專利名稱：一種消除或減弱加速血液清除現象產生的方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種消除或減弱加速血液清除現象產生的方法，具體涉及一種通過改變給藥間隔來消除或減弱加速血液清除現象。
背景技術：
活性化合物的體內藥動學行為對其治療效果有決定性影響，一些在體外實驗中顯示出優秀藥理活性的候選化合物正是由于其體內藥動學性質的不理想而被中止開發。所以將活性化合物載體化，從而改善其體內藥動學參數的策略在藥物制劑的開發過程中得到了廣泛而深入的應用。其中，使用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)對活性化合物進行修飾(又稱為藥物分子的PEG化)或將活性分子載入聚乙二醇化載體(又稱為PEG化載體)是最為常用的手段，并獲得了一些非常成功的案例。例如，將血液中消除極快的蛋白多肽(如腺苷脫氨酶、天冬酰胺酶、干擾素a-2b或粒細胞集落刺激因子等)進行PEG修飾后，其血液循環半衰期顯著延長，可以在降低給藥頻率的同時保證療效(胡永祥，牛津梁，張文博，等.聚乙二醇修飾藥物技術的研究進展[J].中國生化藥物雜志，2004，25 ￠):369.373);將血液中代謝較快且具有嚴重心臟毒性的阿霉素裝載于PEG化脂質體中(Doxil )，不僅大大降低了其心臟毒性，而且其療效得到顯著提升。鑒于PEG化載體/藥物的獨特優勢，被FDA認可的靜脈注射安全性，以及上市產品所帶來的可觀社會效益和經濟效益，世界各國政府都投入大量的人力、財力和資源，進行諸如PEG化脂質體、PEG化樹枝狀(dendrimer)給藥系統、PEG化納米粒、PEG化膠束、PEG化藥物、PEG化酶等方面的研究，特別是PEG化結合主動靶向配體、基因轉染、細胞穿透肽、RNA干擾治療等21世紀主攻方向的研究。但是自 2000年以來，PEG化制劑給藥的安全性和治療的有效性受到了挑戰。鑒于大多數PEG化制劑在臨床應用上需要多次給藥，Dams等(Dams ETM, Laverman P, OyenWJGj et al.Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeatedinjections of sterically stabilized liposomes [J].J Pharmacol exp Therj 2000，292: 1071 - 1079)以99mTc標記脂質體，研究大鼠重復注射PEG化脂質體后的藥動學參數和組織分布變化情況，意外的發現第二次注射的脂質體血漿水平出現極大降低(20分鐘時的濃度約為首次注射的10%)，且肝攝取量從8.1±0.8%驟升至46.2±9.8%，即為加速血液清除(Accelerated Blood Clearance, ABC)現象。目前研究者對ABC現象的機制還不十分明確，其可能的機理是:首次注射的PEG化脂質體，作為抗原激活脾臟B細胞，該B細胞增殖分化為漿細胞后分泌相應抗體，此抗體與之后注射的脂質體表面的PEG結合，隨后激活補體系統，通過補體C3片段對PEG化脂質體的調理作用而加快單核巨噬細胞系統對其的攝取，導致PEG化脂質體快速從血液中清除(佘振南，翟文君，鄧意輝，“加速血液清除”現象中的免疫機制分析[J].沈陽藥科大學學報，2011.28(9): 760-768.)。更多的研究表明，ABC現象并不是PEG化脂質體所專有的，Lu等(LU，W.,WAN, J., SHE, Z., et al., Brain delivery property and accelerated bloodclearance of cationic albumin conjugated pegylated nanoparticle[J].Journalof Controlled Release, 2007, 118(1): 38-53.)的研究發現陽離子牛血清白蛋白修飾的PEG與PLA交聯形成的納米粒(CBSA-NP)在小鼠體內的重復注射時也產生了 ABC現象；KOIDE 等(K0IDE, H., ASAI, T., HATANAKA, K., et al., Particle size-dependenttriggering of accelerated blood clearance phenomenon[J].1nternational Journalof Pharmaceutics, 2008, 362(1-2): 197-200.)發現 PEG 化的膠束亦能誘導 ABC 現象的產生；我們課題組的研究表明PEG化的乳劑和固體脂質納米粒對于小鼠、大鼠或比格犬的重復注射均可以產生強烈的ABC現象(國家自然科學基金資助項目81072602)。一些研究甚至證明PEG化蛋白也能誘導機體產生抗PEG抗體，從而導致蛋白藥物從血液中快速清除(Cheng, T.L., P.Y.ffu, et al.(1999)."Accelerated clearance of polyethyleneglycol-modified proteins by ant1-polyethylene glycol IgM.