腫瘤特異性抗體和細胞表面蛋白質的制作方法

專利名稱：：腫瘤特異性抗體和細胞表面蛋白質的制作方法
技術領域：
：本發明涉及人腫瘤特異性結合蛋白及其所有應用。特別的，本發明涉及對癌細胞上的抗原或分子為特異的抗體或抗體片段、及含有本發明的結合蛋白的免疫偶聯物，以及它們的使用方法。本發明還涉及新的與癌癥相關的抗原和其應用。
背景技術：
：在2000年，全世界有約2200萬人患癌癥，620萬人死于這類疾病。每年有超過IOOO萬新增病例，且預計在未來15年內增加50%(WHO，世界癌癥報道(WorldCancerReport))。BernardW.Stewart禾BPaulKleihues編，IARCPress,Lyon,2003)。目前的癌癥治療局限于侵入性手術、放射療法和化學療法，所有的這些方法或是導致潛在的嚴重副作用，非特異性毒效和/或由創傷帶來的體形和/或生活質量的改變。癌癥可發展成為對化學療法產生不反應性，從而降低了其他治療手段的選擇余地和成功機會。對于一些癌癥的預后比其他的更壞，且某些癌癥其結果幾乎都是致命的。此外，那些有著相對較高治療成功率的癌癥，同樣也有著非常高的發生率，因此還是主要的殺手。導致現有癌癥療法的不足的原因之一是它們缺少對受影響的組織和細胞的選擇性。手術切除總是包含移除看似正常的被認為是"安全界限"的組織，而這樣會增加發病率和并發癥的危險。另外，手術切除還包含移除一些散置于癌細胞中、有可能維持或恢復受影響的器官或組織的健康組織。放射線和化療由于其非特異性的作用模式，會損害到許多正常的細胞。這將會導致嚴重的副作用，例如嚴重的惡心、體重減輕和體力降低、脫發等，并且還會增加其在以后患其他癌癥的危險。對于癌細胞有更高選擇性的治療將不會傷及正常細胞，從而將提高作用/副作用比例和生活質量。對癌癥治療的選擇性可通過使用對僅存在于或主要上存在于癌細胞中的分子有特異性的抗體來提高。這樣的抗體可被用于調節免疫系統以及增強患者自身免疫系統對癌癥的識別和毀滅。它們還可以妨礙或改變靶分子的功能，從而妨礙或改變癌細胞的功能。它們還能用于靶向藥物、基因、毒素或其他與癌細胞醫學相關的分子。這種抗體一藥物復合物通常被稱作為免疫毒素或免疫偶聯物，且近年來許多這樣的化合物都被進《亍了測i式。[KreitmanRJ(1999)Immunotoxinsincancertherapy.CurrOpinImmunol11:570-578;KreitmanRJ(2000)Immunotoxins.ExpertOpinPha謹cother1:1117-1129;WahlRL(1994)Experimentalradioimmunotherapy.Abriefoverview.Cancer73:989-992;GrossbardML,FidiasP(1995)Prospectsforimmunotoxintherapyofnon-Hodgkin'slymphoma.ClinImmunolImmunopathol76:107-114;JurcicJG,CaronPC，ScheinbergDA(1995)Monoclonalantibodytherapyofleukemiaandlymphoma.AdvPharmacol33:287-314;LewisJP,DeNardoGL，DeNardoSJ(1995)Radioimmunotherapyoflymphoma:aUCDavisexperience.Hybridoma14:115-120;UckunFM,ReamanGH(1995)Immunotoxinsfortreatmentofleukemiaandlymphoma.LeukLymphoma18:195-201;KreitmanRJ，WilsonWH，BergeronK，RaggioM，Stetler-StevensonM,FitzGeraldDJ,PastanI(2001)Efficacyoftheanti-CD22recombinantimmunotoxinBL22inchemotherapy-resistanthairy-cellleukemia.NEnglJMed345:241-247].迄今已測試過的對抗已知腫瘤標記物的抗體大多為小鼠的單克隆抗體，有時通過分子工程進行"人類化"。不幸的是，它們的靶也通常存在于正常細胞的亞群中，因此引起一些非特異性的影響。此外，這些抗體基本上是小鼠蛋白，它們被人類患者的免疫體統識別為外來蛋白。接下來的免疫反應和抗體響應可導致效率的喪失或副作用的產生。本發明的發明人在開發治療癌癥的抗體過程中使用了各種不同的方法。與對帶有癌細胞或分離的癌細胞標記物的試驗動物進行免疫處理不同的是，本發明的發明人僅僅尋求那些可被患者自身免疫系統識別的標記物，換句話說，那些被免疫系統識別為外來分子的標記物。這就意味著標記物或抗體通常是基本上不存在于正常細胞中的，因此進一步降低了非特異性毒性的危險。雜交瘤文庫產生自癌癥患者衍生的淋巴細胞，及由它們分泌的抗體進行了結合到正常和癌細胞的測試。只有那些顯示出對癌細胞有高選擇性的抗體為了以后的評價和發展才被作為癌癥治療或診斷試劑的研究。本專利申請的主題即是這樣的一種高選擇性的抗體。除了具有選擇性外，該抗體由于是完全的人蛋白，因此能與病人的免疫系統完全相容。本發明的抗體可以用作診斷或治療用，或者作為改造其他耙抗原的結合分子的基礎。本發明的抗體還可以用作識別靶抗原。然后，該抗原能被用在設計新的癌癥治療和診斷之中。抗體分子的基本結構包括4條蛋白鏈，其中2條重鏈，2條輕鏈。這些鏈通過二硫鍵相互連接。每條輕鏈均是由輕鏈可變區和輕鏈恒定區組成。每條重鏈均是由重鏈可變區和重鏈恒定區組成。輕鏈和重鏈的可變區可進一步細分為構架區和超變區，被稱作互補決定區(CDR)。每條輕鏈和重鏈的可變區均是由3個CDRs和4個構架區組成。葡萄糖轉運體8(GLUT8)是蛋白質GLUT家族中的一員，及已知其具有轉運糖的活性。GLUT8由在人染色體9上發現的基因s/c^S編碼。GLUT8的長度為477個氨基酸，是50kDa的II型跨膜蛋白質。其具有12個跨膜區域。其在TM1和TM2之間具有一個短的細胞外環，以及在TM9和TM10之間具有一個長的細胞外環。盡管具有幾個跨膜區域，由于N-端的二-亮氨酸部分的原因，GLUT8很可能位于細胞內(Ibbersonetal.JBC275:4607-4612,2000;Moadeletal"CancerRes65:698-702,2005)。在經胰島素處理的小鼠細胞中已觀察到了向膜的遷移(Carayannopoulosetal.,PNAS97:7313-18,2000)或在經低氧休克或胰島素處理的大鼠細胞中(US09/886,954[2002/0038464])。在人類中，還沒有膜定位的報道，且沒有確認任何誘導遷移的刺激物(Widmeretal.,Endocrinology146:4727-36,2005)。GLUT/SLC2A家族的命名法已公開在Amer.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282:E974-76，2002中。如在該文中指出的，GLUT8在過去被用作描述現在所知的GLUT12。N-端的二-亮氨酸部分已被發現存在于所有的哺乳動物的GLUT8序列中(見Zhaoetal.,BiochimicaetBiophysicaActa1680:103-113，2004-顯示在牛、人、大鼠禾口小鼠)。
發明內容本發明者們制備了人癌癥特異性抗體，其結合到包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑素瘤、肝癌、結腸癌、子宮頸癌、頭和頸癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌和子宮內膜癌在內的幾種癌癥細胞。重要的是，該抗體不會顯著地結合到正常的組織上，因此使得其適用于癌癥的治療和診斷中。本發明者們已克隆出抗體并對其進行了測序，還確定了抗體輕鏈和重鏈可變區和互補決定區1，2和3的序列。因此，本發明提供了分離的輕鏈互補決定區1，2禾P/或3，其分別包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQIDNO:l),AASSLHS(SEQIDNO:2)禾口LQYSTYPIT(SEQIDNO:3);以及分離的重鏈互補決定區1，2和3，其分別包含氨基酸序列NYAMS(SEQIDNO:4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQIDNO:5)和VPYRSTWYPLY(SEQIDNO:6)。本發明還提供了分離的核酸序列，該核酸序列編碼輕鏈互補決定區1，2和/或3，其分別包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQIDNO:l),AASSLHS(SEQIDNO:2)和LQYSTYPIT(SEQIDNO:3);以及分離的核酸序列，該核酸序列編碼重鏈互補決定區1，2和/或3，其分別包含氨基酸序列NYAMS(SEQIDNO:4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQIDNO:5)和VPYRSTWYPLY(SEQIDNO:6)。本發明的其它方面是關于分離的輕鏈可變區，其包含本發明的輕鏈互補決定區l，2和/或3(SEQIDNOS:l-3)，以及分離的重鏈可變區，其包含本發明的重鏈互補決定區1，2和/或3(SEQIDNOS:4-6)。在一實施方式中，輕鏈可變區包含示于圖1中的氨基酸序列(SEQIDNO:7)。在另一實施方式中，重鏈可變區包含示于圖2中的氨基酸序列(SEQIDNO:9)。本發明還提供了編碼本發明的輕鏈可變區的一個分離的核酸序列，以及編碼本發明的重鏈可變區的一個分離的核酸序列。在一實施方式中，輕鏈可變區包含示于圖1中的核酸序列(SEQIDNO:8)。在另一實施方式中，重鏈可變區包含示于圖2中的核酸序列(SEQIDNO:IO)。本發明的另一方面是關于一種結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，其包含至少一個本發明的輕鏈互補決定區(即一個或多個SEQIDNOS:l-3)和/或至少一個本發明的重鏈互補決定區(即一個或多個SEQIDNOS:4-6)。本發明還提供一種結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，其包含本發明的輕鏈可變區和/或本發明的重鏈可變區。本發明者們還確認了與本發明的結合蛋白結合的抗原。因此，本發明提供的結合蛋白結合到葡萄糖轉運體8(GLUT8)或其變異體；包含氨基酸序列SEQIDNOS:11-20，優選為SEQIDNOS:ll-13中任何一個的蛋白質；或在癌細胞表面表達的與癌癥相關的GLUT8的變異體。在本發明的一個實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體包含由SEQIDNOS:11，12或13中任何一個或其變異體定義的氨基酸序列。在本發明的另一實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體包含在N-端的二-亮氨酸部分產生改性的GLUT8。在本發明的又一實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性為二-丙胺酸。此外，本發明還提供含有本發明的結合蛋白，例如抗體或抗體片段，并具有藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑或穩定劑的組合物。本發明的又一方面是關于一種免疫偶聯物，其包含(l)本發明的結合蛋白，優選為結合到癌細胞上的抗原或分子上的抗體或抗體片段，其附于(2)效應物分子上。本發明的再一方面是一種免疫偶聯物包含(l)本發明的結合蛋白，優選為結合到被癌細胞內化的抗原或分子上的抗體或抗體片段，其附于(2)效應物分子上。在一優選的實施方式中，效應物分子是(i)一種標記物，其可直接或間接地生成可檢測的信號，或者是(ii)一種癌癥治療試劑，其或者是毒害細胞的、抑制細胞生長的，或者是阻止或降低癌癥細胞分裂和/或轉移的能力。優選地，該癌癥治療試劑是毒素或細胞毒素。本發明還提供含有本發明的免疫偶聯物的組合物，以及該免疫偶聯物在生產治療或預防及診斷癌癥的藥物中的應用。此外，本發明提供了使用本發明的免疫偶聯物及相關的試劑盒于治療或預防癌癥的方法。本發明的另一方面是檢測或監控受測試者中癌癥的方法，該方法包含以下步驟(1)將從所述受測試者中取出的測試樣品與本發明的結合蛋白接觸，所述結合蛋白特異性地結合到癌細胞上的抗原，形成結合蛋白一抗原復合物；(2)測量測試樣品中結合蛋白一抗原復合物的含量；以及(3)將測試樣品中的結合蛋白一抗原復合物的含量與對照物比較。本發明的另一方面是關于包含本發明的免疫偶聯物的診斷試劑，其中的效應分子是一標記物，其可以直接或間接地生成可探測的信號。本發明還包括可特異性地結合到本發明的結合蛋白之一的分離的蛋白、其核酸序列及應用。本發明者們還確認了與本發明的結合蛋白結合的抗原。本發明包括新的與癌癥相的抗原，其是在癌細胞表面表達的GLUT8的變異體。本發明還包括了新的與癌癥相關的抗原在癌癥的治療和診斷的應用。在本發明的一實施方式中，與癌癥相關的GLUTS的變異體包含由SEQIDNOS:11，12或13中任何一個或其變異體定義的氨基酸序列。在本發明的另一實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體包含在N-端的二-亮氮酸部分產生改性的GLUT8。在本發明的又一實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性為二-丙胺酸。本發明還包括檢測或監控患有或懷疑患有癌癥的受測試者的癌癥的方法，該方法包括檢測樣品中細胞上的與癌癥相關的GLUTS的變異體，其中，如果在細胞上檢測到與癌癥相關的GLUT8的變異體，則表明有癌癥存在。此外，本發明還包括檢測或監控患有或懷疑患有癌癥的受測試者的癌癥的方法，該方法包含檢測在樣品的細胞中與癌癥相關的GLUT8的變異體的表達，其中，如果在細胞中檢測到與癌癥相關的GLUTS的變異體的表達，則表明有癌癥存在。本發明的另一方面是治療或預防受測試者中的癌癥的方法，該方法通過調整GLUT8在癌細胞中的功能或表達而達成。本發明還包括治療或預防受測試者中的癌癥的方法，該方法使用與癌癥相關的GLUTS的變異體或其片段。此外，本發明還包括含有有效量的與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段、編碼與癌癥相關的GLUTS的變異體或其片段的核酸序列、和/或包含了編碼與癌癥相關的GLUTS的變異體或其片段的核酸序列的重組體表達的載體的藥物組合物。本發明的其他特征及益處將從以下的詳細說明中更清楚地看出。然而，應當明白的是這些詳細的說明和具體的例子雖然給出了本發明的優選的實施方式，但它們僅是為了示例的目的。本領域的技術人員能夠在不脫離本發明精神下，從本發明詳細的描述中得出各種基于本發明的變化和改進。本發明將由附圖加以說明，其中圖1是輕鏈可變區VB1-050的核酸(SEQIDNO:8)和氨基酸(SEQIDNO:7)序列。圖2是重鏈可變區VB1-050的核酸(SEQIDNO:10)和氨基酸(SEQIDNO:9)序列。圖3顯示了于不同溫度下溫培A-375細胞之后、由流式細胞儀確定的抗體結合到細胞的表面。在4°C下溫培細胞懸浮液后的A-375細胞的熒光標記4B5(1)和VBl-050(2)。將抗體結合的細胞加溫到37°C后的A-375細胞的熒光標記VBl-050(3)保持60分鐘，(4)保持120分鐘。圖4顯示了共聚焦顯微鏡對VB1-050內化的評估。A-375細胞與抗體一同在4。C下溫培，洗凈并加溫到37。C保持60分鐘。細胞被固定、透化和用已熒光標記的第二抗體標記。在VB1-050于4。C下溫培60分鐘后，對A-375細胞的熒光標記顯示出標記物的圓周表面分布，(60Xx4)的放大(A)。當抗體結合的細胞在37。C下溫培60分鐘后，細胞通過內化的抗體，顯示出強的細胞內染色，(60Xx4)的放大(B).圖5顯示了PCR反應的瓊脂糖膠。在UV燈下用溴化乙錠檢測到DNA。A)通過五coRI禾卩尸vwll消化PelB-VH845-CH-F-de-bouganin/psV73質粒和PdB(-S)-VHQ5(rCH-F-de-bouganin/pSV73，并分別加載到泳道1和泳道3上。*號表示EcoRI-PdB-PvuII插入了連接到預消化的Peffi(-S)-VH()5(rCH-F-de-bouganin/pSV73(用箭頭表示的)的肽前導序列，從而產生了PelB-VH05(rCH-F-de-bouganin/pSV73。B)通過五coRV和AToI消化Pe舊-(S)-VL。5o-CL/pSV73和SpeI-de-bouganin-PelB-VL845-CL/pSV73質粒，并分別加載到泳道2-3和泳道4-5上。用*號和箭頭分別標識插入片段和載體，用于產生Spel-de-bouganin-PdB-VL845-CL/pSV73質粒，隨后，該質粒被插入到3302質粒中。C)SpeI-de-bouganin-PelB-VL845-CL/3302質粒，和D)Peffi-VHo5(rCH-F-de-bouganin插入片段，通過五coRI和消化(分別用箭頭和*號標識)，并加載到泳道2上，該插入片段經連接產生VB6-050/3302。圖6示出了VB6-050的西方墨點。在非還原的條件下，將典型的VB6-845(泳道l)和VB6-050(泳道2)的上清液加載到SDS-PAGE凝膠上，并用抗-人K輕鏈-HRP抗體(1/1000)進行免疫印跡。泳道3和4分別對應于未經誘導培養物的上清液和梯狀條帶(ladder)。泳道5是VB6-845上清液，之前在西方墨點法測試中為陽性。圖7示出了由E104上清液得到的典型的經純化的VB6-050的西方墨點。A)用抗人K輕鏈-HRP抗體對16pL取自純化過程中不同階段的樣品進行免疫印跡。箭頭表示完整的產物。泳道l:培養物上清液；泳道2:濃縮上清液的滲透物；泳道3:以1/10稀釋的濃縮上清液；泳道4:經滲透過濾濃縮的上清液的滲透物；泳道5:經滲透過濾的上清液稀釋1/10;泳道6:CM-瓊脂糖柱的流經物；泳道7:CM-瓊脂糖柱的洗漆物；泳道8:CM-瓊脂糖柱或Ni-瓊脂糖起始材料的洗脫物；泳道9:Ni-螯合柱的流經物；泳道IO，11和12:Ni-螯合柱中不同步驟的洗滌物；泳道13:Ni-螯合-瓊脂糖或SEC-200起始材料的洗脫物；泳道14:SEC-200流分物26-28的匯總；泳道15:梯和VB6-845作為對照物。B)VB6-050的考馬斯(Coomassie)染色。泳道l:SEC-200起始材料；泳道2:流分物27;泳道3:純化的VB6-845;泳道4:梯。圖8示出了VB6-050的滴定曲線。用不同濃度的VB6-050培育SKBR-3，A-375和SK-OV-3細胞，并由流式細胞儀獲得熒光強度的中位數。中熒光強度(medianfluorescence,MF)增加倍數使用下面公式計算，MF增加倍數=在各濃度測得的MF/用PBS測得的MF。圖9示出了VB6-050的體外細胞毒性。用抗原陽性細胞MB-435S(空心圓圈)和抗原陰性細胞Daudi(實心圓圈)進行VB6-050的MTS測定。每個孔植有1000細胞，與Fab-de-bouganin純化的蛋白質溫培。經培育5天后，進行細胞生存力的測定和IC5C的確定。圖10示出了HepG2，MCF-7，Panc-l禾BC-33A在PF-2D系統上的分級譜圖。在兩個陽性和兩個陰性細胞系之間的抗原表達的不同的比較譜圖。該圖代表了從10到25分鐘的層析譜圖。分離的抗原的區別可清楚地在兩個陽性細胞系中看到。MCF-7和HepG2在洗脫時間為15和18分鐘處顯示出兩個峰，表明了中等水平的疏水性。Panc-l和C-33A未顯示出相應的峰。在12分鐘處的峰在各細胞系中均有觀察到。圖11示出了由HepG2細胞系獲得的肽的TOF-MS掃描結果，以探測樣品中所有的肽離子的存在。在1200-1400V下對靜態納米噴霧進行53次100-1200amu范圍的掃描發現了大量回收的肽，對它們的分析獲得了蛋白質ID為葡萄糖轉運體8。圖12示出了由Panc-l細胞系獲得的肽的TOF-MS掃描結果，以探測樣品中所有的肽離子的存在。在1200-1400V下對靜態納米噴霧進行30次100-1200amu范圍的掃描發現了大量回收的肽，對它們的分析獲得了蛋白質ID為lgG。圖13示出了由MCF-7細胞系獲得的肽的TOF-MS掃描結果，以探測樣品中所有的肽離子的存在。在1200-1400V下對靜態納米噴霧進行27次100-1200amu范圍的掃描發現了大量回收的肽，對它們的分析獲得了蛋白質ID為葡萄糖轉運體8。圖14示出了由C-33A細胞系獲得的肽的TOF-MS掃描結果，以探測樣品中所有的肽離子的存在。在1200-1400V下對靜態納米噴霧進行30次100-1200amu范圍的掃描發現了大量回收的肽，對它們的分析獲得了蛋白質ID為lgG。圖15示出了由質譜分析回收的肽的序列覆蓋(s叫uencecoverage),其列于表8中。從溶液內經胰蛋白酶消化的溶液中總共回收了8個肽，獲得了34%的蛋白質覆蓋。