專利名稱：血清/糖皮質激素調節激酶的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及血清/糖皮質激素調節激酶(SGK)在發現有效成分中的用途。本發明另一方面涉及用于鑒定退化性軟骨改變的方法和測試試劑盒。
背景技術：
SGK-1激酶受到血清和糖皮質激素誘導，對其最初的描述是在1993年，作為鼠乳癌細胞系中的即時早期基因(Webster等人，1993a；Webster等人，1993b)。在這些細胞中，對糖皮質激素處理的早期應答為誘導SGK-1基因活性，并且其結果為SGK-1mRNA的量顯著增加。在進一步的研究中顯示，在多種細胞系和正常組織細胞中都存在SGK-1和它的可誘導性(Brennan等人，2000；Naray-Fejes-Toth等人，2000；Cooper等人，2001；Mikosz等人，2001)。SGK-1屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，迄今為止已發現三個成員，被稱為SGK-1、SGK-2和SGK-3。SGK-3還被命名為SGKL(類SGK)和CISK。在其催化結構域中，三種亞型在蛋白質水平彼此至少有80％同源。
實際上，SGK-1在目前測試過的所有組織中表達，但是表達的mRNA的量不同，這很大程度上依賴于所研究組織類型的性質(Gonzalez-Robayna等人，1999；Waldegger等人，1999；Alliston等人，2000；Klingel等人，2000；Lang等人，2000；Loffing等人，2001；Fillon等人，2002；Warntges等人，2002a；)。另外還發現SGK-1mRNA在典型的胚胎組織中存在。在小鼠胚胎發生過程中，SGK-1mRNA在胚胎的特定組織(蛻膜、卵黃囊、聽囊)中顯示出發育的動態變化，在肺芽、腦、心臟、肝、胸腺等器官發生過程中可以檢測到SGK-1mRNA(Lee等人，2001)。SGK-2在上皮組織中表達量最大，例如在腎、肝、胰腺和腦的特定區域(Kobayashi等人，1999b)。SGK-3在目前已測試的所有組織中都能夠檢測到，尤其是在成人心臟和脾臟中(Kobayashi等人，1999b；Liu等人，2000)。
然而，還沒有SGK在正在退化或已經退化的軟骨組織中表達的證據。
骨關節炎(OA)是最常見的退化性關節病癥之一，其晚期會導致關節功能的喪失。在此疾病的慢性期，延伸至下層骨組織的關節軟骨被破壞，必需對患者做關節取代手術。除了軟骨的破壞，還能夠在滑膜和韌帶中觀察到病理變化。像風濕性關節炎一樣，此疾病在一些情況下伴隨有炎性過程，但是與這一關節炎有差別。
此病癥的確切原因尚未知，但是可能涉及多種因素，例如代謝變化、機械應激、遺傳缺陷或關節損傷。
不論最初由什么觸發，OA的共同病理特征是關節軟骨的退化。OA病理條件的一個主要特征是膠原和蛋白聚糖的蛋白水解切割。同時，發生完整的系列進一步過程，例如合成代謝的修復機制、細胞的再生性分化或細胞死亡。這些過程的具體分子機制還遠未被完全了解。
成人軟骨的健康功能來自于其獨特的生物力學性質，其確保組織對高壓的抵抗力和必需的彈性。因此，軟骨組織的特殊結構是決定性的。與多數其它組織相反，軟骨細胞沒有直接接觸，而是彼此分離地包埋在細胞外基質(ECM)中。該ECM中的大分子保證關節軟骨和關節行使功能的能力。
ECM的基本結構由II型、IX型和XI型膠原纖維形成的網絡組成。其中包埋蛋白聚糖(主要是聚集蛋白聚糖)，產生極高滲透性的水結合能力。由此產生的膨脹壓力結合膠原基本結構的性質，保證軟骨的特殊性質。
OA發病機制的主要特征是軟骨和關節軟骨組織的ECM喪失。受患的關節功能因此受限或丟失。另外，在疾病的過程中顯示出多種癥狀(例如疼痛)的參數。
當前治療骨關節炎的方法主要限于減輕癥狀的不適。因此根據當前的知識，不可能基于藥療法產生軟骨退化的消退。由于這個原因，特別需要預防和/或治療骨關節炎的新的有效成分。另外需要能夠對關節軟骨退化性變化進行早期和可靠的診斷，以便盡可能在疾病初期階段開始治療。因此本發明目的是為鑒定對抗退化性軟骨改變的有效成分提供新的可能。
發明內容
本發明是通過使用SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段(也包括這類片段的功能性衍生物)或者編碼這類蛋白質、功能性片段或衍生物的核酸(及其功能性衍生物，例如穩定的衍生物)，從而找到預防或治療退化性軟骨改變的有效成分，來實現這一發明目的。
人SGK基因的序列是公知的。可以從NCBI核苷酸數據庫下載這些基因的編碼多核苷酸序列，其登錄號為NM_005627、AF153609(SGK-1)，AF169034、AF186470(SGK-2)、NM_013257、AF085233、AF169035(SGK-3)。同樣，也可從NCBI蛋白質數據庫中獲得蛋白質序列，其登錄號是NP_005618(SGK-1)、NP_733794、NP_057360(SGK-2)、Q96BR1(SGK-3)。人SGK基因定位于不同的染色體。SGK-1定位于6號染色體(6q23)，SGK-2定位于20號染色體(20q13.2)，SGK-3定位于8號染色體(8q12.3-8q13.1)。NCBI是生物技術信息國家中心(郵政地址NationalCenter for Biotechnology Information，National Library of Medicine，Building 38A，Bethesda，MD20894，USA；網址www.ncbi.nhm.nih.gov)。SGK-1基因的克隆尤其在Webster等人，1993a；Waldegger等人，1997；1998中被描述；SGK-2和SGK-3的克隆首先在Kobayashi等人，1999b中被描述。
使SGK區別于許多其它激酶的一個特征是基于其分子的轉錄、細胞定位和酶激活的嚴格依賴刺激的調節(Firestone等人，2003)。
已知激活SGK-1轉錄的大量刺激。其包括鹽皮質激素(Brennan等人，2000；Shigaev等人，2000；Bhargava等人，2001)、促性腺激素(Richards等人，1995；Gonzalez-Robayna等人，2000)、1，25(OH)2D3(Akutsu等人，2001)、p53、滲透性、細胞體積和低滲性變化(Waldegger等人，1997；Klingel等人，2000；Waldegger等人，2000；Rozansky等人，2002；Warntges等人，2002a)、細胞因子如GM-CSF和TNF-α(Cooper等人，2001)或通過TGF-β(Kumar等人，1999；Waldegger等人，1999；Lang等人，2000)。在進一步的生長依賴性信號途徑中，還發生經由血清(Webster等人，1993a)、胰島素和IGF-1(Kobayashi等人，1999a；Park等人，1999；Perrotti等人，2001)、FSH(Alliston等人，1997)、成纖維細胞和血小板細胞衍生的生長因子(Davies等人，2000)、Erk信號級聯激活物(Hayashi等人，2001)和TPA(Mizuno等人，2001)的SGK誘導。
還已知包括SGK-1激活的一些病理變化，例如腦局部缺血損傷(Imaizumi等人，1994)、病毒性肝炎(Fillon等人，2002)、肺纖維化(Warntges等人，2002b)或心臟纖維化(Funder2001)。
然而，SGK在退化性關節病癥過程中的相關性是先前未知的。
細胞外的刺激一般基本不引起SGK-1的激活。因此，例如用肝素處理之后，接著在血管系統的增殖平滑肌細胞中抑制SGK-1轉錄(Delmolino等人，1997)。
為了轉換成為其功能形式，需要通過磷酸化激活SGK-1。這由信號級聯介導，其中涉及磷脂酰肌醇(PI)-3激酶以及依賴3-磷酸肌醇的激酶PDK1和PDK2。
已知通過PI-3激酶信號途徑激活SGK-1是對胰島素、IGF和生長因子的應答。激活需要兩個氨基酸殘基的磷酸化，在蛋白質的T環上的蘇氨酸256和疏水基序上的絲氨酸422。蘇氨酸256的磷酸化由PDK1介導，絲氨酸422的磷酸化可能由假定的PDK2催化，其目前尚未知(Kobayashi等人，1999a；Park等人，1999；Biondi等人，2001)。
通過蘇氨酸256和絲氨酸422磷酸化位點的突變顯示出PDK1的激活作用。蘇氨酸256突變為丙氨酸引起磷酸化作用減少80-90％，并且阻止PDK1依賴的SGK-1激活。當蘇氨酸256和絲氨酸422同時突變成丙氨酸時也能觀察到同樣結果。相反，絲氨酸422突變為天冬氨酸引起PDK1的磷酸化和激活增加約6倍(Kobayashi等人，1999a)。
SGK在生理學或病理學過程中的功能尚未知。關于SGK的功能，目前只有系列研究表明SGK-1、-2和-3對細胞膜通道具有調節性影響。因此，已經表明上皮Na+通道(ENaC)是SGK-1、-2和-3的靶分子，此通道為腎小管中鹽皮質激素調節的Na+重吸收的主要轉運載體(Alvarez de la Rosa等人，1999；Bhmer等人，2000；Wagner等人，2000a；Wang等人，2001；Faletti等人，2002；Friedrich等人，2003)。SGK與ENaC發生相互作用并非通過直接磷酸化(Lang等人，2000)，而是通過由SGK磷酸化導致的泛素連接酶Nedd4-2的滅活(Debonneville等人，2001；Snyder等人，2002)。從而ENaC在細胞膜上的量和停留時間增加(Staub等人，1997；Alvarez de laRosa等人，1999；Wagner等人，2000a)。另外，許多實驗顯示ROMK1是SGK的靶分子。然而，ROMK1并不是直接受到SGK調節，而是為此目的需要“Na+/H+交換調節因子2”(NHERF2)作為中介分子(Shenolikar等人，2001；Yun等人，2003)。這同樣適用于SGK的另一靶分子Na+/H+轉運載體NHE3(Yun等人，2002)。此外，在爪蟾卵中的實驗已顯示SGK影響Kv1.3通道依賴性K+電流(Gamper等人，2002b；Warntges等人，2002a)。另有報道SGK調節氨基酸轉運蛋白42F/LAT和SN1(Wagner等人，2000b；Bhmer等人，2003a，b)。
然而，盡管有這些發現，迄今為止僅可能部分地重建在生理和病理學過程中SGK功能的描述圖。
SGK的片段是多肽或寡肽(或編碼它們的多聚或寡核苷酸)，其通過從天然存在的SGK，優選人SGK和特別優選根據SEQ ID No.1、2或3所示序列之一的SGK的末端或者內部缺失一個或多個氨基酸而不同。功能性片段的首選實例包含SGK激酶結構域或由SGK激酶結構域組成(見Kobayashi等人，1999a)。在這一點上特別首選包含SEQ ID No.7-12所示序列的片段，特別是由其組成的片段。SGK的衍生物是具有SGK功能的多肽或寡肽，其通過從天然存在的SGK蛋白質中替換至少一個氨基酸，和/或添加至少一個氨基酸，和/或化學修飾至少一個氨基酸(例如生物素化、磷酸化等)而不同，所述天然存在的SGK優選人SGK并且特別優選根據SEQ ID No.1、2或3中所示序列之一的SGK。
SGK的功能性片段或衍生物是多肽或寡肽、或編碼它們的多核苷酸或寡核苷酸，其至少具有SGK的一種功能。SGK的多種功能描述如下，例如調節細胞體積(Fillon等人，2001)、激活上皮Na通道(EnaC)(Debonneville等人，2001)；激活Na+轉運(Rozansky等人，2002或Lang和Cohen，2001)或激活氨基酸轉運(Wagner等人，2000)、或調節KCNE1依賴的K+通量；SGK的激酶活性，例如磷酸化泛素連接酶P或磷酸化Nedd4-2的絲氨酸444和/或絲氨酸338位點(Synder等人，2002)；自磷酸化作用的能力或磷酸化某肽的能力(參見Kobayashi等人，1999a)。與某蛋白質相互作用的能力(例如上述之一)同樣屬于SGK的功能。在這一點上特別適合的是在精氨酸-Xaa-精氨酸-Xaa-Xaa-絲氨酸/蘇氨酸基序中，尤其是包含GRPRTSSFAEG序列或者其組成的寡肽或多肽中，SGK磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基的能力(參見Kobayashi等人，1999a)。此外，具體的SGK亞型的片段或衍生物可以具有至少一個對所有SGK亞型共同的功能(例如在精氨酸-Xaa-精氨酸-Xaa-Xaa-絲氨酸/蘇氨酸基序或者在GRPRTSSFAEG序列的肽中，SGK磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基的能力)。它們優選具有各個亞型特殊的功能(例如對不同序列特定合成肽的磷酸化有不同的活性，見例如Kobayashi等人，1999a)。
