封閉系統多階段核酸擴增反應的制作方法

專利名稱：封閉系統多階段核酸擴增反應的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及用于分析樣品中一種或多種核酸的存在的系統和方法，更具體地，涉及用于在封閉條件下進行多階段核酸擴增反應，特別是聚合酶鏈式反應(PCR)的系統和方法。
背景核酸擴增反應對于許多研究、醫療和工業應用是極其重要的。這些反應用于臨床和生物學研究、檢測和監測感染性疾病、檢測突變、檢測癌癥標志物、環境監測、遺傳鑒定、生物防御應用中病原體的檢測等等，例如Schweitzer等人，Current Opinion in Biotechnology，1221-27(2001)；Koch，Nature Reviews Drug Discovery，3749-761(2004)。特別地，聚合酶鏈式反應(PCR)已經被應用在所有這些領域中，包括用于病毒和細菌檢測、病毒負荷的監測、稀有和/或難以培養的病原體的檢測、生物恐怖威脅的快速檢測、癌癥患者中最少量殘留疾病的檢測、食物病原體測試、血液供給篩選等等的應用，例如，Mackay，Clin.Microbiol.Infect，10190-212(2004)；Bernard et al，Clinical Chemistry，481178-1185(2002)。關于PCR，如此廣泛應用的主要原因是其速度和容易使用(通常使用標準化試劑盒和相對簡單和低成本的設備在數個小時內進行)、其靈敏度(經常可以檢測到樣品中幾十個拷貝的靶序列)、以及其可靠性(可以容易地分析低質量樣品或保存的樣品，例如法醫樣品或固定的組織樣品)，Strachan和Read，Human Molecular Genetics 2(John Wiley & Sons，New York，1999)。
盡管如此廣泛的應用反映出核酸擴增技術中的進步，但依然需要速度和靈敏度上的進一步提高，特別是在感染性疾病檢測、最少量殘留疾病檢測、生物防御應用等等領域中。
通過在兩階段擴增反應中使用嵌套的成套引物已經實現了PCR靈敏度的顯著提高，例如，Albert等人，J.Clin.Microbiol.，281560-1564(1990)。
在此方法中，第一擴增反應的擴增子成為使用新一套引物的第二擴增反應的樣品，所述新一套引物中的至少一個結合到第一擴增子的內部位置。盡管提高了靈敏度，但是該方法具有增加試劑操作和增加引入污染序列的風險的問題，其能夠導致假陽性。已使用所謂的封閉試管嵌套PCR(closed-tube nested PCR)進行了克服這些困難的嘗試；然而，這些方法主要依賴于這樣的設計，即將試劑隔離在同一反應容器中不同部分以使得可以通過利用諸如離心等一些物理方法使試劑合在一起來啟動第二階段反應，例如Yourno，PCR Methods and Applications，260-65(1992)；Wolff等人，PCR Methods and Applications，4376-379(1995)；Olmos等人，Nucleic Acids Research，271564-1565(1999)。因此，第一階段反應組分的相當大部分存在于第二階段反應中。
通過在封閉環境中進行反應也實現了靈敏度的顯著提高和假陽性的減少。高靈敏度擴增技術的缺點是由于非靶序列的不當擴增造成的假陽性試驗結果的發生，例如，Borst等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.，23289-299(2004)。非靶序列的存在可能是由于在反應中缺乏特異性，或者由于來自在前反應的污染(即“攜帶(carry over)”污染)，或者由于來自直接環境的污染，例如水、一次性用品、試劑等等。這些問題可通過以下方式來進行改善在封閉容器中進行擴增，以使得一旦加入樣品和和試劑并將容器密封，就不再發生對反應物或產物的更多操作。“實時”擴增的出現很大程度上使得所述操作成為可能，該“實時”擴增使用連續報告反應混合物中產物含量的標記。
盡管有對封閉容器中多階段擴增的嘗試，現有技術缺乏如下的方法或系統，其中多階段反應可以在沒有來自在前反應的不希望組分(例如引物或其它組分)的干擾影響下進行。因此，亟需進行封閉多階段擴增反應的新方法，該方法具有單階段技術的方便，但是其具有使用嵌套引物的多階段擴增所賦予的更高靈敏度。
發明簡要描述本發明提供用于封閉多階段核酸擴增反應的系統、方法和設備，其中較前階段反應混合物的一部分作為下一階段反應的樣品。
一方面，本發明提供檢測一種或多種靶多核苷酸是否存在于樣品中的方法，其具有以下步驟(a)在流體封閉反應系統中，使用第一階段擴增試劑在第一反應混合物中擴增來自樣品的一種或多種靶多核苷酸，形成一種或多種第一擴增子，所述第一階段擴增試劑包括針對每一種靶多核苷酸的初始引物；(b)在該流體封閉反應系統中分離第一反應混合物的樣品；以及(c)在該流體封閉反應系統中，使用第二階段擴增試劑在第二反應混合物中擴增該樣品中的所述一種或多種第一擴增子，形成一種或多種第二擴增子，所述第二階段擴增試劑包括針對所述一種或多種第一擴增子的每一種的至少一種次級引物，使得每一種次級引物相對于所述第一擴增子的初始引物均嵌套在所述第一擴增子中。
另一方面，本發明提供控制嵌套擴增反應的方法，其包括以下步驟(i)在第一階段擴增反應中，在反應混合物中存在有熒光指示劑的情況下擴增靶多核苷酸，所述熒光指示劑能夠產生與第一階段擴增反應中擴增子數量相關的光信號；(ii)監測第一階段擴增反應中熒光指示劑的光信號；以及(iii)當光信號達到或超過預定水平時，自動分離有效部分的第一階段擴增反應的反應混合物來啟動第二階段擴增反應。
另一方面，本發明提供檢測樣品中是否存在一種或多種靶多核苷酸的方法，該方法包括以下步驟(i)提供與廢料容器、含有樣品的樣品容器、含有第一階段擴增試劑的第一反應物容器、以及含有第二階段擴增試劑的第二反應物容器可選擇地流體相通的反應室，每一個所述容器均為流體封閉的；(ii)將樣品從樣品容器以及第一階段擴增試劑從第一反應物容器以流體形式轉移至反應室，以使得當樣品中存在靶多核苷酸時第一階段擴增試劑與樣品在擴增反應中反應，產生含有第一擴增子的反應產物；(iii)除了保留在反應室中的有效部分之外，以流體形式將反應產物轉移至廢料容器；(iv)將第二階段擴增試劑從第二反應物容器中以流體形式轉移至反應室，以使得當反應產物中存在第一擴增子時第二階段擴增試劑與有效部分的反應產物在擴增反應中反應，產生第二擴增子；以及(v)檢測第二擴增子以確定樣品中是否存在靶多核苷酸。
另一方面，本發明提供確定樣品中一種或多種靶多核苷酸的相對量的方法，該方法包括以下步驟(i)在第一擴增反應中，擴增樣品中的所述一種或多種靶多核苷酸以及至少一種參照序列，以形成包含每一種靶多核苷酸和參照序列的第一擴增子的第一反應產物，所述第一擴增反應包括針對每一種靶多核苷酸和參照序列的初始引物；(ii)在第二擴增反應中，從有效部分的第一反應產物擴增所述一種或多種靶多核苷酸的第一擴增子，以形成每一種第一擴增子的第二擴增子，所述第二擴增反應包括針對每一種靶多核苷酸的次級引物，使得每一種第一擴增子的每一種次級引物相對于其初始引物均嵌套在所述第一擴增子中；以及(iii)將第二擴增反應的第二擴增子與第一擴增反應中至少一種參照序列的擴增子進行比較，以確定樣品中所述一種或多種靶多核苷酸的相對量。
本發明的另一方面，提供用于進行嵌套擴增反應的流體封閉反應系統，該系統包括(i)反應室，其與含有樣品的樣品容器、廢料容器、含有第一階段擴增試劑的第一反應物容器以及含有第二階段擴增試劑的第二反應物容器可選擇地流體相通，每一所述容器均為流體封閉的；以及(ii)與回轉閥可操作地連接的泵，用于以流體形式將樣品和第一階段擴增試劑轉移至反應室，在其中進行第一擴增反應以形成反應混合物中的一種或多種第一擴增子；用于分離有效部分的反應混合物；并且用于以流體形式將所述第二階段擴增試劑和有效部分轉移至反應室，其中進行第二擴增反應以形成一種或多種第二擴增子。
另一方面，本發明提供用于進行本發明方法的反應容器，該反應容器包括(i)用于容納液體的反應室；(ii)通過入口管道與反應室連接的入口；(iii)通過出口管道與反應室連接的出口；以及(iv)反應室中的保留部件，該保留部件被設置成當其余液體通過出口管道移出反應室時其將一定體積的液體保留在反應室中。
另一方面，本發明提供用于進行多階段反應的設備，該設備包括(a)至少形成有第一和第二管道的本體；和(b)從本體延伸出的反應容器，該反應容器包括(i)用于容納液體的反應室；(ii))通過入口管道與反應室連接的入口；(iii)通過出口管道與反應室連接的出口；以及(iv)反應室中的保留部件，該保留部件被設置成當其余液體通過出口管道移出反應室時其將一定體積的液體保留在反應室中，其中所述容器的入口連接到本體的第一通道，并且所述容器的出口連接到本體的第二通道。
另一方面，本發明提供計算機可讀產品，其包含由計算機執行的程序以控制嵌套擴增反應的進行，所述程序包含指令，用于(a)讀取來自第一階段擴增反應的光信號的值，所述光信號與第一階段擴增反應中擴增子的濃度單一(monotonically)相關，并且光信號的值具有最新值；(b)從光信號的值確定基線信號水平；(c)從光信號的值計算預定水平；(d)將該預定值與光信號的最新值進行比較；(e)當光信號的最新值等于或高于預定水平時，啟動第二階段擴增反應；以及(f)重復步驟(d)和(e)直至第二階段擴增反應啟動。
另一方面，本發明提供擴增一種或多種RNA序列的方法，該方法包括以下步驟(i)在流體封閉反應系統中，使用逆轉錄酶試劑在第一反應混合物中轉錄一種或多種RNA序列，以形成一種或多種互補單鏈DNA序列；(ii)在該流體封閉反應系統中分離第一有效部分的第一反應混合物；以及(iii)在該流體封閉反應系統中，使用第一階段擴增試劑在第二反應混合物中擴增所述第一有效部分中的所述一種或多種互補單鏈DNA序列以形成一種或多種第一擴增子，所述第一階段擴增試劑包括針對每一種互補單鏈DNA序列的初始引物。
本發明提供檢測或測量標本或樣品中一種或多種多核苷酸的系統和方法，在其多個方面比目前的技術具有若干優勢，包括但不限于，(1)通過避免“攜帶”反應物實現封閉系統中兩階段擴增反應的較高靈敏度；(2)進行以閉環控制反應啟動的實時多階段擴增反應，更具體地，進行實時嵌套PCR；(3)通過參照序列的單階段擴增和靶序列的多階段擴增達到低豐度靶多核苷酸在多階段擴增中的更加準確的定量；(4)用于進行本發明方法的方便的一次性反應容器。
定義本文所用的核酸化學、生物化學、遺傳學和分子生物學的術語和符號遵循該領域中標準論文和教科書中的那些，例如Kornberg和Baker，DNA Replication(DNA復制)，Second Edition(W.H.Freeman，New York，1992)；Lehninger，Biochemistry(生物化學)，Second Edition(WorthPublishers，New York，1975)；Strachan和Read，Human Molecular Genetics(人類分子遺傳學)，Second Edition(Wiley-Liss，New York，1999)；Eckstein，editor，Oligonucleotides and AnalogsA Practical Approach(寡核苷酸及類似物實用方法)(Oxford University Press，New York，1991)；Gait，editor，Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach(寡核苷酸合成實用方法)(IRL Press，Oxford，1984)；Sambrook et al，Molecular CloningA LaboratoryManual(分子克隆實驗手冊)，2ndEdition(Cold Spring Harbor Laboratory，1989)；等等。
“擴增子”指多核苷酸擴增反應的產物。也就是，其為從一種或多種起始序列復制的多核苷酸群，通常為雙鏈。該一種或多種起始序列可以是同一序列的一種或多種拷貝，或者其可以是不同序列的混合物。可以通過其產物為一種或多種靶核酸的多個復制物的多種擴增反應產生擴增子。通常，因為核苷酸或寡核苷酸反應物的堿基配對在產生反應產物所必需的模板多核苷酸中有互補物，所以產生擴增子的擴增反應是“模板驅動”的。一方面，模板驅動反應是使用核酸聚合酶的引物延伸或使用核酸連接酶的寡核苷酸連接。這些反應包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)、線性聚合酶反應、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈取代反應(SDA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、滾環復制等等，在通過引用方式包括于此的以下參考文獻中公開了這些反應Mullis等人，美國專利第4,683,195號；第4,965,188號；第4,683,202號；第4,800,159號(PCR)；Gelfand等人，美國專利第5,210,015號(使用“taqman”探針的實時PCR)；Wittwer等人，美國專利第6,174,670；Landegren等人，美國專利第4,988,617(“LCR”)號；Birkenmeyer等人，美國專利第5,427,930號(“缺口-LCR”)；Kacian等人，美國專利第5,399,491號(“NASBA”)；Walker，美國專利第5,648,211號；第5,712,124號(“SDA”)；Lizardi，美國專利第5,854,033；Aono等人，日本專利公開JP 4-262799(滾環復制)；等等。一方面，本發明的擴增子是通過PCR產生的。如果可獲得使得能夠隨著擴增反應的進行測量反應產物的檢測化學，那么擴增反應可以是“實時”擴增，例如下文描述的“實時PCR”或者在Leone等人，Nucleic Acids Research，262150-2155(1998)及類似參考文獻中描述的“實時NASBA”。如本文中所用，術語“擴增”指進行擴增反應。“反應混合物”指含有進行反應所需的全部反應物的溶液，其可以包括但不限于在反應期間將pH保持在選定水平的緩沖劑、鹽類、輔因子、清除劑(scavenger)等等。