劃下底線的序列表示回收的肽序列，用粗體表示的序列表示變異的氨基酸序列。圖16示出了從VBl-050Ag回收的肽的肽質量指紋分析結果。蛋白質分數大于64的被認為是顯著的。唯一觀察到的顯著的蛋白質IDs指向一個抗原，即葡萄糖轉運體8。圖17示出了鑒定的抗原，即葡萄糖轉運體8，具有顯著的分數83。由于數據庫本身服務器的特點,以及相似性洞源性相關連的蛋白質，該蛋白質的所有的異構體就象被擊中而萎靡。由MS/MS裂解和肽的同一性確認了該抗原是葡萄糖轉運體8。圖18示出了中性肽Mr.1401.54的MS/MS離子裂解譜，顯示為三價的分子(466.60000,3+)。肽序列與葡萄糖轉運體8的肽序列完全符合。圖19示出了中性肽Mr.1070.785的MS/MS離子裂解譜，顯示為二價的分子(536.40000，2+)。肽序列與葡萄糖轉運體8的肽序列完全符合。圖20示出了中性肽Mr.1997.9992的MS/MS離子裂解譜，顯示為三價的分子(667.098230,3+)。與葡萄糖轉運體8的同源肽序列相比，顯示的肽序列改變了位于7,10,12，13，14,15禾Q18處的氨基酸。圖21示出了中性肽Mr.1176.3547的MS/MS離子裂解譜，顯示為二價的分子(589.100000，2+)。與葡萄糖轉運體8的同源肽序列相比，顯示的肽序列改變了位于7，10，12，13，14和15處的氨基酸。具體實施方式(A)定義在此使用的術語"全身性施用"意味著例如通過注射(皮下、靜脈、肌肉等)、口服、吸入、經皮膚給予或局部施用(例如局部藥膏或油膏等)、栓劑施用或植入手段等方便的方法進行全身性施用免疫偶聯物和/或其他癌癥治療劑。植入物可以是多孔的、非多孔的或凝膠狀的物質，包括膜，例如硅橡膠膜或纖維。栓劑通常含重量比例為0.5%到10%的活性成分。術語"氨基酸"包括所有的天然氨基酸和改性的氨基酸。在此使用的術語"抗體"意在包括單克隆抗體、多克隆抗體和嵌合抗體。抗體可由重組源得到和/或由轉基因動物產生。在此使用的術語"抗體片段"意在包括Fab，Fab'，F(ab')2,scFv,dsFv,ds-scFv,其二聚體、微型抗體、雙抗體和多聚抗體，以及雙特異性抗體片段。可使用常規技術將抗體變為片段。例如，F(ab')2片段可經由胃蛋白酶處理抗體而產生。產生的F(ab')2片段可經處理而還原二硫鍵，從而產生Fab'片段。木瓜蛋白酶的消化可導致Fab片段的形成。Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚體、微型抗體、雙抗體、雙特異性抗體片段，以及其他片段也可通過重組技術合成。在此使用的術語"本發明的抗體或抗體片段"包括至少一本發明的輕鏈互補決定區(即一個或多個SEQIDNOS:l-3)和/或至少一本發明的重鏈互補決定區(即一個或多個SEQIDNOS:4-6)。優選地，抗體或抗體片段包含輕鏈CDR序列(SEQIDNOS:l-3)和/或重鏈CDR序列(SEQIDNOS:4-6)或這些序列的功能性變異體(functionalvariantsofthes叫uences)，這樣，這些抗體或抗體片段就能夠結合到癌細胞上而不會具體地結合到正常細胞上。本發明的抗體或抗體片段還包括結合到葡萄糖轉運體8(GLUT8)或其變異體，或包含氨基酸序列SEQIDNOS:11-20，優選為SEQIDNOS:ll-13中任何一個的蛋白質上的抗體或抗體片段。"至少為適度的嚴格雜交條件"是指為促進在溶液中兩個互補核酸分子間進行選擇性雜交所選擇的條件。雜交可發生在全部或部分核酸序列分子上。雜交的部分的長度通常至少為15個(例如，20，25,30，40或50)核苷酸。本領域技術人員應當知道核酸雙鏈(duplex)或雜種的穩定性取決于Tm，而在含鈉的緩沖液中，Tm是鈉離子濃度和溫度的函數(Tm=81.5°C-16,6(Log10[Na+])+0.41(%(G+C)600/1)，或類似的方程)。因此，決定雜種穩定性的洗滌條件的參數為鈉離子濃度和溫度。為了鑒定某一分子與一已知的核酸分子是相似的，而不是相同的，可假設1%的錯配將會導致Tm降低約1°C。例如，如果認為核酸分子有大于95%的同一性，則最終的洗滌溫度將降低約5。C。基于這些考慮，本領域的技術人員將能夠輕松地選擇合適的雜交條件。在優選的實施方式中，選擇的是嚴格的雜交條件。例如，以下條件可應用于獲得嚴格雜交基于上述方程，在5x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)/5xDenhardt，s溶液/1.0%SDS中于Tm-5°C的條件下進行雜交，然后在60°C下用0.2xSSC/0.1%SDS洗滌。適度的嚴格雜交條件包括在42。C下于3xSSC中洗滌的步驟。然而，應當理解的是，相當的嚴格度可通過使用替代緩沖液、鹽和溫度來達成。另外，還可在如下著作中找到關于雜交條件的其他指導CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.，2002，以及Sambrooketal.，MolecularCloning:aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001。在此使用的術語"結合蛋白"指特異性地結合到其他物質上的蛋白。在一實施方式中，結合蛋白為抗體或抗體片段。在此使用的術語"本發明的結合蛋白"包括本發明的抗體或抗體片段。"適合體內施用的生物相容性形式"是指一種被施用的物質的形式，其療效超過任何毒效。在此使用的術語"癌癥"包括可被本發明的結合蛋白，優選為本發明的抗體或抗體片段結合的任何癌癥。在此使用的術語"與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體"是指表達于癌細胞表面的葡萄糖轉運體8的新的變異體。在本發明的一實施方式中，與癌癥相關的GLUTS的變異體具有與GLUT8相同的作為糖的轉運體的功能，但位于細胞中的不同位置。例如，與癌癥相關的GLUTS的變異體具有與GLUTS相同的作為糖的轉運體的功能，但定位于細胞的表面。在另一實施方式中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體是含有由SEQIDNO:11定義的氨基酸序列的蛋白質。在又一實施方式中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體是含有由SEQIDNO:12定義的氨基酸序列的蛋白質。在再一實施方式中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體是含有由SEQIDNO:13定義的氨基酸序列的蛋白質。在本發明的另一實施方式中，與癌癥相關的GLUTS的變異體包含了在N-端的二-亮氨酸部分發生改性的GLUT8。在本發明的又一實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性為二-丙氨酸。在此使用的"保守氨基酸取代"是指在該氨基酸中，一氨基酸殘基被另一氨基酸殘基所取代，而不喪失該蛋白質所期望的功能。在該方法中可使用對照。在此使用的術語"對照"是指受測試者或一組受測試者中的樣品，已知他們或者患有癌癥，或者不患有癌癥。所用的術語"可控制的釋放系統"指本發明的免疫偶聯物和/或其他癌癥治療劑可以可控制的方式施用。例如，用微型泵可直接將可控制的劑量送至腫瘤區域，從而能夠精確地調節藥物組合物遞送的時機和濃度(例女口參見Goodson,1984,inMedicalApplicationsofControlledRelease,vol.2,pp.115-138)。術語"肽的衍生物"是指具有一個或多個通過功能性側基反應而發生化學衍生的殘基的肽。這樣的衍生的分子包括那些自由氨基被衍生形成胺鹽酸鹽、對甲苯磺酸基、芐氧羰基、叔丁基氧基羰基、氯乙酰基或甲酰基形式的分子。自由的羧基可衍生形成鹽、甲酯、乙酯或其它形式的酯或酰肼。自由的羥基可衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可衍生形成N-im-芐基組氨酸。其它的衍生物包括那些含有20個標準氨基酸中一個或多個天然氨基酸衍生物的肽。例如，4-羥基脯氨酸可代替脯氨酸；5-羥基賴氨酸可代替賴氨酸；3-甲基組氨酸可代替組氨酸；高絲氨酸可代替絲氨酸；以及鳥氨酸可代替賴氨酸。術語"檢測或監控癌癥"是指確定受測試者是否患有癌癥以及癌癥程度的方法或過程。并且，本發明的結合蛋白可被用于檢測或監控疾病的出現和發展。在此使用的術語"直接施用"是指免疫偶聯物和/或其他癌癥治療劑可在腫瘤內、血管內和腫瘤周圍施用，而無限制。例如，免疫偶聯物可通過一次或多次直接注射到腫瘤中、通過連續或間斷地灌注入腫瘤中、通過引入免疫偶聯物蓄庫、通過在腫瘤中引入一緩慢釋放裝置、通過在腫瘤中引入一緩慢釋放的配方，和/或通過直接應用在腫瘤上來進行施用。"在腫瘤中"施用的方式包括將免疫偶聯物和/或其他癌癥治療劑引入腫瘤區域，或引入基本上直接流入腫瘤區域的血管或淋巴管中。在此用的術語"有效量"是指在一定劑量下和一段時間內有效達到預期結果的量。免疫偶聯物的有效量可根據一些因素如動物的疾病狀態、年齡、性別、體重而變化。可對治療劑量進行調整，以提供最佳治療反應。例如，可將劑量分為若干次每日施用，或可以根據治療情況的緊迫度而適當地降低劑量。"葡萄糖轉運體8"(GLUT8)是由在人染色體9上發現的基因s/c2M編碼的蛋白質。其是GLUT蛋白質家族中III級中的一員，已知具有轉運糖的能力。GLUT8的長度為477個氨基酸，是約50kDa的II型跨膜蛋白質。其具有12個跨膜區域。在TM1和TM2之間具有一個短的假定的細胞外環，以及在TM9和TM10之間具有一個長的細胞外環。該術語包括了GLUT8的變異體。(GLUT/SLC2A家族命名法Amer.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282:E974-76，2002.)在此用的術語"重鏈互補決定區"指在抗體分子的重鏈可變區域內的超變區。重鏈可變區有3個互補決定區，從氨基端到羧基端，分別是重鏈互補決定區l、重鏈互補決定區2和重鏈互補決定區3。在此用的術語"重鏈可變區"指重鏈的可變區。在此用的術語"本發明的免疫偶聯物"包含(l)結合蛋白，優選為本發明的抗體或抗體片段，其附于(2)效應物分子上。效應物分子可以是某人希望遞送到癌癥細胞的任何分子，其包括但不限于(i)一種標記物，其可直接或間接地生成可檢測的信號，或者是(ii)一種癌癥治療試劑，例如是毒害細胞的、抑制細胞生長的，或是阻止或降低癌癥細胞分裂和/或轉移的能力的毒素。在此使用的術語"分離的核酸序列"是指在用重組DNA技術產生時基本上沒有細胞物質或培養介質的核酸，或在用化學合成時基本上沒有化學前體或其他化學物質的核酸。另外，分離的核酸基本上也沒有那些天然側接于核酸(即位于核酸5'和3'端的序列)的序列，而由此衍生出該核酸。術語"核酸"意在包括DNA和RNA，可以是雙鏈的或單鏈的。在此使用的術語"分離的蛋白質"是指在用重組DNA技術產生時基本上沒有細胞物質或培養介質的蛋白質，或在用化學合成時基本上沒有化學前體或其他化學物質的蛋白質。其包括本發明的輕鏈互補區1，2和3、本發明的重鏈互補區l，2和3、本發明的輕鏈可變區、本發明的重鏈可變區和本發明的結合蛋白和結合到本發明的結合蛋白上的抗體。在此用的術語"輕鏈互補決定區"指在抗體分子的輕鏈可變區域內的超變區。輕鏈可變區有3個互補決定區，從氨基端到羧基端，分別是輕鏈互補決定區1、輕鏈互補決定區2和輕鏈互補決定區3。在此用的術語"輕鏈可變區"指輕鏈的可變區。GLUT8中的術語"在N-端的二-亮氨酸部分的改性"是指在N-端的二-亮氨酸部分發生的改變，其影響了GLUT8的定位，使得GLUT8在細胞表面，優選為癌細胞表面表達。在本發明的一實施方式中，N-端基二-亮氨酸部分變為了二-丙氨酸。在此用的術語"改性的bouganin"指具有在PCT/CA2005/000410和美國專利申請號11.084,080中描述的具有減少的傾向性以激活免疫反應的改性的bouganin。在一個例子中，改性的bouganin具有氨基酸序列(SEQIDNO:29):P畫GILKFKSSK.在此用的術語"核酸序列"是指含天然堿基、糖和糖間(骨架)鍵連的核苷或核苷酸單體的序列。該術語也包括含有非天然的單體或其部分的改性的或取代過的序列。本發明的核酸序列可以是脫氧核糖核酸(DNA)的序列或核糖核酸(RNA)的序列，并可包括天然的堿基，其包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列也可含改性的堿基。這些改性的堿基的例子包括氮和脫氮腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黃嘌呤和次黃嘌呤。在此用的術語"樣品"是指任何由受測試者中獲得的任何液體、細胞或組織樣品，其可用于進行癌癥測定。在此用的術語"序列同一性"指兩個多肽序列中的序列相同的百分比例。為確定兩個多肽序列中的序列相同的百分比例，需將該兩個序列的氨基酸序列進行排序，優選用ClustalW運算法貝lj(Thompson，JD，HigginsDG,GibsonTJ，1994,NucleicAcidsRes,22(22):4673-4680)，及BLOSUM62記分矩陣(HenikoffS.andHenikoffJ.G.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919)，以及空位開放罰分為10，空位延伸罰分(gapextensionpenalty)為O.l，這樣就獲得了兩序列中最高等級的匹配，而在該兩序列中之一的至少50%的總長度包括在序列對比之中。另一可用于序列對比的方法是Needleman和Wunsch序列對比法(J.Mol.Biol.，1970,48:443)，其由Smith禾卩Waterman加以修改(Adv.Appl.Math"1981,2:482)，從而就獲得了兩序列中最高等級的匹配，并確定了兩序列中相同的氨基酸的數目。其他計算兩氨基酸序列之間的同一性百分比的方法通常有如在Carillo和Lipton(SIAMJ.AppliedMath.，1988,48:1073)中描述的方法，以及在ComputationalMolecularBiology,Lesk,e.d.OxfordUniversityPress,NewYork,1988，Biocomputing:InformaticsandGenomicsProjects中描述的方法。通常，計算機程序會被用于這些計算。可用于此的計算機程序包括但不限于GCG(Devereuxetal.，NucleicAcidsRes.，1984，12:387)BLASTP，BLASTN禾QFASTA(Altschuletal.,J.Molec.Biol"1990:215:403)。術語"N-端的二-亮氨酸部分"是指在GLUTS中的N-端的二-亮氨酸部分，其涉及蛋白質定位到細胞的細胞內區域。在本發明的一實施方式中，二-亮氨酸部分位于GLUT8的12-13處。在此用的術語"受測試者"是指動物界中的任何成員，優選為哺乳動物，更優選為人。在一優選的實施方式中，受測試者疑似或確實患有癌癥。在此用的術語"治療癌癥"指抑制癌細胞的復制，抑制癌細胞的擴散(轉移)，抑制腫瘤的生長，減少癌細胞的數量或腫瘤生長，降低癌癥的惡性程度(例如，增加的癌細胞分化)，或改善與癌癥相關的癥狀。在此用的術語"變異體"包括本發明的氨基酸和核苷酸序列的改性或化學等同物，其與本發明的氨基酸和核酸序列以基本上相同的方式實現基本上相同的功能。例如，本發明的蛋白的變異體包括但不限于保守氨基酸取代。本發明的蛋白的變異體還包括本發明的蛋白的添加和缺失。此外，變異的肽和變異的核苷酸序列包括它們的類似物和衍生物。fB)本發明的蛋白和核酸0^鏈界置鏈互^挽定區以及袞楚^7簠鏈^變區本發明提供分離的輕鏈互補決定區1，其包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQIDNO:l)。本發明還提供分離的輕鏈互補決定區2，其包含氨基酸序列AASSLHS(SEQIDNO:2)。此外，本發明還提供分離的輕鏈互補決定區3，其包含氨基酸序列LQYSTYPIT(SEQIDNO:3)。本發明提供分離的重鏈互補決定區1，其包含氨基酸序列NYAMS(SEQIDNO:4)。本發明還提供分離的重鏈互補決定區2，其包含氨基酸序列AITPSGGSTNYADSVKG(SEQIDNO:5)。此外，本發明還提供分離的重鏈互補決定區3，其包含氨基酸序列VPYRSTWYPLY(SEQIDNO:6)。本發明提供分離的輕鏈互補決定區1,2和3，其分別包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQIDNO:l)，AASSLHS(SEQIDNO:2)和LQYSTYPIT(SEQIDNO:3);以及分離的重鏈互補決定區1，2和3，其分別包含氨基酸序列NYAMS(SEQIDNO:4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQIDNO:5)和VPYRSTWYPLY(SEQIDNO:6)。本發明還包括CDR序列的變異體，其能結合到由上述CDR序列識別的相同的抗原決定位或抗原上。本發明的其他方面還涉及分離的輕鏈可變區，其包含本發明的輕鏈互補決定區1,2禾卩/或3(SEQIDNOS:l-3);以及重鏈可變區，其包含本發明的重鏈互補決定區1,2禾Q/或3(SEQIDNOS:4-6)。在一實施方式中，輕鏈可變區包含示于圖1中的氨基酸序列(SEQIDNO:7)，而重鏈可變區包含示于圖2中的氨基酸序列(SEQIDNO:9)。本發明還包括分離的輕鏈可變區和重鏈可變區的變異體，它們可結合到由上述分離的輕鏈可變區和分離的重鏈可變區序列識別的相同的抗原決定位或抗原上。本領域的技術人員應當理解，本發明包括氨基酸序列SEQIDNOS:l-6，7和9的變異體，包括本發明公開的序列的化學等同物。這樣的等同物包括與在此揭露的特異性蛋白以基本相同的方式實現基本相同的功能的蛋白。CDR序列的功能變異體將能夠結合到由天然CDR序列識別的抗體或抗原決定位。例如，等同物包括但不限于保守氨基酸取代。在一個實施方式中，輕鏈互補決定區1，2和3及重鏈互補決定區1，2和3的變異的氨基酸序列分別至少有50%，優選為至少60%，更優選為至少70%，最優選為至少80%，及進一步更優選為至少90%的序列與SEQIDNOS:l-6相同。在另一實施方式中，輕鏈可變區及重鏈可變區的變異的氨基酸序列至少有50%，優選為至少60%，更優選為至少70%，最優選為至少80%，及進一步更優選為至少90%的序列分別與SEQIDN0S:7和9相同。本發明還提供編碼本發明的輕鏈可變區的分離的核酸序列，以及編碼本發明的重鏈可變區的分離的核酸序列。在一實施方式中，輕鏈可變區包含示于圖1中的核酸序列(SEQIDNO:8)。在另一實施方式中，重鏈可變區包含示于圖2中的核酸序列(SEQIDNO:10)。本發明還包括編碼本發明的輕鏈可變區和重鏈可變區的核酸序列的變異體。例如，變異體包括至少在適度的嚴格雜交條件下，雜交到編碼本發明的輕鏈可變區和重鏈可變區的核酸序列上的核苷酸序列。本發明還提供編碼輕鏈互補決定區1，2和/或3的分離的核酸序列，其分別包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQIDNO:l)，AASSLHS(SEQIDNO:2)和LQYSTYPIT(SEQIDNO:3);以及編碼重鏈互補決定區1,2和/或3的分離的核酸序列，其分別包括氨基酸序列NYAMS(SEQIDNO:4)，AITPSGGSTNYADSVKG(SEQIDNO:5)禾口VPYRSTWYPLY(SEQIDNO:6)。本發明還提供編碼示于圖1中的輕鏈可變區(SEQIDNO:7)的分離的核酸序列，以及編碼示于圖2中的重鏈可變區(SEQIDNO:9)的分離的核酸序列。本發明還包括編碼以上討論的CDR序列的變異體和變異區域的分離的核酸序列。變異的核酸序列包括至少在適度的嚴格雜交條件下，雜交到編碼示于SEQIDNOS:l-6,7和9中的氨基酸序列以及其變異體上的核酸序列。問^會歪A本發明的另一方面是結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，其包含至少一個本發明的輕鏈互補決定區(即一個或多個SEQIDNOS:l-3)和/或至少一個本發明的重鏈互補決定區(即一個或多個SEQIDNOS:4-6)。這樣的結合蛋白可通常被稱作"本發明的結合蛋白"，或優選地被稱之為"本發明的抗體或抗體片段"。在一實施方式中，該結合蛋白，優選地為抗體或抗體片段，包含輕鏈互補決定區1,2和3，其分別包含氨基酸序列RASQDISNYLA(SEQIDNO:1)，AASSLHS(SEQIDNO:2)和LQYSTYPIT(SQIDNO:3);以及分離的重鏈互補決定區1，2和3，其分別包含氨基酸序列NYAMS(SEQIDIDNO:6)。本發明還提供結合蛋白，優選地為抗體或抗體片段，其包含本發明的示于圖1中的輕鏈可變區(SEQIDNO:7)和/或示于圖2中的重鏈可變區(SEQIDNO:9)。本領域的技術人員應當理解，本發明包括上述公開的特異性結合蛋白的變異體，其包括上述公開的序列的化學等同物。