〃 Bioconjug Chem10(3): 520-528.)，這可以被認為是PEG化蛋白藥物的ABC現象。所以，我們認為ABC現象是PEG化制劑(即PEG化藥物載體和PEG化藥物)存在的共性問題。ABC現象所引發的PEG化制劑藥動學特性的改變在其臨床應用中是一個不容忽視的問題，會嚴重影響藥物治療的的安全性、有效性和患者的順應性。Semple等(SempleSC, Harasym TO, Clow KA, et al.1mmunogenicity and rapid blood clearance ofliposomes containing polyethylene glycol-lipid conjugates and nucleic acid [J].J Pharmacol Exp Ther, 2005, 312: 1020 - 1026)的研究證明，重復注射包封寡核苷酸(0DN)、pDNA或RNA核酶的PEG化脂質體會誘導強烈的免疫應答，導致制劑血液循環時間縮短和小鼠死亡率的顯著增加。我們在研究工作中發現，比格犬在重復注射PEG化乳劑、PEG化納米粒和PEG化脂質體時，ABC現象的產生往往伴隨著嚴重的類似過敏的反應，如困倦、嘔吐、腹瀉、面部嚴重水腫等，某些反應嚴重的比格犬甚至因此死亡。現有文獻已證明小鼠、大鼠、家兔、比格犬、恒河猴等試驗動物均會在重復注射PEG化制劑時產生ABC現象，由此推知，人類在重復注射PEG化制劑時亦能產生ABC現象，所引起的相應后果。在尋找ABC現象解決方法的過程中，研究者們發現PEG化制劑的注射劑量、PEG修飾密度、PEG分子量、制劑粒徑等因素均可以影響ABC現象的產生及強弱程度。注射劑量Ishida等發現PEG化脂質體的首劑量與ABC現象發生的程度存在明顯的反相關(Ishida T, Masuda K, Ichikawa T, et al.Accelerated clearance of asecond injection of PEGylated liposomes in mice [J].1nt J Pharm, 2003, 255:167 - 174)。大鼠首次注射PEG化脂質體，磷脂劑量分別為O (HEPES鹽緩沖液)、0.001、0.01、0.1、1、5 μ mol/kg，5天后注射放射標記的PEG化脂質體(磷脂劑量為5 μ mol/kg),結果表明二次注射PEG化脂質體的血液清除程度與肝聚集量隨首劑量的降低而明顯增加。當首劑量磷脂高于I μ mol/kg時，二次注射的PEG化脂質體血液清除速度與肝聚集量不再繼續增加。而Laverman等的研究與上述Ishida的結果存在一定矛盾:首次注射磷脂劑量分別為0.05,0.5,5.0 μ mol/kg的PEG化脂質體，二次注射PEG化脂質體(磷脂劑量5.0μ mol/kg)時均能產生ABC現象(Laverman P, Carstens MG, Boerman 0C, et al.Factorsaffecting the accelerated blood clearance of polyethylene glycol—liposomes uponrepeated injection [J].J Pharmacol Exp Ther, 2001, 298: 607 - 612)。當固定首次注射劑量為5.0 μ mo I磷脂/k g，二次注射的PEG化脂質體劑量為15或50 μ mo I磷脂/kg時，產生的ABC現象比5.0 μ mol磷脂/kg組明顯減弱。最近文獻(Repeated Injection ofHigh Doses of Hemoglobin-Encapsulated Liposomes (Hemoglobin Vesicles) InducesAccelerated Blood Clearance in a Hemorrhagic Shock Rat Model DRUG M ETABOLISMAND DISPOSITION 2011,39 (3):484 - 489)報道，即使高劑量也會產生ABC現象。PEG修飾密度目前能夠誘導產生ABC現象的PEG化脂質體均以PEG-DSPE為長循環材料，因此有研究者專門對PEG-DSPE在處方中的比例對ABC現象的影響進行考察。首次注射PEG化脂質體中PEG-DSPE占處方脂質摩爾比分別為0、5、10、15% (磷脂劑量為0.001μ mol/kg)，5天后注射PEG化脂質體(磷脂劑量為5.0 μ mol/kg, PEG-DSPE在處方中的摩爾比例為5%)，結果發現ABC現象發生的程度與PEG-DSPE的比例存在明顯的反相關:含有0% PEG-DSPE的脂質體(即普通脂質體)不產生ABC現象；含有5% PEG-DSPE的脂質體可以誘導產生明顯的ABC現象，且伴隨肝聚集量顯著增加。進一步增加PEG-DSPE的含量(10、15%)，與5%組相比，二次注射脂質體的清除速率與肝聚集呈現降低趨勢，但仍顯著高于對照組(P〈0.01) (Ishida T, Harada M, Wang XY, et al.Accelerated blood clearanceof PEGylated liposomes following preceding liposome injection: Effects of lipiddose and PEG surface-density and chain length of the first-dose liposomes [J].J Control Release , 2005, 105: 305 - 317)。