關于擴增反應，“封閉的”指該反應在沒有液體可通過的開口的容器(vessel)或容器(container)或室(chamber)中發生，特別是含有非樣品物質的液體，例如非樣品生物分子或有機體，包括但不限于核酸、蛋白質、病毒、細菌等等。一方面，容納封閉擴增反應的容器或室可以包括氣體可穿過但液體不可穿過的端口或通風孔，例如，在常規反應條件下允許空氣通過濾膜但不允許液體通過的端口。用于所述端口或通風孔的合適膜包括織物聚烯烴膜，例如Tyrek膜(杜邦)等等。
“互補的或基本互補的”指雜交或堿基配對或在核苷酸或核酸之間形成雙鏈體，例如，在雙鏈DNA分子的兩條鏈之間或者在寡核苷酸引物和單鏈核酸的引物結合位點之間形成雙鏈體。通常，互補核苷酸是A和T(或A和U)，或者C和G。在最優地排列和比較以及帶有合適的核苷酸插入或刪除時，當一條鏈的核苷酸與另一條鏈的核苷酸的至少約80％，通常至少約90％至95％，并且更優選約98％至100％配對時，這兩條單鏈RNA或DNA分子被稱為基本互補的。或者，當RNA或DNA鏈在選擇性雜交條件下與其互補物雜交時，它們也基本互補。通常，當在至少14至25個核苷酸長度中存在至少約65％互補，優選約75％，更優選約90％互補時，選擇性雜交發生。參見，M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12203(1984)，通過引用將其包括于此。
“計算機可讀產品”指用于儲存可被讀取或可被傳輸至計算機的信息的有形介質。計算機可讀產品包括但不限于磁盤、磁帶、光盤、CD-ROM、打孔帶或卡、只讀存儲裝置、直接存取裝置、門陣列、靜電存儲器以及其它類似介質。
“雙鏈體”指全部或部分互補的至少兩寡核苷酸和/或多核苷酸在它們的所有或大部分核苷酸中進行Watson-Crick型堿基配對，使得形成穩定的復合體。術語“退火”和“雜交”可互換使用，指穩定雙鏈體的形成。關于雙鏈體，“完美匹配”指組成雙鏈體的多或寡核苷酸鏈與另一條鏈形成雙鏈結構，以至于每一條鏈中的每一個核苷酸都與另一條鏈中的核苷酸進行Watson-Crick堿基配對。術語“雙鏈體”包括可以使用的核苷類似物的配對，所述核苷類似物例如脫氧肌苷、具有2-氨基嘌呤堿基的核苷、PNA等等。雙鏈體中兩個寡核苷酸或多核苷酸之間的“錯配”指雙鏈體中的核苷酸對未能進行Watson-Crick成鍵。
“流體封閉的”指在常規運行條件下，系統中的液體不能與該系統外部交流，并且類似地，該系統外部的液體不能與包含在系統內部的液體交流，該系統包含可能相互連接并且相互溝通的一個或多個容器、室、閥門和/或通道。一方面，常規運行條件指流體封閉的系統的容器、室、閥門和/或通道被加壓至低于100psi的程度，或者另一方面，被加壓至低于50psi的程度，或者至低于30psi的程度。
“熒光指示劑”指當擴增反應的產物(即擴增產物)存在時能夠產生熒光信號的探針，至少在預定的濃度范圍內當產物在反應混合物中積累時，熒光指示劑的信號增強。熒光指示劑可以是非特異性的，例如結合雙鏈DNA產物的插入染料，例如YO-PRO-1、SYBR綠1等等，Ishiguro等人，Anal.Biochem.，229207-213(1995)；Tseng等人，Anal.Biochem.，245207-212(1997)；Morrison等人，Biotechniques，24954-962(1998)；或者例如帶有熒光分子的具有發卡結構的引物，該熒光分子位于熒光淬滅劑附近直至被引物延伸所分開，例如Whitecombe等人，Nature Biotechnology，17804-807(1999)(“AmplifluorTM引物”)。熒光指示劑還可以是靶序列特異的，通常包含位于熒光淬滅劑附近的熒光分子，直至其所結合的寡核苷酸部分與擴增產物結合，例如Gelfand等人，美國專利第5,210,015號(“taqman”)；Nazarenko等人，Nucleic Acids Research，252516-2521(1997)(“蝎型探針”)；Tyagi等人，Nature Biotechnology，1649-53(1998)(“分子燈塔”)。熒光指示劑可以與實時PCR聯合使用，或者它們可被用于在反應結束時測量反應產物的總量。
“內標”指為了能夠絕對或相對地量化樣本中靶多核苷酸而與靶多核苷酸在同一擴增反應中擴增的核酸序列。內標可以是內源或外源的。也就是，內標可以在樣品中天然存在，或者可以在擴增前加入到樣品中。一方面，可以向反應混合物中以一系列預先確定的濃度加入多個外源內標以提供校準，靶擴增子可以與其比較來確定樣品中其相應靶多核苷酸的數量。對于本領域技術人員來說，外源內標的數目、序列、長度和其它特征的選擇是常規的設計選擇。優選地，內源內標，本文中也稱為“參照序列”，是對應被最少調節的基因的、在樣品中天然存在的序列，所述基因顯示恒定和獨立于細胞周期的轉錄，例如，Selvey等人，Mol.CellProbes，15307-311(2001)。示例性的參照序列包括但不限于來自以下基因的序列GAPDH、β2-微球蛋白、18S核糖體RNA和β-肌動蛋白(參見Selvey等人，上文已引用)。
“試劑盒”指輸送用于進行本發明方法的物質或試劑的任何輸送系統。在反應測定中，所述輸送系統包括使得反應試劑(例如適當容器中的探針、酶等等)和/或支持物質(例如緩沖液、進行測定的書面用法說明等等)能夠從一地到另一地儲存、運輸或遞送的系統。例如，試劑盒包括一個或多個裝有相關反應試劑和/或支持物質的包裝物(例如盒子)。可以將這些內容物一起或分別地輸送至預期接收者。例如，第一個容器可能裝有測定中使用的酶，而第二個容器裝有探針。
“連接”指在模板驅動反應中，在兩個或多個核酸的末端之間形成共價鍵或連接，所述核酸例如寡核苷酸和/或多核苷酸。所述鍵或連接的性質可以非常不同，并且連接可以通過酶或化學的方法進行。用在本文中時，通常使用酶方法來進行連接，以在一個寡核苷酸的末端核苷酸的5’碳和另一寡核苷酸的3’碳之間形成磷酸二酯鍵。以下參考文獻中描述了多種模板驅動的連接，通過引用將所述文獻包括于此Whitely等人，美國專利第4,883,750號；Letsinger等人，美國專利第5,476,930；Fung等人，美國專利第5,593,826號；Kool，美國專利第5,426,180號；Landegren等人，美國專利第5,871,921號；Xu和Kool，Nucleic Acids Research，27875-881(1999)；Higgins等人，Methods in Enzymology，6850-71(1979)；Engler等人，The Enzymes，153-29(1982)；以及Namsaraev，美國專利公開2004/0110213。
“微流裝置”指相互連接并且流體相通的一個或多個室、端口和管道的整合系統，其被設計為單獨或與提供支持功能的器械或儀器一起用于進行分析反應或過程，所述支持功能包括樣品引入、流體和/或試劑驅動裝置、溫度控制以及檢測系統。微流裝置還可以包括閥門、泵以及它們內壁上專門的功能涂層，例如防止樣品組分或反應物吸附、通過電滲促進試劑移動等等。通常作為固體基體或者在固體基體中制造這些裝置，所述固體基體可以是玻璃、塑料或其它固體聚合材料，并且為了容易檢測和監測樣品和試劑的移動，特別是通過光學或電化學方法，這些裝置通常具有平面形式。微流裝置的特征通常具有小于數百平方微米的截面尺寸，并且通道通常具有毛細管的大小，例如，具有約1000μm至約0.1μm的最大截面尺寸。微流裝置的容積為通常100μL至少許nL，例如10-100nL。微流裝置的制造和操作為本領域公知，如以下文獻中所舉例，通過引用將所述文獻包括于此Ramsey，美國專利第6,001,229號、第5,858,195號、第6,010,607號和第6,033,546號；Soane等人，美國專利第5,126,022和第6,054,034號；Nelson等人，美國專利第6,613,525號；Maher等人，美國專利第6,399,952號；Ricco等人，國際專利公開WO02/24322；Bjornson等人，國際專利公開WO 99/19717；Wilding等人，美國專利第5,587,128號和第5,498,392號。
如本文中所用，“核苷”包括天然核苷，包括2’-脫氧和2’-羥基形式，例如，如Romberg和Baker，DNA Replication(DNA復制)，2ndEd.(Freeman，San Francisco，1992)中所描述。關于核苷，“類似物”包括具有修飾的堿基部分和/或修飾的糖部分的合成核苷，例如Scheit，Nucleotide Analogs(John Wiley，New York，1980)；Uhlman和Peyman，Chemical Reviews，90543-584(1990)等等中所描述的，附帶條件為它們能夠特異雜交。這些類似物包括設計成增強結合特性、降低復雜度、增加特異性等等的合成核苷。Uhlman和Peyman(上文已引用)；Crooke等人，Exp.Opin.Ther.Patents，6855-870(1996)；Mesmaeker等人，Current Opinion in Structual Biology，5343-355(1995)等等中描述了包含具有增強的雜交或抗核酸酶特性的類似物的多核苷酸。能夠提高雙鏈體穩定性的多核苷酸的示例性類型包括寡核苷酸N3’→P5’氨基磷酸酯(本文中稱為“酰胺化物”)、肽核酸(本文中稱為“PNA”)、寡-2′-O-烷基核糖核苷酸、含有C-5丙炔基嘧啶的多核苷酸、鎖核酸(LNA)，以及類似化合物。這些寡核苷酸或者可商購，或者可以使用文獻中描述的方法合成。
“聚合酶鏈式反應”或“PCR”指用于體外擴增特定DNA序列的反應，該反應通過DNA互補鏈的同時引物延伸來進行。換句話說，PCR是產生靶多核苷酸的在側翼具有引物結合位點的多個拷貝或復制物的反應，所述反應包括以下步驟的一次或多次重復(i)變性靶核酸，(ii)將引物退火至引物結合位點，和(iii)在三磷酸核苷存在下，通過核酸聚合酶延伸引物。通常，反應在溫度循環儀器中在為每一步驟優化的不同溫度間循環。具體溫度、每一步驟的持續時間以及步驟間轉變的速度依賴于本領域技術人員公知的許多因素，例如，參考文獻所列舉的McPherson etal，editors，PCRA Practical Approach(PCR實踐方法)和PCR2A PracticalApproach(PCR2實踐方法)(IRL Press，Oxford，1991和1995，依序)。例如，在使用Taq DNA聚合酶的常規PCR中，可以在＞90℃下使雙鏈靶核酸變性，在50-75℃范圍內的溫度下使引物退火，并且在72-78℃范圍內的溫度下延伸引物。術語“PCR”包括反應的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、實時PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR等等。反應體積從數百納升，例如200nL，至數百微升，例如200μL。“逆轉錄PCR”或“RT-PCR”指先進行將靶RNA轉換成互補的單鏈DNA的逆轉錄反應，然后再擴增該DNA的PCR，例如，Tecott et al，美國專利第5,168,038號，通過引用將該專利包括于此。“實時PCR”指隨著反應進行其反應產物的含量被監測的PCR，所述反應產物即擴增子。存在許多形式的實時PCR，它們的主要區別在于用來監測反應產物的檢測化學，例如，Gelfand等人，美國專利第5,210,015號(“taqman”)；Wittwer等人，美國專利第6,174,670號和第6,569,627號(插入染料)；Tyagi等人，美國專利第5,925,517號(分子燈塔)；通過引用將所述專利包括于此。用于實時PCR的檢測化學被綜述在Mackay et al，Nucleic Acids Research，301292-1305(2002)中，也通過引用將其包括于此。“嵌套PCR”指兩階段PCR，其中第一PCR的擴增子成為使用新一套引物的第二PCR的樣品，新一套引物中的至少一個結合到第一擴增子的內部位置。用在本文中時，關于嵌套擴增反應“初始引物”指用于產生第一擴增子的引物，并且“次級引物”指用于產生第二或嵌套擴增子的一種或多種引物。“多重PCR”指在同一反應混合物中多種靶序列(或單一靶序列和一種或多種參照序列)同時進行的PCR，例如，Bernard et al，Anal.Biochem.，273221-228(1999)(雙色實時PCR)。通常，對每一擴增序列使用不同的成套引物。通常，多重PCR中靶序列數目在2至10的范圍內，或者2至6，或者更典型地，2至4。
“定量PCR”指設計用來測量樣品或標本中一種或多種特定靶序列豐度的PCR。定量PCR包括所述靶序列的絕對定量和相對定量。使用可以單獨地或與靶序列一起測定的一種或多種參照序列進行定量測量。參照序列對于樣品或標本可以是內源或外源的，并且在后一種情況中，可以包含一種或多種競爭模板。典型的內源參照序列包括以下基因的轉錄物的區段β-肌動蛋白、GAPDH、β2-微球蛋白、核糖體RNA等等。定量PCR技術為本領域普通技術人員所公知，如以下通過引用包括于本文的參考文獻中所舉例的Freeman等人，Biotechniques，26112-126(1999)；Becker-Andre等人，Nucleic Acids Research，179437-9447(1989)；Zimmerman等人，Biotechniques，21268-279(1996)；Diviacco等人，Gene，1223013-3020(1992)；Becker-Andre等人，Nucleic Acids Research，179437-9446(1989)等等。