這樣的等同物與上述公開的結合蛋白以基本上相同的方式實現基本上相同的功能。如上述公開的結合蛋白，結合蛋白的功能性變異體將能結合到相同的抗原上。在一實施方式中，結合蛋白結合到葡萄糖轉運體8或其變異體、一個包含氨基酸序列SEQIDNOS:11-20，優選為SEQIDNOS:ll-13中任何一個的蛋白質、或在癌細胞表面表達的與癌癥相關的GLUT8的變異體上。本發明者們發現了在癌細胞表面表達的GLUT8的新的變異體。因此，本發明包括了對與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體產生特異性的結合蛋白。在一實施方式中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體包含由SEQIDNOS:11-13定義的氨基酸序列中的任何一個，或其變異體。在本發明的另一實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體包含在N-端的二-亮氨酸部分發生改性的GLUT8。在又一實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分已被改性為二-丙氨酸。在一些實施方式中，抗體或抗體片段包含所有或部分重鏈恒定區，例如IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgAl,IgA2，IgE，IgM或IgD恒定區。優選地，重鏈恒定區是IgGl重鏈恒定區。再有，抗體或抗體片段可包含所有或部分k(kappa)輕鏈恒定區或人(lambda)輕鏈恒定區。優選的是，輕鏈恒定區是X輕鏈恒定區。為產生人的單克隆抗體，產生抗體的細胞(淋巴細胞)可從癌癥患者中獲得，且通過標準的體細胞融合程序與骨髓瘤細胞融合，從而無限增殖化這些細胞以產生雜交瘤細胞(hybridomacells)。這些技術已為本領域所熟知(例如，首先由Kohler和Milstein提出的雜交瘤技術(A^we^M:495-497(1975))，以及其他的技術，例如人B-細胞雜交瘤技術(Kozboretal.，/wmw2o/.7b^y4:72(1983))，EBV-雜交瘤技術以產生人單克隆抗體(Coleetal.,A/eAo^五"矽mo/，m:140-67(1986))，和篩選組合抗體文庫(Huseetal.,Sc/gwcg246:1275(1989))。雜交瘤細胞可經免疫化學篩選以產生與癌細胞的特異性反應的抗體，而且該單克隆抗體可以被分離。對特殊的抗原或分子，如癌細胞上的抗原或分子有反應性的特異性抗體，或抗體片段也可通過篩選編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達文庫，并表達于具有細胞表面成分的細菌來產生。例如，完整的Fab片段，VH區域和FV區域可使用抗菌素表達文庫來表達在細菌中(例如，參見Ward等，Atoi^g341:544-546(1989);Huse等，Sc/g"cg246:1275-1281(1989);禾口McCafferty等，A^we，:552-554(1990))。本發明包括所有的與本發明的抗體或抗體片段結合到相同抗原的抗體和抗體片段。本領域的技術人員應當理解結合測試可用于發現具有與本發明的抗體或抗體片段相同的結合特異性的其他抗體和抗體片段。如以下所示例的，競爭結合測定可用于發現這樣的其他抗體。在使用流式細胞儀進行競爭測定前，先確定本發明的抗體的最低濃度(Abl)，在該濃度下，抗體對固定數量的癌細胞(例如，用于VBl-050的A-375細胞)產生最大的結合。從呈指數增長的培養物中收集總計為106個細胞，并與各種濃度的抗體于4。C下溫培1小時。細胞經洗滌并與適當的探測抗體于4。C下再溫培1小時。洗滌后，細胞用流式細胞儀進行分析。對每一測試抗體，以中熒光強度對抗體濃度作圖，由數據得到飽和曲線。對于競爭測定，癌細胞按上述進行制備，并用固定濃度的抗體(Abl)以雙份進行處理。該固定濃度是抗體對按上述確定的固定數量的癌細胞產生最大的結合的最低濃度。在加入Abl后立即向每個試管中加入不同濃度的潛在抑制抗體(Ab2)，并將混合物在4。C下溫培1小時。抑制百分比以及隨最大的中熒光強度的變化均通過從各測試樣品(Abl+Ab2)的中熒光強度讀數中扣除背景熒光強度(PBS-5Q/。FCS)而計算得到。然后，得到的結果除以Abl的中熒光強度(最大結合)與背景強度(如下)的差。再乘以100后得到抑制百分比的結果。用重復點的平均值及它們相對的標準誤差對抗體濃度作圖。以下公式用于計算抑制百分比PI=(MF(Abl+Ab2)—MF背景)/(MFaw-MF背景)Ix100其中，PI=抑制百分比；MF(Abl+Ab2)=由Abl+Ab2混合物測得的中熒光強度；MFWS=以PBS-5。/oFCS得到的背景中熒光強度。從而，本發明提供能結合到癌細胞上抗原的結合蛋白，其中，該結合蛋白可通過如下方法鑒定，該方法包括(1)用最小濃度的本發明的結合蛋白與固定數量的癌細胞一起溫培，優選是以產生對固定數量的癌細胞的最大結合的抗體或抗體片段(Abl)，并測量(Abl)的中熒光強度(MF^);(2)通過向Abl和癌細胞中加入Ab2，對測試的結合蛋白(Ab2)的兩個或更多濃度進行測試，并測量中熒光強度(MF(Ab,+Ab2));(3)測量背景熒光強度(MF背最)；(4)計算PI，其中，PI=[(MF(Abl+Ab2)—MF背景)/(MFAb,-MF背楚)]xlOO;以及(5)將PI與對照物的PI值進行比較；其中，與對照物的PI有在統計上顯著不同的PI表明該測試的結合蛋白能夠結合到癌細胞的抗原上。本領域的技術人員應當知道，通過增加其對抗原、葡萄糖轉運體8或其變異體的親和力，親和力成熟技術(affinitymaturationtechniques)可用于改性本發明的結合蛋白或免疫偶聯物。通常使用兩種策略來增加抗體的結合親和力。一種方法應用到Ab-Ag復合物的晶體結構的分辨率來鑒定抗原結合中涉及的關鍵殘基(DaviesD.R.，CohenG.H.1996.Interactionsofproteinantigenswithantibodies.ProcNatl.Acad.Sci.U.SA.93,7-12)。接著，這些殘基可發生突變而增加交互作用。另一方法是模仿體內的抗原刺激，其驅動由B細胞產生的免疫球蛋白的親和力成熟。在免疫反應的成熟過程中，免疫球蛋白的可變區發生體細胞突變(McHeyzer-WilliamsM.2003.B-cellsignalingmechanismandactivation.FundamentalImmunology,Fifthedition,195-225)。該對免疫系統有高度特異性的過程，其特征在于在非常高的速率下引入點突變。它僅僅發生在編碼可變區的DNA片段中，且不包括保守區域。然后，表達發生了體細胞突變的變異的抗體的B細胞被進行抗原介導的選擇，從而選擇有更高親和力的免疫球蛋白。為在體外重復該現象，采用了多種方法以通過任意的或靶向的過程來引入突變。任意的突變可使用傾向差錯PCR、鏈改組或突變大腸桿菌菌株來引入(ClacksonT.HoogenboomN.R.,GriffithsA.D.andWinterG.1991Makingantibodyfragmentsusingphagedisplaylibraries.Nature352，624-628,HawkinsR.E.，RussellS.J.andWinterG.1992.Selectionofphageantibodiesbybindingaffinity.Mimickingaffinitymaturation.J,Mol.Biol.226,889-896,LowN.,HolligerP.andWinterG.1996.Mimickingsomatichypermutation:affinitymaturationofantibodiesdisplayedonbacteriophageusingabacterialmutatorstrain.JMol.Biol.260,359-368)。由該策略產生了巨大的文庫，并通過如核糖體、噬菌體或酵母等的展示技術來選擇反應性的克隆。(MinL.(2000).Applicationsofdisplaytechnologyinproteinanalysis.Nat.Biotechnol.18,1251-1256)。CDRs的靶向突變，特別是輕鏈和重鏈的CDR3，已展示出其為增加抗體親和力的有效技術。CDR3的3—4個氨基酸段或被稱為"熱點"的特異性區域被靶向以形成突變。據Yang等報道，通過4個CDR殘基的突變，抗-HIVgpl20Fab片段增加了420倍的親和力(YangW.P.,GreenK.，Pinz誦SweeneyS.,BrionesA.T.,BurtonD.R.andBarbasC.F.III.1995.CDRwalkingmutagenesisfortheaffinitymaturationofapotenthumananti-HIV-1antibodyintopicomolarrange.J.Mol.Biol"254，392-403)。在C6.5scFv中的VLCDR3的一個突變與VHCDR3的三個突變組合得出1230倍的親和力的增加。(SchierR.，McCallA.,AdamsG.P.，MarshallK,W.，MerritH.,YinM.，CrawfordR.S.WeinerL.M.，MarksC.andMarksJ.D.1996.Isolationofpicomolaraffinityanti-c-erbB-2single-chainFvbymolecularevolutionofthecomplementarydeterminingregionsinthecenteroftheantibodybindingsite.J.Mol.Biol"263，551-567)。"熱點"是體內發生體細胞超突變的序列。(NeubergerM.SandMilsteinC.1995.Somatichypermutation.Curr.Opin.Immunol,7,248-254)。熱點序列可被定義為在某些密碼子中的共有核苷酸序列。共有序列是四核苷酸，RGYW，其中，R可以是A或G，Y可以是C或T，W可以是A或T(NeubergerM.SandMilsteinC.1995.Somatichypermutation.Curr.Opin.Immunol.7，248-254)。此外，由核苷酸AGY編碼的絲氨酸殘基主要存在于可變區域的CDR區，優于位于那些由TCN編碼的對應于潛在熱點序列之上的絲氨酸。(WagnerS.D.,MilsteinC.andNeubergerM.S.1995.Codonbiastargetsmutation.Nature,376,732)。結構分析表明，CDR環，特別是CDR3環，對抗原結合貢獻最大(GiudicelliV.，ChaumeD.andLefrancM.R2004.IMGT/V-QUEST，anintegratedsoftwareprogramforimmunoglobulinandTcellreceptorV-JandV-D-Jrearrangementanalysis.NucleisAcidsRes.32，435-440)。因此，本發明每一抗體的重鏈和輕鏈的CDRs的核苷酸序列均被掃描以檢査熱點序列和AGY密碼子的存在。使用國際免疫原Tics數據庫(InternationalImMunoGenTicsdatabase),將輕鏈和重鏈的CDR區中經鑒定的熱點與重鏈和輕鏈的生殖序列進行比較(IMGT,http:〃imgt.cines.fr/textes/vquest/)(DaviesD.R.，PadlanE.A.andSheriffS.1990.Antibody-antigencomplexes.Annu.Rev.Biochem.59,439-473)。若一序列與生殖系相同，則說明體細胞突變未發生；因此，任意突變被引入來模仿發生在體內的體細胞事件。與此相反的是，不同的序列則說明一些體細胞突變已經發生。然而該體內的體細胞突變是否為最佳，還有待于確定。編碼CDR中埋藏的或保守的氨基酸的熱點未被誘變。這些殘基通常對整個結構都是至關重要的，且由于它們被埋藏而不太可能與抗原發生作用。此外，該序列可以與生殖系序列中預測的主要是發生體細胞突變之處相比較(TomlinsonI.M.，CoxJ.RL.,GherardiE.，LeskA.M.andChotiaC.1995.ThestructuralrepertoireofthehumanYldomain.EMBOJ.14，4628-4638，TomlinsonI.M.，WalterG"JonesP.T.,DearP.H.，SonnhammerE丄丄.andWinterG.1996.TheimprintofsomatichypermutationontherepertoireofhumangermlineVgenes.J.Mol.Biol.256，813-817)。類似的策略應用于BL22scFv的親和力成熟。對重鏈的CDR3引入的點突變導致5—10倍在多種CD22陽性細胞系的結合活性的增加(SalvatoreG.,BeersR.，MarguliesI.，KreitmanR.J.andPastanI.2002.Improvedcytotoxicactivitytowardcelllinesandfreshleukemiacellsofamutantanti-CD22immunotoxinobtainedbyantibodyphagedisplay.ClinicalCancerresearch,8,995-1002)。此外，在CDR1和CDR2環中的多種氨基酸的突變也產生了具有在3—7倍的范圍內增加的親和力的突變體(HoM.，Kreitman丄,OndaM.andPastanI.2005.Invitroantibodyevolutiontargetinggermlinehotspotstoincreaseactivityofananti-CD22immunotoxin.J.Biol.Chem.,280,607-617)。在通過任意的或靶向的過程引入突變后，抗體得以表達并被評價其功能。例如，可基于結合進行功能性篩選。一旦功能得以評價，即可用已知的方法進行所選抗體的DNA排序。在另一個實施方式中，錨固周質的表達(anchoredperiplasmicexpression)(APEx)方法被用于本發明的結合蛋白或免疫偶聯物的親和力成熟，該方法被描述于Harvey,B等中(PNAS2004June22;101(25):9193-8)。從而，本發明包括本發明的結合蛋白，該結合蛋白經親和力成熟化而增加結合蛋白對葡萄糖轉運體8或其變異體的親和力、一種包含SEQIDNOS:11-20，優選SEQIDNOS:ll-13的氨基酸序列的蛋白質，或一種與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體。本發明還提供了包含本發明的結合蛋白的組合物，優選的是抗體和抗體片段，并附有藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑或穩定劑。,鄉與艦被微嚴如上所述，本發明者們已鑒定了與本發明的結合蛋白結合的抗原。該新的與癌癥相關的抗原表達在癌細胞的表面，在正常細胞表面無顯著表達。因此，本發明包括能夠特異性地與本發明的結合蛋白之一結合的分離的蛋白質，及其氨基酸序列和其應用。在一實施方式中，本發明提供一種包含葡萄糖轉運體8或其變異體的分離的蛋白質。在另一實施方式中，本發明提供一種包含氨基酸序列SEQIDNOS:11-20中任何一個或其變異體的分離的蛋白質。在又一實施方式中，本發明提供一種包含氨基酸序列SEQIDNOS:11或其變異體的分離的蛋白質。本發明還提供一種包含氨基酸序列SEQIDNOS:12或其變異體的分離的蛋白質。進而,本發明還提供一種包含氨基酸序列SEQIDNOS:13或其變異體的分離的蛋白質。此外，本發明提供一種表達在癌細胞的表面的與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體。在本發明的一實施方式中，與癌癥相關的GLUTS的變異體包含由SEQIDNOS:11,12或13中的任何一個或其變異體定義的氨基酸序列。在本發明的另一實施方式中，與癌癥相關的GLUTS的變異體包含在N-端的二-亮氨酸部分發生改性的GLUT8。在本發明的進一步的實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性為二-丙胺酸。本領域的技術人員應當理解，本發明包括氨基酸序列SEQIDNOS:ll-13的變異體，包括本發明公開的序列的化學等同物的變異體。這樣的等同物包括一種與在此公開的特異性蛋白以基本上相同的方式實現基本上相同的功能的蛋白。例如，等同物包括但不限于保守氨基酸取代。在一個實施方式中，本發明的分離的蛋白質的變異的氨基酸序列至少有50%，優選為至少60%，更優選為至少70%，最優選為至少80%，進一步更優選為至少90%的序列分別與SEQIDNOS:11-13相同。本發明包括分離的蛋白質的使用。例如，使用本發明的分離的蛋白質來生成結合蛋白和免疫偶聯物，其可用于治療或預防癌癥，或可用于探測或監控受測試者中的癌癥。因此，本發明包括本發明的分離的蛋白質在生產治療或預防癌癥的藥物中的應用。(C)免疫偶聯物本發明也包括一種免疫偶聯物，其包括(1)本發明的的結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，其附于(2)效應物分子上。在一實施方式中，本發明的結合蛋白結合到癌細胞上的抗原或分子上。抗原可以是葡萄糖轉運體8或其變異體；一種包含氨基酸序列SEQIDNOS:U-20，優選為SEQIDNOS:ll，12或13中任何一個的蛋白質;或與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體。在本發明的一實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體包含由SEQIDNOS:11,12或13中的任何一個或其變異體定義的氨基酸序列。在本發明的另一實施方式中，GLUTS的與癌癥相關的變異體包含在N-端的二-亮氨酸部分產生改性的GLUT8。在本發明的又一實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性為二-丙胺酸。在一個優選的實施方式中，效應物分子是(i)一種標記物，其可直接或間接地生成可檢測的信號，或者是(ii)一種癌癥治療試劑，其或者是毒害細胞的、抑制細胞生長的，或者是阻止或降低癌癥細胞分裂的和/或轉移的能力。該免疫偶聯物在此通常被稱為"本發明的免疫偶聯物"。在本發明的一個實施方式中，效應物分子是一種癌癥治療試劑，該癌癥治療試劑優選為一種毒素，其或者是毒害細胞的、抑制細胞生長的，或者是阻止或降低癌癥細胞分裂的和/或轉移的能力。因此，本發明的一方面是一種免疫偶聯物，包含(l)本發明的結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，其附于(2)—種癌癥治療試劑，例如細胞毒素上。在另一實施方式中，免疫偶聯物被內化，且癌癥治療試劑是一種細胞毒素，其阻礙了細胞的蛋白質合成，從而導致細胞的死亡。重要的是，由于大多數正常細胞不會廣泛表達位于癌細胞上的抗原，它們不能結合并內化免疫偶聯物，從而保護其不會被毒素或其它癌癥治療試劑的殺傷效應。可在本發明的免疫偶聯物中使用多種效應物分子，而若干這樣的效應物分子是細胞內活化的分子。因此，在本發明的一個實施方式中，免疫偶聯物被癌癥細胞內化。在優選的實施方式中，效應物分子是一種癌癥治療試劑，更優選的是包含具有核糖體失活活性的多肽的細胞毒素，其包括但不限于多花白樹毒素(gelonin)、bouganin、阜草毒素(saporin)、篦麻毒素(ricin)、篦麻毒素A鏈、異株瀉根毒素(biyodin)、白喉毒素(diphtheriatoxin)、局限曲菌素(restrictocin)、假單細胞菌外毒素A(PseudomonasexotoxinA)和它們的變異體。當蛋白是核糖體失活蛋白時，免疫偶聯物必須在結合到癌細胞時被內化，從而使該蛋白對細胞產生細胞毒害性。因此，在本發明的一實施方式中，效應物分子是一種毒素，且免疫偶聯物被癌癥細胞內化。在本發明的一個實施方式中，毒素是bouganin或假單細胞菌外毒素A，以及它們的變異體。在另一個實施方式中，毒素是經改性的bouganin，或是失去細胞結合區域的假單細胞菌外毒素A的截去形式。在又一的實施方式中，毒素是基本上失去T細胞的抗原決定位的bouganin，或是由氨基酸252-608組成的假單細胞菌外毒素A的截去形式。在其他的非限制性實施方式中，癌癥治療試劑包含一種破壞DNA的試劑。因此，癌癥治療試劑可以選自但不局限于烯二炔類(例如刺孢霉素和埃斯波霉素(esperamidn))以及非烯二炔類的小分子試劑(例如博來霉素(bleomycin)、甲錠丙基乙二胺四乙酸鐵(methidiumpropyl-EDTA-Fe(II)))。