Ishida 等也發現增加 PEG-DSPE 的比例能減弱PEG化脂質體對ABC現象的誘導。與首次劑量中PEG-DSPE含量低(小于5 mol%)的脂質體相比，若首次注射脂質體中PEG-DSPE含量高(大于10 mol%),則其后注射的PEG化脂質體的肝臟蓄積量減少(Ishida T, Ichikawa T, Ichihara M, et al.Effect of thephysicochemical properties of initially injected liposomes on the clearance ofsubsequently injected PEGylated liposomes in mice [J].J Control Release, 2004,95: 403 - 412)。PEG的分子量有研究表明，首次注射摩爾比均為5%的PEG2000-DSPE和PEG5000-DSPE修飾脂質體(0.001 μ mol磷脂/kg)，5天后注射PEG2000-DSPE修飾的標記脂質體(5 μ mol磷脂/kg)，均產生明顯的ABC現象(未考察二次注射PEG5000-DSPE修飾脂質體)(Ishida T, Maeda R, Ichihara M, et al.Accelerated clearance of PEGylatedliposomes in rats after repeated injections [J].J Control Release, 2003, 88:35 - 42)，因此認為PEG的分子量對誘導ABC現象沒有影響。Ishida等的結論恰恰相反:首次注射PEG5000-DSPE修飾脂質體誘導ABC現象的程度遠遠低于首次注射PEG2000-DSPE修飾脂質體，PEG5000-DSPE和PEG2000-DSPE修飾脂質體組的肝聚集量分別為35.3±3.8%和78.7±8.8%，表明首次注射脂質體中PEG分子量的增加可以在一定程度上減弱ABC現象。PEG化制劑粒徑Dams等的研究表明:ABC現象與首次注射PEG化脂質體的粒徑、表面性質和放射性標記均無關。未標記的小(85 nm)或大(400 nm)PEG化脂質體均會引起二次注射PEG化脂質體的血液清除速度顯著增加，產生明顯的ABC現象。注射間隔Dams等發現能夠誘導ABC現象的兩次注射最小時間間隔為5天；Ishida等證明兩次注射間隔為7天時ABC現象最為強烈。從上述影響ABC現象各因素的分析可知:對于PEG化載體，通過調節其注射劑量、粒徑或所修飾PEG的分子量等因素難以避免ABC現象的產生；而降低PEG修飾密度雖然可以消弱ABC現象的強度甚至避免其產生，但PEG化制劑的長循環優勢亦隨之喪失；當給藥間隔小于5天或更少時雖然可以減弱或消除ABC現象的產生，但是PEG化制劑的優勢正在于延長了活性物質的血液循環半衰期，降低給藥頻率，某些PEG化制劑的循環半衰期甚至超過100小時，所以將給藥間隔縮短至5天以內并非理想選擇，即使在較短給藥間隔的情況下，多次給藥也會產生ABC現象；我們課題組的研究發現，通過可斷裂PEG脂質衍生物修飾脂質體或囊泡可以消除或減輕ABC現象(Xu H, Wang KQ, Deng YH, et al.Effectsof cleavable PEG-cholesteroI derivatives on the accelerated blood clearance ofPEGylated liposomes.Biomaterials, 2010; 31 (17):4757-63.),但可斷裂 PEG 脂質衍生物對于延長脂質體、囊泡或乳劑等制劑的血液循環時間效果不大。Judge等(JUDGE, A.，MCCLINT0CK, K., PHELPS, J.R., et al., Hypersensitivity and loss of disease sitetargeting caused by antibody responses to PEGylated liposomes[J].Mol Ther,2006，13(2): 328-337.)使用烷基鏈長度不同的PEG脂質衍生物對脂質體進行修飾，其誘導ABC現象的能力隨烷基鏈的縮短而降低，但烷基鏈較短的PEG脂質衍生物易從所修飾的脂質體或乳劑等表面脫落，因此也不能使相應的PEG化制劑獲得理想的血液循環效果。雖然Doxif在臨床使用中并未觀察到典型的ABC現象，這可能是由于其中的藥物具有較強的免疫系統毒性而在一定程度上抑制了免疫反應，或是由于注射劑量較大因而ABC現象較弱，但是Doxi Γ在靜脈注射給藥時仍然會發生過敏反應(HSRs )，其與ABC現象可能有關(另外，我們在進行低劑量重復注射研究中發現，Doxif也存在ABC現象)。而隨著越來越多的PEG化制劑逐漸步入臨床研究環節，它們在臨床試驗或上市后使用中所潛伏的與ABC現象相關的嚴重問題和風險也將日益凸顯，所以急需一種解決ABC現象的切實可行的方法。