“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用且每一個均指核苷酸單體的線性聚合物。組成多核苷酸和寡核苷酸的單體能夠通過單體對單體相互作用的常規方式特異結合天然多核苷酸，例如通過Watson-Crick型堿基配對、堿基堆積、Hoogsteen或反Hoogsteen型堿基配對等等。所述單體及它們的核苷酸間鍵合物(internucleosidic linkage)可以是天然存在的或者可以是其類似物，例如天然存在或非天然存在的類似物。非天然存在類似物可以包括PNA、硫代磷酸酯核苷酸間鍵合物、含有使得能夠附著標記物的連接基團的堿基，該標記物例如熒光團或半抗原，等等。當寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶處理時，例如通過聚合酶延伸、連接酶連接等等，普通技術人員應當理解在這些情況下寡核苷酸或多核苷酸在任何或某些位置不含有核酸間鍵合物、糖部分或堿基的某些類似物。多核苷酸的大小范圍通常從幾個單體單元至幾千個單體單元，所述幾個單體單元例如5-40，此時它們通常被稱為“寡核苷酸”。當用字母(大寫或小寫)序列代表多核苷酸和寡核苷酸時，例如“ATGCCTG”，應當理解除另行指明或從上下文明顯看出外，核苷酸從左至右為5’→3’順序且“A”表示脫氧腺苷，“C”表示脫氧胞苷，“G”表示脫氧鳥苷，以及“T”表示脫氧胸苷，“I”表示脫氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另行說明，術語和原子編號習慣遵循Strachan和Read，Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss，New York，1999)中所公開的。通常多核苷酸包括由磷酸二酯鍵連接的四種天然核苷(例如，脫氧腺苷、脫氧胞苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷用于DNA或者它們的核糖對應物用于RNA)；然而，它們還可以包括非天然核苷酸類似物，例如，包括修飾的堿基、糖或核苷酸間鍵合物。本領域技術人員清楚當酶的活性要求特定的寡核苷酸或多核苷酸底物時，例如，單鏈DNA、DNA/RNA雙鏈體等等，普通技術人員能夠選擇寡核苷酸或多核苷酸底物的適當組成，特別是有來自論文的指導時，所述論文例如Sambrook等人，Molecular Cloning(分子克隆)，Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)以及類似參考文獻。
“引物”指天然或合成的寡核苷酸，其與多核苷酸模板形成雙鏈體后能夠作為核酸合成的起始點并且從其3’末端沿模板延伸，從而形成延伸的雙體。通常使用諸如DNA或RNA聚合酶等的核酸聚合酶進行引物的延伸。延伸過程中加入核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列決定。通常使用DNA聚合酶延伸引物。引物長度通常為14至40個核苷酸，或者為18至36個核苷酸。在多種核酸擴增反應中使用引物，例如，線性擴增反應使用單一引物或聚合酶鏈式反應使用兩種或多種引物。選擇引物的長度和序列用于特定應用的指南為本領域普通技術人員所公知，如以下通過引用包括于本文的參考文獻中所顯示Dieffenbach編輯，PCRPrimerA Laboratory Manual(PCR引物實驗室手冊)，2ndEdition(ColdSpring Harbor Press，New York，2003)。
“讀出值”指測量和/或檢測的、能夠被轉化為數字或數值的一個或多個參數。在某些情況中，讀出值可以指如此收集或記錄的數據的實際數字表現。例如，來自微陣列的熒光強度信號的讀出值是在該微陣列的每一雜交位點處產生的信號的地址和熒光強度；因此，所述讀出值可以以多種方法登記或儲存，例如，作為微陣列的圖象、作為數字的表等等。
關于一個分子與另一個分子的結合，“特異的”或“特異性”指所述兩個分子間識別、接觸且形成穩定復合體，以及與其它分子間顯著減少的識別、接觸和復合體形成，所述一個分子與另一個分子結合例如標記靶序列與探針的結合。一方面，關于第一分子與第二分子的結合，“特異的”指就第一分子在反應或樣品中識別另一分子并與其形成復合體的程度而言，其與第二分子形成最大數目的復合體。優選地，此最大的數目為至少50％。通常，參與特異結合事件的分子在其表面或腔中具有引起相互結合的分子之間特異識別的區域。特異結合的例子包括抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸之間形成雙鏈體或三鏈體、受體-配體相互作用等等。用在本文時，關于特異性或特異結合，“接觸”指兩個分子足夠靠近使得弱的非共價化學相互作用在分子間相互作用中占據優勢，所述非共價化學相互作用例如范德瓦爾斯力、氫鍵、堿基堆積相互作用、離子和疏水相互作用等等。
“Tm”或“解鏈溫度”指雙鏈核酸分子群半解離成單鏈的溫度。本領域公知數個計算核酸的Tm的方程式。例如，當核酸在1M NaCl水溶液中時，可以通過方程式來簡單估算Tm值。在Breslauer等人，Proc.Natl.Acad.ScL，833746-3750(1986)和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.，26227-259(1991)中可找到根據雙體形成和解離的更完全模型計算Tm的方法。
“樣品”指生物、環境、醫療或患者來源的一定數量的物質，在其中尋求靶核酸的檢測或測量。一方面，其包括標本或培養物(例如微生物培養物)。另一方面，其包括生物和環境樣品。樣品可以包括人工來源的標本。生物樣品可以是包括人在內的動物的流體、固體(例如糞便)或組織，以及液體和固體食品和飼料產品和成分，例如乳制品、蔬菜、肉類和肉類副產品，以及廢料。生物樣品可以包括從患者取得的材料，包括但不限于培養物、血液、唾液、腦脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰、精液、針吸出物等等。可以從馴養動物以及未馴化的或野生動物的全部各種家族獲得生物樣品，所述動物包括但不限于有蹄類動物、熊、魚、嚙齒類動物等等。環境樣品包括諸如表面物質、土壤、水和工業樣品等環境材料，以及從食品和乳品加工儀器、器械、設備、器具、一次性和非一次性物品得到的樣品。不應將這些例子理解為限制適用于本發明的樣品類型。術語“樣品”和“標本”可互換使用。
關于多種熒光標記物，“光譜可分辨的”指標記物熒光發射帶足夠不同，即充分不重疊，使得能夠通過標準光探測系統(例如，使用帶通濾光器和光電倍增管系統等等)根據相應標記物產生的熒光信號區分相應標記物所連接的分子標簽，例如美國專利第4,230,558、4,811,218號等等，或Wheeless等人，第21-76頁，Flow CytometryInstrumentation and DataAnalysis(流式細胞術儀器和數據分析)(Academic Press，New York，1985)中描述的系統。
附圖簡要說明

圖1A-1B說明諸如實時PCR的擴增反應的信號相對于循環次數(或反應時間)的曲線。
圖1C是用于實現本發明方法的設備的示意圖。
圖2A-2H圖示說明在使用旋轉閥門和活塞型液體泵的流體封閉反應系統中實施嵌套擴增反應。
圖3A-3C圖示說明用于實現本發明某些實施方案的可替代的反應室。
發明詳細說明本發明涉及用于進行多階段擴增反應的系統、方法和設備，特別是在流體封閉條件下。一方面，本發明的方法在流體封閉反應系統中進行，該系統允許分離一部分第一(或在前)反應混合物并且在第二(或隨后)反應混合物中將其用作樣品或標本，由此基本上避免了將兩個反應混合物簡單地混合在一起時第一反應組分對第二反應可能造成的干擾影響。此方面，本發明的系統、方法和設備可以用于任何擴增反應，該擴增反應允許基于使用嵌套引物的多階段擴增。
特別地，它們非常適合于進行兩階段或嵌套PCR和NASBA反應。以舉例的方式，下文描述了嵌套PCR和NASBA反應的基本反應條件；然而，本領域技術人員應當理解在PCR和NASBA反應中使用嵌套引物以達到更高靈敏度的相同原理可以類似地使用在其它使用一種或多種引物的擴增反應中。另一方面，本發明還提供用于兩階段RT-PCR反應的流體封閉反應系統，其中可以在沒有影響隨后PCR的RT反應的組分情況下進行第二階段PCR，例如，Sellner等人，Nucleic Acids Research，201487(1992)。另一方面，本發明提供三階段反應，其中進行逆轉錄酶反應以將一種或多種靶RNA轉化成為互補單鏈DNA，然后在兩階段擴增反應中擴增該DNA，例如逆轉錄酶-嵌套PCR，或“RT-nPCR”。
如上所述，本發明一方面提供用于進行兩步反應的設備，該設備包括a)至少形成有第一和第二通道的本體；和b)從所述本體延伸出的反應容器，該反應容器具有i)接收液體的反應室；ii)通過入口管道連接到反應室的入口；iii)通過出口管道連接到反應室的出口；以及iv)反應室中的保留部件，該保留部件被設置成當其余液體通過出口管道被移出反應室時其將一定部分的液體保留在反應室中，其中所述容器的入口連接到本體的第一管道且容器的出口連接到本體的第二管道。本發明的設備還包括與第二管道流體相通的通風口，用于從第二管道排放氣體。本發明的設備還包括用于迫使本體的第一管道中的流體流過容器的入口而進入反應室的差壓源。本發明的容器還包括i)限定反應容器側壁的剛性框架；和ii)附設于剛性框架相對側的第一和第二聚合物膜以形成反應室的相對的主要壁。所述設備的本體還包括用于混合流體樣品和反應試劑的混合室，該反應室通過第一管道連接到所述容器的入口。所述設備的本體還包括用于接收通過出口管道移出的其余液體的廢料室，該廢料室通過第二管道連接到容器的出口。所述設備的本體還包括形成于其中的i)樣品流動路徑；和ii)樣品流動路徑中的分離區，用于從流體樣品中分離需要的分析物，該分離區通過第一管道連接到容器的入口。一方面，所述本體中的分離區包括a)樣品流動路徑中的溶解室，用于溶解樣品中的細胞或病毒以從其中釋放物質；和b)置于溶解室中的至少一個固體支持物，用于捕獲待溶解的細胞或病毒。所述設備的容器包括限定反應室的許多壁，至少一個壁包含柔性片或膜，并且所述設備還包括a)用于接觸所述片或膜的至少一個熱表面；b)提高反應室中壓力的裝置，其中該室中的壓力增加足以迫使所述片或膜適應所述熱表面；以及c)用于加熱或冷卻所述表面以向室中引入溫度變化的至少一個熱元件。
所述設備的容器還包括兩個相對的主要壁和將主要壁相互連接以形成反應室的側壁，至少兩個所述側壁是透光的并且彼此成角度的偏移，并且所述設備還包括具有至少一個光源和至少一個檢測器的光學系統，該光源用于透過第一個透光的側壁向反應室中傳輸光，該檢測器用于檢測透過第二個透光的側壁從該室中發出的光。
嵌套擴增反應關于PCR，如上所述，嵌套擴增反應是多階段反應，其中在前階段的擴增子作為使用新的引物或引物對的后續階段的樣品，所述引物或引物對結合到在先產生的擴增子中至少一個內部位置。在嵌套擴增反應的每一階段中，以常規方式進行擴增反應。將單獨擴增反應連接成嵌套擴增反應的設計選擇包括(i)每一階段的循環次數或持續時間，(ii)用作第二階段反應的樣品的第一階段反應混合物的有效部分的大小，(iii)第二階段引物的內部結合位點的選擇，(iv)是否應當在每一階段中擴增參照序列，(v)是否應當在每一階段中進行相同類型的擴增反應，例如，對于兩階段嵌套擴增反應PCR-PCR、NASBA-NASBA、PCR-NASBA等等。通常嵌套擴增反應是連續PCR或連續NASBA反應，并且在常規反應條件下進行。
本發明的一方面，當PCR是嵌套擴增反應的一個階段時，PCR中的循環次數在20至40的范圍內，或者在24至36的范圍內。另一方面，循環的次數是足以產生可預定量的擴增子的次數，該擴增子又在實時信號產生化學中產生預定信號。如果嵌套擴增反應包括兩個相繼PCR，那么相繼PCR中的循環次數和其它反應條件可以相同或不同。
對于第一或在前階段反應，一方面，有效部分是足夠啟動第二階段反應的量。一方面，有效部分是足以在第二階段反應中提供每μL至少一個靶多核苷酸的目標濃度的量，或者另一方面，每μL至少10個靶多核苷酸，或者另一方面，每μL至少50個靶多核苷酸，或者另一方面，每μL至少100個靶多核苷酸，或者另一方面，每μL至少500個靶多核苷酸，或者另一方面，每μL至少1000個靶多核苷酸。另一方面，有效量是占第一階段反應混合物體積的0.5％至10％的量，或者占第一階段反應混合物體積的1％至5％的量。如下所述，在一些實施方案中，為了更準確地取出有效部分并且最小化取樣誤差，在移出或分離一部分之前稀釋第一階段反應混合物。例如，為了獲得體積為1μL的第一階段反應混合物的10％部分，可以稀釋至10μL隨后移出1μL的稀釋混合物，而不是直接移出0.1μL的未稀釋混合物。通常，第二階段擴增反應中的反應物可以與第一階段反應中的那些相同，但至少有以下例外第二階段反應中的一種或多種引物不同，但第二階段反應中引物的濃度是常規的。第一階段反應和第二階段反應中的信號產生方案可以相同或不同。