可用于本發明中的其他癌癥治療試劑包括fi不限于道諾霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、遠端霉素A(distamycinA)、順鉬(cisplatin)、絲裂霉素C(mitomycinC)、海鞘素(ecteinascidins)、倍癌霉素(duocarmycin)/CC-1065以及博來霉素/培洛霉素(pepleomycin)。在其他非限制性實施方式中，癌癥治療試劑包含一種破壞微管蛋白的試劑。這樣的試劑可包括但不限于力索新(rhizoxin)/美登素(maytansine)、紫杉醇(paclitaxel)、長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicine)、auristatin海兔毒素(dolastatin)10MMAE禾口pelorusideA。在其他的非限制性實施例中，本發明的免疫偶聯物的癌癥治療試劑的部分可包含垸基化試劑，其包括但不限于AsaleyNSC167780、AZQNSC182986、BCNUNSC409962、白消安(Busulfan)NSC750、羧基鄰苯二甲酸鉬(carboxyphthalatoplatinum)NSC271674、CBDCANSC241240、CCNUNSC79037、CHIPNSC256927、苯丁酸氮芥(chlorambucil)NSC3088、氯脲霉素(chlorozotocin)NSC178248、順式-鉬(cis—platinum)NSC119875、克羅米松(clomesone)NSC338947、氰基嗎啉ft阿霉素(cyanomorpholinodoxorubicin)NSC357704、cyclodisoneNSC348948、二去水衛矛醇(dianhydrogalactitol)NSC132313、fluorodopanNSC73754、hepsulfamNSC329680、羥胺硫蒽酮(hycanthone)NSC142982、美法侖(melphalan)NSC8806、甲基CCNUNSC95441、絲裂霉素CNSC26980、米托唑酰胺(mitozolamide)NSC353451、氮芥(nitrogenmustard)NSC762、PCNUNSC95466、哌嗪NSC344007、二酮哌嗪(piperazinedione)NSC135758、哌泊溴烷(pipobroman)NSC25154、甲基絲裂霉素(porfiromycin)NSC56410、螺旋乙內酰脲芥(spirohydantoinmustard)NSC172112、特洛西酮(teroxirone)NSC296934、四氧環己柏(tetraplatin)NSC363812、硫替派(thio-tepa)NSC6396、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)NSC9706、尿嘧啶氮芥(uracilnitrogenmustard)NSC34462和Yoshi-864NSC102627。在其他非限制性實施方式中，本發明的免疫偶聯物的癌癥治療試劑的部分可包含抗有絲分裂試劑，其包括但不限于別秋水仙堿(alocochicine)NSC406042、軟海綿素(Halichondrin)BNSC609395、秋水仙堿(colchicine)NSC757、秋水仙堿衍生物NSC33410、海兔毒素10NSC376128(NG—auristatin衍生的)、美登素(maytansine)NSC153858、力索新(rhizoxin)NSC332598、紫杉醇(taxol)NSC125973、紫杉醇衍生物NSC608832、硫代秋水仙堿(thiocolchicine)NSC361792、三苯甲游基半胱氨酸(tritylcysteine)NSC83265、硫酸長春堿(vinblastinesulfate)NSC49842和硫酸長春新堿(vincristinesulfate)NSC67574。在其他非限制性實施方式中，本發明的免疫偶聯物的癌癥治療試劑的部分可包含拓撲異構酶I抑制劑，其包括但不限于喜樹堿(函ptothecin)NSC94600，喜樹堿鈉鹽NSC100880、氨基喜樹堿(aminocamptothecin)NSC603071、喜樹堿衍生物NSC95382、喜樹堿衍生物NSC107124、喜樹堿衍生物NSC643833、喜樹堿衍生物NSC629971、喜樹堿衍生物NSC295500、喜樹堿衍生物NSC249910、喜樹堿衍生物NSC606985、喜樹堿衍生物NSC374028、喜樹堿衍生物NSC176323、喜樹堿衍生物NSC295501、喜樹堿衍生物NSC606172、喜樹堿衍生物NSC606173、喜樹堿衍生物NSC610458、喜樹堿衍生物NSC618939、喜樹堿衍生物NSC610457、喜樹堿衍生物NSC610459、喜樹堿衍生物NSC606499、喜樹堿衍生物NSC610456、喜樹堿衍生物NSC364830、喜樹堿衍生物NSC606497和嗎啉代阿霉素(morpholinodoxorubicin)NSC354646。在其他非限制性實施方式中，本發明的免疫偶聯物的癌癥治療試劑的部分可包含拓撲異構酶II抑制劑，其包括但不限于阿霉素(doxorubicin)NSC123127、氨萘非特(amonafide)NSC308847、m-AMSANSC249992、蒽吡唑類(anthrapyrazole)衍生物NSC355644、枇唑啉吖啶(pyrazoloacridine)NSC366140、鹽酸比生群(bisantreneHCL)NSC337766、正定霉素(daunorubicin)NSC82151、脫氧阿霉素(deoxydoxorubicin)NSC267469、米托蒽醌(mitoxantrone)NSC301739、美諾立爾(menogaril)NSC269148、N,N-聯卞基正定霉素NSC268242、oxanthrazoleNSC349174、柔紅脖(rubidazone)NSC164011、VM-26NSC122819和VP-16NSC141540。在其他非限制性實施方式中，本發明的免疫偶聯物的癌癥治療試劑的部分可包含RNA或DNA抗代謝物，其包括但不限于L-阿拉諾新(alanosine)NSC153353、5-氮雜胞苷(azacytidine)NSC102816、5-氟尿嘧啶(fl畫薦il)NSC19893、阿西維辛(acivicin)NSC163501、氨基喋呤(aminopterin)衍生物NSC132483、氨基喋呤衍生物NSC184692、氨基喋呤衍生物NSC134033、anantifolNSC633713、anantifolNSC623017、Baker'ssolubleantifolNSC139105、二氯烯丙基甲花醌(dichlorallyllawsone)NSC126771、布利喹啉(br叫uinar)NSC368390、呋喃氟脲嘧啶(ftoraftir)(前體藥物(pro-drug))NSC148958、5，6-二氫-5-氮雜胞嘧啶核苷NSC264880、甲氨蝶呤(methotrexate)NSC740、甲氨蝶呤衍生物NSC174121、N-(磷乙酰基)-L-天冬氨酸酯(PALA)NSC224131、吡唑呋喃菌素(pyrazoflirin)NSC143095、三甲曲沙(trimetrexate)NSC352122、3-HPNSC95678、2'-脫氧-5-氟尿嘧啶NSC27640、5-HPNSC107392、a-TGDRNSC71851、甘氨阿非迪霉素(aphidicolinglycinate)NSC303812、ara-CNSC63878、5-氮-2'-脫氧胞苷NSC127716、卩-TGDRNSC71261、環胞苷NSC145668、胍唑(guanazole)NSC1895、羥基脲NSC32065、次黃嘌呤核苷甘油二醛(inosine(肌苷)glycodialdehyde)NSC118994、麥克菌素(macbecin)IINSC330500、吡唑啉咪唑(pyrazoloimidazole)NSC51143、硫鳥嘌呤NSC752和硫嘌呤(thiopurine)NSC755。在另一非限制性實施方式中，本發明的免疫偶聯物的治療部分可以是核酸。可用的核酸包括但不限于反義RNA、基因或其它多核苷酸、核酸類似物例如硫鳥嘌呤和硫嘌呤。本發明進一步提供了免疫偶聯物，其包含(i)本發明的結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，其附于(2)效應物分子上，該效應物分子為一標記，可直接或間接地生成可檢測的信號。這些免疫偶聯物可用于研究或診斷，例如用于癌癥的體內探測。標記物優選為能夠直接或間接地產生可檢測的信號。例如，標記物可是不透射線的或是放射線同位素，例如，3H、l4C、32P、35S、'23I、'25I、131I;熒光的(熒光團)或化學發光的(發色團)化合物，例如熒光素異硫氰酸鹽(fluoresceinisothiocyanate)、若丹明(rhodamine)或熒光素(luciferin);酶，例如堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)、卩-半孚L糖苷酶(beta-galactosidase)或辣根過氧化酶(horseradishperoxidase);成像試齊U;或金屬離子。在另一實施方式中，免疫偶聯物可被間接地檢測到。例如，對免疫偶聯物有特異性的第二抗體，且含有可用于檢測免疫偶聯物的可探測的標記物。本發明的結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，可通過任何能將該結合蛋白與效應物分子關聯或連接的方式而"附于"效應物分子之上。例如，結合蛋白可通過化學或重組的方式而附于效應物分子上。用于制備融合物或偶聯物的化學方法已為本領域所知，其可用于制備免疫偶聯物。用于偶聯結合蛋白和效應物分子的方法必須能夠將結合蛋白連接到效應物分子上，而不會影響結合蛋白結合到癌細胞上抗原的能力。本發明的結合蛋白可間接地連接到效應物分子上。例如，結合蛋白可直接連接到含有若干種類型中的一種效應物分子的脂質體上。效應物分子和/或結合蛋白也可結合到固體表面上。在一實施方式中，結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，以及效應物分子均是蛋白質且可使用習知方法進行偶聯。有幾百種用于偶聯兩蛋白的偶聯劑。(例如，見"ChemistryofProteinConjugationandCrosslinking".1991，ShansWong,CRCPress,AnnArbor)。通常，偶聯劑的選擇是基于在結合蛋白上或可被插入到結合蛋白的反應性官能團，該結合蛋白優選為抗體或抗體片段、和/或效應物分子。此外，如果有沒有反應性基團，則可使用光活化的偶聯劑。在某些情況下，需要在結合蛋白，優選為抗體或抗體片段和效應物分子之間加入一間隔區(spacer)。本領域已知的偶聯劑包括同源雙官能性試劑(homobifunctionalagents):戊二醛(glutaraldehyde)、乙二酸二甲酯(dimethyladipimidate)和雙重氮對二胺基聯苯(Bis(diazobenzidine))，以及異源官能性試劑(heterobifimctionalagents):間雙馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺(mMaleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide)和硫代間雙馬來酰亞胺苯甲酰-N-輕基琉泊酷亞月安(Sulfo-mMaleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide)。也可使用重組DNA技術來制備結合蛋白一效應物分子蛋白的融合物。在此，編碼結合蛋白的DNA序列融合到編碼效應物分子的DNA序列中，產生嵌合(chimeric)DNA分子。嵌合DNA序列被轉染到宿主細胞中以表達融合蛋白。該融合蛋白可從細胞培養基中回復，并用已知技術進行純化。將作為標記物的效應物分子附在結合蛋白上的例子包括描述于以下文獻中的方法Hunter等，Nature144:945(1962);David等，Biochemistry13:1014(1974);Pain，etal"J.Immunol.Meth.40:219(1981);Nygren,J.Histochem.andCytochem.30:407(1982);WenselandMeares，RadioimmunoimagingAndRadioimmunotherapy,Elsevier,N.Y.(1983);禾口Colcher等.,"UseOfMonoclonalAntibodiesAsRadiopharmaceuticalsForTheLocalizationOfHumanCarcinomaXenograftsInAthymicMice",Meth.Enzymol.，121:802-16(1986)。O))本發明的蛋白質的制備本領域的技術人員應當能理解，本發明的蛋白，例如輕鏈和重鏈的互補決定區、輕鏈和重鏈的可變區、抗體和抗體片段、免疫偶聯物以及與癌癥相關的抗原，可通過許多方法中的任何一種來制備，但最為優選的是采用重組方法進行制備。因此，本發明的核酸分子可通過已知的方式引入到能確保良好地表達本發明的蛋白的合適的表達載體中。可用的表達載體包括但不限于黏端質粒、質粒或改性的病毒(例如，復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒)，只有在載體與所使用的宿主細胞相容時。表達載體為"適合于宿主細胞的轉化"，意為表達載體含有本發明的核酸分子以及基于被用于進行表達的宿主細胞而選擇的調整序列，其有效地連接到核酸分子上。有效地連接意為核酸通過允許核酸進行表達的方式而連接到調整序列上。因此，本發明構思出了本發明的重組表達載體，其含有本發明的核酸分子、或其片段，以及用于轉錄和翻譯插入的蛋白序列的必要的調節序列。適合的調節序列可衍生自多種來源，包括細菌的、真菌的、病毒的、哺乳動物的或昆蟲的基因(例如，見描述于以下文獻中的調節序列Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1990))。適合的調節序列的選擇取決于如下討論的所選的宿主細胞，且這可以由本領域的技術人員容易地實現。這些調節序列的例子包括轉錄啟動區和增強子或RNA聚合酶結合序列、核糖體結合序列，包括一翻譯起始信號。此外，基于所選的宿主細胞以及使用的載體，還可向表達載體中引入其他序列，例如復制起點、附加的DNA限制性位點、增強子以及可施加誘導轉錄的序列。本發明的重組表達載體還可含有選擇性標記基因，從而便于選擇經本發明的重組分子轉化或轉染的宿主細胞。選擇性標記基因的例子是編碼蛋白如G418和潮霉素(hygromycin)這類對某些藥物產生抵制性的蛋白、J3-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基轉移酶、螢火蟲熒光素酶、或免疫球蛋白或其一部分，例如免疫球蛋白的Fc部分，優選為IgG的基因。通過選擇性標記蛋白例如p-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰轉移酶或螢火蟲熒光素酶濃度的改變來監控選擇性標記基因的轉錄。如果選擇性標記基因編碼的蛋白產生對抗生素的抵抗性，例如對新霉素的抵抗性，則被轉化的細胞可用G418進行選擇。插入了選擇性標記基因的細胞將存活，而其他的細胞則會死亡。這就使得對本發明的重組表達載體的表達的顯現和測定，特別是使得確定表達和表現型的突變的效果成為可能。可以理解的是，選擇性標記物可從感興趣的核酸引入到另一個的載體上。重組的表達載體也可以含有編碼融合部分的基因，該融合部分提供重組蛋白的增強的表達；重組蛋白的增強的溶解性；以及通過在親和力純化中作為配體而輔助靶的重組蛋白的純化。例如，蛋白水解的切割位點可被加入到靶的重組蛋白中，以允許在純化融合蛋白后，重組蛋白從融合部分分離。典型的融合表達載體包括pGEX(AmradCorp.,Melbourne,Australia),pMal(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)禾卩pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ)，其分別融合谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A到重組蛋白上。重組表達載體可被引入到宿主細胞中而產生轉化的宿主細胞。術語"用轉化"、"用，,，轉染"、"轉化"和"轉染"意在包含用習知的許多可能的方法之一，將核酸(例如載體)引入到細胞中。在此使用的術語"轉化的宿主細胞"也意在包括能夠進行糖基化的細胞，其已被本發明的重組表達載體進行了轉化。原核細胞可用核酸通過如電穿孔或氯化鈣介導的轉化而被轉化。例如，可用常規技術，如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE—右旋糖苷介導的轉化、脂質轉染劑、電穿孔或微型注射等將核酸引入到哺乳動物細胞中。合適的轉化和轉染宿主細胞的方法均可在Sambrook等(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)的著作以及其他實驗教科書中找到。合適的宿主細胞包括大量不同的真核宿主細胞和原核細胞。例如，本發明的蛋白可在酵母細胞或哺乳動物細胞中得以表達。其他適用的宿主細胞可在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，CA(1991)中找到。此外，本發明的蛋白還可以在原核細胞，如大腸桿菌(Escherichiacoli)(Zhangetal.，Science303(5656):371-3(2004))中表達。再有，還可使用基于假單胞菌屬(尸化z^omowas)的表達系統，例如熒光假單胞菌(尸"Mcfcwowas/7膨escms)(USPatentApplicationPublicationNo.US2005/0186666，Schneider,JaneCetal.)。適合于實現本發明的酵母和真菌宿主細胞包括但不限于釀酒酵母(Sacc/^rawy/cescerevhz'ae入畢赤酵母屬(尸/c/w'a)或克魯維酵母(A7"，erom_yCM)屬，以及各種曲霉菌屬的菌種。用于在釀酒酵母ce/^Ws/。e)中表達的載體包括pYepSecl(Baldari.等，EmboJ.6:229-234(1987)),pMFa(KurjanandHerskowitz,Cell30:933-943(1982)),pJRY88(Schultz等，Gene54:113-123(1987》，和pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。酵母和真菌轉化的協議已為本領域的技術人員所熟知。(見Hinnen等，Pro"Natl.Acad.Sci.USA75:1929(1978);Itoh等，J.Bacteriology153:163(1983),禾卩Cullenetal.(BiolTechnology5:369(1987》。適合于進行本發明的哺乳動物細胞包括COS(例如ATCCNo.CRL1650或1651)、BHK(例如ATCCNo.CRL6281)、CHO(ATCCNo.CCL61)、HeLa(例如ATCCNo.CCL2)、293(ATCCNo.1573)和NS-1細胞。適合于直接在哺乳動物細胞中表達的表達載體通常包括啟動子(例如，來自病毒性物質，如多瘤病毒、腺病毒2、細胞巨化病毒和猿病毒40)，以及其他的轉錄和翻譯控制序列。哺乳動物的表達載體的例子包括pCDM8(Seed,B.,Nature329:840(1987))禾卩pMT2PC(Kaufman等，EMBOJ.6:187-195(1987))。由在此所述的教導，也可以容易地實現啟動子、終止區以及向植物、鳥、昆蟲細胞中引入適當類型的表達載體的方法。例如，在一實施方式中，本發明的蛋白可以從植物細胞得以表達(見Sinkar等.，J.Biosci(Bangalore)11:47-58(1987)，該文綜述了發根土壤桿菌(^grakc&Wwmr/n'zogewes)載體的使用；另見Zambryski等，GeneticEngineering,PrinciplesandMethods,Hollaender禾口Setlow(eds.),Vol.VI,pp.253-278，PlenumPress,NewYork(1984)，該文描述了使用表達載體用于植物細胞，包括PAPS2022、PAPS2023和PAPS2034)。適合于進行本發明的昆蟲細胞包括源自蠶(Som;c)、夜蛾(7Hc/2op/肌'fl)或夜蛾(&o^&ra)種的細胞和細胞系。可用于溫培的昆蟲細胞(SF9細胞)中蛋白表達的桿狀病毒(Baculovirus)載體包括pAc系列(Smith等，Mol.CellBiol.3:2156-2165(1983))和pVL系列(Lucklow，V.A.，和Summers,M.D.,Virology170:31-39(1989))。