發現蛋白質活性的測試方法是相關技術人員熟知的。因此通過常規方法測定例如磷酸化活性、與特定靶蛋白質或其片段的相互作用、或SGK調控特定離子通道和轉運蛋白活性的能力(關于這點也見下文)是可能的。在一個有利的實施方案中，SGK因此被用作分離的分子。
術語“分離的”涉及多肽/蛋白質/多核苷酸/核酸和它們的片段和衍生物，在本發明上下文中意指這些分子可以從天然來源純化，或者重組地制備并純化(這里的術語“純化”也包括“部分地純化”)。
分離的SGK分子的制備是相關技術人員熟知的。因此可能基于已知基因組或多核苷酸編碼序列，通過聚合酶鏈式反應擴增希望長度的多核苷酸，然后通過克隆到宿主細胞來增殖(關于這點，尤其見下文詳述的標準文獻)。聚合酶鏈式反應(PCR)是一種體外技術，允許通過旁側的兩段已知序列特異地擴增多核苷酸片段。在這一點上，如果已知位于待擴增序列5’端的序列即可。這種情況下可以用常規技術(例如限制酶消化等)產生待擴增的片段，在其3’末端連接一段已知序列的DNA分子(稱為連接子)，從而最終待擴增序列兩端都有已知序列(稱為連接子介導的PCR，ImPCR)。
使用與待擴增多核苷酸兩側的DNA或RNA模板序列區域互補的短單鏈DNA分子(引物)進行擴增。在確定的反應條件下，當存在三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)時，通過稱為聚合酶的特定酶(DNA聚合酶識別DNA為模板產生DNA鏈，或逆轉錄酶識別RNA為模板產生DNA鏈)，沿著單鏈變性基質延長引物，形成新的與模板互補的DNA鏈。通過選擇特定的周期性重復的溫度順序，保證新產生的多核苷酸鏈被變性，引物隨即雜交于其上，和最后發生新的延伸反應等等。為了能夠使用變性必需的溫度而不在后來添加新的酶，應用熱穩定性的聚合酶，例如Taq聚合酶(從水生嗜熱菌(Thermus aquaticus)而來的DNA聚合酶)是有利的。合適的聚合酶的選擇由使用目的決定，并且為相關技術人員公知。因此，例如當以克隆為目的使用PCR時，選擇具有改正錯誤(稱為校正)能力的聚合酶是有利的。
通常PCR混合物除多核苷酸模板外還包含兩種合適的引物(例如濃度在0.2到2μm)、還有dNTP(例如每種dNTP濃度為200μm)、還有濃度為1-2mM的MgCl2和1-10單位的熱穩定DNA聚合酶(例如Taq)，以及，例如0.01到20ng的多核苷酸(即DNA或RNA)模板。
根據常規方案通過化學合成產生引物或寡核苷酸。而且合成按照常規由商業供應商，例如尤其是MWG Biotech執行。來源廣泛多樣的cDNA是可商購的，例如來自Promega、STRatagene等供應商。進行PCR的合適的緩沖液和酶同樣為相關技術人員公知，并且也可商購。產生分離的多核苷酸序列的另外的方法包括通過已知方法克隆所希望的序列，隨后其在適當的生物中表達(優選單細胞生物，例如適當的細菌或酵母菌株)，和而后(至少部分的)純化表達的多核苷酸。
例如PCR反應適合用于制備用于克隆的多核苷酸片段。在這種情況下，使用至少一個在其5’部分含有限制性核酸內切酶識別序列的引物(稱為限制性切割位點)是有利的。
兩種引物都具有這樣的切割位點是有利的，兩個切割位點可以選擇為相同的或不同的。常規的限制性內切酶有例如BamHI(GGATCC)、Clal(ATCGAT)、EcoRI(GAATTC)、EcoRV(GATATC)、HindIII(AAGCTT)、NcoI(CCATGG)、Sall(GTCGAC)、XbaI(TCTAGA)等。合適的限制性酶和合適的反應條件的選擇是相關技術人員充分了解的。通過合適的限制性核酸內切酶切割(“消化”)載體DNA用于克隆，其在要克隆的cDNA片段的引物序列中也具有該酶的合適的識別位點。例如使通過PCR產生的片段與經分離和相同的限制性酶處理的“消化”載體相適合。接著，在載體純化和片段處理之后，通過DNA連接酶在合適的反應條件下進行連接(這些是技術人員所公知的)。
載體是環狀或線性DNA分子，例如質粒、噬菌體或粘粒，在其幫助下能夠在適當的生物中特異地擴增DNA片段(稱為克隆)。適當的生物主要是具有高生長速率的單細胞生物，例如細菌或酵母，但是也可以是來自多細胞集聚的細胞，例如從廣泛多樣的生物體產生的細胞系(例如，來自草地貪夜蛾(Spodoptera Frugiperda)的SF9細胞等)。合適的載體是技術人員熟知的，并且可以從生物技術供應商(例如Roche Diagnostics、New EnglandBiolabs、Promega、Stratagene和許多其他公司)商購獲得。
也可能通過合適的特異性載體，基于克隆的多核苷酸，重組產生分離的多肽，這同樣是現有技術公知的。這可以通過在合適的宿主細胞，例如細菌(優選大腸桿菌菌株)或真核宿主(例如，SF9細胞等)中表達而進行，在各種情況下將多核苷酸克隆到特殊的表達載體，然后插入適當的細胞中。合適的轉化和轉染方法同樣是技術人員公知的(例如見所附標準文獻)，同樣地，細胞培養條件和蛋白質表達的誘導也是技術人員所公知的。另一種重組產生分離的多肽的可能是體外翻譯。同樣為此目的將多核苷酸克隆到合適的載體中，然后在合適的緩沖液和細胞提取物中(例如在網織紅細胞裂解物中)進行體外表達。載體，還有必需的試劑和條件同樣是眾所周知的和可商購的(例如從Invitrogen)。
三個SGK亞型(SGK1到3)是在現有技術中公知的。相應地，在本發明多方面內容中首選使用這三個家族成員中的至少一個(但是優選SGK1亞型)，例如根據本發明檢測這三個家族成員中的至少一個(尤其是SGK1)的表達。
基于發明人的結果，通過對從健康的和已退化/退化中的軟骨組織中提取的總細胞RNA樣品的比較性基因表達分析，本發明令人驚訝地顯示出血清/糖皮質激素調節激酶-1(SGK-1)在已退化/退化中的骨關節軟骨中表達，然而其在健康的關節軟骨組織中檢測不到。在此處首次涉及軟骨組織中該分子的檢測。另外，通過發明人的進一步實驗，首次提供證據證明了SGK與退化性軟骨改變發展的因果關聯。
此外，SGK-1在軟骨組織中的表達代表了全新的發現，因為現有技術中并沒有已公布的研究說明SGK在這種組織中的作用或者在軟骨細胞中SGK在病理和發育特異性參數下的可能的調節機制。基于發明人的研究，可能是首次作出結論，認為SGK與軟骨的病理學條件特異性相關，例如在類風濕性關節炎或骨關節炎的構架組織中，特別是在骨關節炎的構架組織中，因此其代表誘導軟骨降解過程的關鍵分子。
由于在SGK家族成員之間的高同源性，可以假定這同樣適用于SGK-2和SGK-3。
通過使用已知的測試方法發現可能的有效成分在SGK活性和/或SGK水平上的作用，這些關系的鑒定首次使發現預防或治療退化性軟骨改變的有效成分成為可能。而且，SGK在退化性關節病癥發展中的因果關聯使特異性地研究治療有效成分成為可能，此有效成分靶向恢復軟骨正常細胞生理的調節機制。
相應地，本發明另一方面涉及鑒定預防或治療退化性軟骨改變的有效成分的方法，包括如下步驟a.用可能的有效成分接觸SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段。
b.在存在可能的有效成分時測定SGK活性。
c.在缺少可能的有效成分時測定SGK活性。
d.將b與c中SGK活性進行比較，優選測定SGK(蛋白質、其功能性衍生物或片段)的活性是否在存在可能的有效成分時比缺少可能的有效成分時降低，并且因此優選基于其抑制SGK活性的能力來區別有效成分。
本發明另一方面涉及鑒別預防或治療退化性軟骨改變的有效成分的方法，包括如下步驟a)在至少能夠轉錄的系統中，用可能的有效成分接觸含有編碼SGK蛋白質、功能性衍生物或片段的核酸的樣品。
b)在存在可能的有效成分時，測定SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段的量或者編碼后者的mRNA的量。
c)在缺少可能的有效成分時，測定SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段的量或者編碼后者的mRNA的量。
d)將b)與c)中的蛋白質或mRNA的量進行比較，優選測定SGK的量(蛋白質、其功能性衍生物或片段或者編碼后者的mRNA)是否在存在可能的有效成分時比缺少有效成分時降低，并且因此優選基于其減少SGK有效量的能力區別有效成分。
本發明還涉及鑒別預防或治療退化性軟骨改變的有效成分的方法，包括如下步驟a)在至少能夠翻譯的系統中，用可能的有效成分接觸含有SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段、或者其編碼核酸的樣品。
b)在存在可能的有效成分時，測定SGK蛋白質、片段或衍生物的活性。
c)在缺少可能的有效成分時，測定SGK蛋白質、片段或衍生物的活性，優選測定SGK的活性或量(蛋白質、其功能性衍生物或片段或者編碼后者的mRNA)是否在存在可能的有效成分時比缺少可能的有效成分時降低，并且因此優選基于其抑制SGK活性或減少SGK有效量的能力區別有效成分。
例如通過測定磷酸化合成肽或其它SGK底物的能力，能夠測定SGK活性是否在存在可能的有效成分時比缺少可能的有效成分時降低。(這也包括自磷酸化)。在這一點上優選使用多肽或寡肽，其含有序列基序精氨酸-Xaa-精氨酸-Xaa-Xaa-絲氨酸/蘇氨酸，優選RPRTSS基序和特別優選GRPRTSSFAEG基序，或由其組成。另一種可能是測定SGK調控某些離子通道活性的能力；這可以例如通過細胞內離子濃度或其它相關技術人員公知的方法來測量。
在這一點上SGK活性指SGK的所有功能(也見上述)。這些可能由可能的有效成分在所有水平上調控而影響蛋白質的活性(例如通過與激酶結構域直接相互作用；影響翻譯后修飾從而影響蛋白質活性、通過天然SGK抑制劑或激活劑，例如PI3K影響蛋白質折疊或激活)。SGK的量涉及活性SGK在系統中(例如在特定時間的細胞或生化混合物中)的平衡。還可以在SGK表達或SGK降解的所有水平上調控SGK的量(轉錄包括轉錄本的加工處理和從細胞核排出，或者翻譯或翻譯后修飾，這些可能會影響蛋白質的穩定性，因此影響活性SGK的平衡)。
而且由于SGK在軟骨細胞向退化性狀態變化中的相關功能，具有調控、優選減少SGK活性和/或SGK量能力的有效成分應該抑制(優選阻抑)退化性軟骨改變的發展，和/或減少(且優選阻止)現存的軟骨改變效應。
合適的分析方法或系統(所謂的測定)是目前技術水平上已知的，其測量身體中特定靶分子(這里是SGK)(稱為靶標，通常為蛋白質或核酸)的活性或濃度或量作為可能的有效成分的活性參數。這些可以是例如體外測定，意指生物化學測定，用分離或部分分離的組分組合成反應混合物，籍此測量可能的有效成分的活性。因此另外的可能性是細胞測試系統(測定)，其中能夠測定細胞環境中靶蛋白質(這里為SGK)的活性和可能的有效成分對此靶分子活性的作用。
在這一點上測定指任何類型的分析方法，籍此使監測生物學過程成為可能。這通常使分子過程和信號級聯(其代表部分的生理代謝途徑和控制機制)還有病理學條件在細胞系統或生物化學系統被模擬。隨后可以基于其介入這些途徑和機制的能力來測定有效成分的藥理學活性。
為了發現有效成分，尤其是對有效成分的高通量篩選，測定必須是可重復的并且優選是可測量的和有力的(指對外部影響敏感度低)。該測定應該優選適于對化學物質影響靶分子活性的能力進行的高通量篩選。在這一點上，測定的類型尤其依賴于所用靶分子的性質(例如生物化學基本分子的確切類型或特性，例如多肽或多核苷酸)和讀數(即通過其測定靶分子活性的參數)。多種測定類型是當前技術狀態下已知的，在多數情況下也可從工業供應商那里獲得。
適合測量兩種結合配體相互作用的測定包含例如放射性同位素或熒光測定(例如熒光極化測定)，可商購自，例如Panvera、Perkin-Elmer LifeSciences(NENTM、LANCETM)或Packard BioScience(HTRF；ALPHAscreenTM)。上述測定適于測量標記組分和未標記組分之間的相互作用(例如標記的蛋白質和它們與未標記配體的相互作用)。
測定的另外實例包括細胞測定，其中細胞系穩定地(可誘導地或組成型地，染色體地或游離型地)或者瞬時地表達所希望的重組蛋白質。這些測定包括例如報告基因測定，其中通過在相關啟動子控制下表達的報告酶的活性測量特定啟動子的調節、或者信號轉導途徑或信號轉導級聯成員的調節。對于這一類型的測定，需要產生在確定的啟動子控制下表達報告基因的重組細胞系，所述啟動子本身是待研究的或者受到待研究的信號轉導級聯調節。合適的報告酶通常是相關技術人員公知的，包括螢火蟲螢光素酶、renilla螢光素酶(都是可商購的，例如通過Packard Reagents)、β-半乳糖苷酶等。合適細胞系的選擇是相關技術人員公知的，并且尤其依賴于測定的靶標或讀數。這些是易于培養和轉染的普通細胞系，例如HeLA、COS、CHO或NIH 3T3細胞。