一方面，本發明提供在開環控制或閉環控制之下，自動啟動第二階段(或隨后階段)擴增反應的方法。在具有開環控制的實施方案中，第一階段擴增反應進行預定的循環次數或預定的反應時間，然后分離有效部分的反應混合物，與第二階段反應物混合，并且啟動第二階段擴增反應。在這些實施方案中，第一階段擴增子的實時監測是任選的。在具有閉環控制的實施方案中，監測第一階段擴增反應的反應參數，并且當其呈現預定值或超過預定閥值時，停止第一階段反應，并且分離有效部分的反應混合物，與第二階段反應物混合，并且啟動第二階段擴增反應。用于確定何時啟動第二階段擴增反應的反應參數可以是與反應產物的積累有明確關系的任何參數，或者換句話說，與所述第一階段反應的完成程度有明確關系的任何參數。優選地，反應參數與第一階段反應中一種或多種產物的積累有單一關系，因此參數的增加值可以與所述產物的量正相關或負相關，所述產物通常是一種或多種擴增子。反應參數可以包括但不限于反應混合物的光密度、溫度、pH、次要反應產物的濃度、擴增子濃度，后者例如基于一種或多種熒光信號、比色信號、化學發光信號、電化學發光信號或電化學信號等等。一方面，反應參數與第一階段反應中的至少一種擴增子的濃度單一相關。該擴增子可以從靶多核苷酸產生，或者從參照序列或其它內標產生。因此，在具有閉環控制的嵌套PCR中，第一階段擴增反應是實時PCR。本發明的一方面，反應參數是由熒光指示劑檢測的擴增子，該熒光指示劑的信號與反應混合物中擴增子的濃度單一相關。當樣品或標本中靶核酸的含量或質量有不同時，第二階段反應的閉環控制能夠產生更加穩定和較少變化的讀出值。
由于在一些應用中，樣品可以含有或不含有靶多核苷酸。因此，一方面，監測一種或多種參照序列或其它內標的擴增子以確定何時啟動第二階段反應。也就是，所述內標作為陽性對照和用于啟動第二階段反應的反應參數。另一方面，為了啟動第二階段反應，內標和靶多核苷酸的擴增子均必須達到或超過預定水平，所述水平可以相同或不同。
本發明的另一方面，當第一階段擴增反應是開環控制下的PCR時，在啟動第二階段反應之前進行的循環次數在20至40的范圍內，或者另一方面，在20至30的范圍內。另一方面，當在預定時間后停止第一階段擴增反應并且啟動第二階段擴增反應時，可以根據經驗選擇用于特定類型被分析樣品的預定時間。例如，在具有參照序列的樣品中，可以選擇將選定參照序列擴增至一般樣品中其平臺值的某些部分的平均時間作為預定時間，所述部分例如四分之一、三分之一、二分之一等等。
當第一階段擴增反應處于閉環控制之下時，可以使用多種方式選擇啟動第二階段反應的第一階段反應參數值。一方面，該值被確定為基線信號水平或背景噪聲數值的函數，或者被確定為描述反應混合物中一種或多種擴增子的積累的函數的特征，如圖1A和1B中所示。圖1A中，曲線(1000)和(1002)例如分別代表參照序列和靶多核苷酸的積累的擴增子，所述擴增子的積累通過由擴增子特異探針產生的兩種不同的熒光信號來確定，所述探針例如為具有在可區別波長處發出熒光的熒光染料的分子燈塔。如圖所示，這些曲線通常是S形的，每一條均具有噪聲水平或基線信號(1004)之下的低正斜率區、高正斜率的對數線性區(1010)和低正斜率的平臺區(1012)，該平臺區對應反應物被耗盡和/或干擾副產物積累時的反應階段。本發明的一方面，當靶擴增子的曲線(1002)達到或超過預定水平(1006)時，啟動第二階段反應，所述預定水平(1006)可以是基線信號(1004)的函數。另一方面，當靶擴增子曲線(1002)和參照序列曲線(1000)均達到或超過預定水平(1006)時，啟動第二階段反應。預定水平(1006)的選擇對于本領域技術人員是常規的設計選擇，其可能依賴于多種因素，例如，與在第一階段反應中的靶緊密相關的序列被擴增的可能性(即在測定中缺乏反應特異性)、樣品的質量及其對基線信號值的貢獻程度、使用的擴增反應的類型、使用的信號檢測系統等等。一方面，預定水平(1006)是基線信號值(1004)的倍數。舉例來說，預定水平(1006)可以選自基線信號值1.5至25倍的范圍。另一方面，預定水平(1006)是基線信號值的1.5倍、或基線信號值的2倍、或基線信號值的3倍、或基線信號值的5倍、或基線信號值的10倍。基線信號值可以是靠近擴增反應起始時的預定循環次數或預定時間間隔的熒光測量值的函數，例如平均值。熒光測量值可以是，或者包括，來自這種通道的信號的測量值，該通道與用于測量由被監測的擴增子產生的熒光信號的通道相同。一方面，基線信號值是至少一個擴增子增長曲線的最初10、或25、或50、或100個測量的光信號值的函數。一方面，所述函數是這些最初光信號值的算術平均值。優選地，預定水平(1006)與曲線(1002)和/或曲線(1000)在其各自的對數線性區(1010)相交。可以使用多種產生光信號的標簽來鑒定和/或測量擴增子，包括但不限于熒光指示劑、比色標簽、化學發光標簽、電化學發光標簽等等。
另一方面，可以通過如圖1B所示的描述積累的擴增子和擴增反應的循環次數或時間之間關系的曲線(本文中稱為“擴增子增長曲線”)的特征來確定啟動第二階段反應的反應參數值。如圖1A所示，曲線(1013)和曲線(1015)描述分別對應參照序列和靶多核苷酸的擴增子的積累。兩條曲線在每一個點均具有正斜率，然而，斜率的量值從反應早期到反應后期發生改變，開始時斜坡是平的，在對數線性區是陡峭的，并且在平臺區再次變平。如果取所述曲線的導數，那么產生在時間或循環數值(1019)處具有最大值的大體對稱的函數(1018)。數值(1019)為曲線(1015)的一階導數的根。數值(1019)對應曲線(1015)的斜率停止增加并且開始減小的點(1014)，也就是，其為拐點，該拐點位于對數線性區大約一半的位置，使得其成為曲線(1015)的吸引人的特征，用于確定啟動第二階段反應的信號值(1022)。另一方面，可以取曲線(1015)的二階導數以產生如曲線(1021)的另一個大體對稱的函數。曲線(1021)的根提供用于確定啟動第二階段反應的信號值的另一候選特征，所述信號值例如(1023)。McMillan等人的美國專利第6,783,934號公開了確定對應描述擴增子積累的曲線(1015)的這些特征的信號值，通過引用將該專利包括于此。如上所述，術語“擴增子增長曲線”指描述反應混合物中擴增子積累的曲線，例如曲線(1000)、(1002)、(1013)或(1015)，該曲線是循環次數或時間的函數，或者是諸如非溫度調節的擴增反應中的溫度等等相關參數的函數。應當理解，當收集組成所述曲線的數據時，在反應期間重復地計算擴增子增長曲線的特征，例如一階或二階導數。還應當理解，由于上述測定的實時性質，可能只能夠追溯既往地確定擴增子增長曲線的某些特征；因此，這些特征可能不是在每一種情況下都適合用來確定應當何時啟動第二階段擴增反應。選擇擴增子增長曲線的適合特征來確定何時啟動第二階段擴增反應對于本領域技術人員是常規設計選擇。
本發明的一方面，通過檢測對應反應參數的光信號達到或超過預設值來進行第二階段反應啟動的閉環控制。優選地，反應參數是擴增子的濃度，通常該擴增子對應靶多核苷酸。可獲得多種熒光信號產生方案用于在擴增反應中產生與擴增子濃度單一相關的熒光信號。這些熒光信號產生方案包括但不限于分子燈塔、諸如SYBR綠的插入染料、taqman探針、AmplifluorTM引物、“蝎型”引物等等，它們在上文引用的參考文獻中公開。可以使用多種儀器操作系統來進行所述基于光信號的閉環控制，所述光信號由諸如擴增子濃度的反應參數產生。如下文更充分描述的，一方面，由Christel等人的美國專利第6,369,893號公開的多通道光學檢測系統非常適于所述測量。圖1C說明了適用于本發明的所述系統的原理圖。Christel等人提供發光二極管LED(1050)至(1056)，用于照射反應室(1070)中的反應混合物。檢測器(1060)至(1066)收集由LED(1050)至(1056)激發的熒光，每一個檢測器(1060)至(1066)通常任選地與限制檢測到的光的波長的帶通濾波器關聯。LED(1050)至(1056)的激發光束可以相同或不同。一方面，選擇帶通濾波器以選擇性地通過由多種在光譜上可分辨的熒光染料所發出的熒光，使得每一個檢測器(1060)至(1066)收集只主要來自多種熒光染料之一的熒光。為了在本發明中使用，LED-檢測器對之一，例如(1052)和(1062)，被分配用來檢測來自對應靶多核苷酸的擴增子的熒光信號，并且LED-檢測器對之一，例如(1056)和(1066)，被分配用來檢測來自對應參照序列的擴增子的熒光信號。
通過微處理器(1080)控制檢測系統和流體閉合反應系統(1086)的所有組件的控制。通過常規光學處理由檢測器(1060)至(1066)收集的光信號并轉化為電信號，在經過常規的預放大和調節(1082)后，該電信號被數字化以儲存和/或由微處理器(1080)進一步處理。本發明的一方面，微處理器(1080)被編程以連續監測由諸如檢測器(1062)的檢測器之一收集的信號的數值。當該值達到或超過預編程值時，微處理器(1080)啟動向控制器(1084)提供一系列命令以開動流動閉合反應系統(1086)的組件來啟動第二階段擴增反應的子程序。微處理器(1080)還通過控制器(1088)改變和/或調節反應室(1070)的溫度。優選通過一個或多個具有耐熱元件和冷卻風扇的加熱板來完成溫度控制，所述加熱板如Chang等人的美國專利6,565,815和美國專利6,391,541中所教導的，通過引用將其公開包括于此。在使用閉環控制的實施方案中，微處理器(1080)可以以預定間隔計算諸如圖1B的(1013)和(1015)的曲線特征的值，使得它們可以與預定值相比較。當所述計算值達到或超過預定水平時，微處理器(1080)啟動子程序以開始第二階段擴增反應，如上所述。
如上所述，優選計算機進行啟動第二階段反應的方法的步驟。在一實施方案中，計算機包括處理單元、存儲器、I/O設備和用于在它們之間傳輸信息的相連的地址/數據總線結構。處理單元可以是由合適操作系統驅動的常規微處理器，包括RISC和CISC處理器，使用嵌入防火墻的專用微處理器，或定制的數字信號處理電路(DSP)，其專用于本方法的特定處理任務。存儲器可以在微處理器中，即一級緩存、快速S-RAM，即二級緩存、D-RAM或光盤或磁盤。I/O裝置可以是能夠在計算機和用戶間傳遞信息的任何裝置，例如鍵盤、鼠標、網卡等等。地址/數據總線可以是PCI總線、NU總線、ISA或任何其它類似的總線結構。當計算機進行本發明的方法時，上述方法步驟可以包含在儲存在計算機可讀產品之內或之上的程序中。所述計算機可讀產品還可以包括用于圖形用戶界面的程序和改變電泳系統或數據收集裝置的設置的程序。一方面，本發明提供控制圖1C中描述的流體封閉反應系統中的操作的算法和計算機可讀產品。
本發明的一方面，計算機可讀產品包括用來在流動封閉反應系統中控制嵌套擴增反應進行的由計算機執行的程序。在一實施方案中，所述程序包括用于以下目的的指令(a)讀取來自第一階段擴增反應的光信號的值，該光信號與第一階段擴增反應中擴增子的濃度單一相關，并且光信號的值具有最新值；(b)根據光信號的值確定基線信號水平；(c)根據光信號的值計算預定水平；(d)將光信號的預定值和最新值進行比較；(e)當光信號的最新值等于或高于預定水平就啟動第二階段反應；以及(f)重復步驟(d)和(e)直至第二階段反應被啟動。如本文中所用，關于光信號的“最新值”指對應光信號的由監測擴增反應的探測系統最新測量的值。換句話說，其為在擴增反應期間產生的擴增子增長曲線的最新值。
本發明的另一方面，計算機可讀產品包括用來在流動封閉反應系統中控制嵌套擴增反應進行的由計算機執行的程序。在一實施方案中，所述程序包括用于以下目的的指令(a)讀取來自第一階段擴增反應的光信號的值，該光信號與第一階段擴增反應中擴增子的數量或濃度相關；(b)根據光信號的值確定是否超過閥值；以及(c)如果超過閥值，就啟動第二階段擴增反應。
嵌套PCR非常適合用在上述設備中，例如當第一階段和第二階段反應均為實時PCR時。舉例來說，第一階段擴增反應可以是實時PCR，其中使用AmplifluorTM發卡引物來產生其強度與擴增子單一相關的熒光信號，例如，Whitcombe等人，Nature Biotechnology，17804-808(1999)。第二階段擴增反應可以使用相同或不同的標記方案。簡而言之，AmplifluorTM發卡引物具有靶結合部分，其選擇與常規引物相同，以及位于靶結合部分5’末端的發卡部分，只要發卡存在其就保持熒光團-淬滅劑對互相接近，由此淬滅來自熒光團的任何熒光信號。在PCR的反向延伸步驟中，隨著反向鏈穿過發卡向靶多核苷酸的末端延伸，發卡的雙鏈體部分被替代，由此從熒光團的附近移開淬滅劑使得熒光信號產生。隨著雙鏈DNA產物積累，來自反應混合物的熒光信號增加。當熒光信號的強度達到或超過預定水平時，例如三倍于基線時，停止PCR并且分離有效部分的反應混合物，然后與第二階段反應物混合。通過移出有效部分的第一反應混合物(并且因此一部分的第一擴增子)并且將其作為樣品或標本在獨立的第二反應中擴增，可以基本上排除來自第一反應組分的干擾，例如來自延伸的AmplifluorTM引物的熒光。
