr1 5 10 15Asp<210>69<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>69aaaggaatga cttccagctg acctgtctc 29<210>70<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>70aatcagctgg aagtcattcc tcctgtctc 29
<210>71<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>71aagatcgtcg agatgtctac tcctgtctc 29<210>72<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>72aaagtagaca tctcgacgat ccctgtctc 29<210>73<211> 29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>73aaggtccatc tggttggtat tcctgtctc 29<210>74<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>74aaaataccaa ccagatggac ccctgtctc 29<210>75<211>29<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>75aagctggact cctcctacac acctgtctc 29<210>76<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>76aatgtgtagg aggagtccag ccctgtctc 29<210>77<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>77aaagtcgacc ttcagtaagg acctgtctc 29<210>78<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>78aatccttact gaaggtcgac tcctgtctc 29<210>79<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>79aagcuggacu ccuccuacac20<210>80<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>80aaacacaucc uccucagguc g 21<210>81<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>81aaaggaatga cttccagctg a 21<210>82<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>82aagatcgtcg agatgtctac t 21<210>83<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>83
aaggtccatc tggttggtat t 21<210>84<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>84aagctggact cctcctacac a 21<210>85<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明合成寡核苷酸<400>85aaagtcgacc ttcagtaagg a 2權利要求
1.一種凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸阻抑細胞中凋亡特異性eIF-5A的內源性表達。
2.權利要求1的反義寡核苷酸，其中的凋亡特異性eIF-5A由SEQ ID NO20的核苷酸序列所編碼。
3.權利要求1的反義寡核苷酸，其中的凋亡特異性eIF-5A由SEQ ID NO41的核苷酸序列所編碼。
4.權利要求1的反義寡核苷酸，其中的反義寡核苷酸具有SEQID NO35中列出的序列。
5.權利要求1的反義寡核苷酸，其中的反義寡核苷酸具有SEQID NO37中列出的序列。
6.權利要求1的反義寡核苷酸，其中的反義寡核苷酸具有SEQID NO39中列出的序列。
7.一種用以轉染哺乳動物細胞的表達載體，其中包含權利要求1的反義寡核苷酸和操作性連接于該反義寡核苷酸上的調控序列，以使得該反義寡核苷酸可在所述細胞中進行轉錄。
8.一種用以轉染哺乳動物細胞的表達載體，其中包含權利要求4的反義寡核苷酸和操作性連接于該反義寡核苷酸上的調控序列，以使得該反義寡核苷酸可在所述細胞中進行轉錄。
9.一種用以轉染哺乳動物細胞的表達載體，其中包含權利要求5的反義寡核苷酸和操作性連接于該反義寡核苷酸上的調控序列，以使得該反義寡核苷酸可在所述細胞中進行轉錄。
10.一種用以轉染哺乳動物細胞的表達載體，其中包含權利要求6的反義寡核苷酸和操作性連接于該反義寡核苷酸上的調控序列，以使得該反義寡核苷酸可在所述細胞中進行轉錄。
11.一種抑制細胞中凋亡特異性eIF-5A表達的方法，所述方法包括向所述細胞中導入權利要求7的表達載體，從而使所述的凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸抑制所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。