適合表達本發明的重組蛋白的一些桿狀病毒一昆蟲細胞表達系統描述在PCT/US/02442中。可選擇的，本發明的蛋白也可表達在非人的轉基因動物中，如在大鼠、兔、羊和豬中(Hammer等Nature315:680-683(1985);Palmiter等Science222:809-814(1983);Brinster等Proc,Natl.Acad.Sci.USA82:4438-4442(1985);Palmiter和BrinsterCell41:343-345(1985)以及U.S.PatentNo.4，736，866)。本發明的蛋白可通過化學合成法使用蛋白化學中習知的方法，例如固體相合成法制備(Merrifield,J.Am.Chem.Assoc.85:2149-2154(1964);Frische等，J.Pept.Sci,2(4):212-22(1996))或在均相溶液里合成(Houbenweyl，MethodsofOrganicChemistry,ed.E.Wansch,Vol.15IandII,Thieme,Stuttgart(1987))。N-端的或C-端的融合蛋白包含與其他分子偶聯的本發明的蛋白，例如，蛋白可通過重組技術經融合制備。所得的融合蛋白含有融合到在此描述的挑選的蛋白或標記物蛋白的本發明的蛋白。本發明的重組蛋白也可由己知技術偶聯到其他蛋白上。例如，可使用WO90/10457中描述的異源雙官能性含硫的偶聯劑、N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫-丙酸)或N-琥珀酰亞胺-5-硫代乙酸偶聯蛋白。可用于制備融合蛋白或偶聯物的蛋白的例子包括細胞結合蛋白，例如免疫球蛋白、荷爾蒙、生長因子、外源凝集素、胰島素、低密脂蛋白、胰高血糖素、內啡肽、鐵傳遞蛋白、鈴蟾肽(bombesin)、脫唾液酸糖原蛋白谷胱甘肽-S-轉移酶(asialoglycoproteinglutathione-S-transferase(GST))、紅血球》疑聚素(HA)和截斷的myc。因此，本發明提供了重組表達載體，其包含編碼本發明的蛋白的核酸序列，例如本發明的輕鏈和重鏈互補決定區，輕鏈和重鏈可變區，結合蛋白，例如抗體和抗體片段，以及本發明免疫偶聯物和本發明的新的分離的蛋白質。再有，本發明提供含有本發明的重組表達載體的宿主細胞。(E)本發明的結合蛋白和免疫毒素的治療方法和藥物組合物本發明者們已示出了本發明的結合蛋白結合到葡萄糖轉運體8或其變異體；包含氨基酸序列SEQIDNOS:11-20中任何一個定義的氨基酸序列，優選為ll、12或13，或與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體；或與癌癥相關的GLUT8的變異體上。在本發明的一實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體包含由SEQIDNOS:11,12或13中的任何一個或其變異體定義的氨基酸序列。在本發明的另一實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體包含在N-端的二-亮氨酸部分發生改性的GLUT8。在本發明的進一步的實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性為二-丙胺酸。發明者們還示出了本發明的結合蛋白顯示出對癌細胞的特異性，且它們被細胞所內化。因此本發明的結合蛋白可被用于耙向遞送生物活性的或與醫藥相關的試劑，例如成像試劑、放射性試劑或細胞毒素。在一實施方式中，本發明提供一種治療或預防癌癥的方法，該方法包含向患有或疑似患癌癥的病人施用有效量的本發明的免疫偶聯物。在另一實施方式中，本發明提供有效量的本發明的免疫偶聯物在制造治療和預防癌癥的藥物中的應用。此外，本發明提供有效量的本發明的免疫偶聯物的應用，進一步包含另外的癌癥的治療試劑在制造同時的、分開的或連續的治療或預防癌癥的藥物中的應用。本發明還提供有效量的本發明的免疫偶聯物在治療或預防癌癥中的應用。另外，本發明還提供有效量的本發明的免疫偶聯物，進一步包含使用其它的癌癥治療制劑在制備同時、分開或連續治療或預防癌癥的藥物中的應用。在本發明的一實施方式中，癌癥包括但不限于胃癌、結腸癌、前列腺癌、和子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、頭和頸癌、鱗狀細胞癌、胃腸癌、乳癌(例如惡性腫瘤、輸送管的、小葉的和乳頭的)、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、腦癌、神經母細胞瘤、肉瘤、直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、子宮內膜癌、質漿細胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在一優選的實施方式中，癌癥包括但不限于乳癌、前列腺癌、結腸癌、前列腺癌、子宮頸癌、腎癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、和頭和頸癌。本發明的免疫偶聯物的選擇性抑制或破壞癌細胞的能力可通過使用癌細胞系在體外容易地進行測試。本發明的免疫偶聯物的選擇性抑制效果可通過如展示對癌細胞的細胞增殖的選擇性抑制來確定。毒性也可基于細胞生存能力來測量，例如，癌癥和正常細胞培養基在暴露于免疫偶聯物時的生存能力可進行比較。細胞生存能力可借助已知的技術，如臺盼藍排除:法(trypanblueexclusionassays)進行評價。在另一例子中，可使用許多模型來測試本發明的免疫偶聯物的效力。Thompson,E.W.等(BreastCancerRes.Treatment31:357-370(1994))描述了一種模型，其通過測量腫瘤細胞介導的細胞外基質的蛋白水解和腫瘤細胞對重構基底膜(膠原質、層粘蛋白、纖維連接蛋白、Matrigd或明膠)的入侵，來確定人的乳癌細胞在體外的入侵性。其他的適用的癌細胞模型包括培養的卵巢腺癌細胞(Young,T.N.等Gynecol.Oncol.62:89-99(1996);Moore,D.H.等Gynecol.Oncol.65:78-82(1997))，人濾泡性甲狀腺癌細胞(Demeure，M丄etal.，WorldJ.Surg.16:770-776(1992)),人黑素瘤(A-2058)和纖維肉瘤(HT-1080)細胞系(Mackay,A.R.等Lab.Invest.70:781783(1994))，以及肺鱗狀(HS-24)和腺癌(SB-3)細胞系(Spiess，E.等J.Histochem.Cytochem.42:917-929(1994))。體內測試系統包括摔入腫瘤，且描述了腫瘤在無胸腺的裸鼠中的生長和轉移的測量(Thompson，E.W.等，BreastCancerRes.Treatment31:357-370(1994);Shi:Y.E,等，CancerRes.53:1409-1415(1993))。本發明的免疫偶聯物可配入藥物組合物中，以適合體內施用的生物相容形式給予受試者。可向包括人和動物在內的有機生物施用藥物。施用治療活性量的本發明的藥物組合物被定義為以一定劑量，在一定時間內有效地獲得期望的結果的必要的劑量。例如，一種物質的治療活性量可根據個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，以及本發明的重組蛋白在個體中產生期望反應的能力等因素而定。可對劑量的選取進行調整，以期望獲得最佳治療反應。例如，可每日施用若干次分開的劑量，或者可以根據治療情況的緊迫度而成比例地降低劑量。因此，本發明提供了用于治療或預防癌癥的藥物組合物，其包含本發明的免疫偶聯物，和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在一優選的實施方式中，在藥物組合物中的效應物分子是癌癥治療試劑，更優選是毒素。包含本發明的免疫偶聯物的藥物制劑可全身地進行施用。藥物制劑可直接施用到癌癥部位。取決于施用的方式，可用一種材料將免疫偶聯物進行涂層，以保護化合物不受到酶、酸和其他使化合物失活的天然環境的作用。根據本發明的一方面，免疫偶聯物通過直接施用而給予患者。本發明構思出了施用至少為足以獲得端點的一定量的藥物組合物，如果需要，還包含藥學上可接受的載體。本發明也提供了降低手術后并發癥危險的方法，包含在手術治療癌癥之前、之中和之后施用有效量的本發明的免疫偶聯物。在此所述的組合物可通過已知的制備藥學上可接受的組合物的方法制備，該藥學上可接受的組合物在施用時，有效量的活性物質與藥學上可接受的載體結合形成混合物。適合的載體例如在以下文獻中有描述Remington'sPharmaceuticalSciences(Remington'sPharmaceuticalSciences,20thed.，MackPublishingCompany,Easton,Pa.,USA,2000)。基于此，組合物包括但不限于與一種或多種藥學上可接受的載體或稀釋劑相關的物質的溶液，且在具有適當的pH值的緩沖液中和具有生理液的等滲透壓。藥物組合物包括但不限于凍干粉或水性的或非水的滅菌的可注射溶液或懸浮液，其可進一步含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使組合物基本上與受藥者的組織和血液相容的溶質。其他可存在于該組合物中的成分如包括水、表面活性劑(例如Tween)、醇、多元醇、甘油和植物油。即時注射溶液和懸浮液可用滅菌粉末、顆粒、藥片或濃縮的溶液或懸浮液來配制。免疫偶聯物的非限制性的供給形式可以是如凍干粉，其可以在向病人施用前，用蒸餾水或鹽水復原。本發明的藥物組合物可包含藥學上可接受的載體。合適的藥學上可接受的載體包括基本上是化學惰性的和非毒性的組合物，它們不會影響到藥物組合物的生物活性的效力。合適的藥學上可接受的載體的例子包括但不限于水、鹽水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(l(2,3-二油基氧)丙基)N,N,N-氯化三甲銨(DOTMA)、二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和脂質體。這樣的組合物應當含有治療有效量的化合物，以及適當量的載體，以提供直接形式供病人施用。組合物可以是藥學上可接受的鹽的形式，其包括但不限于那些用自由氨基形成的鹽，而那些自由氨基源自如鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等；以及那些用自由羧基形成的鹽，而那些自由羧基源自如鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2—乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因(procaine)等。在本發明的各種實施方式中，藥物組合物被直接全身地施用或直接遞送至腫瘤區域。藥物組合物可被用于治療患有癌癥的動物的方法中，包括哺乳動物，優選為人。施用的免疫偶聯物的劑量和類型將取決于許多能夠容易地在人類受治者中得以監控的因素。這樣的因素包括癌癥的病因學和嚴重程度(級別和階段)。本領域的技術人員，例如內科醫師，應當能夠容易地察覺到使用本發明的免疫偶聯物治療癌癥的結果。例如，標準的醫學測試以測量癌癥的臨床標記物的方法可作為治療效力的有力指示物。這樣的測試可包括但不限于身體檢査、表現量表、疾病標記物、12-導聯ECG、腫瘤測量、活體組織檢查、細胞檢查、細胞學研究、最長腫瘤直徑計算、腫瘤的放射線照相術、腫瘤的數碼成像、維生征象、體重、不良事件的記錄、感染性事件的評價、伴隨藥物的評價、疼痛評價、血液或血清化學、尿樣分析、CT掃描以及藥物代謝動力學分析。此外，包含免疫偶聯物和另一癌癥治療劑的組合療法的協同效應可通過與經歷單一療法的病人進行對比研究來確定。本發明的另一實施方式是關于治療或預防癌癥的試劑盒，其包含有效量的本發明的免疫偶聯物，以及使用其治療癌癥的指導說明。在大多數核準的抗癌療法中，抗癌療法與其他抗癌療法聯合使用。因此，本發明提供了用于預防或治療癌癥的方法，該方法使用本發明的免疫偶聯物以及至少一種另外的抗癌療法。其他的癌癥療法可以在施用免疫偶聯物之前、交疊、同時和/或之后施用。當同時施用時，免疫偶聯物和其他的癌癥治療劑可在同一配方中或在不同的配方中，如果在不同的配方中，則可選用不同施用方式。一種或多種免疫偶聯物和一種或多種其他癌癥療法的組合可以協同對抗癌癥。其他的癌癥療法包括但不限于放射性和其他的抗癌治療劑。這些其他的癌癥治療劑可包括但不限于2,2'，2"三氯三乙胺、6-氮尿苷(6-azauridine)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、aceglarone、aclacinomycins、方夂射菌素、六甲蜜胺(altretamine)、'氨魯米特(aminoglutethimide)、氨魯米牛寺(aminoglutethimide)、胺苯卩丫啶(amsacrine)、阿納托唑(anastrozole)、安西他濱(ancitabine)、血管生成素反義寡核苷酸(angiogeninantisenseoligonucleotide)、安曲霉素(anthramycin)、阿扎胞苷(azacitidine)、重氮乙酰絲氨酸(azaserine)、氮丙環(aziridine)、batimastar、bcl-2反義寡核苷酸、苯佐替派(benzodepa)、必卡他胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博來霉素(bleomycin)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、放線菌素C(cactinomycin)、卡普睪酮(calusterone)、卡鉑(carboplatin)、卡巴酉昆(carboquone)、洋紅霉素(carminomycin)、卡莫氟(carmoftir)、卡莫司汀(carmustine)、卡柔比星(carubicin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯地孕酮(chlormadinoneacetate)、氣脈霄素(chlorozotocin)、色毒素(chromomycins)、順鉬(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、環磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、正定霉素(daunorubidn)、地磷酰胺(defosfamide)、秋水仙胺(demecolcine)、denopterin、土也托比星(detorubicin)、i也卩丫酉昆(diaziquone)、烯紫衫醇(docetaxel)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星(doxombicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、屈他雄酮(dromostanolone)、依達曲沙(edatrexate)、eflomithine、依禾U醋銨(elliptiniumacetate)、乙嘧替氟(emitefUr)、enocitabune、表柔吡星(epirubicin)、環硫雄醇(epitiostanol)、依索比星(esorubicin)、雌莫司汀(estramustine)、依托格魯(etoglucid)、依托泊苷(etoposide)、法倔唑(fad畫le)、芬維A胺(fenretinide)、2-去氧氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludambine)、氟尿卩密啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、亞葉酸(folinicacid)、福美斯坦(formestane)、磷雌酚(fosfestrol)、福莫司汀(fotemustine)、硝酸鎵(galliumnitrate)、吉西他汀(gemcitabine)、戈舍瑞林(goserelin)、己雌酚(hexestrol)、羥基脲(hydroxyurea)、伊達比星(idarubicin)、異環磷酰胺(ifosfamide)、英丙舒凡(—rosulfan)、干擾素-a(interferon-alpha)、干擾素-P(interferon-beta)、干擾素-y(interferon-gamma)、白細胞介素-2(interleukin-2)、左旋門冬酰胺酶(L-asparaginase)、香薛多糖(lentinan)、來曲挫(letrozole)、柳菩林(leuprolide)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼達明(Ionidamine)、甘露醇氮芥(mannomustine)、麻西羅霉素(marcellomycin)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧化雙氯乙基甲月安(mechlorethamineoxidehydrochloride)、安宮黃體素(medroxyprogesterone)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、氯地孕酮(melengestrol)、、美法侖(melphalan)、美諾立爾(menogaril)、美雄烷(m印itiostane)、甲氨蝶呤(methotrexate)、美妥替哌(meturedepa)、米巾白(miboplatin)、米替福新(miltefosine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴衛矛醇(mitolactol)、絲裂霉素(mitomycins)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌達醇(mopidamol)、霉酚酸(mycophenolicacid),尼魯米特(nilutamide)、尼莫司汀(ni脂stine)、nitracine，諾拉霉素(nogalamycin)、novembichin、olivomycins、草酸鉬(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、噴司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、哌磷酰胺(perfosfamide)、蛋氨氮芥(phenamet)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、哌泊溴烷(pipobroman)、哌泊舒凡(piposulfan)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、普卡霉素(plicamycin)、足葉草酸2-乙基-酰肼(podophyllinicacid2-ethyl-hydrazide)、聚石粦酸雌二醇(polyestradiolphosphate)、卩卜吩姆鈉(porfimersodium)、甲基絲裂霉素(porfiromycin)、潑尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procabazine)、丙帕鍺(propagermanium)、PSK，蝶羅呤(pteropterin)、嘌呤霉素(puromycin)、quelamycin、雷莫司汀(ranimustine)、丙亞胺(razoxane)、魯道柔比星(rodorubicin)、羅喹美克(roquinimex)、sizofican、、索布佐生(sobuzoxane)、螺鍺(spirogermanium)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、泰素帝(taxotere)、替加氟(tegafiir)、替莫唑胺、(temozolomide)、替尼泊武(teniposide)、細交鏈孢菌酮酸(tenuzonicacid)、testolacone、硫咪嘌呤(thiamiprine)，巰基鳥嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、托穆戴克斯(Tomudex)、拓撲替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、三亞胺醌(triaziquone)、三亞乙基密胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)、曲》各司坦(trilostane)、三甲曲沙(trimetrexate)、曲普瑞林(triptorelin)、曲洛磷胺(trofosfamide)、trontecan、6-mercaptopurin結