還可以進行嵌套NASBA反應使得在產生的與反應參數相關的信號達到或超過預定水平時啟動第二階段NASBA。NASBA反應基于逆轉錄酶(通常是鳥類成髓細胞性白血病病毒(AMV)逆轉錄酶)、RNase H和帶有兩個寡核苷酸引物的RNA聚合酶(通常是T7 RNA聚合酶)的同時存在的活性，其在常規條件下能夠在90至120分鐘內產生期望靶序列的109至1012倍的擴增。在NASBA反應中，只有當核酸是單鏈的并且含有引物結合位點時才是擴增反應的模板。因為NASBA是等溫的(通常使用上述酶在41℃進行)，如果在樣品準備過程中防止雙鏈DNA的變性，那么可以完成單鏈RNA的特異擴增。也就是，與諸如RT-PCR的其它技術不同，有可能檢測雙鏈DNA背景中的單鏈RNA目標而不得到由復雜基因組DNA造成的假陽性結果。通過使用與反應相容的熒光指示劑，例如分子燈塔，可以在進行NASBA時實時檢測擴增子。分子燈塔是莖環結構的寡核苷酸，其在一個末端帶有熒光標記而在另一個末端帶有淬滅劑，例如5’-熒光黃和3’-(4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(即3’-DABCYL)，如Tyagi和Kramer所公開的(上文已引用)。示例性的分子燈塔可以具有有六個核苷酸的互補莖鏈，例如，4個G或C和2個A或T，以及約20個核苷酸的靶特異環，使得該分子燈塔能夠與靶序列在諸如41℃的反應溫度下形成穩定的雜種分子。典型的NASBA反應混合物是80mM Tris-HCl[pH 8.5]、24mM MgCl2、140mM KCl、1.0mM DTT、每一dNTP各2.0mM、ATP和UTP和CTP各4.0mM、3.0mM GTP和30％DMSO中的1.0mMITP。引物濃度是0.1μM且分子燈塔濃度是40nM。酶混合物是375山梨糖醇、2.1μgBSA、0.08 U RNase H、32 U T7 RNA聚合酶和6.4 U AMV逆轉錄酶。反應可以包括5μL樣品、10μL NASBA反應混合物和5μL酶混合物，總反應體積為20μL。進行實時NASBA反應的更多指導在以下參考文獻中公開，通過引用將其包括于此Polstra等人，BMC InfectiousDiseases，218(2002)；Leone等人，Nucleic Acids Research，262150-2155(1998)；Gulliksen等人，Anal.Chem.，769-14(2004)；Weusten等人，NucleicAcids Research，30(6)e26(2002)；Deiman等人，Mol.Biotechnol.，20163-179(2002)。與嵌套PCR類似地進行嵌套NASBA反應；也就是，第一NASBA反應的擴增子成為使用新一套引物的第二NASBA反應的樣品，新引物中的至少一個結合到第一擴增子的內部位置。
如上所述，一方面，本發明提供在流體封閉反應系統中進行與一個或多個擴增反應相連的逆轉錄酶反應的方法。在一實施方案中，如下方式擴增一種或多種RNA序列，例如從細胞或組織樣品中提取的選定mRNA(i)在流動封閉反應系統中，使用逆轉錄酶試劑在第一反應混合物中轉錄一種或多種RNA序列以形成一種或多種互補單鏈DNA序列；(ii)在該流體封閉反應系統中分離第一有效部分的第一反應混合物；以及(iii)在該流動封閉反應系統中使用第一階段擴增試劑在第二反應混合物中擴增第一有效部分中的所述一種或多種互補單鏈DNA序列以形成一種或多種第一擴增子，所述第一階段擴增試劑包括針對每一種互補單鏈DNA序列的初始引物。使用常規逆轉錄酶反應來進行轉錄的步驟，常規逆轉錄酶反應的組分，即逆轉錄酶試劑容易購得，例如，Ambion。大體上，在本實施方案中，以與如上所述的嵌套PCR中的第一階段擴增反應類似地處理逆轉錄反應。也就是，分離有效部分(第一有效部分)的逆轉錄酶反應混合物，優選通過將所述部分保留在反應室中，而棄去其余混合物。在本實施方案中，所述第一有效部分指含有足夠量的互補單鏈DNA的部分，所述DNA可以被隨后的擴增反應所檢測。因此，以上給出的有效部分的定義適用于本實施方案中的第一有效部分。如上所述，上述兩階段反應之后可以跟隨有第三階段嵌套擴增。通過以下附加步驟進行本方法的此方面(i)在所述流體封閉反應系統中分離第二有效部分的所述第二反應混合物；以及(ii)在所述流動封閉反應系統中，使用第二階段擴增試劑在第三反應混合物中擴增所述第二有效部分中的所述一種或多種第一擴增子以形成一種或多種第二擴增子，所述第二階段擴增試劑包括針對所述一種或多種第一擴增子中每一種的至少一種次級引物，使得每一種次級引物相對于所述第一擴增子的所述初始引物嵌套在所述第一擴增子中。優選地，本發明的上述方面作為在流體封閉反應系統中的RT-nPCR來進行。
實現本發明方法的系統可以通過多種系統和設備來實現本發明的方法，所述系統和設備基于用來隔離試劑、將試劑和反應產物移入或移出反應、控制溫度和檢測反應產物的不同工程方法。系統的選擇依賴于許多因素，包括但不限于樣品或標本的可獲得性、樣品或標本的形式、樣品或標本引起的危險或傳染性的程度、便攜的愿望、使用的擴增反應的性質等等。可以用來實現本發明方法的示例性系統包括流體封閉反應系統，其使用微處理器控制下的回轉閥和活塞型流體泵，例如Christel等人的美國專利第6,369,893號和Dority的美國專利第6,374,684號所公開的；具有柔性試劑容器的封閉的一次性小管，用于機械地驅動樣品、反應物和產物通過反應室和檢測點，如Schnipelsky等人的美國專利第5,229,297號和Findlay等人，Clin.Chem.，391927-1933(1993)所公開的；以及微流裝置，例如在定義部分引用的參考文獻中所公開的，以及Shoji等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，4121-34(1993)和J.Micromech.Microeng.，4157-171(1994)；McCormick等人，Anal.Chem.，692626-2630(1997)；Cheng等人，Topics Curr.Chem.，194215-231(1998)；Stave等人，美國專利第6,663,833號；Neri等人，美國專利第5,714,380號；Northrup等人，美國專利第5,589,136號等等所進一步公開的。所述系統能夠在容器和反應室之間以可控的方式以流體形式轉移反應物、樣品和產物。也就是，所述系統以直接的方式在液體動力作用下移動液體溶液中的反應物、樣品、反應產物等等。液體動力包括通過各種泵或壓縮氣體容器、電磁泵等等所產生的壓差。
一方面，可以通過Dority(上文已引用)中總體公開的回轉閥、反應物及廢料容器和反應室的特定設計和操作方法方便地實現本發明的方法。另一方面，當需要實時監測擴增產物時，所述設備方便地與Christel等人(上文已引用)公開的溫度控制器和熒光計一起使用。如下文將要詳細描述的，還可以使用Christel等人的設備以提供在Dority的流體封閉反應系統中啟動第二階段反應的閉環控制。
圖2A-2I顯示遵循Dority(上文引用)中公開的一般設計方法的設備的概略操作，該設備使得能夠部分地清空反應室以在反應室中保留有效部分的第一反應混合物用作第二擴增反應的樣品。通過電控制被活塞型泵置換的體積來實現所述部分清空。或者，如下文所述，可以通過反應室的其它設計來被動地進行反應室的部分清空，其中容器的“死體積”定義有效部分并且允許活塞型泵運行全沖程。
圖2A顯示包含回轉閥(2002)的殼(2000)，該回轉閥(2002)具有可操作地與活塞型泵(2006)相連的內室(2004)。泵(2006)的活塞(2056)的上行程使內室(2004)增壓并且迫使流體內容物通過可能與容器等等相連的任何端口流出；類似地，泵(2006)的活塞(2056)的下行程使內室(2004)減壓并且通過可能開放并與容器等等相連的任何端口吸入流體。Dority(上文已引用)提供了對所述泵-回轉閥裝置的操作和結構以及使用內室(2004)進行樣品制備的更多描述，為此目的通過引用將其包括于此。回轉閥(2002)具有多個端口，例如(2050)和(2052)，以及相關通道(2008)和(2012)，只要所述端口與通向所述容器或反應室(2042)的通道的相應端口對準，那么其允許內室(2004)與多個容器(下文更詳細描述)或反應室(2042)流體相通。在該示例性實施方案中，所述相關通道的縱軸徑向地置于回轉閥(2002)的與回轉閥(2002)的軸相垂直的一個或兩個平面中(以虛線(2048)和(2049)表示)，以至于可以將內室(2004)設置成與通向置于殼(2000)中的容器等等的通道的端口流體相通。回轉閥(2002)還包括連接通道(2010)，其允許所述閥的一個平面中的端口被置于與殼(2000)的端口流體相通，而該殼(2000)的端口與回轉閥(2002)的另一個平面對準。所述連接通道(2010)不允許與內室(2004)流體相通。如圖2A中所示，當所述連接通道(2020)在(2046)處對準通道(2044)和(2016)的端口時，通道(2044)和(2016)流體相通。類似地，當所述連接通道(2020)在(2038)處對準通道(2040)和(2036)的端口時，通道(2040)和(2036)流體相通。在圖2A-2I和3A-3I中，殼(2000)中交叉的通道和容器位于回轉閥(2002)的泵近側平面，而非交叉的通道和容器位于泵遠側平面。如上所述，回轉閥(2002)可以使內室(2004)與通過通道相連的、在回轉閥(2002)在其中旋轉的殼(2000)的基座中有端口的多種容器和反應室(2042)流體相通。在本實例中，所述容器包括以下(i)含有第一階段擴增試劑的容器(2014)，其可以通過通道(2016)與回轉閥(2002)以流體形式相連；(ii)含有例如用于破裂細胞樣品的表面膜的溶解試劑的容器(2018)，其可以通過通道(2020)與回轉閥(2002)以流體形式相連；(iii)含有樣品或標本材料的容器(2022)，其可以通過通道(2024)與回轉閥(2002)以流體形式相連；(iv)含有洗滌試劑的容器(2026)，其可以通過通道(2028)與回轉閥(2002)以流體形式相連；(v)廢料容器(2030)，其可以通過通道(2032)與回轉閥(2002)以流體形式相連；以及(vi)含有第二階段擴增試劑的容器(2034)，其可以通過通道(2036)與回轉閥(2002)以流體形式相連。
圖2B至2H說明圖2A的設備用于在流體封閉條件下進行兩階段擴增反應的運轉。為了說明回轉閥(2002)的特定實施方案是如何運作的，圖2B至2H中的每一幅均圖解顯示被劃分成32個部分的回轉閥(2002)，所述部分被編號。回轉閥(2002)的每一編號部分毗鄰的是殼(2000)的基座中的相應位置，其也被編號。編號32僅僅是反映回轉閥(2002)在容器和室的復雜系統中提供互連以及其它能力的設計選擇。在回轉閥(2002)的起始位置，兩套編碼每一相鄰部分的編號相同，如圖2B所示。回轉閥(2002)的某些編號(“內部編號”)以圓圈標出(1、5、14、28)，并且與回轉閥(2002)相鄰并在其之外的某些編號(“外部編號”)以圓圈標出(1、6、8、21、30、31)。圓圈表明通向各個容器和室的端口所在的部分。帶有內部陰影的圓圈，例如5、6和8，表明位于回轉閥(2002)的“泵近端”平面(2049)中的端口，而無陰影的圓圈，例如1、21、30和31，表明位于回轉閥(2002)的“泵遠端”平面(2048)中的端口。分別位于部分14和28的內部帶點的圓圈(2126)和(2124)表明連接通道(2010)。在圖2B中，回轉閥(2002)以起始位置顯示，其中閥的端口1(2108)對準殼(2000)的端口1使得樣品容器(2022)與內室(2004)流體相通，可以在內室中進行樣品制備過程。當泵(2006)下行時，通過由通道(2024)、端口(2106)和(2108)以及通道(2012)所限定的路徑吸取樣品以注入(2104)內室(2104)。可以如圖2C和2D所示地進行清洗步驟。簡而言之，在圖2C中，旋轉回轉閥(2002)使得部分5的端口(2128)對準殼(2000)的端口6(2110)，使得當活塞(2056)下行時，容器(2026)中的洗滌溶液被吸取(2200)(和(2204))至內室(2004)中。通過旋轉回轉閥(2002)使得端口5(2128)對準殼(2000)的端口8，使得內室(2004)和廢料容器(2030)流體相通，可以通過活塞(2056)的上行將內室(2004)中的洗滌溶液排出(2202)至廢料容器(2030)中。
對于含有完整細胞的樣品，可以向內室(2004)中加入溶解細胞表面膜的試劑以產生溶胞產物，可以根據需要進一步洗滌該溶胞產物。在圖2D中，旋轉回轉閥(2002)使閥的端口1(2108)對準殼(2000)的端口31(2114)，由此使內室(2004)與容器(2018)流體相通。活塞(2056)的下行會將溶解試劑從容器(2018)吸取(2300)至內室中(2302)。在溶解試劑中孵育后，樣品可任選地進一步洗滌，如上所述。在孵育后，或者在孵育和進一步洗滌后，旋轉回轉閥(2002)使端口1(2108)對準殼(2000)的通道(2016)(在部分30處)的端口，使得通過活塞(2056)的上行迫使內室(2004)中的溶胞產物通過端口1和30、通道(2016)進入容器(2014)，在其中其與第一階段擴增試劑混合。沒有進入通道(2044)的流動，因為在端口1和通道(2044)的端口之間沒有流體形式的連接，因為一個位于回轉閥(2002)的泵近端平面(圖2A中的2049)，而另一個位于回轉閥(2002)的泵遠端平面(圖2A中的2048)。在樣品材料與第一階段擴增試劑混合后，轉移混合物至反應室(2042)中。如圖2F中所示，可以通過旋轉回轉閥(2002)使得端口5(2128)對準與反應室(2042)流體相同的通道(2040)的端口以及使得連接通道14(2126)在部分30(2112)處對準通道(2026)和(2044)的端口。當活塞(2056)下行時，反應混合物通過通道(2106)、連接通道14和通道(2044)從容器(2014)被吸取(2500)至反應室(2042)中，在反應室(2042)中進行第一階段擴增反應，例如使用如Christel等人(上文已引用)所教導的監測光學的實時PCR。依照另一實施方案，只簡單地將第一階段擴增試劑放置在反應室(2042)中以至于不需要第一反應物容器(2014)，并且以流體形式將樣品材料轉移至反應室中，在反應室中其與第一階段擴增試劑混合以形成第一反應混合物。