測量細胞內離子濃度的測定包括，例如所謂FLIPRTM(熒光成像板讀數器，可從Molecular Devices商購測)定，其中氬激光光源與冷CCD照相機組合，使能夠同時測量培養在384孔板的細胞中(例如重組地或天然地表達特定離子通道的細胞)不同混合物的細胞內離子濃度(例如Na+或Ca2+等)。可以通過這些FLIPRTM測定來測量，例如通過特定的熒光染料(例如Fluo-3、Fluo-4)測量細胞內鈣水平、通過使用BCECF、BCPCF或特異性FLIPRTM測定試劑盒測量細胞內pH值、通過使用例如DiBAC或特殊的FLIPRTM測定試劑盒或膜極性變化測量膜電位的變化。其它染料適合于測定其它離子，例如鋅、鈉等的濃度，并且同樣是現有技術水平公知的和可商購的。
適合測定特定離子通道活性(例如其控制細胞內離子濃度，因而能夠基于特定離子的細胞內濃度測定其活性)的測定和染料的實例是那些敏感地應答膜電位變化的例子，例如DiBAC或從Molecular Devices獲得的用于FLIPRTM分析的膜電位測定試劑盒，其通過JC-1染料用FLIPRTM技術測量線粒體膜極化；離子敏感性染料，例如Fluo-3、Fluo-4或者從MolecularDevices獲得的鈣測定試劑盒，其使用FLIPRTM技術測定細胞內離子濃度；鈉敏感性染料，例如從Molecular Probes獲得的，用來測定細胞內的鈉濃度；測定細胞內鈣濃度的測定，例如基于膜片鉗或通過原子吸收光譜的銣離子外流的測量等。還有用于測量和測定細胞中特定變化和狀態的自動裝置和自動機械是相關技術人員公知的，包括例如Acumen Bioscience的AcumenTM檢測器，這是一種基于熒光的激光掃描讀數設備，它使合適標記的物體分布的三維重建成為可能。
適合測量蛋白質磷酸化或激酶活性的實例是熒光偏振(例如可從Panvera商購的)、均相時間分辨熒光(HTRF，Cis Bio)或LANCETM測定(Perkin Elmer生命科學)，或者放大的發光鄰近均相測定(從PackardBioScience獲得的ALPHAScreenTM)。
其它類型的測定和其它類型的讀數同樣是相關技術人員充分熟知的。
本發明另一方面涉及基于上述方法之一的發現有效成分的高通量篩選。高通量篩選在本發明上下文中意指在很小規模，例如在96、386或1536孔板或者在幾毫升至幾納升范圍的小體積混合物中執行的方法，從而能夠在非常短的時間里分析大量的混合物，例如500000或更多。
本發明的上述使用和方法，和上述高通量篩選，可用于發現治療和/或預防退化性軟骨改變的有效成分。它們尤其可用于發現能夠抑制SGK引起和加速這種退化過程的能力的有效成分。在本發明多方面的上下文中，抑制意指適合于抑制至少一個SGK家族成員的功能，優選至少是SGK1。這種抑制可能從廣泛多樣的機制衍生而來，例如通過降低細胞的SGK水平(例如通過減少轉錄和/或翻譯，降低蛋白質或mRNA的穩定性等)，抑制SGK的酶活性或負影響上游或下游信號途徑。
在這一點上優選降低細胞的SGK水平或抑制其酶活性。
另外，本發明涉及鑒別發展中和已存在的退化性軟骨改變的方法，其包括軟骨組織中SGK的檢測。
在這一點上通過技術人員公知的方法進行SGK的檢測。因此，可能通過合適的方法，用軟骨組織中SGK的存在來鑒別存在或發展中的軟骨退化，這些檢測變性或退化軟骨中SGK方法的實例有基于免疫組織化學檢測SGK蛋白質或RNA(例如樣品組織切片的免疫組織化學染色、免疫印跡、酶聯免疫吸附測定或蛋白質微陣列)，或者通過Northern印跡、定量PCR、原位雜交或DNA微陣列等檢測SGK RNA。更多合適的SGK表達的檢測方法是相關技術人員公知的。取得組織樣品(例如含有刮擦軟骨細胞的軟骨或滑膜液)的合適技術和多種分析方法的過程同樣是技術人員熟知的。
檢測SGK家族或單個SGK家族成員的合適的抗體是可商購的(SantaCruz Biotechnology，Europa Bioproducts Ltd)，或者能通過使用SGK肽(例如具有SEQ ID No.4、5、6或SEQ ID No.7-12所示序列的多肽)在兔中按標準方案制備(例如見下文所示標準文獻)。其產品通常在商業上由多個供應商，例如BioTrend、Cologne、Germany提供。在這一點上，SGK家族成員之一的特異性抗血清或抗體優選使用各家族成員的C末端非催化區域的多肽片段制備，例如100個，優選80個或更少的C末端氨基酸，或特別優選從SGK蛋白質的N末端氨基酸的100個、優選85個選擇的多肽片段，特別是由各個SGK家族成員N末端氨基酸的20到100個、50到90個和特別優選85個組成的片段(在SGK2的情況從SGK2β序列開始；以此為目的特別適合SGK2α的是21個N末端氨基酸；也參見Kobayashi等人，1999b)。
對于Northern和Southern印跡、DNA微陣列、或原位組織切片中用于與固定核酸雜交的合適探針、以及PCR寡核苷酸引物的選擇和制備是相關技術人員眾所周知的(關于這點，也見下文所示的標準文獻)。在這一點上，特定的探針適合于不同的檢測，這些探針編碼各種SGK家族成員的上述、低同源性區域，例如從編碼序列最初255個核苷酸選出的探針(對應于各種SGK家族成員的85個低同源性N末端氨基酸；從編碼序列最初63個核苷酸選出的SGK2α探針，對應于SGK2α蛋白質低同源性的N末端21個氨基酸；見上述)。在這一點上適合檢測SGK1表達的探針優選具有SEQ ID No.1(圖1)、SEQ ID No.7(圖7)或SEQ ID No.13(圖8)所示序列。
在優選的實施方案中，用本發明的方法檢測SGK1。
用于鑒定退化性軟骨改變的本發明的方法優選包含如下步驟a)測量待研究的分離的軟骨樣品中SGK蛋白質或mRNA的含量；b)與未退化軟骨的分離樣品中SGK蛋白質或mRNA的含量進行比較，其中SGK的量在退化的或退化中的軟骨中比在未退化軟骨中要高。
本發明的這些方法使得能夠通過對移取的滑膜液或組織樣品的適當分析，簡單而可靠地診斷發展中或已存在的退化性軟骨改變。
本發明還涉及用于診斷退化性軟骨改變的、包含至少一種檢測SGK方法的測試試劑盒。在本發明的上下文中試劑盒的部分(或簡稱“試劑盒”)指所述成分的組合，這些成分組合成為在空間上相互并列的功能性單位，并且這些成分可能適當的包含更多的組成。
該手段優選用抗至少一個SGK蛋白質或蛋白片段的抗體，和/或引物組和/或核酸探針(后兩者用于檢測至少一種SGK mRNA的mRNA表達)。這樣的制備手段是相關技術人員眾所周知的。試劑盒可能另外包含更多有利的成分，例如合適的緩沖液、酶、使用說明書等。這類成分和必需的包裝手段是技術人員能夠從可商購的診斷測試試劑盒中得知的。
在本發明的多個主題和方面的首選實施方案中，SGK是多核苷酸，優選人SGK或其片段或衍生物，尤其優選包含如下序列之一或由其組成a)SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3b)與至少一個根據a)的序列并且編碼具有SGK功能多肽的序列在嚴格條件下雜交的序列。
c)與根據a)或b)的序列并且編碼具有SGK功能多肽的序列之一基于遺傳密碼簡并的序列。
d)根據a)、b)或c)的序列之一的片段，其編碼具有SGK功能的多肽，優選具有SEQ ID No.7-9(圖7)所示序列之一的片段。
e)通過交換一個或多個堿基從先前序列a)、b)、c)或d)之一產生的，并且編碼具有SGK功能多肽的序列，其中所述堿基交換并非、或并非專有地基于遺傳密碼簡并而發生。
在另外優選的實施方案中，SGK多核苷酸包含SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，或由這些序列組成。
根據本發明使用的SGK片段優選包含SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示核苷酸序列之一(圖7所示多核苷酸片段)，或由其組成。
在本發明的多個主題和方面的另一首選實施方案中，SGK是多肽，優選人SGK或其片段或衍生物，尤其優選由具有至少一種如下序列或由其組成的核酸編碼f)SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3g)與至少一個根據a)的序列在嚴格條件下雜交，并且編碼具有SGK功能的多肽的序列。
h)與根據a)或b)的序列之一基于遺傳密碼簡并，并且編碼具有SGK功能的多肽的序列。
i)根據a)、b)或c)序列之一的編碼具有SGK功能多肽的片段，優選具有SEQ ID No.7-9(圖7)所示序列之一的片段。
j)通過交換一個或多個堿基從先前序列a)、b)、c)或d)之一產生的，并且編碼具有SGK功能多肽的序列，其中所述堿基交換并非、或并非專有地基于遺傳密碼簡并而發生。
在另外首選的實施方案中，SGK多肽包含SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列，或由上述序列組成。
根據本發明使用的SGK片段包括SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示氨基酸序列之一(圖7)，或優選由其組成。
嚴格性描述影響兩條單鏈核酸分子之間的雜交特異性或退火的反應條件。在這一點上，反應的嚴格性，并且因此也是特異性，尤其依賴于溫度和緩沖液條件因此，能夠通過提高溫度和降低離子強度增加嚴格性，也即特異性。低嚴格性條件(即也是低反應或雜交特異性)存在于例如當雜交在室溫和2×SCC溶液中進行。相反，高嚴格性條件應用于例如當雜交在68℃、0.1×SSC和0.1％SDS溶液中進行時。
而且，在本申請含義下的嚴格條件雜交優選意指1)標記探針與待研究樣品在60到70℃、優選65℃的雜交，或者對于寡核苷酸，以低于雙鏈寡核苷酸和樣品的解鏈溫度5℃(此解鏈溫度也稱為“退火溫度”)雜交，在50mM Tris pH7.5、1M NaCl、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、0.5mg/ml變性的鯡精或鮭精DNA中過夜。
2)室溫下于2×SSC中洗10分鐘。
3)在60到70℃、優選65℃(或者對于寡核苷酸低于退火溫度5℃)，于1×SSC/0.1％SDS中洗30分鐘。
4)在60到70℃、優選65℃(或者對于寡核苷酸低于退火溫度5℃)，于0.2×SSC/0.1％SDS中洗30分鐘。
5)在60到70℃、優選65℃(或者對于寡核苷酸低于退火溫度5℃)，于0.1×SSC/0.1％SDS中洗30分鐘。
寡核苷酸優選長度為15到30個之間、優選20個核苷酸的DNA片段。在這種情況下退火溫度由公式Tm＝2×(A+T數)+4×(G+C數)℃測定。例如通過適當稀釋20×SSC溶液制備2×SSC或0.1×SSC溶液。20×SSC溶液組成為3M NaCl/0.3M Na檸檬酸鹽×2H2O。
在進行雜交之前，待研究的多核苷酸經適當的電泳分離(稱為Southern(DNA)或Northern(RNA)印跡)，或者不經電泳分離(稱為點或狹線印跡)之后，轉移到合適的膜上，例如尼龍或硝化纖維素膜。通過合適的方式與標記的探針進行雜交。因此，放射性標記或熒光染料標記是有利的，但是同樣可用其它類型的標記。探針是單鏈多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，本身是單鏈形式，或者通常是雙鏈形式但在變性狀態下應用。這種探針通過堿基配對結合于反向單鏈形式的DNA或者RNA探針。
在附圖中可以找到多種氨基酸和核苷酸序列。
本發明的多種主題和方面特別適用于關節病癥情況，優選骨關節炎或類風濕關節炎，尤其是骨關節炎。
參考文獻Akutsu，N.，Lin，R.，Bastien，Y.，Bestawros，A.，Enepekides，D.J.，Black，M.J.，andWhite，J.H.(2001).Regulation of gene Expression by 1 alpha，25-dihydroxyvitamin D3 and Its analog EB1089 under growth-inhibitory conditionsin squamous carcinoma Cells.Mol Endocrinol.，15，1127-1139.