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、尿嘧啶芥子氣(uracilmustard)、烏瑞替派(uredepa)、烏拉坦(urethan)、長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)、凈司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、吉妥單抗(gemtuzumab)、thioepa、cyclothosphamide、抗代i射物(antimetabolites)(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine(鳥嘌呤))、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氟達拉濱(fludarabine)、吉西他汀(gemcitabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、temozoamide)、六甲密胺(hexamethylmelamine)、LYSODREN、核苷相似物(nucleosideanalogues)、植物生物堿(plantalkaloids)(例如，泰素(Taxol)、紫杉醇(paclitaxel)、喜樹堿(camptothecin)、拓撲替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)(CAMPTOSAR，CPT-ll)、長春新堿(vincristine)、長春花生物堿(vincaalkyloids)例如長春石咸(vinblastine)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、VP-16(4衣托泊苷(etoposide))、松胞菌素B(cytochalasinB)、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化乙錠(ethidiumbromide)、依米丁(emetine)、蒽環類(anthracyclines)(例如，正定霉素)、阿霉素月旨質體(doxorubicinliposomal)、二蘿5基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米拉霉素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycinD)、阿地白介素(aldesleukin)、allutamine、biaomycin、卡培他濱(capecitabine)、carboplain、chlorabusin、cyclarabine、daclinomycin、、floxuridhe、lauprolideacetate、左方定咪唑(levamisole)、lomusline、mercaptopurino、美司鈉(mesna)、mitolanc、pegaspergase、pentoslatin、picamycin、riuxlmab、坎巾白斯-l(campath-l)、straplozocin、維A酸(tretinoin)、VEGF反義寡核苷酸、長春地辛(vindesine)和長春瑞賓(vinorelbine)。含有一種或多種癌癥制劑的組合物(例如，FLAG,CHOP)也可用于本發明。FLAG包含氟達拉濱(fludarabine)、阿糖胞苷(cytosine(胞嘧啶)arabinoside)(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含環磷酰胺(cyclophosphamide)、長春新堿(vincristine)、阿霉素(doxorubicin)和強的松(prednisone)。已知的所有癌癥制劑可參見最茅Jf版的TheMerckIndex禾卩Physician'sDeskReference兩書。用于聯合療法的藥物組合物也可包括，但不限于抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)、平陽霉素(bleomycin)、米拉霉素(mithramycin)、氨茴霉素(anthramycin))、門冬酰胺酶(asparaginase)、桿狀菌(Bacillus)和介蘭(Guerin)、白喉毒素(diphtheriatoxin)、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、禾U多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、抗有絲分裂劑、相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ridnA)、假單細胞菌外毒素(Pseudomonasexotoxin)、神經生長因子、血小板衍生的生長因子、組織血漿酶原活化劑、抗組胺劑、抗作嘔劑等。實際上，向需要這種治療的病人施用有效量的免疫偶聯物，可減少其他具有顯著臨床功效的癌癥治療劑的劑量。這種其他癌癥治療劑減少的劑量的功效在沒有施用免疫偶聯物時可能未觀察到。因此，本發明提供了治療腫瘤或癌癥的方法，該方法包含施用減少劑量的一種或多種其他癌癥治療劑。再有，與標準治療方法的周期長短或多少相比，向需要這種治療的病人施用包含免疫偶聯物的聯合療法可導致更短的治療時間。因此，本發明提供了治療腫瘤或癌癥的方法，該方法包含施用減少劑量的一種或多種其他癌癥治療劑，以獲得相對較短的持續時間和/或更少的治療周期。因此，根據本發明，包含免疫偶聯物和其他癌癥治療劑的聯合療法可降低整個癌癥治療的毒性(即副作用)。例如，與單一療法或其他聯合療法相比，當施用減少劑量的免疫偶聯物和/或其他癌癥治療劑時，禾口/或當減少周期的持續時間(即單一施藥的時段或一系列的施藥的時段)時，和/或當減少周期數目時，可觀察到毒性的降低。因此，本發明提供藥物組合物，其包含免疫偶聯物和一種或多種其他癌癥治療劑，可選擇地含在藥學上可接受的載體中。本發明還提供包含有效量的免疫偶聯物的試劑盒，可選擇地與一種或多種其他癌癥治療劑聯合，以及使用其治療癌癥的指導說明。如上所述，含免疫偶聯物的聯合療法可能敏化癌癥或腫瘤對其他癌癥治療劑的施用。因此，本發明構思出用于預防、治療、和/或預防癌癥復發的聯合療法，該療法包含在施用減少劑量的癌癥治療劑之前、之后或同時，施用有效量的免疫偶聯物。例如，用免疫偶聯物的最初的治療可能增加癌癥或腫瘤對隨后的癌癥治療劑的劑量的敏感程度。該劑量接近或低于單獨采用癌癥治療劑或無免疫偶聯物時的標準劑量的下限。當同時施予時，免疫偶聯物可與癌癥治療劑分開施用，可選擇地通過不同的施用模式給予。在另外的實施方式中，其他的癌癥治療劑的施用可使癌癥或腫瘤對免疫偶聯劑或結合蛋白產生敏化。在該實施方式中，其他的癌癥治療劑可在施用免疫偶聯劑或結合蛋白前給予。在一實施方式中，其他的癌癥治療劑包括順鉑(cisplatin)，例如PLATINOL或PLATINOL-AQ(BristolMyers)，其劑量大約在5到10、11到20、21到40或41到75mg/mV周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含卡鉑(carboplatin)，例如PARAPLATIN(BristolMyers)，其劑量大約在2到3、4到8、9到16、17到35或36到75mg/m"周期的范圍。在又一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含環磷酰胺(cyclophosphamide),例如CYTOXAN(BristolMyersSquibb)，其劑量大約在0.25到0.5、0.6到0.9、1到2、3到5、6到10、11到20或21到40mg/kg/周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含阿糖胞苷(cytambine),例如CYTOSAR-U(Pharmacia&Upjohn)，其劑量大約在0.5to1、2to4、5to10、11到25、26到50或51到100mg/mV周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含阿糖胞苷脂質體例如DEPOCYT(ChironCorp.),其劑量大約在5到50mg/mV周期的范圍。在又一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含達卡巴嗪(dacarbazine),例如DTIC或DTICDOME(BayerCorp.),其劑量大約在15到250mg/m2/周期的范圍，或大約在0.2到2mg/kg/周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥制劑包含拓撲替康(t叩otecan)，例如HYCAMTIN(SmithKlineBeecham)，其劑量大約在0.1至U0.2、0.3到0.4、0.5至lj0.8或0.9至IJ1.5mg/m2/周z期的范圍。在又一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含依立替康(irinotecan),例如CAMPTOSAR(Pharmacia&Upjohn),其劑量大約在5到9、10到25或26到50mg/m"周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含氟達拉濱(fludarabine)，例如FLUDARA(BerlexLaboratories),其劑量大約在2.5到5、6到10、11到15或16到25mg/m"周期的范圍。在又一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含胞嘧啶阿糖胞苷(cytosinearabinoside)(Ara-C)，其劑量大約在200到2000mg/m2/周期、300到1000mg/m2/周期、400到800mg/m2/周期或500到700mg/m2/周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含多烯紫衫醇(docetaxel),例如TAXOTERE(RhonePoulencRorer)，其劑量大約在6到10、11到30或31到60mg/m々周期的范圍。在又一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含紫杉醇(paditaxel),例如泰素(TAXOL)(BristolMyersSquibb)，其劑量大約在10至!j20、21到40、41到70或71到135mg/kg/周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，其劑量大約在0.5到5mg/kg/周期、l到4mg/kg/周期或2-3mg/kg/周期的范圍。在又一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含多柔比星(doxorubicin)，例如ADRIAMYCIN(Pharmacia&Upjohn)、DOXIL(Alza)、RUBEX(BristolMyersSquibb),其劑量大約在2到4、5到8、9到15、16至!j30或31到60mg/kg/周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含依托泊苷(etoposide)，例如VEPESID(Pharmacia&Upjohn),其劑量大約在3.5到7、8到15、16到25或26到50mg/n/周期的范圍。在又一實施方式中，其他的癌癥治療劑包含長春堿(vinblastine)，例如VELBAN(EliLilly),其劑量大約在0.3到0.5、0.6到0.9、1到2或3到3.6mg/mV周期的范圍。在另一實施方式中，其他的癌癥治療劑包括長春新堿(vincristine)，例如ONCOVIN(EliLilly),其劑量大約在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7mg/m2/周期的范圍。在又一實施方式中，其他的癌癥治療劑包括甲氨蝶呤(methotrexate)，其劑量大約在0.2到0.9、1到5、6到10或11到20mg/mV周期的范圍。在另一實施方式中，免疫偶聯物與至少一種其他的免疫治療劑聯合施用，該其他的免疫治療劑包括但不限于利妥昔(rituxan)、利妥昔單抗(rituximab)、campath-l、吉妥單抗(gemtuzumab)禾口trastuzutmab。在又一實施方式中，免疫偶聯物與至少一種或多種抗血管新生的試劑聯合施用，該抗血管新生的試劑包括但不限于抑制管張素(Angiostatin)、沙利度胺(thalidomide)、三環(kringle)5、內皮抑制素(endostatin)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)、抗凝血酶(anti-thrombin)、纖維連接蛋白的29kDaN-端的和40kDaC-端的水解蛋白片段、催乳素的16kDa水解蛋白片段、血小板因子4的7.8kDa水解蛋白片段、對應于血小板因子4的含13個氨基酸的月太(Maioneetal.,1990,CancerRes.51:2077-2083)、對應于膠原質I片段的含14個氨基酸的肽(Tolmaetal.，1993,J.CellBiol.122:497-511)，對應于凝血酶敏感蛋白1片段的含19個氨基酸的月太(Tolsma等,1993，J.CellBiol.122:497-511),對應于SPARC片段的含20個氨基酸的肽(Sage等，1995，J.Cell.Biochem.57:1329-1334)，和它們變異體，包括其藥學上可接受的鹽。在另一實施方式中，免疫偶聯物與一種放射療法聯合施用。該療法也可包含手術和/或化學療法。例如，免疫偶聯物可與放射療法以及順鉑(dsplatin)(Platinol)、5—氟尿噴啶(fluo證acil)(5-FU,Adrucil)、卡鑰(carboplatin)(Paraplatin)禾口/或紫杉醇(paditaxel)(泰素(Taxol))聯合物施用。使用免疫偶聯物進行治療可容許較低的放射劑量和/或較低放射治療的頻率，例如可減少影響吞咽功能從而導致減重或脫水的嚴重喉嚨疼痛的發生。在又一實施方式中，免疫偶聯物與至少一種或多種細胞激素(cytokines)聯合施用，該細胞激素包括但不限于淋巴因子(lymphokine)、月中瘤壞死因子(tumornecrosisfactors)、類腫瘤壞疽因子的細胞激素、干擾素、巨噬細胞炎癥蛋白(macrophageinflammatoryprotein)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocytemonocytecolonystimulatingfactor)、白細胞介素(包括但不限于白細胞介素-1、白細胞介素-2、白細胞介素-6、白細胞介素-12、白細胞介素-15、白細胞介素-18)和它們的變異體，包括它們的藥學上可接受的鹽。在另一實施方式中，免疫偶聯物與一種癌癥疫苗或生物試劑聯合施用，該癌癥疫苗或生物制劑包括但不限于自體同源的細胞或組織、非自體同源的細胞或組織、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen)，a—胎球蛋白、人類絨毛膜性腺激素(humanchorionicgonadotropin)、卡介苗活疫苗(BCGlivevaccine)、分枝桿菌細胞壁一DNA復合物(Mycobacterialcellwall-DNAcomplexes)、黑色素細胞衍生蛋白(melanocytelineageproteins)和突變的及腫瘤特異性抗原。在又一實施方式中，免疫偶聯物與荷爾蒙療法聯合施用。荷爾蒙治療劑包括但不限于荷爾蒙興奮劑(hormonalagonist)、荷爾蒙拮抗劑(hormonalantagonist)(例如，氟他胺(flutamide)、它莫西芬(tamoxifen)、醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)(LUPRON))和類固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)、維甲類化學物、倍他米松(betamethasone)、氫化可的松(cortisol)、可的松(cortisone)、強的松(prednisone)、去氫睪酮(dehydrotestosterone)、糖腎上腺皮質激素(glucocorticoid)、鹽皮質激素(mineralocorticoid)、雌激素(estrogen)、睪丸激素(testosterone)、孕酮(progestin)).在另一實施方式中，免疫偶聯物與基因治療計劃聯合物施用，以治療或預防癌癥。因此，聯合療法可增加癌癥或腫瘤對所施用的免疫偶聯物和/或其他的癌癥治療劑的敏感度。這樣，可有望獲得更短的治療周期，從而減少毒性事件。治療周期的長短可隨所施用的特異性的癌癥治療劑而改變。本發明也考慮了連續或不連續地進行給藥，或者將每日的劑量分為若干次進行部分給藥。本領域的技術人員應當能夠認識到對特異性的癌癥治療制的適當的治療周期，而本發明考慮了對每一種癌癥療法的最佳治療計劃的評估。具體的專業指導已為人知。參見例如Therasse等，2000，"Newguidelinestoevaluatetheresponsetotreatmentinsolidtumors.EuropeanOrganizationforResearchandTreatmentofCancer,NationalCancerInstituteoftheUnitedStates,NationalCancerInstituteofCanada,"JNatlCancerInst.Feb2;92(3):205-16。免疫偶聯物可通過任何適合的方法例如注射、口服、吸入、經皮膚、在腫瘤內施用。而其他的癌癥治療劑可通過相同的或不同的模式施用。此外，當需要向病人施用多種癌癥治療劑時，免疫偶聯物和一種或多種其他的癌癥治療劑可用一種方法施用，而其他的癌癥治療劑可用另一種模式施用。(F)本發明的結合蛋白和免疫毒素的診斷方法和試劑本發明的結合蛋白選擇地結合到癌細胞或被癌細胞內化的分子，而無明顯地結合到正常細胞。因此，結合蛋白可用于診斷癌癥。如上所述，發明者們已示出了本發明的結合蛋白結合到葡萄糖轉運體8或其變異體；包含氨基酸序列SEQIDNOS:11-20中任何一個定義的蛋白質；或與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體。在本發明的一個實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體包含由SEQIDNOS:11、12或13或其變異體中任何一個定義的氨基酸序列。在本發明的另一個實施方式中，與癌癥相關的GLUTS的變異體包含在N-端的二-亮氨酸部分產生改性的GLUT8。在本發明的又一實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性為二-丙胺酸。在一優選的實施方式中，結合蛋白是本發明的抗體或抗體片段。并且，癌細胞可被評價以確定它們對本發明的治療方法的易感性。評價方法例如取癌細胞樣品，確定樣品的能力結合到本發明的結合蛋白，優選為抗體或抗體片段。因此，本發明包括診斷方法、試劑和試劑盒，它們本身可用在本發明的治療方法之前、之中或之后，以確定是否有癌細胞的存在，所述癌細胞是否表達抗原，并結合到本發明的蛋白，優選抗體或抗體片段上。在一實施方式中，本發明提供一種檢測或監控受測試者中的癌癥的方法，該方法包括以下步驟(1)將從所述受測試者中取出的測試樣品與本發明的結合蛋白接觸，所述結合蛋白特異性地結合到癌細胞上的抗原，形成結合蛋白一抗原復合物；(2)測量測試樣品中結合蛋白一抗原復合物的量；以及(3)將測試樣品中的結合蛋白一抗原復合物的量與對照物比較。在一實施方式中，抗原是葡萄糖轉運體8或其變異體；一種包含氨基酸序列SEQIDNOS:ll-20，優選為SEQIDNOS:ll、12或13中任何一個定義的蛋白質；或與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體。在另一實施方式中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體在N-端的二-亮氨酸部分包含一個突變，這樣，該突變的葡萄糖轉運體8就定位在細胞膜中。本發明進一步包括用于診斷癌癥的試劑盒，其包含任何一種本發明的結合到癌細胞表面的抗體的結合蛋白，以及使用其診斷癌癥的指導說明。為應用于診斷，本發明的結合蛋白，優選為抗體或抗體片段，可用可探測的標記物，如不透射線的或放射線同位素例如SH、14C、32P、35S、l23I、l25I、131I;熒光的(熒光團)或化學發光的(發色團)化合物，例如熒光素異硫氰酸鹽、若丹明或熒光素；酶，例如堿性磷酸酶、卩-半乳糖苷酶或山葵過氧化酶；成像試劑；或金屬離子進行標記。