在反應室中進行第一階段擴增反應以產生第一擴增子。在停止第一階段擴增反應并且(任選地)通過排空至廢料容器(2030)將活塞(2056)帶到接近回轉閥(2002)后，可以通過活塞(2056)的部分下行將大部分反應混合物移出室(2042)，其中通過在計算機控制下進行活塞(2056)的下行來預先確定保留在反應室(2042)中的反應混合物(2600)的量。選擇保留的量以有效進行多階段反應的下一階段；因此，可能需要常規實驗來確定特定實施方案中的實際體積。在所述部分移出之后，如圖2H中所示，旋轉回轉閥(2002)使得端口5(2128)對準通道(2044)的端口，并且使得連接通道在部分21(2504)處對準通道(2040)和(2036)的端口。按此結構，在含有第二階段擴增試劑的容器(2034)和內室(2004)之間沿以下路徑流體相通通道(2036)、連接通道28(2124)、通道(2040)、反應室(2042)和通道(2044)。當活塞(2056)下行時，第二階段反應試劑從容器(2034)中被吸取(2700)并且進入反應室(2042)，在其中進行第二階段擴增，有效部分的擴增子(2600)作為樣品。
如圖3A中所示，作為使用部分泵沖程以確定保留在反應室(2042)中用于第二階段擴增的反應混合物(因此為有效部分)的體積的另一選擇，可以通過使用含有預定大小的“死體積”的反應室(2042)來被動地控制體積。這可以通過沿反應室(2042)的壁移動通道(2040)的反應室端口至更高位置來實現此目的，使得當通過通道(2040)排出反應混合物時，反應混合物的一部分(2804)在反應室(2042)的底部(2805)留在室(2042)中。在要求可靠性的和不能容忍由于電元件或軟件故障造成中斷的應用中特別需要這樣的被動控制。一方面，本發明提供具有死體積的反應室(2042)，該死體積用于收集有效部分的反應混合物作為第二階段擴增反應的樣品。或者，如圖3B所示，可以向反應室加入例如保留壁的保留部件(2852)，而不改變通道(2040)的設計。在此實施方案中，當通過通道(2040)排出反應混合物而降低流體水平(2850)時，在反應室中保留一定體積(2858)(本文中稱為“保留體積”)。未被保留部件(2852)保留的流體以流體形式通過通道(2040)被轉移出反應室至廢料室，直至除保留部件(2852)所保留的之外基本上沒有流體保留在反應室中。
本發明的一方面，提供與本發明設備和方法一起使用的反應容器。圖3C圖解說明了所述反應容器的一個實施方案。最通常地，反應容器(2874)包含用于容納諸如反應混合物的液體的反應室(2876)、通過入口管道(2882)連接到反應室(2876)的入口(2878)、通過出口管道(2884)連接到反應室(2876)的出口(2880)以及反應室(2876)中的保留部件(2852)，該保留部件(2852)被放置為當通過出口(2880)和出口管道(2884)排空反應室(2876)時，其保留一定體積的液體。在一實施方案中，反應容器(2874)包括限定反應室(2876)的側壁的剛性框架(2900)，所述測壁包括側壁(2886)和(2888)，其每一個均透光并且互相成角度地偏移，由此允許對反應室(2876)中的熒光指示劑進行照射以及收集由它們產生的熒光信號。在上文更充分描述的優選實施方案中，通過側壁(2886)或(2888)中之一照射發光反應室(2876)中的熒光指示劑，并且通過另一側壁(2886)或(2888)收集熒光信號。通過分別向所述框架的相對側密封地附設第一和第二塑料膜(2870)和(2872)，從剛性框架(2900)形成流體密封的反應室(2876)。因此，當附設后，第一和第二塑料膜(2870)和(2872)分別形成反應室(2876)的第一和第二主要壁。優選地，塑料膜(2870)和(2872)具有足夠的柔性以適應熱表面，以允許足夠的熱傳導用于精確調節室(2876)內的溫度。反應室(2876)具有深度(進入圖3C中附圖的平面的維度)和寬度(2902)，其中在圖解的實施方案中，寬度(2902)是反應室(2876)主要壁的表面區域的測量。所述反應容器的一方面，選擇寬度(2902)和反應室(2876)的深度以使其具有大的表面-體積比，用于快速加熱或冷卻反應室(2876)的內容物。在一實施方案中，寬度(2902)和反應室(2876)的深度具有約41的比例且反應室的深度(2902)小于2mm。
內標經常需要比較來自不同測定的讀出值，例如，當試圖確定患者標本中測量的靶基因表達水平是否在正常范圍內時。特別在醫學應用中，經常需要將來自患者樣品的測定結果與來自參照樣品的測定結果進行比較。通過確定靶多核苷酸相關信號和來自同一樣品的參照序列相關信號的比率，容易進行所述比較。這使得能夠將靶多核苷酸的值與來自其它樣品或標本的值相比較。內標，尤其是參照序列的使用和選擇為本領域普通技術人員所公知，并且反映在以下參考文獻中，通過引用將它們包括于本文Rasonic等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，313856-862(2004)；Bustin，J.Mol.Endoccrinol.，2923-39(2002)；Hoorfar等人，J.Clin.Microbiol.，421863-1968(2004)；等等。應當理解與參照序列相關的信號或值還可以是從多個參照序列測量的信號或值的函數，例如平均值。
本發明的一方面，通過以下方法來提供靶多核苷酸的所述相對值在第一階段擴增反應中擴增參照序列和靶多核苷酸，在第二階段擴增反應中只擴增靶多核苷酸的擴增子，并且形成比率，其每一個包含來自第二擴增反應中的靶多核苷酸的擴增子的信號對來自第一擴增反應中的參照序列的擴增子的信號。本發明的此方面特別適用于比較來自不同樣品的很少或非常低水平的靶多核苷酸的水平。在這樣的情況中，通常參照序列遠比靶多核苷酸多；因此，如果兩個序列都經歷兩個階段的擴增，即使各自信號甚至輕微重疊，參照序列信號可能很容易壓倒靶多核苷酸信號，有機熒光燃料的發光帶就是如此。因此，在此方面的一個實施方案中，通過進行嵌套PCR來提供測量多個樣品中靶多核苷酸的相對數量的方法，其中(i)在第一階段PCR中但不在第二階段PCR中擴增參照序列以及(ii)從以下兩個測量的比值來確定靶多核苷酸的相對量來自第二階段PCR中從靶多核苷酸產生的擴增子的熒光信號，和來自第一階段PCR中從參照序列產生的擴增子的熒光信號。在一優選實施方案中，第一階段和第二階段反應均為實時PCR。在此方面的另一實施方案中，提供通過進行嵌套NASBA反應來測量多個樣品中靶多核苷酸的相對量的方法，其中(i)在第一階段NASBA中但不在第二階段NASBA中擴增參照序列以及(ii)從以下兩個測量的比值來確定靶多核苷酸的相對量來自第二階段NASBA中從靶多核苷酸產生的擴增子的熒光信號，和來自第一階段NASBA中從參照序列產生的擴增子的熒光信號。在一優選實施方案中，第一階段和第二階段反應均為實時NASBA反應。在以上描述的兩個方法中，均可以通過監測第一階段PCR或NASBA中的光信號來啟動第二階段反應。一方面，所述光信號提供了對參照序列或靶多核苷酸或二者的擴增子含量的測量。一方面，當所述光信號達到或超過為基線信號水平1.5至10倍范圍內的預定水平時可以啟動第二階段反應。另一方面，當所述光信號達到或超過預定水平時可以啟動第二階段反應，該預定水平對應于參照序列的擴增子增長曲線的根或二階導數。
內標或參照序列類型的選擇依賴于被分析樣品的性質。對于包括哺乳動物細胞或組織的樣品，表1列出了示例性參照序列。
表1示例性參照序列
樣品或標本制備用于本發明的含有靶多核苷酸的樣品或標本可以來自多種來源，包括細胞培養物、動物或植物組織、患者活組織檢查、環境樣品等等。使用常規技術制備樣品用于本發明的測定，所述技術通常依賴于取得樣品或標本的來源。
收集樣品或標本應最大程度地減小樣品或標本被外源成分污染的機會或樣品或標本污染周圍環境的機會(如果其含有危險成分)。通常，通過將諸如組織、血液、唾液等等的用于分析的樣品直接引入封閉流體系統中的收集室來進行。通常，可以通過將樣品通過可密封的開口直接注射入樣品收集室中來達到防止樣品的交叉污染，所述開口例如為注射閥或隔膜。通常，優選注射閥以減少在樣品注射期間或之后任何泄漏的潛在威脅。除上述之外，所述裝置的樣品收集部分還可以包括用于中和感染劑、穩定樣品或標本、pH調節等等的試劑和/或處理。穩定和pH調節處理可以包括，例如，引入肝素以防止血液樣品的凝集、加入緩沖劑、加入蛋白酶或核酸酶抑制劑、防腐劑等等。一般可以將所述試劑儲存在所述裝置的樣品收集室中，或者可以儲存在單獨的可及的室中，其中當向所述裝置中引入樣品時可以加入所述試劑或與樣品混合。根據使用的特定試劑的性質和穩定性，可以以液體或低壓凍干的形式將這些試劑包括在所述裝置中。
在對樣品進行擴增反應之前，經常需要對樣品進行一種或多種樣品制備操作。通常，這些樣品制備操作包括提取細胞內物質的操作，例如從完整細胞的樣品、病毒等等中提取核酸。可以容易地將這些多種操作中的一種或多種包括到本發明設想的流體封閉系統中。
對于分析完整細胞、病毒或其它組織樣品的那些實施方案，在繼續多種樣品制備操作之前，通常需要從細胞或病毒中提取核酸。因此，收集樣品后，可以從收集的細胞、病毒外殼等等中釋放核酸至粗提物中，然后進行其它處理以制備用于隨后操作的樣品，例如變性污染(DNA結合)蛋白、純化、過濾、脫鹽等等。通常可以通過化學、物理或電解溶解方法來進行從樣品細胞或病毒中釋放核酸以及DNA結合蛋白的變性。例如，化學方法通常使用溶解劑破壞細胞并且從細胞中提取核酸，然后通過用諸如異硫氰酸胍或脲的離液鹽(chaotropic salt)處理提取物來變性任何污染和潛在干擾蛋白質。通常，使用化學提取和/或變性方法時，可以將適當的試劑包括在作為單獨的可及的室的樣品制備室中，或者可以從外部加入。
可以使用物理方法來提取核酸和變性DNA結合蛋白質。Wilding等人的美國專利第5,304,487號討論了使用在顯微管道內的物理突出物或在室或管道中的邊緣鋒利的顆粒來刺穿膜且提取它們的內容物，為了所有目的通過引用將所述專利整體包括于此。所述結構和用于振蕩的壓電元件的組合能夠提供用于溶解的合適剪切力。下文關于核酸破碎的部分更加詳細地描述所述元件。還可以使用更加傳統的細胞提取方法，例如，使用具有受限橫截面大小的通道，其當樣品以足夠的流動壓力通過該通道時造成細胞溶解。或者，可以通過向樣品施加交流電流來進行細胞提取和污染蛋白質的變性。更具體地，當對流體流動橫向施加交流電流時，使細胞樣品流過顯微管陣列。可以在本發明的裝置中使用各種其它方法來進行細胞溶解/提取，例如包括使細胞經受超聲振蕩，或者迫使細胞通過小孔，由此使細胞接受高剪切壓力而造成破裂。
提取后，經常需要將核酸與粗提物中的諸如變性蛋白質、細胞膜顆粒、鹽等等的其它成分分離。通常通過過濾、絮凝等等來完成除去顆粒物質。可以容易地將多種過濾器類型包括在所述裝置中。此外，當使用化學變性方法時，可能需要在繼續下一步驟之前使樣品脫鹽。一般可以在同一步驟中進行樣品的脫鹽和核酸的分離，例如，通過將核酸結合到固定相上并且洗去污染鹽類或對樣品進行凝膠過濾層析、使鹽類通過透析膜等等。用于核酸結合的合適固體支持物例如包括硅藻土、硅石(即玻璃絨)等等。還可以將也為本領域公知的合適的凝膠排阻介質包括到本發明的裝置中，所述凝膠排阻介質可以從例如Pharmacia和Sigma Chemical購得。
可以在額外的室中進行所述分離和/或凝膠過濾/脫鹽，或者，可以將特定層析介質包括在通向隨后反應室的管道或流體通道中。或者，一個或多個流體通道或室的內表面自身可以被衍生以提供適合所需純化的官能團，例如，帶電基團、親和結合基團等等，即用于mRNA純化的多聚T寡核苷酸。或者，脫鹽方法一般可以利用DNA與其它成分相比較高的電泳淌度和負電荷。電泳方法還可以被用在從其它細胞污染物和碎片中純化核酸中。在一個例子中，所述裝置的分離管道或室與兩個單獨的在其中放置有諸如鉑電極的電極的“場”管道或室流體相通。使用適當屏障或“俘獲膜”將所述兩個場管道與分離管道分開，所述屏障或“俘獲膜”允許電流通過而不允許核酸或其它大分子通過。所述屏障一般具有兩個基本功能第一，該屏障用來將向正極遷移的核酸保留在分離室中；以及第二，該屏障防止電極處與電解相關的副作用進入反應室(例如，作為鹽接界(salt junction))。所示屏障例如可以包括透析膜、稠密膠(densegel)、PEI濾器或其它合適材料。一旦施加適當電場，樣品中的核酸將會向正電極遷移并且被俘獲膜捕獲。樣品雜質不與膜結合，然后通過使用適當的流體流被從容器中洗去。一旦電壓逆轉，核酸以顯著更純的形式從膜上釋放。場通道可以被設置在分離室或通道的相同或相對側或末端，還可以與本文中描述的混合元件聯合使用，以保證操作的最大效率。此外，還可以在屏障上覆蓋粗過濾器以防止屏障被顆粒物質、蛋白質或核酸淤塞，由此使得能夠重復使用。在類似方面，核酸的高電泳淌度及其負電荷可以被用來從污染物中分離核酸，該分離通過使用短的凝膠柱或其它適當基質或凝膠來進行，它們減慢或拖延其它污染物的流動而允許更快的核酸通過。
對于許多應用，可能需要從細胞、細胞碎片和其它污染物中提取和分離信使RNA。因此，在一些情況中，本發明的系統可以包括mRNA純化室或管道。通常，所述純化利用mRNA的多聚A尾部。具體地，如上所述可以將多聚T寡核苷酸固定在所述裝置的室或管道之內作為mRNA的親和配體。可以將多聚T寡核苷酸固定在被包括在室或管道之內的固體支持物上，或者，可以被固定在室或管道本身的表面上。