發明內容
由于ABC現象的發生會對實驗對象產生傷害甚至引起死亡，所以我們使用藥動學特征與人類相似的比格犬作為模型動物`，尋找解決ABC現象的方法，所得實驗結果可以在很大程度上用于指導人用PEG化制劑的開發。我們在對實驗動物重復注射PEG化制劑后ABC現象的產生情況進行深入研究后驚人地發現，對于PEG化乳劑、PEG化固體脂質納米粒、PEG化脂質體和PEG化囊泡等PEG化載體，通過對注射間隔進行巧妙地選擇，可以減弱甚至完全消除ABC現象對二次注射PEG化制劑藥動學的影響。我們提出的注射方案可以保證二次，或之后的第三次、第四次注射的PEG化制劑不會從血液中快速清除，從而借助其長循環作用實現藥物的治療效果。要實現本發明所述的減弱或者消除PEG化制劑的加速血液清除現象，須采用如下的技術方案:
一種消除或減弱加速血液清除現象產生的方法，即PEG化制劑的注射間隔不小于30天。本發明所述注射間隔可以選擇不小于60天。本發明所述注射間隔可以選擇不小于90天。作為優選，所述注射間隔不小于60天或不小于90天；作為更優選，所述注射間隔不小于90天。
本發明所述的在PEG化制劑的注射方式，指通過靜脈注射或是靜脈滴注的方式給予用藥對象，也可利用其它注射類型，如皮下注射、肌肉注射和硬膜外注射等；或者是利用已知多種類型的注射給藥設備，例如使用可植入泵或非植入的可便攜或非便攜型的注射泵。注射方式可以是連續輸注、間歇輸注或脈沖輸注。注射速度可以不同，就如臨床上靜脈注射和靜脈滴注的區別。本發明中所述聚乙二醇化制劑(PEG化制劑)是PEG化乳劑、PEG化脂質體、PEG化固體脂質納米粒、PEG化膠束、PEG化囊泡、PEG化微乳、PEG化納米粒、PEG化納米結構載體或PEG化蛋白。如公知的，PEG化制劑，特別是其中的是PEG化乳劑、PEG化脂質體、PEG化固體脂質納米粒、PEG化膠束、PEG化囊泡、PEG化納米粒、PEG化微乳或PEG化納米結構載體是采用聚乙二醇脂質衍生物(PEG脂質衍生物)所修飾的，PEG脂質衍生物中PEG與脂質鏈段通過酯鍵或酰胺鍵或者醚鍵相連。 聚乙二醇脂質衍生物例如:聚乙二醇-留醇類衍生物如聚乙二醇-膽固醇、聚乙二醇-膽固醇琥珀酸酯(PEG-CHEMS)、聚乙二醇-膽固醇碳酸甲酯等，聚乙二醇-磷脂類衍生物如聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)、聚乙二醇-二油酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二肉豆蘧酰磷脂酰乙醇胺等；聚乙二醇-二酸甘油酯或單酯如聚乙二醇-二硬脂酰甘油、聚乙二醇-二棕櫚酰甘油、聚乙二醇-二肉豆蘧酰甘油等;聚乙二醇-脂肪酸或脂肪酸酯衍生物等如聚乙二醇-硬脂酸、聚乙二醇-棕櫚酸、吐溫、芐澤、賣澤、聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS)等。PEG衍生物還可以是Diacylglycerol-PEG(公司名稱NOF America Corporation),其結構式如下:
權利要求
1.一種消除或減弱加速血液清除現象產生的方法，即聚乙二醇化制劑的注射間隔不小于30天。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述注射間隔為不小于60天。
3.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述注射間隔為不小于90天。
4.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述注射包括靜脈注射、皮下注射或肌肉注射。
5.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述聚乙二醇化制劑是聚乙二醇化乳劑、聚乙二醇化脂質體、聚乙二醇化固體脂質納米粒、聚乙二醇化膠束、聚乙二醇化囊泡、聚乙二醇化微乳、聚乙二醇化納米粒、聚乙二醇化納米結構載體或聚乙二醇化蛋白。
6.根據權利要求 1的方法，其特征在于，所述聚乙二醇化制劑為臨床上的預防、診斷或治療制劑。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，公開了一種可以消除或減弱加速血液清除現象產生的方法，通過合理選擇PEG化制劑的注射間隔可以消除或避免加速血液清除現象的產生。所述PEG化制劑的注射間隔不小于30天，優選不小于90天，所述聚乙二醇化制劑為臨床上的預防、診斷或治療制劑。按照本發明所述方法進行PEG化制劑的注射給藥，可以減輕或完全消除加速血液清除現象，從而避免可能發生的嚴重的器官毒性反應或類似過敏反應，并能保證PEG化制劑的藥效。
文檔編號A61K47/34GK103169981SQ20111043132
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者鄧意輝, 佘振南, 王龍, 嚴米娜, 王春玲, 趙永雪 申請人:沈陽藥科大學