如上所述，將標記物附著于結合蛋白，如抗體或抗體片段之上的方法已為本領域所習知。本發明的另一方面是檢測或監控受測試者中癌癥的方法，該方法包含以下步驟(1)測量在取自所述受測試者的樣品中本發明的抗體的量；以及(2)將測試樣品中本發明的抗體的量與對照物作比較。在一實施方式中，本發明的抗體的量是通過用如ELISA來測量測試樣品中的本發明的抗體的量而測定。在另一實施方式中，本發明的抗體的量是通過用如RT-PCR來測量編碼測試樣品中的本發明的抗體的核酸的表達水平而測定。(G)新的與癌癥相關的抗原的藥物組合物，方法和應用本發明提供了新的與癌癥相關的抗原，其表達在癌細胞的表面，且在正常細胞表面無顯著表達。因此，該新的與癌癥相關的抗原可用于治療和預防癌癥的療法中，包括使用該新的與癌癥相關的抗原或其片段來引起體內的免疫應答。并且，本發明包括了新的與癌癥相關的GLUTS的變異體來探測或監控癌癥。W微蘊合激本發明的一實施方式是藥物組合物，其包含有效量的新的與癌癥相關的GLUTS的變異體或其片段在具有適當的稀釋劑或載體的混合物中。本發明的另一實施方式是藥物組合物，其包含有效量的分離的核酸在具有適當的稀釋劑或載體的混合物中，該核酸編碼新的與癌癥相關的GLUTS的變異體。本發明的進一方面是藥物組合物，其包含有效量的重組表達在具有適當的稀釋劑或載體的混合物中，該重組表達包括編碼新的與癌癥相關的GLUT8的變異體的核酸序列。例如，本發明的藥物組合物可被用于治療或預防癌癥。并且，藥物組合物可被用于引起受測試者對新的與癌癥相關的GLUT8的變異體的免疫應答。藥物組合物可按如上所述進行制備和施用。藥物組合物可與如上討論的其它的抗癌癥的治療試劑聯合使用。當免疫試劑(即新的與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段，和/或對其編碼的核酸序列，和/或其的重組表達載體)和/或其組合物在不受施用形式約束下，能夠與佐藥用于共免疫，則免疫原性可得到顯著地提高。通常，佐藥的用量為磷酸鹽緩沖鹽水溶液中的0.05-1.0%。佐藥能夠提高免疫原的免疫原性，但它們自身卻不一定是免疫性的。佐藥可通過將免疫原保留在靠近施用的部位來產生貯庫效應，從而達成向免疫系統的細胞緩慢的、持續地釋放免疫原。佐藥也能夠將免疫系統的細胞吸引到免疫原貯庫，并激發這些細胞產生免疫應答。這樣，本發明的實施方式包含了進一步含有佐藥的藥物組合物。佐藥已被使用多年來提高宿主對如疫苗的免疫應答。內部佐藥(例如脂多糖)通常為疫苗中使用的被殺死的或毒性減弱的細菌的成分。外部佐藥為免疫調節劑，其通常是以非共價鍵的方式連接到抗原上，并配制用于增強宿主的免疫應答。因此，佐藥己被確認為經腸胃外的遞送而增強對抗原的免疫應答。但是，這些佐藥中的一些是有毒的，能導致不期望的副作用，從而不適合用于人和許多動物。事實上，只有氫氧化鋁和磷酸鋁(通常統稱為alum)是通常被用作人和獸醫用的疫苗中的佐藥。已建立了完整的Alum在增加抗體對白喉和白喉類毒素的應答方面的效果。盡管如此，這是有限制的。例如，alum對于用作流感疫苗是沒有效果，且不一致地引起細胞介導的與其它免疫原的免疫應答。在小鼠中被alum-輔助的抗原而誘出的抗體主要是IgGl同種型，其可不被一些疫苗試劑作出最佳的保護。大量的外部佐藥可激起潛在的對免疫原的免疫應答。這些佐藥包括復合到細胞膜蛋白質抗原的皂角苷(免疫刺激復合物)、具有礦物油的普流尼克(pluronic)聚合物、殺死的分枝細菌和礦物油、弗氏完全佐藥(Freund'scompleteadjuvant)、細菌產品，例如胞壁酰二月太(muramyldipeptide，MDP)和脂多糖(LPS)以及脂質A和脂質體。在本發明的一方面，在本發明的任何一個實施方式中均可使用的佐藥如下所述。用于腸胃外免疫的佐藥，包括鋁化合物(如氫氧化鋁、磷酸鋁和氫氧化磷酸鋁)。抗原可根據標準協議沉淀到或吸附到鋁化合物中。其它的佐藥如RIBI(ImmunoChem，Hamilton,MT)也可用于腸胃外施用。用于粘膜免疫的佐藥包括細菌毒素(例如，霍亂毒素(CT))、大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labileenterotoxin,LT)、艱難梭狀芽孢桿菌毒素A(ClostridiumdifficiletoxinA)和日咳毒素(pertussistoxin，PT),或它們的組合、亞單位、類毒素，或它們的突變體)。例如，可使用天然的霍亂毒素亞單位B(CTB)的純化制劑。只要它們保留佐藥活性，則這些毒素的片段、類似物、衍生物和它們任意的毒素的融合體也可適用。優選的，使用減毒的突變體。合適的突變體在以下文獻中有描述(例如，WO95/17211(Arg-7-LysCT突變體)，WO96/6627(Arg-192-GlyLT突變體)，和WO95/34323(Arg-9-Lys和Glu-129-GlyPT突變體))。可用于本發明的方法和組合物中的其它的LT突變體包括如，Ser-63-Lys、Ala-69-Gly、Glu-110-Asp和Glu-112-Asp突變體。其它不同來源(例如，大腸桿菌、明尼蘇達沙門氏菌(S'almonellaminnesota)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)，或弗氏志賀菌(Shigellaflexneri)、皂角苷，或聚交酯乙交酯(PLGA)微球)的佐藥也可用于粘膜施用。同時適用于腸胃外免疫和粘膜免疫的佐藥包括聚磷腈(polyphosphazene)(例如，WO95/2415)、DC-chol(3b-(N-(N',N'-二甲基氨基甲垸)-氨基甲酰)膽固醇)(例如，美國專利No.5，283,185和WO96/14831)以及QS-21(例如，WO88/9336)。采用任何一種本領域的技術人員熟知的傳統方法，可向受測試者進行免疫的藥物組合物，該藥物組合物包含與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段、和/或對其編碼的分離的核酸序列、和/或重組表達載體。這藥物組合物可通過包括，如粘膜(例如眼睛、鼻內、口、胃、肺、腸、直腸、陰道、或尿道)表面、腸胃外(如皮下、皮內、肌肉、靜脈內或腹膜內)途徑或經結節內進行免疫。優選的途徑是取決于對本領域的技術人員能夠容易地選出的免疫原。可以是單一劑量的或間隔重復的形式進行給藥。本領域技術人員應該理解，合適的劑量取決于各種參數，如免疫原本身(即肽對核酸)(和其更特異性的類型)、施用途徑和被免疫的動物的狀況(體重、年紀等)。本發明還提供含有有效量的本發明的藥物組合物的試劑盒，可選擇的，可含有一種或多種其它的癌癥治療劑，以及其使用說明。仰治綠法如上所述，新的與癌癥相關的GLUT8的變異體位于癌細胞表面，而在正常細胞上不顯著。因此，該新的與癌癥相關的抗原可用于預防或治療癌癥的療法中。并且，該新的與癌癥相關的抗原可用于在受測試者中引起免疫應答，例如，在疫苗中。本發明的一實施方式是與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段在制造治療或預防癌癥的藥物中的應用。本發明的另一實施方式是與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段在制造在受測試者中引起免疫應答的藥物中的應用。本發明還包括編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段的分離的核酸序列在制造治療或預防癌癥的藥物中的應用。并且，本發明還包括編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段的分離的核酸序列在制造在受測試者中引起免疫應答的藥物中的應用。本發明的進一步的實施方式是包含了編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段的分離的核酸序列的重組表達載體在制造治療或預防癌癥的藥物中的應用。并且，本發明還包括包含了編碼與癌癥相關的GLUTS的變異體或其片段的分離的核酸序列的重組表達載體在制造在受測試者中弓I起免疫應答的藥物中的應用。本發明的其它的實施方式是對患有或疑似患有癌癥的受測試者進行癌癥的治療或預防的方法，包括向該受測試者施用有效量的與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段。此外，本發明還包括對患有或疑似患有癌癥的受測試者進行癌癥的治疔或預防的方法，包括向該受測試者施用有效量的編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段的分離的核酸序列。進而，本發明還包括對患有或疑似患有癌癥的受測試者進行癌癥的治療或預防的方法，包括向該受測試者施用有效量的包含了編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段的分離的核酸序列的重組表達載體。本發明的另一實施方式是在受測試者中誘發對與癌癥相關的GLUT8的變異體的免疫應答的方法，包括向該受測試者施用有效量的與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段。此外，本發明還包括在受測試者中誘發對與癌癥相關的GLUT8的變異體的免疫應答的方法，包括向該受測試者施用有效量的編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段的分離的核酸序列。進而，本發明還包括在受測試者中誘發對與癌癥相關的GLUT8的變異體的免疫應答的方法，包括向該受測試者施用有效量的包含了編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體或其片段的分離的核酸序列的重組表達載體。腳珍銜方法新的與癌癥相關的GLUT8的變異體位于癌細胞表面，而在正常細胞上不顯著。因此，對新的與癌癥相關的GLUT8的變異體的檢測可用于癌癥的診斷方法。在優選的實施方式中，與癌癥相關的GLUT8的變異體含有由SEQIDNOS:11、12或13或其變異體的任何一個定義的氨基酸序列。在本發明的另一實施方式中，與癌癥相關的GLUTS的變異體含有在N-端的二-亮氨酸部分發生改性的GLUT8。在本發明的進一步的實施方式中，N-端的二-亮氨酸部分被改性為二-丙胺酸。本發明的一個實施方式是對患有或疑似患有癌癥的受測試者進行癌癥的檢測或監控的方法，包括檢測樣品中細胞上的與癌癥相關的GLUT8的變異體，其中，如果在細胞上檢測到了與癌癥相關的GLUT8的變異體，則表明有癌癥。若干的技術可用于檢測細胞上與癌癥相關的GLUT8的變異體。例如，本發明的結合蛋白可用于免疫分析，以探測與癌癥相關的GLUT8的變異體在細胞表面的表達。本領域的技術人員應當理解有若干的技術可用于檢測和/或定量與癌癥相關的GLUT8的變異體在細胞表面的表達。這些技術包括西方墨點法、SDS-PAGE后進行的免疫沉淀、免疫細胞化學、FACS、蛋白質陣列等。本發明的其它方面是對患有或疑似患有癌癥的受測試者進行癌癥的檢測或監控的方法，包括檢測樣品中細胞內的與癌癥相關的GLUT8的變異體，其中，如果在細胞內檢測到與癌癥相關的GLUT8的變異體，則表明有癌癥。在一優選的實施例中，編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體的RNA表達產物被用于檢測細胞上的與癌癥相關的GLUT8的變異體。本領域技術人員應當理解，通過檢測編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體的mRNA，或那些特異性地和/或選擇性與編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體的mRNA雜交的寡核苷酸、cDNA、DNA、RNA、PCR產物、合成的DNA、合成的RNA或其它天然或改性的核苷酸，則可對RNA表達產物進行檢測或定量。若干的方法可用于檢測和/或定量細胞內與癌癥相關的GLUT8的變異體的RNA表達，包括RT-PCR，核酸酶保護分析(nucleaseprotectionassay),例如核糖核酸酶保護分析(ribonucleaseprotectionassays)禾口SI核酸酶分析(SInucleaseassays),以及北方墨點法(Northernblots)等。(H)其它方法葡萄糖轉運體8已顯示出具有轉運糖的活性。因此，本發明包括通過調控癌細胞上或內的與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體，來治療或預防受測試者中的癌癥的方法。在本發明的一實施方式中，治療或預防受測試者中的癌癥的方法包括，阻止或減少與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體作為糖的轉運體的功能。在本發明的另一實施方式中，葡萄糖轉運體的非抗體抑制劑被用于治療或預防受測試者中的癌癥。已知有幾種葡萄糖轉運體家族的分子的抑制劑，包括類黃酮家族中的幾個成員。例如，腺苷酸環化酶激動劑(forskolin)、根皮素(phloretin)(一種類似類黃酮的化合物)和細胞松弛素B(cytochalasinB)己知為抑制GLUT1，且它們的假定結合部位己在GLUT-1的三維分子模型上得到確認(Salas-Burgos等，Biophys丄87:2990-2999,2004)。槲黃素(Quercetin)，一種黃酮醇，顯示出抑制GLUT2-介導的葡萄糖轉運(Song等，J.Biol.Chem.277:15252-15260,2002)。雌二醇(Oestradiol)和異黃酮植物雌激素染料木素(isoflavonephytoestrogenGenistein)也是GLUTl-介導的葡萄糖轉運的抑制劑，且也有人提出了這些分子的假定的結合部位(Afzal等，BiochemJ.365:707-719，2002)。葡萄糖轉運體抑制劑中的腺苷酸環化酶激動劑(forskolin)、駢嘧啶氨醇(dipyridamole,潘生丁)和異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine(黃嘌呤)(IBMX))均結合到GLUTI和GLUT4上(Hellwig&Joost,Mol.Pharmacol.40:383-389,1991)。細胞松弛素B也結合到GLUT4上(Wandel等，Biochim.Bi叩hys.Acta1284:56-62，1996)。除了這些已知的抑制劑外，本領域的技術人員應當理解，存在若干已知的用于確認葡萄糖轉運體抑制劑的分析。例如，抑制劑對葡萄糖轉運體的作用可通過表達感興趣的GLUT，優選為葡萄糖轉運體8，在細胞如非洲爪蟾卵母細胞(Xenopuslaevisoocytes)或CHO中，測量在有或沒有抑制劑的存在下的葡萄糖的攝取，并確定抑制劑是否具有競爭性來進行評價。一旦知道給定的GLUT異構體的序列后，就可容易地測試出它對大量分子的敏感性，從而確認候選藥物。因此，本發明包括了向受測試者根據其需要施用有效量的葡萄糖轉運體的抑制劑，來治療或預防受測試者中的癌癥的方法。該抑制劑包括類黃酮家族中的成員，例如槲黃素(Quercetin)或染料木素(genistein)、似類黃酮的化合物，例如根皮素(phloretin)、雌性激素類(Oestrogenic)化合物，包括雌二醇(oestradiol)或染料木素(genistein)、腺苷酸環化酶激動劑(forskoHn)、細胞松弛素B(cytochalasinB)和/或異丁基甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine(黃嘌呤)(IBMX))。在本發明的另一實施方式中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的功能通過降低或阻止與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體在細胞中的表達而得到阻止或降低。用于阻止或降低與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體在細胞中的表達的標準技術包括，使用對與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體基因的轉錄物活潑的反義、三螺旋核酸或核酶分子。例如，可采用標準技術生產反義核酸分子，即與編碼感興趣的多肽的正義核酸的互補的分子，例如，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補，或與mRNA序列互補。因此，反義核酸可由氫鍵結合到正義核酸上。反義核酸可與整條編碼鏈或僅與其部分互補，例如蛋白質編碼區域(或開發閱讀框)的全部或部分。反義核酸分子可與編碼感興趣的多肽的核酸序列的編碼鏈中的非編碼區形成反義。該非編碼區(5'和3'的非翻譯區)是5'和3'的序列，其與編碼區的側翼相接，并不會翻譯為氨基酸。反義寡核苷酸例如可以在長度上有約5,10,15,20,25,30,35，40，45或50個核苷酸或更多。本發明的反義核酸可使用本領域習知方法，采用20058化學合成和酶連接反應構建。例如，反義核酸(例如反義寡核苷酸)可使用天然核苷酸，或多項地經改性以提高分子生物穩定性的或增加反義和正義核酸間形成的雙鏈的物理穩定性的核苷酸而進行化學合成。例如，可使用硫代磷酸酯(phosphorothioate)衍生物和吖啶取代的核苷。可用于產生反義核酸的改性的核苷酸包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、卩-D-半乳糖基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、WL—ff、JNO-開AX^布脈塌7、i-^垂與H宗W、卜卞垂Wli甘、Z,2-—T整與"泉呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、J3-D-甘露糖基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5，-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-而氨基嘌呤。此外，反義核酸可使用表達載體以生物形式產生，將一核酸按反義取向亞克隆到該載體(即從插入的核酸轉錄的RNA將與感興趣的耙核酸呈反義取向)。被施用到受測試者的或與編碼感興趣的多肽的細胞的mRNA雜交或結合的原位生成的反義核酸分子，從而抑制表達，例如通過抑制轉錄和/或翻譯。雜交可通過傳統的核苷酸的互補性形成穩定的雙鏈，或如在反義核酸分子通過在雙鏈的主要凹區內的形成特異性相互反應的情況下，結合到DNA雙鏈。本發明的施用反義核酸分子的例子包括在組織部位直接注射。另外，反義核酸分子也可經改性而靶向選擇的細胞，然后進行全身性施用。例如，對于全身性施用，反義分子可經改性，從而對表達在所選細胞上，如T細胞或腦細胞上的受體或抗原，通過連接反義核酸分子到結合于細胞表面的受體或抗原的肽或抗體上，而進行特異性結合。反義核酸分子也可使用載體，如下面描述的基因療法的載體向細胞傳遞。為了獲得足夠的反義核酸分子的細胞內濃度，優選的載體構建是反義核酸分子在強polII或polIII啟動子控制下放置于其中的。感興趣的反義核酸分子可為a-異頭核酸分子。a-異頭核酸分子與互補RNA形成特異性雙鏈雜交鏈，其中，與通常的a-單元不同的是，雜交鏈是相互平行(Gaultier等.，1987,NucleicAcidsRes.15:6625-6641)。該反義核酸分子也可含有2，-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987,NucleicAcidsRes.15:6131-6148)或一嵌合RNA-DNA的類似物(Inoue等，1987，FEBSLett.215:327-330)。核酶是催化性的RNA分子，具有核糖核酸酶活性，能夠切割單鏈核酸，例如mRNA，核酶具有與單鏈核酸互補的區域，且可通過標準技術生成。因此，核酶(例如錘頭型核酶)(描述于HaselhoffandGerlach，1988,Nature334:585-591)可被用于催化性切割mRNA轉錄物，從而抑制由mRNA編碼的蛋白質的翻譯。對編碼感興趣的多肽的核酸分子具有特異性的核酶可基于編碼與癌癥相關的GLUT8的變異體的cDNA的核苷酸序列而設計。例如，根據Cech等的美國專利No.4，987，071;和Cech等的美國專利No.5,116,742，可構建出四膜蟲(Tetrahymena)L-19IVSRNA的衍生物，其中，活性部位的核苷酸序列是互補于被切割的核苷酸序列。此外，編碼感興趣的多肽的mRNA可被用于選擇催化的RNA，其選自RNA分子的匯總，且具有特異性核糖核酸酶的活性。參見如BartdandSzostak,1993,Science261:1411-1418。三螺旋結構也可用已知的技術生成。例如，可通過靶向與編碼多肽的基因的調節區(例如啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列，形成三螺旋結構，以抑制基因在靶細胞中的轉錄，從而抑制感興趣的多肽的表達。