Ali，S.，Wei，Y.，Lerea，K.M.，Becker，L.，Rubin，C.S.，and Wang，W.(2001).PKA-inducedstimulation of ROMK1 channel activity is governed by both tethering and non-tethering domains of an A kinase anchor protein.Cell Physiol Biochem.，11，135-142.
Alliston，T.N.，Gonzalez-Robayna，I.J.，Buse，P.，Firestone，G.L.，and Richards，J.S.(2000).Expression and localization of serum/glucocorticoid-induced kinase inthe rat ovaryrelation to follicular growth and differentiation.Endoc rinology，141，385-395.
Alliston，T.N.，Maiyar，A.C.，Buse，P.，Firestone，G.L.，and Richards，J.S.(1997).Folliclestimulating hormone-regulated expression of serum/glucocorticoid-induciblekinase in rat ovarian granulosa cellsa functional role for the Sp1 family inpromoter activity.Mol Endocrinol.，11，1934-1949.
Alvarez，d.l.R.，Zhang，P.，Naray-Fejes-Toth，A.，Fejes-Toth，G.，and Canessa，C.M.(1999).The serum and glucocorticoid kinase sgk increases the abundance ofepithelial sodium channels in the plasma membrane of Xenopus oocytes.J BiolChem，274，37834-3783g.
Bhargava，A.，Fullerton，M.J.，Myles，K.，Purdy，T.M.，Funder，J.W.，Pearce，D.，andCole，T.J.(2001).The serum-and glucocorticoid-induced kinase is aphysiological mediator of aldosterone action.Endocrinology，142，1587-1594.
Biondi，R.M.，Kieloch，A.，Currie，R.A.，Deak，M.，and Alessi，D.R.(2001).The PIF-bindingpocket in PDK1 is essential for activation of S6K and SGK，but not PKB.EMBOJ，20，4380-4390.
Boehmer，C.，Okur，F.，Setiawan，I.，Broer，S.，and Lang，F.(2003a).Properties andregulation of glutamine transporter SN1 by protein kinases SGK and PKB.Biochem.Biophys.Res.Commun。306，156-162.
Boehmer，C.，Wilhelm，V.，Palmada，M.，Wallisch，S.，Henke，G.，Brinkmeier，H.，Cohen，P.，Pieske，B.，andLang，F.(2003b).Serum and glucocorticoid inducible kinases inthe regulation of the cardiac sodium channel SCN5A.Cardiovasc Res.，57，1079-1084.
Boehmer，C.，Wagner，C.A.，Beck，S.，Moschen，I.，Melzig，J.，Werner，A.，Lin，J.T.，Lang，F.，and Wehner，F.(2000).The shrinkage-activated Na(+)conductance ofrat hepatocytes and its’possible correlation to rENaC.Cell Physiol Biochem.，10，187-194.
Brennan，F.E.and Fuller，P.J.(2000).Rapid upregulation of serum and glucocorticoid-regulated kinase(sgk)gene expression by corticosteroids in vivo.Mol CellEndocrinol.，166，129-136.
Chen，S.Y.，Bhargava，A.，Mastroberardino，L.，Meijer，O.C.，Wang，J.，Buse，P.，Firestone，G.L.，Verrey，F.，and Pearce，D.(1999).Epithelial sodium channelregulated by aldosterone-induced protein sgk.Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A，96，2514-2519.
Cooper，M.S.，Bujalska，l.，Rabbitt，E.，Walker，E.A.，Bland，R.，Sheppard，M.C.，Hewison，M.，and Stewart，P.M.(2001).Modulation of 11 beta-hydroxysteroiddehydrogenase isozymes by proinflammatory cytokines in osteoblastsanautocrine switch from glucocorticoid inactivation to activation.J Bone Miner.Res.，16，1037-1044.
Davies，S.P.，Reddy，H.，Caivano，M.，and Cohen，P.(2000).Specificity and mechanismof action of some commonly used protein kinase inhibitors.Biochem.J，351，95-105.
Debonneville，C.，Flores，S.Y.，Kamynina，E.，Plant，P.J.，Tauxe，C.，Thomas，M.A.，Munster，C.，Chraibi，A.，Pratt，J.H.，Horisberger，J.D.，Pearce，D.，Loffing，J.，andStaub，O.(2001).Phosphorylation of Nedd4-2by Sgk1 regulates epithelial Na(+)channel cell surface expression.EMBO J，20，7052-705g.
Delmolino，L.M.and Castellot，J.J.，Jr.(1997).Heparin suppresses sgk，an earlyresponse gene in proliferating vascular smooth muscle cells.J Cell Physiol，173，371-379.
Djelidi，S.，Beggah，A.，Courtois-Coutry，N.，Fay，M.，Cluzeaud，F.，Viengchareun，S.，Bonvalet，J.P.，Farman，N.，and Blot-Chabaud，M.(2001).Basolateraltranslocation by vasopressin of the aldosterone-induced pool of latent Na-K-ATPases is accompanied by alpha1 subunit dephosphorylationstudy in a newaldosterone-sensitive rat cortical collecting duct cell line.J Am.Soc.Nephrol.，12，1805-1818.
Eisen，M.B.Spellman，P.T.，Brown.P.O.，Botstein，D.(1998).Cluster analysis anddisplay of genome-wide expression patterns.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(25)14863-14868.
Embark，H.M.，Bohmer，C.，Vallon，V.，Luft，F.，and Lang，F.(2003).Regulation ofKCNE1-dependent K(+)current by the serum and glucocorticoid-induciblekinase(SGK)isoforms.Pflugers Arch，445，601-606.
Faletti，C.J.，Perrotti，N.，Taylor，S.I.，and Blazer-Yost，B.L.(2002).sgkan essentialconvergence point for peptide and steroid hormone regulation of ENaC-mediated Na+transport.Am.J Physiol Cell Physiol，282，C494-C500.
Fillon，S.，Wamtges，S.，Matskevitch，J.，Moschen，I.，Setiawan，I.，Gamper，N.，Feng，Y.X.，Stegen，C.，Friedrich，B.，Waldegger，S.，Broer，S.，Wagner，C.A.，Huber，S.M.，Klingel，K.，Vereninov，A.，Lang，F.(2001).Serum-and glucocorticoid-dependent kinase，cell volume，and the regulation of epithelial transport.Comp.Biochem.Physiol.A Mol.lntegr.Physiol.130(3)367-376.
Fillon，S.，Klingel，K.，Warntges，S.，Sauter，M.，Gabrysch，S.，Pestel，S.，T anneur，V.，Waldegger，S.，Zipfel，A.，Viebahn，R.，Haussinger，D.，Broer，S.，Kandolf，R.，andLang，F.(2002).Expression of the serine/threonine kinase hSGK1 in chronicviral hepatitis.Cell Physiol Biochem.，12，47-54.
Ref ID1Firestone，G.L.，Giampaolo，J.R.，and O′Keeffe，B.A.(2003).Stimulus-dependentregulation of serum and glucocorticoid inducible protein kinase(SGK)transcription，subcellular localization and enzymatic acttivity.Cell PhysiolBiochem.，13，1-12.
Friedrich，B.，Feng，Y.，Cohen，P.，Risler，T.，Vandewalle，A.，Broer，S.，Wang，J.，Pearce，D.，Lang，F.(2003).The serine/threonine kinnases SGK2 and SGK3 arepotent stimulators of the epithelial Na(+)channel alpha，beta，gamna-EnaC.Pflugers Arch.445(6)693-696.
Funder，J.(2001).Mineralocorticoids and cardiac fibrosisthe decade in review.ClinExp Pharmacol Physiol，28，1002-1006.
Gampe r，N.，Fillon，S.，Feng，Y.，F ried rich，B.，Lang，P.A.，Henke，G.，Huber，S.M.，Kobayas hi，T.，Cohen，P.，and Lang，F.(2002a).K+channel activation by all threeisoforms of serum-and glucocorticoid-dependent protein kinase SGK.PflugersArch，445，60-66.
Gamper，N.，Fillon，S.，Huber，S.M.，Feng，Y.，Kobayashi，T.，Cohen，P.，and Lang，F.(2002b).IGF-1 up-regulates K+channels via PI3-kinase，PDK1 and SGK1.Pflugers Arch，443，625-634.
Giebisch，G.(1998).Renal potassium transportmechanisms and regulation.Am.JPhysiol，274，F817-F833.