12.一種抑制細胞中凋亡特異性eIF-5A表達的方法，所述方法包括向所述細胞中導入權利要求8、9或10的表達載體，從而使所述的凋亡特異性eIF-5A反義寡核苷酸抑制所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。
13.權利要求11的方法，其中對所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A表達的抑制對該細胞具有選自以下的作用阻抑所述細胞發生凋亡、減少所述細胞中p53的表達、降低所述細胞中產生的細胞因子的水平、降低所述細胞中產生的細胞因子的水平、提高所述細胞中Bcl-2的表達、降低所述細胞中產生的髓過氧化物酶的水平、降低所述細胞中活性NFk β的水平、降低所述細胞中TLR4的水平、降低所述細胞中TNFR-1的水平和降低所述細胞中iNOS的水平的作用。
14.權利要求12的方法，其中對所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A表達的抑制對該細胞具有選自以下的作用阻抑所述細胞發生凋亡、減少所述細胞中p53的表達、降低所述細胞中產生的細胞因子的水平、降低所述細胞中產生的細胞因子的水平、提高所述細胞中Bcl-2的表達、降低所述細胞中產生的髓過氧化物酶的水平、降低所述細胞中活性NFk β的水平、降低所述細胞中TLR4的水平、降低所述細胞中TNFR-1的水平和降低所述細胞中iNOS的水平的作用。
15.一種向哺乳動物體內肺臟細胞導入siRNA的方法，包括將所述siRNA與水混合并通過鼻腔導入哺乳動物細胞。
16.一種凋亡特異性eIF-5A siRNA，其中siRNA阻抑細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。
17.權利要求16的siRNA，其中的凋亡特異性eIF-5A由SEQ IDNO20的核苷酸序列所編碼。
18.權利要求16的siRNA，其中的凋亡特異性eIF-5A由SEQ IDNO41的核苷酸序列所編碼。
19.權利要求16的siRNA，其中siRNA具有SEQ ID NO30中列出的序列。
20.權利要求16的siRNA，其中siRNA具有SEQ ID NO31中列出的序列。
21.權利要求16的siRNA，其中siRNA具有SEQ ID NO32中列出的序列。
22.權利要求16的siRNA，其中siRNA具有SEQ ID NO33中列出的序列。
23.一種抑制細胞中凋亡特異性eIF-5A表達的方法，所述方法包括向所述細胞中導入權利要求16的siRNA，從而使所述的凋亡特異性eIF-5A siRNA抑制所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。
24.一種抑制細胞中凋亡特異性eIF-5A表達的方法，所述方法包括向所述細胞中導入權利要求19、20、21或22的siRNA，從而使所述的凋亡特異性eIF-5A siRNA抑制所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。
25.一種抑制細胞中凋亡特異性eIF-5A表達的方法，所述方法包括向所述細胞中導入權利要求16的siRNA，從而使所述的凋亡特異性eIF-5A siRNA抑制所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。
26.一種抑制細胞中凋亡特異性eIF-5A表達的方法，所述方法包括向所述細胞中導入權利要求19、20、21或22的siRNA，從而使所述的凋亡特異性eIF-5A siRNA抑制所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A的表達。
27.權利要求25的方法，其中對所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A表達的抑制對該細胞具有選自以下的作用阻抑所述細胞發生凋亡、減少所述細胞中p53的表達、降低所述細胞中產生的細胞因子的水平、降低所述細胞中產生的細胞因子的水平、提高所述細胞中Bcl-2的表達、降低所述細胞中產生的髓過氧化物酶的水平、降低所述細胞中活性NFkβ的水平、降低所述細胞中TLR4的水平、降低所述細胞中TNFR-1的水平和降低所述細胞中iNOS的水平的作用。
28.權利要求26的方法，其中對所述細胞中內源性凋亡特異性eIF-5A表達的抑制對該細胞具有選自以下的作用阻抑所述細胞發生凋亡、減少所述細胞中p53的表達、降低所述細胞中產生的細胞因子的水平、降低所述細胞中產生的細胞因子的水平、提高所述細胞中Bcl-2的表達、降低所述細胞中產生的髓過氧化物酶的水平、降低所述細胞中活性NFk β的水平、降低所述細胞中TLR4的水平、降低所述細胞中TNFR-1的水平和降低所述細胞中iNOS的水平的作用。
全文摘要
本發明涉及凋亡特異性真核起始因子5A(eIF－5A)，稱為“凋亡特異性eIF－5A”或“eIF－5A1”，包括相關核酸和多肽。也涉及到使用反義核苷酸或者siRNA抑制凋亡特異性eIF－5A表達從而抑制或阻抑細胞凋亡的方法。本發明也涉及通過抑制凋亡特異性eIF－5A表達，來阻抑或抑制促炎細胞因子表達，或抑制NFkB活化作用的方法。
文檔編號C12N15/113GK101027393SQ200580031487
公開日2007年8月29日 申請日期2005年7月20日 優先權日2004年7月20日
發明者J·E·湯普森, B·C·加爾頓, C·泰勒, C·迪納雷洛, L·列茲尼科夫, A·布恩, M·霍普金斯 申請人:森尼斯科技術公司