在一些應用中，例如測量來自患者血液的稀少轉移細胞中的靶多核苷酸，可以在進行分析之前進行富集步驟，例如通過免疫磁分離。可以使用諸如在以下代表性參考文獻中公開的多種本領域已知的技術和材料來進行所述分離或富集，通過引用將所述文獻包括于此Terstappen等人，美國專利第6,365,362號；Terstappen等人，美國專利第5,646,001號；Rohr等人，美國專利第5,998,224號；Kausch等人，美國專利第5,665,582號；Kresse等人，美國專利第6,048,515號；Kausch等人，美國專利第5,508,164號；Miltenyi等人，美國專利第5,691,208號；Molday，美國專利第4,452,773號；Kronick，美國專利第4,375,407號；Radbiruch等人，第23章，Methodsin Cell Biology(細胞生物學方法)，Vol，42(Academic Press，New York，1994)；Uhlen等人，Advances in Biomagnetic Separation(生物磁分離進展)(Eaton Publishing，Natick，1994)；Safarik等人，J.Chromatography B，72233-53(1999)；Miltenyi等人，Cytometry，11231-238(1990)；Nakamura等人，Biotechnol.Prog.，171145-1155(2001)；Moreno等人，Urology，58386-392(2001)；Racila等人，Proc.Natl.Acad.ScL，954589-4594(1998)；Zigeuner等人，J.Urology，169701-705(2003)；Ghossein等人，Seminarsin Surgical Oncology，20304-311(2001)。
用來實施本發明的優選磁性顆粒是具有膠體行為的顆粒。這些顆粒的特征為它們的亞微米粒度，其通常小于約200納米(nm)(0.20微米)，以及這些顆粒對從溶液中重力分離的長時間穩定性。除許多其它優點外，此大小范圍使得它們對于常規應用于細胞分析的分析技術來說基本上不可見。考慮在本發明中使用90-150nm范圍內且具有70-90％磁性物質的顆粒。合適的磁性顆粒由被分子包圍的超順磁材料的晶體核組成，所述分子通過例如物理吸附或共價結合與磁性核結合并且賦予穩定膠體特性。應當優選以有效防止樣品中生物大分子和磁性核之間的非特異性相互作用的量來使用包被材料。所述生物大分子可以包括非靶細胞表面的唾液酸殘基、凝集素、糖蛋白以及其它膜成分。此外，所述材料應當含有盡可能多的磁性物質/納米顆粒。構成核的磁性晶體的尺寸足夠小以使得它們不含有完整的磁疇。納米顆粒的尺寸足夠小使得它們的布朗能超過它們的磁矩。結果，甚至在中等強度的磁場中也不發生這些膠體磁性顆粒的北極、南極排列和隨后的相互吸引/排斥，對它們的溶液穩定性作出貢獻。最后，應當能夠在高磁性梯度外部場分離器中分離所述磁性顆粒。該特征有助于樣品處理且提供相對于裝有鐵磁珠或鋼棉的更加復雜的內部梯度柱的經濟優勢。具有上述特征的磁性顆粒可以通過修飾原材料來制備，如美國專利第4,795,698號、第5,597,531號和第5,698,271號中描述的，通過引用將所述專利包括于此。
如上所述，可以從廣泛的來源取得用于使用本發明檢測或定量靶多核苷酸的樣品或標本。示例性靶多核苷酸包括但不限于來自病毒、細菌、真菌、原生動物和哺乳動物的核酸。特別地，哺乳動物核酸包括癌癥基因，例如p53、ATP、Her 1(EGFR)、BCR-ABL、PTEN、BRAF、BRCA1、Grb7、拓撲異構酶IIα等等。表II列出了含有可以檢測和/或定量的示例性病毒和細菌。對于本領域普通技術人員，從表II的有機體中選擇靶多核苷酸是常規設計選擇。
表II示例性病毒和細菌
權利要求
1.控制嵌套擴增反應的方法，所述方法包括如下步驟在第一階段擴增反應中，在反應混合物中存在有熒光指示劑情況下擴增靶多核苷酸，所述熒光指示劑能夠產生與所述第一階段擴增反應中的擴增子的數量相關的光信號；監測所述第一階段擴增反應中的熒光指示劑的光信號；以及當所述光信號達到或超過閾水平時，自動分離有效部分的所述第一階段擴增反應的反應混合物，并且啟動第二階段擴增反應。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述第一階段擴增反應的反應混合物處于流體封閉反應系統的第一反應室中，并且其中所述自動分離步驟包括以流體形式將所述有效部分的所述第一階段反應混合物轉移至第二反應室。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述第一階段擴增反應的所述反應混合物處于流體封閉反應系統的第一反應室中，并且其中所述自動分離步驟包括，除了保留在所述第一反應室中的有效部分外，以流體形式將所述第一階段反應混合物轉移至廢料容器。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述第一反應室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得當所述第一階段反應混合物以流體形式通過所述出口被轉移至所述廢料容器時，一定體積的所述第一階段反應混合物被保留在所述第一反應室中所述出口之下。
5.如權利要求4所述的方法，其中保留在所述第一反應室中的所述體積包括所述有效部分。
6.如權利要求3所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少1分子所述擴增子的一定體積的所述反應混合物。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述擴增子的一定體積的所述反應混合物。
8.如權利要求3所述的方法，其中所述反應混合物具有一定體積并且其中所述有效部分是所述反應混合物的體積百分比，所述百分比選自0.5％至10％的范圍。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述閾水平是基線信號水平的倍數，所述倍數選自1.5至25的范圍。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述閾水平對應由所述光信號確定的增長曲線的最大、最小或零值。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述熒光指示劑選自特異結合雙鏈DNA的插入染料或者包含特異結合擴增產物的寡核苷酸部分。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述擴增子通過在所述第一階段擴增反應中擴增參照序列而產生。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述擴增子通過在所述第一階段擴增反應中擴增靶多核苷酸而產生。
14.檢測樣品中是否存在一種或多種靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟在流體封閉反應系統中，使用第一階段擴增試劑在第一反應混合物中從樣品擴增一種或多種靶多核苷酸，以形成一種或多種第一擴增子，所述第一階段擴增試劑包括針對每一靶多核苷酸的初始引物；在所述流體封閉反應系統中分離有效部分的所述第一階段反應混合物；在所述流體封閉系統中，使用第二階段擴增試劑在第二反應混合物中擴增所述有效部分中的一種或多種第一擴增子以形成一種或多種第二擴增子，所述第二階段擴增試劑包括針對所述一種或多種第一擴增子每一種的至少一種次級引物，使得每一種次級引物相對于所述第一擴增子的初始引物均嵌套在所述第一擴增子中；以及檢測所述一種或多種第二擴增子以確定所述樣品中是否存在所述一種或多種靶多核苷酸。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述第一反應混合物處于流體封閉反應系統的第一反應室中，并且其中所述分離步驟包括以流體形式將所述有效部分的所述第一反應混合物轉移至第二反應室。
16.如權利要求14所述的方法，其中所述第一反應混合物處于流體封閉反應系統的第一反應室中，并且其中所述分離步驟包括，除了保留在所述第一反應室中的有效部分外，以流體形式將所述第一反應混合物轉移至廢料容器。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述第一反應室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得當所述第一階段反應混合物以流體形式通過所述出口被轉移至所述廢料容器時，一定體積的所述第一階段反應混合物被保留在所述第一反應室中所述出口之下。
18.如權利要求17所述的方法，其中保留在所述第一反應室中的所述體積包括所述有效部分。
19.如權利要求16所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少1分子所述擴增子的一定體積的所述反應混合物。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述擴增子的一定體積的所述反應混合物。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述反應混合物具有一定體積并且其中所述有效部分是所述反應混合物的體積百分比，所述百分比選自0.5％至10％的范圍。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述分離步驟包括以下步驟監測來自與所述第一反應混合物中所述一種或多種擴增子的一種相關的熒光指示劑的光信號，所述光信號與所述擴增子的數量單一相關；以及當所述光信號等于或高于預定水平時自動分離所述有效部分的所述第一反應混合物。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述預定水平是基線信號水平的倍數，所述倍數選自1.5至25的范圍。
24.如權利要求16至23中任一權利要求所述的方法，其中所述第一階段擴增試劑和所述第二階段擴增試劑包括用于進行聚合酶鏈式反應或NASBA反應的試劑。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述熒光指示劑選自特異結合雙鏈DNA的插入染料或者包含特異結合所述第一反應混合物中的擴增產物的寡核苷酸部分。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述一種或多種擴增子的所述一種通過在所述第一擴增反應混合物中擴增參照序列而產生。
27.如權利要求24所述的方法，其中所述流體封閉反應系統是微流裝置。
28.如權利要求24所述的方法，其中所述流體封閉反應系統包括反應室，其與含有所述樣品的樣品容器、含有第一階段擴增試劑的第一反應物容器以及含有第二階段擴增試劑的第二反應物容器可選擇地流體相通，每一所述容器均為流體封閉的；以及與回轉閥可操作地連接的泵，用于將所述樣品和所述第一階段擴增試劑以流體形式轉移至所述反應室，用于當所述光信號等于或高于所述預定水平時自動分離所述有效部分的所述第一反應混合物；以及用于將所述第二階段擴增試劑以流體形式轉移至所述反應室用于擴增所述有效部分中的所述一種或多種第一擴增子。
29.檢測樣品中是否存在一種或多種靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟提供反應室，所述反應室與廢料容器、含有樣品的樣品容器、含有第一階段擴增試劑的第一反應物容器以及含有第二階段擴增試劑的第二反應物容器可選擇地流體相通，每一所述容器均為流體封閉的；以及將樣品從所述樣品容器以及將第一階段擴增試劑從所述第一反應物容器以流體形式轉移至所述反應室，以使得當所述樣品中存在靶多核苷酸時所述第一階段擴增試劑與所述樣品在擴增反應中反應，以產生含有第一擴增子的反應產物；除了保留在所述反應室中的有效部分外，以流體形式將所述反應產物轉移至所述廢料容器；將第二階段擴增試劑從所述第二反應物容器中以流體形式轉移至所述反應室，以使得當所述反應產物中存在所述第一擴增子時所述第二階段擴增試劑與所述有效部分的所述反應產物在擴增反應中反應，以產生第二擴增子；以及檢測所述第二擴增子以確定所述樣品中是否存在所述靶多核苷酸。
30.如權利要求29所述的方法，其中使用所述第一階段擴增試劑的所述擴增反應是進行預定循環次數的聚合酶鏈式反應，并且其中在所述擴增反應的預定循環次數之后執行所述以流體形式轉移所述反應產物的所述步驟。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述擴增反應的所述預定循環次數在20至50的范圍內。
32.如權利要求29所述的方法，其中所述以流體形式轉移所述反應產物的步驟包括以下步驟監測來自與所述第一擴增子相關的熒光指示劑的光信號，所述光信號與所述第一擴增子的數量單一相關；并且當所述光信號等于或高于預定水平時自動分離所述有效部分的所述反應產物。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述反應產物具有一定體積并且其中所述有效部分是所述反應產物的體積百分比，所述百分比選自0.5％至10％的范圍。
34.如權利要求33所述的方法，其中所述預定水平是基線信號水平的倍數，所述倍數選自1.5至25的范圍。
35.如權利要求33所述的方法，其中所述擴增反應各自是聚合酶鏈式反應或NASBA反應。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述熒光指示劑選自特異結合雙鏈DNA的插入染料或者包含特異結合擴增產物的寡核苷酸部分。
37.確定樣品中一種或多種靶多核苷酸的相對量的方法，所述方法包括以下步驟在第一擴增反應中，擴增所述樣品中所述一種或多種靶多核苷酸以及至少一種參照序列，以形成包括每一種靶多核苷酸和參照序列的第一擴增子的第一反應產物，所述第一擴增反應包括針對每一種靶多核苷酸和參照序列的初始引物；在第二擴增反應中，從有效部分的所述第一反應產物擴增所述一種或多種靶多核苷酸的第一擴增子，以形成每一種第一擴增子的第二擴增子，所述第二擴增反應包括針對每一種靶多核苷酸的次級引物，使得每一種第一擴增子的每一種次級引物相對于其所述初始引物嵌套在所述第一擴增子中；以及將所述第二擴增反應的第二擴增子與所述第一擴增反應中的所述至少一種參照序列的擴增子進行比較，以確定所述樣品中所述一種或多種靶多核苷酸的相對量。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述第一擴增反應和所述第二擴增反應在流體封閉反應系統中進行。