Gonzalez-Robayna，I.J.，Alliston，T.N.，Buse，P.，Firestone，G.L.，and Richards，J.S.(1999).Functional and subcellular changes in the A-kinase-signaling pathwayrelation to aromatase and Sgk expression during the transition of granulosacells to luteal cells.Mol Endocrinol.，13，1318-1337.
Gonzalez-Robayna，I.J.，Falender，A.E.，Ochsner，S.，Firestone，G.L.，and Richards，J.S.(2000).Follicle-Stimulating hormone(FSH)stimulates phosphoryation andactivation of protein kinase B(PKB/Akt)and serum and glucocorticoid-Inducedkinase(Sgk)evidence for A kinase-independent signaling by FSH in granulosacells.Mol Endocrinol.，14，1283-1300.
Hayashi，M.，Tapping，R.I.，Chao，T.H.，Lo，J.F.，King，C.C.，Yang，Y.，Lee，J.D.(2001).BMK1 mediates growth factor-induced cell proliferation through direct cellularactivation of serum and glucocorticoid-inducible kinase.J.Biol.Chem.276(12)8631-634.
Imaizumi，K.，Tsuda，M.，Wannaka，A.，Tohyama，M.，and Takagi，T.(1994).Differentialexpression of sgk mRNA，a member of the Ser/Thr protein kinase gene family，in rat brain after CNS injury.Brain Res Mol Brain Res，26，189-196.
Klingel，K.，Warntges，S.，Bock，J.，Wagner，C.A.，Sauter，M.，Waldegger，S.，Kandolf，R.，and Lang，F.(2000).Expression of cell volume-regulated kinase h-sgk inpancreatic tissue.Am.J Physiol Gastrointest.Liver Physiol，279，G998-G1002.
Kobayashi，T.and Cohen，P.(1999a).Activation of serum-and glucocorticoid-regulatedprotein kinase by agonists that activate phosphatidylinositide 3-kinase ismediated by 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1(PDK1)and PDK2.Biochem.J，339(Pt2)，319-328.
Kobayashi，T.，Deak，M.，Morrice，N.，and Cohen，P.(1999b).Characterization of thestructure and regulation of two novel isoforms of serum-and glucocorticoid-inducedprotein kinase.Biochem.J，344 Pt1，189-197.
Kumar，J.M.，Brooks，D.P.，Olson，B.A.，and Laping，N.J.(1999).Sgk，a putativeserine/threonine kinase，is differentially expressed in the kidney of diabetic miceand humans.J Am.Soc.Nephrol.，10，2488-2494.
Lang，F.，Cohen，P.(2001).The regulation and physiological roles of serum andglucocorticoid-induced protein kinase.Sci.STKE(108)RE17Lang，F.，Klingel，K.，Wagner，C.A.，Stegen，C.，Warntges，S.，F ried rich，B.，Lanzendorfe r，M.，Melzig，J.，Moschen，I.，Steuer，S.，Waldegger，S.，Sauter，M.，Paulmichl，M.，Gerke，V.，Risler，T.，Gamba，G.，Capasso，G.，Kandolf，R.，Hebert，S.C.，Massry，S.G.，and Broer，S.(2000).Deranged transcriptionalregulation of cell-volume-sensitive kinase hSGK in diabetic nephropathy.Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A，97，8157-8162.
Lee，E.，Lein，E.S.，Firestone，G.L.(2001).Tissue-specific expression of thetranscriptionally regulated serum and glucocorticoid-inducible preotein kinase(sgk)du ring embryogenesis.Mech.Dev.103(1-2)177-81Liu，D.，Yang，X.，and Songyang，Z.(2000).Identification of CISK，a new member of theSGK kinase family that promotes IL3-dependent survival.Curr.Biol，10，1233-1236.
Loffing，J.，Zecevic，M.，Feraille，E.，Kaissling，B.，Asher，C.，Rossier，B.C.，Firestone，G.L.，Pearce，D.，and Verrey，F.(2001).Aldosterone induces rapid apical translocationof ENaC in early portion of renal collecting systempossible role of SGK.Am.JPhysiol Renal Physiol，280，F675-F682Maier et al.，1997；inAutomation for genome characterisation.Ed T.J.Beuelsdijk.；PublishersJ.Wiley，New YorkMeier-Ewert，S.et al.，Sebastian.Maier Elmar.Ahmadi Ali.Curtis Jon.Lehrach Hans.An automated approach to generating expressed sequence catalogues.Nature(London).361(6410).1993.375-376
Mikosz，C.A.，Brickley，D.R.，Sharkey，M.S.，Moran，T.W.，and Conzen，S.D.(2001).Glucocorticoid receptor-mediated protection from apoptosis is associated withinduction of the serine/threonine survival kinase gene，sgk-1.J Biol Chem，276，16649-16654.
Mizuno，H.and Nishida，E.(2001).The ERK MAP kinase pathway mediates induction ofSGK(serum-and glucocorticoid-inducible kinase)by growth factors.GenesCells，6，261-268.
Naray-Fejes-Toth，A.，Canessa，C.，Cleaveland，E.S.，Aldrich，G.，and Fejes-Toth，G.(1999).sgk is an aldosterone-induoed kinase in the renal collecting duct.Effectson epithelial na+channels.J Biol Chem，274，16973-16978.
Naray-Fejes-Toth，A.，Fejes-Toth，G.，Volk，K.A.，and Stokes，J.B.(2000).SGK is aprimary glucocorticoid-induced gene in the human.J Steroid Biochem.Mol Biol，75，51-56.
Park，J.，Leong，M.L.，Buse，P.，Maiyar，A.C.，Firestone，G.L.，and Hemmings，B.A.(1999).Serum and glucocorticoid-inducible kinase(SGK)is a target of the PI 3-kinase-stimulated signaling pathway.EMBO J，18，3024-3033.
Perrotti，N.，He，R.A.，Phillips，S.A.，Haft，C.R.，and Taylor，S.I.(2001).Activation ofserum-and glucocorticoid-induced protein kinase(Sgk)by cyclic AMP andinsulin.J Biol Chem，276，9406-9412.
Richards，J.S.，Fitzpatrick，S.L.，Clemens，J.W.，Morris，J.K.，Alliston，T.，and Sirois，J.(1995).Ovarian cell differentiationa cascade of multiple hormones，cellularsignals，and regulated genes.Recent Prog.Horm.Res，50，223-254.
Rozansky，D.J.，Wang，J.，Doan，N.，Purdy，T.，Faulk，T.，Bhargava，A.，Dawson，K.，andPearce，D.(2002).Hypotonic induction of SGK1 and Na+transport in A6 cells.Am.J Physiol Renal Physiol，283，F105-F113.
Shenolika r，S.and Weinm an，E.J.(2001).NHERFtargeting and traffickin9 membraneproteins.Am.J Physiol Renal Physiol，280，F389-F395.
RefID16Shigaev，A.，Ashe r，C.，Latte r，H.，Garty，H.，and Reuveny，E.(2000).Regulation of sgk byaldosterone andits effects on the epithelial Na(+)channel.Am.J Physiol RenalPhysiol，278，F613-F619.
Shukunami，C.，Shigeno，C.，Atsumi，T.，Ishizeki，K.，Suzuki，F.，and Hiraki，Y.(1996).Chondrogenic differentiation of clonal mouse embryonic cell line ATDC5 in vitrodifferentiation-dependent gene expression of parathyroid hormone(PTH)/PTH-relatedpe ptide receptor.J Cell Biol，133，457-468.
Shukunami，C.，Ishizeki，K.，Atsumi，T.，Ohta，Y.，Suzuki，F.，and Hiraki，Y.(1997).Cellularhypertrophy and calcification of embryonal carcinoma-derived chondrogenic celllineATDC5 in vitro.J Bone Miner.Res，12，1174-1188.
Snyder，P.M.，Olson，D.R.，and Thomas，B.C.(2002).Serum and glucocorticoid-regulated kinase modulates Nedd4-2-mediated inhibition of the epithelial Na+channel.J Biol Chem，277，5-8.
Staub，O.，Gautschi，I.，Ishikawa，T.，Breitschopf，K.，Ciechanover，A.，Schild，L.，andRotin，D.(1997).Regulation of stability and function of the epithelial Na+channel(ENaC)by ubiquitination.EMBO J，16，6325-6336.
Vincent，G.M.(1998).The molecular genetics of the long QT syndromegenes causingfainting and sudden death.Annu.Rev.Med，49，263-274.
Wagner，C.A.，Broer，A.，Albers，A.，Gamper，N.，Lang，F.，and Broer，S.(2000).Theheterodimeric amino acid transporter 4F2hc/LAT1 is associated in Xenopusoocytes with a non-selective cation channel that is regulated by theserine/threonine kinase sgk-1.J Physiol，526 Pt1，35-46.
Wagner，C.A.，Ott，M.，Klingel，K.，Beck，S.，Melzig，J.，Friedrich，B.，Wild，K.N.，Broer，S.，Moscheh，I.，Albers，A.，Waldegger，S.，Tummler，B.，Egan，M.E.，Geibel，J.P.，Kandolf，R.，and Lang，F.(2001).Effects of the se rine/threonine kinase SGK1 onthe epithelial Na(+)channel(ENaC)and CFTRimplications for cystic fibrosis.Cell Physiol Biochem.，11，209-218.
Wald，H.，Garty，H.，Palmer，L.G.，and Popovtzer，M.M.(1 998).Differential regulation ofROMK expression in kidney cortex and medulla by aldosterone and potassium.Am.J Physiol，275，F239-F245.
Waldegger，S.，Barth，P.，Raber，G.，and Lang，F.(1997).Cloning and characterization ofa putative human serine/threonine proteinkinase transcriptionally modifiedduring anisotonic and isotonic alterations of cell volume.Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A，94，4440-4445.
Waldegger，S.，Gabrysch，S.，Barth，P.，Fillon，S.，and Lang，F.(2000).h-sgk serine-threonine proteinkinase as transcriptional target of p38/MAP kinase pathway inHepG2 human hepatoma cells.Cell Physiol Biochem.，10，203-208.
Waldegger，S.，Klingel，K.，Barth，P.，Sauter，M.，Rfer，M.L.，Kandoif，R.，and Lang，F.(1999).h-sgk serine-threonine protein kinasa gene as transcriptional target oftransforming growth factor beta in human intestine.Gastroenterology，116，1081-1088.
Wang，J.，Barbry，P.，Maiyar，A.C.，Rozansky，D.J.，Bhargava，A.，Leong，M.，Firestone，G.L.，and Pearce，D.(2001).SGK integrates insulin andmineralocorticoid regulation of epithelial sodium transport.Am.J Physiol RenalPhysiol，280，F303-F313.
Wang，W.(1999).Regulation of the ROMK channelinteraction of the ROMK withassociate proteins.Am.J Physiol，277，F826-F831.
Warntges，S.，Friedrich，B.，Henke，G.，Duranton，C.，Lang，P.A.，Waldegger，S.，Meyernann，R.，Kuhl，D.，Speckmann，E.J.，Obermuller，N.，Witzgall，R.，Mack，A.F.，Wagner，H.J.，Wagner，A.，Broer，S.，and Lang，F.(2002a).Cerebrallocalization and regulation of the cell volume-sensitive serum-andglucocorticoid-dependent kinase SGK1.Pflugers Arch，443，617-624.
Wamtges，S.，Klingel，K.，Weigert，C.，Fillon，S.，Buck，M.，Schleicher，E.，Rodemann，H.P.，Knabbe，C.，Kandolf，R.，and Lang，F.(2002b).Excessive transc ription of thehuman serum and glucocorticoid dependent kinase hSGK1 in lung fibrosis.CellPhysiol Biochem.，12，135-142.
Webster，M.K.，Goya，L.，and Firestone，G.L.(1993a).Immediate-earty transcriptionalregulation and rapid mRNA tumover of a putative serine/threonine proteinkinase.J Biol Chem，268，11482-11485.
Webster，M.K.，Goya，L.，Ge，Y.，Maiyar，A.C.，and Firestone，G.L.(1993b).Characterization of sgk，a novel member of the serine/threonine protein kinasegene family which is transcriptionally induced by glucocorticoids and serum.MolCell Biol，13，2031-2040.
Wulff，P.，Vallon，V.，Huang，D.Y.，Volkl，H.，Yu，F.，Richter，K.，Jansen，M.，Schlunz，M.，Klingel，K.，Loffing，J.，Kauselmann，G.，Bosl，M.R.，Lang，F.，and Kuhl，D.(2002).Impaired renal Na(+)retention in the sgk1-knockout mouse.J Clin Invest，110，1263-1268.
Yun，C.C.(2003).Concerted roles of SGK1 and the Na+/H+exchanger regulatoryfactor2(NHERF2)in regulation of NHE3.Cell Physiol Biochem.，13，29-40.
Yun，C.C.，Chen，Y.，and Lang，F.(2002).Glucocorticoid activation of Na(+)/H(+)exchanger isoform 3 revisited.The roles of SGK1 and NHERF2.J Biol Chem，277，7676-7683.
關于標準方法的文獻除非另外指出，此處描述的實驗室方法是或能夠根據以下詳述的標準文獻進行。
Bancroft et al.，1999；Methods in Microbiology 2867-82.
Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual.Second edition.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.545 pp；Current Protocols in Molecular Biology；regularly updated，e.g.Volume 2000；Wiley &Sons，Inc；EditorsFred M.Ausubel，Roger Brent，Robert Eg.Kingston，David D.Moore，J.G.Seidman，John A.Smith，Kevin Struhl.
Current Protocols in Human Genetics；regularly uptdated；Wiley&Sons，Inc；EditorsNicholas C.Dracopoli，Honathan L.Haines，Bruce R.Korf，Cynthia C.Morton，Christine E.Seidman，J.G.Seigman，Douglas R.Smith.
Current Protocols in Protein Science；regularly updated；Wiley&Sons，Inc；EditorsJohn E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploegh，David W.Speicher，Paul T.Wingfield.
Molecular Biology of the Cell；third edition；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；Garland Publishing，Inc.New York&London，1994；Short Protocolsin Molecular Biology，5th edition，by Frederick M.Ansubel(Editor)，Roger Brent(Editor)，Robert E.Kingston(Editor)，David D.Moore(Editor)，J.G.
Seidman(Editor)，John A.Smith(Editor)，Kevin Struhl(Editor)，October 2002，JohnWiley&Sons，Inc.，New York“Gene Targetingapracticai approach(1995)，EditorA.L.Joyner，IRL Press.Transgenic Animal Technology A Laboratory Handbook.C.A.Pinkert，editor；AcademicPress Inc.，San Diego，Callfornia，1994(ISBN0125571658).
下面通過實施例和附圖詳細解釋本發明，然而這些實施例和附圖并非旨在限制本發明的主題。
具體實施例方式
實施例1使用骨關節炎陣列的基因表達分析基因表達分析基于骨關節炎特異的cDNA陣列，該陣列從GPC-Biotech定購生產，并且由已經應用在尼龍膜上的4500個軟骨相關的基因組成。作為用于陣列雜交的探針，通過逆轉錄作用使來自健康和骨關節炎的關節軟骨的總RNA(通過標準方法制備)摻入32P標記的核苷酸成為放射性cDNA，并且通過標準方法與陣列的cDNA樣品一起孵育。膜的雜交和隨后的洗脫之后，通過放射自顯影檢測雜交信號。在健康和骨關節炎的軟骨之間差異表達不同的270個基因被考慮用于進一步的分析。令人驚奇的，這些基因之一是SGK發明人的基因表達分析的發現首次顯示在骨關節炎的關節軟骨中SGK的表達被誘導。可以通過cDNA文庫中的克隆數來證實這一發現其表現為，在骨關節軟骨cDNA文庫中(相對于正常軟骨文庫)以14倍頻繁表達SGK cDNA。
實施例2陣列的制備和雜交通過SSH(消減阻抑雜交)選擇制備陣列的克隆。也使用對照克隆和看家基因的克隆。在384孔聚丙烯板(Genetix，UK)中，使用Qiagen、HildenUK的PCR試劑盒，使用M13正向(5′GCT ATT ACG CCA GCT GGCGAA AGG GGG ATG TG3′)和M13反向引物(5′CCC CAG GCT TTACAC TTT ATG CTT CCG GCT CG3′)在50μl反應體積的PCR反應中，按照制造廠商(見上述Qiagen、Hilden UK)的說明操作進行擴增。用384針轉移器(Genetix)以2μl或更少的細菌培養物接種反應混合物，隨后用塑料膜(Genetix)對平板封口。在自動水浴系統中(KBioSystems，Basildon，UK)、標準條件下(Meier-Ewert，S.等人)進行PCR擴增。使用如Maier等人描述的自動機械點樣器將來自4396個cDNA克隆的PCR產物分別地轉移到8×12厘米復制尼龍膜上(Hybond N+，Amersham Pharmacia Biotech)，隨后通過空氣干燥固定于膜上。而且，以5×5式樣的形式將PCR產物兩次加至膜上，點與點之間的距離為850μm。
實施例3探針標記、雜交和洗脫在四種不同的反應混合物中用superscript II反轉錄酶(#18064-071，Invitrogen)將總量為2μg的總RNA轉錄為cDNA。在此情況中每種混合物包含200單位的superscript II(#18064-071，Invitrogen)、50μCi的33Pα-dCTP(#NEG313H，NEN Life Science Products GmbH)、每種情況各含0.66mM的dATP、dGTP、dTTP、0.5μg的隨機六聚體(AmershamPharmacia Biotech)和在superscript II第一鏈反應緩沖液(Invitrogen)中含10mM DTT。反應在42℃孵育4小時，然后按照制造廠商的說明用快速旋轉柱(Roche，Penzberg Germany)純化cDNA。在雜交之前，每種探針用0.11體積的變性溶液(1M NaOH/10mM EDTA)和5μg的人COT-1DNA(15279-011，Invitrogen)在70℃變性20分鐘。隨后通過加入一體積的中和溶液(1M Na磷酸鹽/pH7.0)在70℃中和每種探針10分鐘，然后將其加入雜交混合物。使用來自軟骨總RNA的反轉錄cDNA作為探針。
對于每個雜交實驗，在加入探針之前，在50ml的雜交緩沖液(7％SDS、50％去離子甲酰胺、5×SSC、50mM Na磷酸鹽緩沖液pH7.0和2％奶粉)預雜交3個陣列2小時。在塑料管中(20cm×10cm)加入探針后，雜交在50℃進行16小時。雜交后，陣列在2×SSC、1％SDS緩沖液中洗兩次，在0.1％SSC和0.5％SDS緩沖液中洗兩次。每個洗脫步驟在65℃進行15分鐘。隨后將膜用粘性膠片包裹，與磷儲存屏(phospho-storagescreen)接觸放置5天，用FUJI BAS5000顯像系統以25μm分辨率掃描。圖像用可商購的陣列分析程序(VisualGrid，GPC Biotech AG)分析，此程序將應用于陣列每個位置的平均信號強度轉換成計算機可讀的數據，并在儲存介質中將其儲存為文件。
實施例4數據分析按照如下方法，對多個陣列的信號強度傳達的文件中的原始數據(其中每個對應于單個克隆)進行分析首先，通過扣除從未標記DNA位置得到的信號強度來校正本底信號。隨后，考慮每個克隆的6個不同重復值(3個陣列，每種情況兩個數據點)來校正平均信號強度并轉化為對數形式，測定陣列上每個克隆的標準差。然后，使用基于平均-連鎖方法的等級聚類算法(Eisen等人，1998)，通過組合來自個體患者樣品的數據測定可能的樣品異常值。最后通過比較平均信號強度的結果，測定差異表達的克隆(將OA患者軟骨的cDNA樣品中特定克隆的平均信號強度與健康軟骨的cDNA樣品中的平均信號強度進行比較)。
或者，將每組OA患者特定克隆的平均信號強度與健康軟骨樣品的平均信號強度進行比較。
在每種情況下，在由特定cDNA克隆代表的特定組織樣品中，基因的表達水平與在使用組織樣品相應探針進行的雜交實驗中特定克隆的平均信號強度相連系。在這種情況下，更高的平均信號強度對應于更高水平的表達。對于每個比較，通過雙尾T檢驗測定基因表達的顯著性。使用P值為0.1作為顯著性的閾值，以此來鑒定代表在OA患者樣品組中(與正常軟骨樣品相比)差異表達基因的克隆。
實施例5cDNA陣列的雜交為了證實差異的基因表達，使用通過上述操作鑒定的個別克隆作為探針，與固定了骨關節炎和正常組織初級cDNA文庫的陣列進行雜交。在這種情況下，通過標準方法產生初級cDNA文庫，將其導入細菌中，分離出所選的代表文庫的細菌克隆，并且以標準方法將選出的克隆導入微量滴定板中(Bancroft等人，1999)。(1999；Methods in Microbiology 2867-82)。通過上述方法，用上述自動機械系統產生陣列，但是在每種情況中大小為23×23cm，并包含約40000個PCR產物，所述PCR產物對應于以一式兩份應用的初級cDNA克隆。在這些實驗中使用兩組陣列第一組5個陣列，對應于正常組織來源的cDNA文庫中200000個cDNA克隆；第二組5個陣列，對應于骨關節炎組織來源的cDNA文庫中200000個cDNA克隆。
對代表差異表達基因的個別克隆的PCR產物使用隨機引物(DecaPrime system，Ambion)通過標準方法進行放射標記。每個標記的克隆與第一和第二兩組陣列的一份重復雜交，產生總數為10的陣列，其每個代表正常和骨關節炎軟骨組織來源的200000個不同的初級cDNA克隆。在這種情況下，在面積為24×24cm的塑料皿中進行雜交，使用church緩沖液(7％SDS、0.5m Na磷酸鹽緩沖液，pH7.0、1mM EDTA)，在65℃進行16小時。洗脫步驟相當于先前所述步驟。在將磷儲存屏對膜包裹的雜交陣列曝光過夜之后，按照以上操作，使用FUJI BAS1800 II系統以100μm分辨率掃描陣列，并將信號轉換成可儲存的數據。使用上述圖像分析系統和前面描述的方法，測定與標記克隆雜交的每組陣列中初級cDNA的克隆數。在這種情況下，特定基因在第一組織中具有比第二組織中更高的表達水平，導致在對應于第一組織初級cDNA文庫的陣列組比含有第二組織cDNA文庫的陣列組得到更大量的雜交信號。
實施例6通過比較基因表達分析研究OA的分子機制，提出了對病理學狀態分析的有吸引力的方法和對藥物干涉的新的分子攻擊點的鑒定。用于此目的的“基因組分析”結果的解釋是復雜的，因為在OA受患的軟骨中多個過程(在某些情況下為反向)相互平行進行。此處可以提到的一個實例是軟骨構建和軟骨降解活性的同時發生。
為了獲得OA中差異表達基因的可能功能的最大近似(與正常軟骨相比)，需要能夠分別顯現軟骨降解和構建活動的系統。