39.如權利要求38所述的方法，其中所述第一擴增反應和所述第二擴增反應各自是實時擴增反應。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述第二擴增反應中的所述擴增步驟包括以下步驟監測來自與至少一種所述第一擴增子相關的熒光指示劑的光信號，所述光信號與這種第一擴增子的數量單一相關；并且當所述光信號等于或高于預定水平時自動分離所述有效部分的所述反應產物。
41.如權利要求40所述的方法，其中所述反應產物具有一定體積并且其中所述有效部分是所述反應產物的體積百分比，所述百分比選自0.5％至10％的范圍。
42.如權利要求41所述的方法，其中所述預定水平是基線信號水平的倍數，所述倍數選自1.5至25的范圍。
43.如權利要求42所述的方法，其中所述擴增反應各自是聚合酶鏈式反應或NASBA反應。
44.用于進行嵌套擴增反應的流體封閉反應系統，所述系統包括反應室，其與樣品容器、廢料容器、含有第一階段擴增試劑的第一反應物容器以及含有第二階段擴增試劑的第二反應物容器可選擇地流體相通，每一所述容器均為流體封閉的；以及與回轉閥可操作地連接的泵，用于以流體形式將所述樣品容器中的樣品和所述第一階段擴增試劑轉移至所述反應室，在其中進行第一擴增反應以在反應混合物中形成的一種或多種第一擴增子；用于分離有效部分的所述反應混合物；并且用于以流體形式將所述第二階段擴增試劑和所述有效部分轉移至所述反應室，在其中進行第二擴增以形成一種或多種第二擴增子。
45.如權利要求44所述的流體封閉反應系統，其中當所述泵分離所述有效部分的所述反應混合物時，除保留在所述反應容器中的所述有效部分外，所述反應混合物以流體形式被轉移至廢料容器。
46.如權利要求45所述的流體封閉反應系統，其中所述反應室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得當所述反應混合物以流體形式通過所述出口被轉移至所述廢料容器時，一定體積的所述反應混合物被保留在所述第一反應室中所述出口之下，其中所述體積包括所述有效部分。
47.權利要求46所述的流體封閉反應系統，還包括與所述反應室可操作地連接的一個或多個檢測器，用于收集來自與至少一種所述第一擴增子相關的一種或多種熒光指示劑的一個或多個光信號，所述一個或多個光信號的每一個均與所述第一擴增子的一種的數量單一相關。
48.權利要求47所述的流體封閉反應系統，還包括與所述泵、所述回轉閥和所述一個或多個檢測器可操作地連接的微處理器，用于監測所述一個或多個光信號的值和用于當至少一個所述光信號等于或高于預定水平時驅動所述泵和所述回轉閥以分離有效部分的所述反應混合物。
49.反應容器，其包括用于容納液體的反應室；通過入口管道與所述反應室相連的入口；通過出口管道與反應室相連的出口；以及所述反應室中的保留部件，所述保留部件被設置成當其余的所述液體通過所述出口管道被移出所述反應室時將一定體積的所述液體保留在所述反應室中。
50.如權利要求49所述的反應容器，其中所述反應容器還包括限定所述反應容器側壁的剛性框架；以及附設到所述剛性框架相對側的第一和第二聚合物膜，以形成所述反應室的相對的主要壁。
51.如權利要求50所述的反應容器，其中每一所述主要壁足夠柔軟以適應各自的熱表面。
52.如權利要求50所述的反應容器，其中至少兩個所述側壁是透光的并且相互成角度地偏移。
53.如權利要求49所述的反應容器，其中所述反應室具有如下的寬度和深度，所述反應室的深度和寬度具有至少4∶1的比例，并且其中所述反應室的深度小于2mm。
54.用于進行多階段反應的設備，所述設備包括在其中至少形成有第一和第二管道的本體；以及從所述本體延伸出的反應容器，所述反應容器包括用于容納液體的反應室；通過入口管道與所述反應室連接的入口；通過出口管道與所述反應室連接的出口；以及所述反應室中的保留部件，所述保留部件被設置成當其余的所述液體通過所述出口管道移出所述反應室時將一定體積的所述液體保留在所述反應室中，其中所述容器的入口連接到所述本體的第一通道，并且所述容器的出口連接到所述本體的第二通道。
55.如權利要求54所述的設備，其中所述本體還包括與所述第二管道流體相通的通風口，用于當所述液體通過所述入口和所述第一管道進入所述反應室時從所述第二管道通風。
56.權利要求54所述的設備，還包括用于迫使所述本體的所述第一管道中的液體流過所述反應容器的所述入口進入所述反應室的壓差源。
57.計算機可讀產品，其包含由計算機運行以控制嵌套擴增反應進行的程序，所述程序包括指令，用于(a)讀取來自第一階段擴增反應的光信號的值，所述光信號與所述第一階段擴增反應中擴增子的濃度單一相關，并且所述光信號的值具有最新值；(b)從所述光信號的值確定基線信號水平；(c)從所述光信號的值計算預定水平；(d)將所述預定值與所述光信號的最新值進行比較；(e)當所述光信號的最新值等于或高于所述預定水平時，啟動第二階段擴增反應；以及(f)重復步驟(d)和(e)直至所述第二階段擴增反應啟動。
58.如權利要求57所述的計算機可讀產品，其中所述計算所述預定水平的步驟包括將所述基線信號水平乘以選自1.5至25的范圍的系數以獲得所述預定水平，或者計算來自所述光學信號的所述值的擴增子增長曲線的特征性值以獲得所述預定值。
59.如權利要求58所述的計算機可讀產品，其中所述第一階段擴增反應和所述第二階段擴增反應各自是聚合酶鏈式反應或者各自是NASBA反應。
60.如權利要求59所述的計算機可讀產品，其中所述嵌套擴增反應在流體封閉反應系統中進行，并且其中所述啟動所述第二階段擴增反應的步驟包括產生指令，所述指令用于在所述流體封閉反應系統中分離有效部分的所述第一階段擴增反應的反應混合物，以及用于在所述流體封閉反應系統中混合所述有效部分和所述第二階段擴增反應的反應物。
61.擴增樣品中一種或多種靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟在流體封閉反應系統中，使用第一階段擴增試劑在第一反應混合物中從所述樣品擴增一種或多種靶多核苷酸以形成一種或多種第一擴增子，所述第一階段擴增試劑包括針對對每一種靶多核苷酸的第一引物；在所述流體封閉反應系統中分離有效部分的所述第一反應混合物；以及在所述流體封閉反應系統中，使用第二階段擴增試劑在第二反應混合物中擴增所述有效部分中的所述一種或多種第一擴增子以形成一種或多種第二擴增子，所述第二階段擴增試劑包括針對所述一種或多種第一擴增子每一種的至少一種次級引物，使得每一種次級引物相對于所述第一擴增子的第一引物均嵌套在所述第一擴增子中。
62.如權利要求61所述的方法，其中所述第一反應混合物處于流體封閉反應系統的第一反應室中，并且其中所述分離步驟包括，除了保留在所述第一反應室中的有效部分外，以流體形式將所述第一階段反應混合物轉移至廢料容器。
63.如權利要求62所述的方法，其中所述第一反應室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得當所述第一階段反應混合物以流體形式通過所述出口被轉移至所述廢料容器時，一定體積的所述第一階段反應混合物被保留在所述第一反應室中所述出口之下。
64.如權利要求63所述的方法，其中所述保留在所述第一反應室中的體積包括所述有效部分。
65.如權利要求63所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少1分子所述擴增子的一定體積的所述反應混合物。
66.如權利要求65所述的方法，其中所述有效部分是足以含有至少100分子所述擴增子的一定體積的所述反應混合物。
67.如權利要求63所述的方法，其中所述反應混合物具有一定體積并且其中所述有效部分是所述反應混合物的體積百分比，所述百分比選自0.5％至10％的范圍。
68.如權利要求67所述的方法，其中所述分離步驟包括以下步驟監測來自與所述第一反應混合物中的所述一種或多種擴增子之一相關的熒光指示劑的光信號，所述光信號與所述擴增子的數量單一相關；并且當所述光信號等于或高于預定水平時自動分離所述有效部分的所述第一反應混合物。
69.如權利要求68所述的方法，其中所述預定水平是基線信號水平的倍數，所述倍數選自1.5至25的范圍。
70.如權利要求69所述的方法，其中所述第一階段擴增試劑和所述第二階段擴增試劑包括用于進行聚合酶鏈式反應或NASBA反應的試劑。
71.擴增一種或多種RNA序列的方法，所述方法包括以下步驟在流體封閉反應系統中，使用逆轉錄酶試劑在第一反應混合物中轉錄一種或多種RNA序列以形成一種或多種互補單鏈DNA序列；在所述流體封閉反應系統中分離第一有效部分的所述第一反應混合物；以及在所述流體封閉反應系統中，使用第一階段擴增試劑在第二反應混合物中擴增所述第一有效部分中的所述一種或多種互補單鏈DNA序列以形成一種或多種第一擴增子，所述第一階段擴增試劑包括針對所述互補單鏈DNA序列每一種的初始引物。
72.如權利要求71所述的方法，其中所述第一反應混合物處于所述流體封閉反應系統的反應室中，并且其中所述分離所述第一有效部分的步驟包括，除了保留在所述反應室中的所述第一有效部分外，以流體形式將所述第一階段反應混合物轉移至廢料容器。
73.如權利要求72所述的方法，其中所述第一反應室具有底部和位于所述底部之上的出口，使得當所述第一階段反應混合物以流體形式通過所述出口被轉移至所述廢料容器時，一定體積的所述第一階段反應混合物被保留在所述反應室中所述出口之下，其中所述保留體積包括所述第一有效部分。
74.如權利要求72所述的方法，其中所述第一反應混合物具有一定體積并且其中所述有效部分是所述第一反應混合物的體積百分比，所述百分比選自0.5％至20％的范圍。
75.如權利要求74所述的方法，還包括步驟在所述流體封閉反應系統中分離第二有效部分的所述第二反應混合物的；在所述流體封閉反應系統中，使用第二階段擴增試劑在第三反應混合物中擴增所述第二有效部分中的所述一種或多種第一擴增子以形成一種或多種第二擴增子，所述第二階段擴增試劑包括針對每一種所述一種或多種第一擴增子的至少一種次級引物，使得每一種次級引物相對于所述第一擴增子的所述初始引物均嵌套在所述第一擴增子中。
76.如權利要求75所述的方法，其中所述第二反應混合物處于所述流體封閉反應系統的所述反應室中，并且其中所述分離所述第二有效部分的步驟包括，除了保留在所述反應室中的所述第二有效部分外，以流體形式將所述第二反應混合物轉移至所述廢料容器。
77.如權利要求76所述的方法，其中所述第二反應混合物通過所述出口以流體形式被轉移至所述廢料容器，所述第二反應混合物的所述保留體積被保留在所述反應室中所述出口之下，其中所述保留體積包括所述第二有效部分。
78.如權利要求77所述的方法，其中所述第二反應混合物具有一定體積并且其中所述第二有效部分是所述第二反應混合物的體積百分比，所述百分比選自0.5％至20％的范圍。
79.計算機可讀產品，其包含由計算機運行以控制嵌套擴增反應進行的程序，所述程序包括指令，用于(a)讀取來自第一階段擴增反應的光信號的值，所述光信號與所述第一階段擴增反應中擴增子的數量或濃度單一相關；(b)從所述光信號的值確定是否超過閥值；(c)如果超過閥值，啟動第二階段擴增反應。
80.如權利要求79所述的方法，其中所述確定是否超過閥值的步驟包括確定所述光信號的一個或多個值是否超過基于噪聲的、用戶定義的或默認的閥值水平。
81.如權利要求79所述的方法，其中所述確定是否超過閥值的步驟包括確定由所述光信號的值確定的增長曲線的導數是否是最大值、最小值或零。
82.如權利要求79所述的計算機可讀產品，其中所述嵌套擴增反應在流體封閉反應系統中進行，并且其中所述啟動所述第二階段擴增反應的步驟包括產生指令，所述指令用于在所述流體封閉反應系統中分離有效部分的所述第一階段擴增反應的反應混合物，以及用于在所述流體封閉反應系統中混合所述有效部分和所述第二階段擴增反應的反應物。
83.檢測樣品中是否存在一種或多種靶多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟提供含有第一階段擴增試劑的反應室，所述反應室與廢料容器、含有樣品的樣品容器、以及含有第二階段擴增試劑的第二反應物容器可選擇地流體相通，每一個所述容器均為流體封閉的；將樣品從所述樣品容器以流體形式轉移至所述反應室，以使得當所述樣品中存在靶多核苷酸時使所述第一階段擴增試劑與所述樣品在擴增反應中反應以產生第一反應產物；除了保留在所述反應室中的有效部分的所述第一反應產物之外，以流體形式將所述第一反應產物轉移至所述廢料容器；將所述第二階段擴增試劑從所述第二反應物容器中以流體形式轉移至所述反應室，以使得當所述第一反應產物中存在所述第一擴增子時使所述第二階段擴增試劑與所述有效部分的第一反應產物在擴增反應中反應以產生第二擴增子；以及檢測所述第二擴增子以確定所述樣品中是否存在所述靶多核苷酸。
全文摘要
本發明涉及用于進行多階段擴增反應的系統、方法和設備，特別是在流體封閉條件下。一方面，本發明的方法在流體封閉反應系統中進行，所述系統使得能夠分離一部分的第一(或在前)反應混合物，并且將其用作第二(或隨后)反應混合物中的樣品或標本，由此基本上避免僅簡單地將兩種反應混合物混合在一起時第一反應組分對第二反應可能造成的干擾影響。在該方面，可以將本發明的系統、方法和設備用于任何擴增反應，該擴增反應允許基于使用嵌套引物的多階段擴增。
文檔編號A21C3/04GK101068932SQ200580041553
公開日2007年11月7日 申請日期2005年10月27日 優先權日2004年10月27日
發明者羅納德·常, 耶蘇·陳, 道格拉斯·布萊恩·多利, 張建平, 詹姆士·建·全·王, 溫迪·文凱·王, 肯德拉·拉臘·保羅, 魯埃爾·凡·阿塔 申請人:塞弗德公司