適合于這種目的的系統的一個實例是骨骼發育模型，軟骨內骨化。在軟骨內骨化過程中，同樣地同時發生軟骨合成和軟骨降解。然而，與OA相反，其發生在互相清楚分界并且含有不同分化的細胞類型的區域。增殖的軟骨細胞區域與稱為肥大軟骨細胞的區域清楚地分開，肥大軟骨細胞通過它們增加的細胞體積在形態學上清楚可辨。在此區域發生正常細胞外軟骨基質(ECM)的重排和降解事件，ECM的主要組成通常由II型、IX型和XI型膠原以及蛋白聚糖聚集蛋白聚糖組成。相對而言，肥大軟骨細胞合成此區域特異性的X型膠原。在肥大軟骨區域存在組織的骨化，而且出現軟骨抗血管生成狀態的喪失和組織血管化，繼而在鄰近骨骼原基的肥大軟骨區域發生骨形成(圖9A)。軟骨ECM的殘余還在發育早期階段骨形成的位置存在，并且隨后被進一步降解或作為其它細胞的分化基質。
因此，為了在這樣的骨骼發育模型中觀察骨關節炎條件下關節軟骨中基因表達的活性，其基礎必然是在增殖區域中待研究基因表達的軟骨構建功能，和在肥大區域或胚胎骨中表達的軟骨降解功能。
由于先前已知完全沒有關于SGK-1在軟骨組織中表達的數據，如前所述在軟骨內骨化過程中檢測SGK-1mRNA的表達。其目標為獲得關于在上述陣列分析中檢測到的、在軟骨組織中升高的SGK-1mRNA水平顯著性的最初信息。使用新生小鼠的骨端作為研究的組織。在小鼠胚胎發育過程中，在此時期仍然進行骨骼生長和軟骨內骨化過程。
然后通過原位雜交方法研究SGK-1mRNA。
為此目的，將新生小鼠的骨端和發育各種階段的小鼠胚胎在以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶解的4％多聚甲醛(PFA)中固定過夜，并且通過分步轉移到濃度系列增加的不同濃度乙醇(用乙醇/PBS溶液替代PBS溶液)中脫水。隨后將脫水的組織轉移到二甲苯中，并用石蠟包埋。為此目的，最初將組織在二甲苯/石蠟混合物中孵育，接著放入純石蠟中，在二甲苯蒸發之后組織被包埋在蠟中。將石蠟包埋的胚胎和骨端切為7μm直徑的切片，并將其轉移到載玻片上來制備用于原位雜交的組織切片。然后將切片用地高辛-11-UTP標記，并與SGK-1特異性的反義核糖核酸探針雜交。使用T7RNA聚合酶(Roche)，通過標準方法從克隆進質粒載體pCRR-bluntII-TOPR(Invitrogen)上的SGK-1cDNA片段轉錄核糖核酸探針。在SGK-1 cDNA序列末端用KpnI(Invitrogen)將質粒線性化以便在那里終止轉錄，之后進行體外轉錄。
所用的鼠SGK-1的cDNA片段序列(746到1425核苷酸)代表NCBI核苷酸數據庫中公開的BC005720序列中的部分序列，在圖8中描述為SEQID No.13。
組織切片原位雜交的進行如Dietz等人(1999)所述。檢測雜交產物之后，在Kaiser’s甘油明膠(Merck)中用蓋玻片覆蓋切片，并用Zeiss Axioplan2顯微鏡分析和照相。基于上述原位雜交，發明人首次能夠檢測軟骨細胞中的SGK-1mRNA。在這種情況下檢測到的SGK-1mRNA的表達結構域特異地位于肥大軟骨細胞(圖9c)，而在增殖中的軟骨構建細胞中檢測不到。通過與肥大軟骨細胞標記基因，膠原X的mRNA的存在進行比較，能夠明白地顯示這一發現(圖9B)。相對地，增殖的軟骨明白地顯示為SGK-1mRNA陰性(圖9c)。
原位雜交實驗的結果表明，在軟骨中SGK-1的天然存在與軟骨的合成和維持沒有關聯，但是在其轉化(肥大)和降解中顯示其功能。
SGK-1在骨關節炎軟骨中的表達相應地是促成OA病理學或是其部分原因的過程。通過其調節特性，SGK-1可能是在軟骨中誘導早期病理性軟骨改變以及后期降解活動的新的關鍵分子。因此，SGK-1是用于骨關節炎藥物干涉的令人非常感興趣的新的靶分子。
實施例7為了檢驗從先前實驗得出的關于SGK-1在軟骨中功能的假設，在軟骨形成細胞系ATDC5中進行進一步的體外實驗。
ATDC5是從鼠畸胎癌細胞系AT805獲得的克隆細胞系并在胰島素(10μg/ml培養基)影響下經過軟骨分化。使細胞在細胞培養皿中維持單層生長用于實驗操作。待細胞匯合后，在胰島素影響下細胞開始形成凝聚，在相對長的時期之后，形成光折射簇并且數量上有所增加。通過用愛茜藍染色軟骨蛋白聚糖，可以容易地觀察到這種軟骨分化(Shukunami等人，1996)。與軟骨內骨化方式類似，細胞具有進一步分化為肥大細胞和骨化的潛能。這一過程由特殊培養基和二氧化碳條件支持(Shukunami等人，1997)。通過使用茜素紅進行的Ca2+染色能夠檢測到培養物的骨化。在分子水平證據確鑿的是肥大軟骨細胞的標記基因膠原X的mRNA有所增加(Shukunami等人，1997)。在這里進行的實驗中，肥大性分化不可能與ADTC5細胞的軟骨細胞增殖活動完全清楚地分開，因此，與正常軟骨標記基因(例如II型膠原)相平行，在mRNA水平還能夠檢測到少量X型膠原。然而，隨后在培養物的骨化誘導下這些X型膠原顯著增加(圖10)，而II型膠原mRNA的量減少(無圖)。
在這些條件下，SGK-1mRNA的表達與膠原X(Col10a1)mRNA類似。在軟骨分化和ATDC5細胞增殖期間，可檢測到本底量的SGK-1mRNA，接著在誘導細胞肥大和骨化之后其量強烈上升(圖10)。通過進行定量PCR實驗和Northern印跡雜交來檢測SGK-1和Col10a1mRNA的量。兩種分析方法提供可比較的結果。因此，能夠在可比較的體外模型中證實來自原位雜交中的發現。
實施例8為了靶向研究SGK-1在軟骨分化過程中的功能，通過來自MMLV(鼠莫洛尼白血病毒)的逆轉錄病毒載體系統(pLPCX載體)在ATDC5細胞中過表達人SGK-1。在這種情況下使用兩種不同的SGK-1變體激酶缺失突變體(蘇氨酸256和絲氨酸422突變為丙氨酸＝SGK-1KD)和天然存在的功能形式(SGK-1wt)。使用只含有無SGK-1的逆轉錄病毒載體或未經轉導的ATDC5細胞作為病毒SGK-1轉導的對照。然后用胰島素刺激細胞向軟骨分化，在21天之后進行分析。通過分析蛋白聚糖合成來研究細胞軟骨分化的程度。為此，用愛茜藍染色培養物并檢測聚集蛋白聚糖(軟骨中主要的蛋白聚糖)mRNA的表達(圖11)。
在這些實驗中能夠清楚地顯示SGK-1的過表達引起軟骨合成的抑制。愛茜藍染色的蛋白聚糖(圖11)和聚集蛋白聚糖mRNA(圖12)的量都被顯著地降低。相對而言，激酶缺失的SGK-1形式在這一參數上沒有負影響(圖11、12)。所述對照顯示類似的中性行為。因此能夠表明，軟骨合成的抑制和ECM形成可歸因于SGK-1的作用，而且并非由過表達導致人為增加蛋白質的量而產生。
從這些實驗中能夠得到關于SGK-1在患有OA的關節軟骨中的作用的多個結論。
首先，表達SGK-1的軟骨細胞不能再合成足夠的細胞外基質，例如組織功能所必需的蛋白聚糖。其次，增加例如聚集蛋白聚糖基因的表達阻止軟骨細胞對降解過程進行補償或修復。由此證實了SGK-1作為OA病理學可能的起始子和中心因子的功能。
因此，對于發現和發展用于治療退化性軟骨改變、尤其是骨關節炎的新的有效成分，SGK-1代表一種令人高度感興趣的靶分子。
在關節軟骨細胞中SGK-1、2和3的表達應該為進一步分析分子功能提供重要信息。為此，能夠例如通過技術人員公知的標準方法產生和分析小鼠的轉基因模型和敲除模型(見，例如列出的關于標準方法的文獻)。
圖1根據NCBI登錄號NM_005627、AF153609的人血清糖皮質激素調節激酶1(SGK1)的編碼多核苷酸序列(SEQ ID No.1)。
圖2根據NCBI登錄號AF169034、AF186470的人血清糖皮質激素調節激酶2(SGK2)的編碼多核苷酸序列(SEQ ID No.2)。
圖3根據NCBI登錄號NM_013257、AF085233、AF169035的人血清糖皮質激素調節激酶3(SGK3)的編碼多核苷酸序列(SEQ ID No.3)。
圖4根據NCBI登錄號NP_005618的人血清糖皮質激素調節激酶1(SGK1)的氨基酸序列(SEQ ID No.4)。
圖5
根據NCBI登錄號NP_733794、NP_057360的人血清糖皮質激素調節激酶2(SGK2)的氨基酸序列(SEQ ID No.5)。圖中以粗體標出兩種不同SGK2亞型α和β的第一個氨基酸。這兩種亞型的DDG/EMBL/GenBank登錄號是AF169034(α)和AF186470(β)。SGK2α是367個氨基酸的蛋白質，而SGK2β是427個氨基酸的蛋白質。
圖6根據NCBI登錄號Q96BR1的人血清糖皮質激素調節激酶3(SGK3)的氨基酸序列(SEQ ID No.6)。SGK3是長度為429個氨基酸的蛋白質。
圖7SGK亞型1到3的功能性片段的氨基酸和編碼多核苷酸序列圖7A顯示含有SGK-1編碼多核苷酸序列的激酶結構域的片段(SEQ ID No.7)；圖7B顯示含有SGK-2編碼多核苷酸序列的激酶結構域的片段(SEQ ID No.8)；圖7C顯示含有SGK-3編碼多核苷酸序列的激酶結構域的片段(SEQ IDNo.9)；圖7D顯示含有SGK-1氨基酸序列的激酶結構域的片段(SEQ ID No.10)；圖7E顯示含有SGK-3氨基酸序列的激酶結構域的片段(SEQ ID No.11)；圖7F顯示含有SGK-3氨基酸序列的激酶結構域的片段(SEQ ID No.12)。
圖8小鼠SGK-1mRNA的cDNA片段圖8顯示克隆自小鼠SGK-1mRNA并用于制備核糖核酸探針的cDNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.13)。
圖9用原位雜交在新生小鼠脛骨的組織切片上檢測SGK-1mRNA的表達。
A對照用蘇木精和伊紅染色。
B用地高辛標記的反義核糖核酸探針通過原位雜交和隨后的顯色反應檢測肥大軟骨細胞中Col10a1的表達。C通過用地高辛標記的反義核糖核酸探針原位雜交和隨后的顯色反應檢測肥大軟骨細胞中SGK-1mRNA的表達。
圖中的注解顯示通過特異性反義核糖核酸探針的原位雜交對新生小鼠脛骨的肥大軟骨細胞中SGK-1的檢測(圖9C)。為了更好的鑒定細胞，顯示組織切片的相應對照染色(圖9A)。
圖10比較在多個分化階段ATDC5細胞中SGK-1和Col10a1 mRNA的表達。
1未匯合階段的ATDC5細胞2匯合的ATDC5細胞3在加入胰島素3周后向軟骨形成分化的ATDC5細胞4經過另外兩周的骨化之后，如3中描述的向軟骨形成分化的ATDC5細胞。
圖10A顯示通過定量PCR對SGK-1和Col10a1 mRNA量的分析。顯示數字單位以說明表達幅度的程度。
圖10B顯示通過Northern印跡雜交對SGK-1和Col10a1 mRNA的檢測。
在A和B中測量β-actin mRNA的表達，來校準反應中所用的總細胞RNA量。
圖11病毒轉導的ATDC5細胞用于SGK-1的穩定過表達。
ATDC5未處理細胞作為對照pLCPCX沒有SGK-1的轉導載體的穩定整合，同樣用作對照SGK-1wt功能性SGK-1的過表達SGK-1KD激酶缺失的SGK-1的過表達在達到匯合后，在軟骨形成分化條件下維持細胞21天。通過愛茜藍染色檢測軟骨形成分化和蛋白聚糖產生的程度。
SGK-1過表達細胞顯示軟骨分化細胞量和蛋白聚糖形成量顯著地減少，而激酶缺失的SGK-1在這方面沒有影響。
A和B顯示在兩個獨立實驗中同樣的測試。
圖12通過定量PCR在聚集蛋白聚糖mRNA水平上對圖11所述樣品的蛋白聚糖表達的分析。
A和B對應于圖11A和B中描述的樣品。
1.ATDC52.pLPCX3.SGK-1wt4.SGK-1KD顯示數字單位以說明表達幅度的程度。測量的聚集蛋白聚糖mRNA的量幾乎都與圖11中所示的用愛茜藍染色檢測的蛋白聚糖的量有平行的行為。
在mRNA水平的比較中，只有圖11B中的pLPCX樣品顯示比SGK-1wt樣品更小的幅度。然而，在過表達SGK-1wt之后，與ATDC5和SGK-1KD相比，聚集蛋白聚糖mRNA的表達明顯大量減少。
序列表<110>塞諾菲-安萬特德國有限公司<120>血清/糖皮質激素調節激酶的用途<130>DEAV2004/0077<140>PCT/EP2005/012802<141>2005-12-01<150>102004059781.2<151>2004-12-10<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2370<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1cacgagggag cgctaacgtc tttctgtctc cccgcggtgg tgatgacggt gaaaactgag 60gctgctaagg gcaccctcac ttactccagg atgaggggca tggtggcaat tctcatcgct 120ttcatgaagc agaggaggat gggtctgaac gactttattc agaagattgc caataactcc 180tatgcatgca aacaccctga agttcagtcc atcttgaaga tctcccaacc tcaggagcct 240gagcttatga atgccaaccc ttctcctcca ccaagtcctt ctcagcaaat caaccttggc 300ccgtcgtcca atcctcatgc taaaccatct gactttcact tcttgaaagt gatcggaaag 360ggcagttttg gaaaggttct tctagcaaga cacaaggcag aagaagtgtt ctatgcagtc 420aaagttttac agaagaaagc aatcctgaaa aagaaagagg agaagcatat tatgtcggag 480cggaatgttc tgttgaagaa tgtgaagcac cctttcctgg tgggccttca cttctctttc 540cagactgctg acaaattgta ctttgtccta gactacatta atggtggaga gttgttctac 600catctccaga gggaacgctg cttcctggaa ccacgggctc gtttctatgc tgctgaaata 660gccagtgcct tgggctacct gcattcactg aacatcgttt atagagactt aaaaccagag 720aatattttgc tagattcaca gggacacatt gtccttactg atttcggact ctgcaaggag 780aacattgaac acaacagcac aacatccacc ttctgtggca cgccggagta tctcgcacct 840gaggtgcttc ataagcagcc ttatgacagg actgtggact ggtggtgcct gggagctgtc 900ttgtatgaga tgctgtatgg cctgccgcct ttttatagcc gaaacacagc tgaaatgtac 960gacaacattc tgaacaagcc tctccagctg aaaccaaata ttacaaattc cgcaagacac 1020ctcctggagg gcctcctgca gaaggacagg acaaagcggc tcggggccaa ggatgacttc 1080atggagatta agagtcatgt cttcttctcc ttaattaact gggatgatct cattaataag 1140aagattactc ccccttttaa cccaaatgtg agtgggccca acgagctacg gcactttgac 1200cccgagttta ccgaagagcc tgtccccaac tccattggca agtcccctga cagcgtcctc 1260gtcacagcca gcgtcaagga agctgccgag gctttcctag gcttttccta tgcgcctccc 1320acggactctt tcctctgaac cctgttaggg cttggtttta aaggatttta tgtgtgtttc 1380cgaatgtttt agttagcctt ttggtggagc cgccagctga caggacatct tacaagagaa 1440tttgcacatc tctggaagct tagcaatctt attgcacact gttcgctgga attttttgaa 1500gagcacattc tcctcagtga gctcatgagg ttttcatttt tattcttcct tccaacgtgg 1560tgctatctct gaaacgagcg ttagagtgcc gccttagacg gaggcaggag tttcgttaga 1620
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<210>6<211>496<212>PRT<213>智人<400>6Met Gln Arg Asp His Thr Met Asp Tyr Lys Glu Ser Cys Pro Ser Val1 5 10 15Ser Ile Pro Ser Ser Asp Glu His Arg Glu Lys Lys Lys Arg Phe Thr20 25 30Val Tyr Lys Val Leu Val Ser Val Gly Arg Ser Glu Trp Phe Val Phe35 40 45Arg Arg Tyr Ala Glu Val Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Leu Lys Lys Gln50 55 60Phe Pro Ala Met Ala Leu Lys Ile Pro Ala Lys Arg Ile Phe Gly Asp65 70 75 80Asn Phe Asp Pro Asp Phe Ile Lys Gln Arg Arg Ala Gly Leu Asn Glu85 90 95Phe Ile Gln Asn Leu Val Arg Tyr Pro Glu Leu Tyr Ash His Pro Asp100 105 110Val Arg Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Pro Lys His Gln Ser Gly Pro115 120 125Ser Glu Asp Glu Asp Glu Arg Ser Ser Gln Lys Leu His Ser Thr Ser130 135 140Gln Asn Ile Asn Leu Gly Pro Ser Gly Ash Pro His Ala Lys Pro Thr145 150 155 160Asp Phe Asp Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val165 170 175Leu Leu Ala Lys Arg Lys Leu Asp Gly Lys Val Tyr Ala Val Lys Val180 185 190Leu Gln Lys Lys Ile Val Leu Asn Arg Lys Glu Gln Lys His Ile Met195 200 205Ala Glu Arg Asn Val Leu Leu Lys Asn Val Lys His Pro Phe Leu Val210 215 220Gly Leu His Tyr Ser Phe Gln Thr Thr Glu Lys Leu Tyr Phe Val Leu225 230 235 240
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權利要求
1.SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段的用途，或編碼這類蛋白質、片段或衍生物的核酸的用途，其用于發現預防或治療退化性軟骨改變的有效成分。
2.鑒定預防或治療退化性軟骨改變的有效成分的方法，包括以下步驟a.用可能的有效成分接觸SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段；b.測定存在可能的有效成分時SGK活性；c.測定缺少可能的有效成分時SGK活性；d.將來自b的SGK活性與來自c的進行比較。
3.鑒定預防或治療退化性軟骨改變的有效成分的方法，包括以下步驟a.在至少能夠轉錄的系統中，用可能的有效成分接觸編碼SGK蛋白質、其衍生物或片段的核酸；b.在存在可能的有效成分時，測定SGK蛋白質、衍生物或片段的量或者編碼后者的mRNA的量；c.在缺少可能的有效成分時，測定SGK蛋白質、衍生物或片段的量或者編碼后者的mRNA的量；d.將來自b的蛋白質或mRNA的量與來自c的進行比較。
4.鑒定用于預防或治療退化性軟骨改變的有效成分的方法，包括以下步驟a.在至少能夠翻譯的系統中，用可能的有效成分接觸SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段或編碼核酸；b.在存在可能的有效成分時，測定SGK蛋白質、其功能性片段或衍生物的活性；c.在缺少可能的有效成分時，測定SGK蛋白質、其功能性片段或衍生物的活性。
5.用于發現有效成分的高通量篩選，其基于權利要求2到4中任一項所要求的方法。
6.鑒定退化性軟骨改變的方法，其包括在軟骨組織中SGK的檢測。
7.如權利要求6所要求的用于鑒定退化性軟骨改變的方法，包括以下步驟a.測量待研究的分離軟骨樣品中SGK蛋白質或mRNA的含量；b.將其與未退化軟骨中分離樣品的SGK蛋白質或mRNA的含量進行比較。
8.如權利要求1所要求的用途、如權利要求2到4中任一項所要求的方法、或者如權利要求5所要求的高通量篩選，其中將SGK用作分離的分子。
9.如權利要求1所要求的用途，其中將SGK用于生物化學測定或細胞測定中。
10.如權利要求2到4中任一項所要求的方法、或者如權利要求5所要求的高通量篩選，其中所述測定是生物化學測定或細胞測定。
11.如權利要求1所要求的用途、如權利要求2到4中任一項所要求的方法、或者如權利要求5所要求的高通量篩選，其中SGK是人SGK。
12.如權利要求11所要求的用途、方法或高通量篩選，其中所述血清糖皮質激素調節激酶是SGK1、2或3，并且優選SGK1。
13.如權利要求1所要求的用途或如權利要求5所要求的高通量篩選，其中SGK或其片段或衍生物是多核苷酸。
14.如權利要求15所要求的用途或高通量篩選、或如權利要求3或4的任一項所要求的方法，其中所述多核苷酸包含下述序列之一或由其組成a.SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3；b.與至少一個根據a的序列在嚴格條件下雜交，并且編碼具有SGK功能的多肽的序列；c.與根據a或b的序列之一基于遺傳密碼簡并，并且編碼具有SGK功能多肽的序列；d.根據a、b或c的序列之一的片段，其編碼具有SGK功能的多肽，優選具有SEQ ID No.7-9所示序列之一的片段；e.通過一個或多個堿基交換從先前a、b、c或d的序列之一產生的，并且其編碼具有SGK功能多肽的序列，其中所述堿基交換并非、或者并非專有地基于遺傳密碼的簡并性而發生。
15.如權利要求1所要求的用途或者如權利要求5所要求的高通量篩選，其中SGK或其功能性片段或衍生物是多肽。
16.如權利要求15所要求的用途或高通量篩選、或如權利要求2或4的任一項所要求的方法，其中所述多肽由具有如下序列之一的多核苷酸編碼a.SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3；b.與至少一個根據a的序列在嚴格條件下雜交，并且編碼具有SGK功能多肽的序列；c.與根據a或b的序列之一基于遺傳密碼簡并，并且編碼具有SGK功能多肽的序列；d.根據a、b或c的序列之一的片段，其編碼具有SGK功能的多肽，優選具有SEQ ID No.10-12所示序列之一的片段；e.通過一個或多個堿基交換從先前a、b、c或d的序列之一產生的，并且編碼具有SGK功能多肽的序列，其中所述堿基交換并非、或者并非專有地基于遺傳密碼的簡并性而發生。
17.如權利要求15所要求的用途或高通量篩選、或如權利要求2或4的任一項所要求的方法，其中所述多肽包含SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6所示序列或由其組成。
18.如權利要求15所要求的用途或高通量篩選、或如權利要求2或4的任一項所要求的方法，其中所述功能性片段或衍生物包含SEQID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示序列或由其組成。
19.用于診斷退化性軟骨改變的測試試劑盒，其包含至少一種檢測SGK的手段。
20.如權利要求19所要求的測試試劑盒，其中所述手段是抗體、引物組或核酸探針。
21.如權利要求19或20的任一項所要求的測試試劑盒，其另外地包括用于執行診斷方法的使用說明書。
22.如任意上述權利要求所要求的方法、用途、高通量篩選或測試試劑盒，其中所述退化性軟骨改變是關節炎病癥，優選類風濕性關節炎或骨關節炎，并且特別優選骨關節炎。
全文摘要
本發明涉及SGK蛋白質、其功能性衍生物或片段的用途，或者編碼一種這樣的蛋白質、片段或衍生物的核酸的用途，其用于發現預防或治療退化性軟骨改變的有效成分。
文檔編號C12Q1/68GK101073011SQ200580041846
公開日2007年11月14日 申請日期2005年12月1日 優先權日2004年12月10日
發明者E·巴特尼克, T·艾格納, U·迪茲, A·布里莫 申請人:塞諾菲—安萬特德國有限公司