參見Helene，1991,AnticancerDrugDes.6(6):569-84;Helene,1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36;和Maher,1992，Bioassays14(12):807-15。在多個實施方式中，可在堿基部分、糖部分或磷酸骨架處對核酸組合物進行改性，以提高如分子的穩定性、雜交性或溶解性。例如，核酸的脫氧核糖磷酸骨架可經改性而生成肽核酸(見Hyrup等，1996,Bioorganic&MedicinalChemistry4(1):5-23)。在此使用的術語"肽核酸"或"PNAs"是指核酸模仿物，例如DNA模仿物，其中的脫氧核糖磷酸骨架被假肽骨架取代，而僅保留了4個天然的核堿基。PNAs的中性骨架顯示出在低離子濃度條件下對DNA和RNA的特異性雜交。PNA低聚物的合成可使用標準的固相肽合成協議進行，該協議描述于Hyrup等，1996，supra;Perry-O，Keefe等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14670-675中。PNAs可經改性而如提高它們的穩定性或細胞性攝入。這通過附著親脂性的或其它輔助基團到PNA上，形成PNA-DNA嵌合體，或通過使用脂質體或其它本領域習知的藥物遞送技術達成。例如，可生成PNA-DNA嵌合體，其可集PNA和DNA的有利特點于一身。這樣的嵌合體允許DNA識別酶，例如RNAseH和DNA聚合酶，與DNA部分作用，而PNA部分可提供高的結合親和力和特異性。PNA-DNA嵌合體可使用適當長度的連接體(linker)連接，連接體的選擇考慮堿基堆積、核堿基之間的鍵的數目和取向(Hyrup，1996，supra)。PNA-DNA嵌合體的合成可按Hyrup，1996,supra,和Finn等，1996,NucleicAcidsRes.24(17):3357-63中的描述進行。例如，DNA鏈的合成可在一支撐物上使用標準亞磷酰胺偶聯化學和改性的核苷類似物進行。化合物如5'-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5，-脫氧-胸苷亞磷酰胺可用于連接PNA和DNA的5'端(Mag等，1989,NucleicAcidsRes.17:5973-88)。然后，PNA單體逐步偶聯，與5'PNA片段和3，DNA片段產生嵌合分子(Finn等，1996，NucleicAcidsRes.24(17):3357-63)。嵌合分子也可用5'DNA片段和3'PNA片段合成(Peterser等，1975，BioorganicMed.Chem.Lett.5:1119-11124)。在其它實施方式中，寡核苷酸可包括其它的側基，例如肽(例如，用于體內靶向宿主細胞的受體)，或有助于跨細胞膜傳輸的試劑(例如，參見Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6553-6556;Lemaitre等，1987,Pro"Natl.Acad.Sci.USA84:648-652;InternationalPublicationNo.WO88/09810)或血-腦屏障(參見如InternationalPublicationNo.W089/10134)。此外，寡核苷酸可用雜交觸發的切割試劑(參見如Krol等，1988,Bio/Techniques6:958-976)或插入試劑(參見如Zon,1988,Pharm.Res.5:539-549)進行改性。為此，寡核苷酸可與其它分子，如肽，雜交觸發的交聯試劑、轉運試劑、雜交觸發的切割試劑等偶聯。本發明的其它方面涉及識別能夠調節與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的表達或活性的化合物的方法，該方法可用于預防或治療癌癥。在本發明的一實施方式中，用于識別具有預防或治療癌癥的能力的化合物的方法包括以下步驟(a)將表達與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的細胞與測試化合物接觸；以及(b)確認與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的表達或功能；(c)將與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的表達或功能與對照物比較，其中，與對照物相比，當與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的表達或功能有所降低，則表明一化合物可用于預防或治療癌癥。以下用非限制性的實施例來說明本發明實施例實施例l:VBl-050單克隆抗體的生成VB1-050單克隆抗體是由癌癥病人的匯總的(pooled)淋巴細胞產生。SHFP-1被用作融合伙伴(flisionpartner)來產生單克隆抗體。VB1-050是IgGl,x—單克隆抗體。實施例2:序列測定信使RNA(mRNA)從雜交瘤細胞中分離，且合成第一股互補DNA(cDNA)。然后，通過PCR，cDNA被用于分離抗體H和L鏈基因。根據H(y)和L(ic)鏈同型的一致骨架區來設計PCR引物(見注釋)。PCR的產物被分別克隆到TOPO-pCR2.1載體，且被轉化到大腸桿菌(￡.co//)細胞中。在TOPO-pCR2.1中含有插入片段的獨立的克隆經分離并培養。質粒DNA經純化并測定序列。y引物1)5，TCTAAAGAAGCCCCTGGGAGCACAGCTCATCACCATG3，(SEQIDNO:21)2)5，GCCCGGGGAGCGGGGGCTTGCCGGCCGTCGCACTCA3，(SEQIDNO:22)3)5，ACCATGAGTGAGAAAAACTGGATTTGTGTGGCA3，(SEQIDNO:23)4)5，GGAGCCGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCA3，(SEQIDNO:24)5)5，CTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTT3，(SEQIDNO:25)6)5，GGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCC3，(SEQIDNO:26)k引物7)5,GGCTCGAGATGGACATGRRRDYCCHVGYKCASCTT3'(SEQIDNO:27)8)5，CCCGTCGACCATCAGATGGCGGGAAGAT3，(SEQIDNO:28)備注為了用單一引物分離盡可能多的種類，對某些共有引物使用混合的堿基R=A+GD=A+T+G，Y=C+T,H=A+C+T，V=A+C+G,K=T+G,S=C+G,W=A+T。各PCR反應在50的反應體積內包含以下成分10xPCR緩沖劑5pL2mMdNTPs5pL50mMMgC122^L5，引物20pmoL3'弓l物20pmoLTaqDNA聚合酶2.5UDNA模板50ngPCR循環條件為94°C下1分鐘，62°C下1分鐘，72°C下1.5分鐘，進行30個循環，且最后在72°C下延伸10分鐘。擴增的PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上經電泳分離，切離，用Qiaquick凝膠提取試劑盒純化，并克隆到TOPOpCR2.1克隆載體中，然后用373DNA延伸測序儀進行DNA觀lj序(GriffinG.H.andGriffinM.A.:PCRtechnology,Currentinnovations.CRCPress,Boca.Raton.Florida3431.USA;CloningvectorpCR2.1,Catalogue#205184.Invitrogen,Carlsbad,CA;Qiagen，Qiaquickgelextractionkit,Catalogue#28706.QiagenInc.,Mississauga,ON;and373DNAStretch.PEAppliedBiosystems,MississaugaON.)。VB1-050的CDR序列示于表1。輕鏈可變區和重鏈可變區分別示于圖1和圖2。實施例3:由癌細胞活性測定的抗體譜(AntibodyProfiling)用流式細胞儀測試VB1-050對腫瘤和正常細胞的反應性。對代表了15種不同類型的上皮癌細胞的單板癌細胞系進行了篩選。VB1-050的結果總結于表2中。盡管VBl-050對于所有癥狀的MF值均大于2.0，但在乳房、黑素瘤和卵巢細胞系等中，卻不限于此，而觀察到最強的活性。相比之下，正常細胞的反應性通常低于那些在癌細胞上見到的。在乳房和前列腺細胞系中的VB1-050的平均表達是在癌細胞系上的9倍以上。腎臟和肺細胞系是兩個例外，但它們的MF值仍低于相應的癌細胞類型。MF值是在各癥狀中，由所有細胞系中相對于對照抗體的中熒光強度的平均增加的倍數的總和計算得到的平均。MF值為0表明相對于對照抗體而言，沒有可測量的反應性。實施例4:正常組織微陣列測試VBl-050對流動陽性癌細胞系SKBR-3的作用，以評估適當的組織形式以表明膜的染色以及定義最佳的染色條件。在所有的實驗組中，VB1-050表現出強的核和/或核膜的染色。值得注意的是，細胞離心的載片中顯示出在細胞膜上有斑點狀的染色，這出現在約30%的完整細胞中。在冷凍切片上，除了核和/或核膜的染色(60%的細胞)和細胞質的染色(10%的細胞)夕卜，也檢測到了類似的細胞膜的染色(10%的細胞)。在固定的細胞顆粒上，該抗體對核和核膜(70%的細胞)和細胞質(10%的細胞)的染色，幾乎沒有對細胞膜(3-5%的細胞)染色。由于固定并不對抗原產生影響(可由細胞離心圖片機的照片上對固定的細胞的染色證明)，在固定的細胞顆粒中明顯的細胞膜的染色的丟失可能是由于這些細胞具有比冷凍細胞更小的表面積。在冷凍細胞中可見的更大的膜面積是由于細胞質收縮所致，以及因本質問題，使用冷凍細胞需要更厚的切片。另外，固定后的加工(如嵌入等)可改變表面抗原。一旦優化的染色條件確定后，即對抗體進行測試，且與在用于正常組織反應性的福爾馬林固定的重要正常的低密度(LD)陣列之上的同型對照物(4B5)進行比較。VBl-050的結果總結于表3中。在任何正常的重要組織中均沒有發現明顯的膜染色。在許多組織中看到強烈的核和/或核膜的染色。類似的，在非重要正常組織中均未看到一致性的細胞膜染色。但除了測試以外，在接受測試的1/5中顯示出30%的膜染色。實施例5:腫瘤組織微陣列與重要和非重要正常組織篩選不同的是，在一些但不是所有的腫瘤組織中觀察到了細胞膜反應性。VB1-050更多地在結腸、前列腺、胃、卵巢和肝臟中被檢測到。最強的染色(2+)—致地在胃癌中檢測到。通常，膜被染色的細胞的百分比隨癥狀和各癥狀中的組織樣品而改變；然而，結腸癌顯示出了最高百分比的被染色的細胞。見表5。從肺癌、直腸癌、皮膚癌和子宮癌的組織樣品中沒有發現染色。實施例6:由流式細胞儀和共焦顯微鏡對VB1-050結合及內化的評價使用VB1-050和兩個對腫瘤細胞系A-375顯示強反應性的對照抗體(5E9和MA-103)來評價VBl-050的內化。代表性的實驗示于表6。在不同的溫度下的VB1-050結合結果與內化抗體5E9的沒有區別。在37°C下60分鐘后，結合于膜上的VBl-050從細胞表面消失，且中熒光強度減少了61.8%。在37°C下的溫培時間的增加與繼續減少的中熒光強度有關，但是在較慢的速率下而增加的。到120分鐘時，中熒光強度已減少了69.6%。顯示細胞表面結合的流式柱狀圖見于圖3。為了確認結合于細胞表面的VB1-050是否被內化到A-375細胞或從質膜脫落，通過借用激光掃描共焦顯微鏡觀察直接觀察熒光分布以及細胞內染色，對經抗體處理的細胞作進一步評價。與MA-103和5E9相似，用VB1-050在4°C下溫培60分鐘的A-375細胞顯示出熒光標記的圓周表面分布(圖4A)。將VB1-050抗體結合的細胞加溫到37。C揭示了用內化的抗體在60分鐘內的強的細胞內染色。見圖4B。實施例7:結合親和力狀態影響抗體-抗原復合物的最為重要的因素是抗體對其抗原的親和力。該結合親和力是這些反應物的恒定性能，表達為平衡常數(K)，定義為結合/解離的比率或KA/KD。對于給定的抗體，觀察到的親和力的不同與解離(KD)的相關程度是高于與結合(KA)的相關程度，因此，選擇KD來測量VB1-050的親和力。使用流式細胞方法來確定抗體親和力[Benedict,C.A.等(1997)"Determinationofthebindingaffinityofananti-CD34single-chainantibodyusinganovel,flowcytometrybasedassay"J.Immunol.Methods2001,223-31]。簡言之，用不同濃度范圍的VBl-050溫育A-375細胞在足夠時間內以獲得平衡。然后，細胞經洗過并用生物素偶聯的抗人1gG二抗體處理。然后用流式細胞儀檢測結合了抗體的細胞以分析腫瘤細胞。確定的中熒光強度的倒數作為抗體濃度的倒數的函數，以通過Lineweaver-Burk方法作圖[Lineweaver，H.等(1934)"Thedeterminationofenzymedissociationconstants"J.Am.Chem.Soc.56,658]確定KD。VB1-050和A-375之間相互作用的KD值確定為4.90xl(T8M。實施例8:改造和測試De-Bouganin免疫毒素1)改造VB6-050將由￡coRI和PwII對Pem-VH845-CH-F-de-bouganin/pSV73質粒的消化獲得的Pe舊-VH-PvuII插入片段連接到由相同酶預消化過(之前經改造的含有PelB前導體而無信號肽序列Pe舊(-S)的內含物表達)的PelB(-S)-VH()5(rCH-F-de-bouganin/psV73載體中。通過連接反應轉化的10F受態細胞，并在氨比西林盤上被選擇。通過繪制限制性位點來篩選菌落以確定含有Peffi-VHQ5(rCH-F-de-bouganin插入片段的克隆。Pe舊(-S)-V^o-(^片段用五coRV和Wol消化，并連接到由相同酶預消化過的Spel-de-bouganin-Pe舊-VL845-CL/psV73載體中。然后，通過連接反應轉化10F受態細胞，并置于含有氨比西林的LB-瓊脂盤上。通過繪制限制性位點來篩選菌落以確定含有SpeI-de-bouganin-PdB-Vu)5(rCL插入片段的克隆。然后使用￡"RV禾卩Iol限制性位點將SpeI-de-bouganin-PdB-VL050-CL插入片段克隆至UpING3302質粒。PelB-VH()5(rCH-F-de-bouganin片段用&oRI和5^1消化，并連接到由產生VB6-050插入片段的相同酶預消化過的SpeI-de-bouganin-PdB-VLQ5(rCL/3302載體上。然后，含有VB6-050插入片段的質粒經分離并用于轉化E104細胞。2)小試表達研究經轉化的含有VB6-050的E104細胞在含30mL的TB培養液(1%接種體)在250mL振動燒瓶中于37。C，225rpm下振動繁殖約5小時，直到光學密度(O.D.600nm)達到2。此時，用最終濃度為0.1%的L-(+)樹膠醛醣誘導培養物，并在25°C培養16小時。接著，在14000rpm下，離心5分鐘以收集上清液，并以西方墨點法，在非還原的條件下使用抗X或抗人K輕鏈的抗體確認免疫毒素的存在和大小來進行分析。3)種細胞庫生產為了生成MCB，使用采自含有25pg/mL的四環素的LB-瓊脂盤上的單一菌落，在37T恒定振動下，培育5mL的2xYT和25^ig/mL的四環素。當OD6oo達至U2時，在250mL的振動燒瓶中于37°C下，用1.25mL的種子培養物接種到50mL的含25(ag/mL的四環素的2xYT介質。將1.5mL的部分置于冷凍管(cryotube)中，并儲存于-80。C。測試三個獨立的小瓶如上所述的表達。4)發酵和純化VB6-050的補料發酵在15LCHEMAP發酵器中以TB培養液進行。在OD咖為20(中間-Iog)時，用混合料(50%甘油)和誘導劑(200gL-樹膠醛醣)進行誘導。在誘導后30個小時，獲得培養物，并在8000rpm下離心30分鐘，然后用CM-瓊脂糖柱和螯合-瓊脂糖柱及再經體積排斥色譜柱進行純化。簡單說來，上清液經濃縮和用20mM磷酸鈉pH6.9±0.1進行滲透過濾。然后，將經滲透過濾的濃縮的上清液載入CM-瓊脂糖柱，并用20mM磷酸鈉、25mMNaClpH6.9±0.1平衡。該柱子用20mM磷酸鈉，25mMNaClpH6.9±0.1洗。然后用20mM磷酸鈉和150mMNaClpH7.5±0.1洗脫結合的VB6Fab-de-bouganin融合蛋白。再將CM-瓊脂糖洗脫液調節到最終濃度為0.25%曲拉通-X100，并載入帶電荷的螯合-瓊脂糖柱。然后，螯合-瓊脂糖柱由3種不同的清洗緩沖劑清洗，首先是20mM磷酸鈉，150mMNaCl，0.25%曲拉通-X100pH7.5±0.1，然后是20mM磷酸鈉，150mMNaClpH7.5士0.1和再是20mM磷酸鈉，150mMNaCI,10mm咪唑pH7.5±0.1。結合的VB6Fab-de-bouganin融合蛋白經20mM磷酸鈉，150mMNaCl,250mM咪唑pH7.5士0.1洗脫，并收集2mL的流分物。確定各流分物在A28onm的吸收率，并收集含有原料的流分物并載入體積排斥色譜柱S200，以獲得約80%的純度。該過程中各步驟的樣品均用西方墨點法分析，分析用到抗K的抗體。最后用膠體藍染色確定經體積排斥色譜柱后的純度。5)VB6-050的生物活性人黑素瘤A-375、人T細胞Daudi、人卵巢SK-OV-3、人胰腺Panc-l、人乳腺SKBR-3和MB-435S以及人結腸Colo-320細胞系分別在它們各自的基質中按照ATCC協議生長。在30-40%的飽和度下獲得的細胞具有生存能力大于90%。使用流式細胞儀展示分別使用抗原陽性細胞系SKBR-3、A-375和SK-OV-3，以及抗原陰性細胞系Panc-l、Colo-320禾BDaudi來使純化的VB6-050保留結合的特異性。使用抗de-bouganin的抗體檢測結合。簡言之，待測試的構建體用0.45"06個癌細胞在冰上培育1.5小時。經清洗后，用兔抗de-bouganin(l/100)在冰上1小時檢測細胞表面的結合反應性。細胞經清洗并用FITC-偶聯的抗-兔lgG在冰上培育30分種。然后，清洗細胞，并再懸浮于含5。/。FCS的碘化丙啶的PBS中，供流式細胞儀測定Fab結合之用。"處爭分析飽和曲線通過用濃度在10-750jug/mL范圍內增加的VB6-050與抗原陽性細胞培育而生成的。如前所述那樣使用流式細胞儀測定結合的Fab-de-bouganin。然后，對應于飽和點的Fab-de-bouganin的濃度用抗原陽性細胞在增加濃度的親本lgG抗體存在下培育。結合的Fab-de-bouganin的減少由流式細胞儀測量。4B5IgG被用作陰性對照。d潘應泰絲分折VB6-050的細胞毒性通過MTS分析測量。簡言之，抗原陽性和抗原陰性細胞以每孔1000個細胞進行下種，并在37°C下培育3小時。接著，改變VB6-050的濃度，向細胞中加入de-bouganin，5天后，確定細胞生存能力。結果1)在pING3302表達載體中VB6-050的改造和小試表達為第一個嘗試生產Fab-de-bouganin蛋白質，載體被改造為兩個分離的構建體，其中，Fd部分融合到de-bouganin和輕鏈。每個鏈的表達通過Pe舊前導序列Pe舊(-S)中的信號肽的缺失而導入內含體中。然而，在內含體中Fd-de-bouganin蛋白質的表達的缺少以及成功的VB6-845可溶性表達闡釋了對VB6-050可溶的Fab-de-bouganin構建體的重新改造。為了減少重新改造的時間，并基于可行性，限制酶被用于將Fd-F-de-bouganin和V^CL片段連接到含有信號肽的PdB前導序列。對050的Fd和輕鏈的分析分別揭示了重鏈和輕鏈中五coRl，尸v"II，￡RV和^oI所處的限制性位點，從而允許在沒有PCR反應下使用VB6-845中間的構建體來重新改造VB6-050。為此，通過使用￡coRI和限制性位點，并連接到事先用相同酶預消化的Peffi(-S)-VHo5(rCH-F-de-bouganin上(圖5A)，可獲得具有Peffi-VH845-CH-F-de-bouganin的前導肽的PelB插入片段。類似的，Pe舊(-S)-Vu)5o-CLypSV73質粒由五coRV和J^ol消化，且插入片段克隆到事先用EcoRV和屈ol預消化的Spel-de-bouganin-PelB-VL845-CLK載體。接著，使用EcoRI和屈ol限制性位點將該插入片段PdB-VLQ5(rCL插入到3302質粒中(圖5B)。然后，PeB-VH。5。-CH-F-de-bouganin片段通過￡coRI-5^I限制性位點而連接，從而在3302DNA質粒中產生VB6-050插入片段。最后3302DNA質粒再轉化到E104細胞(圖5C和5D)。在非還原的條件下對VB6-050進行的西方墨點分析表明，用抗K輕鏈的抗體探測出了全長的蛋白質(圖6)。此外，VB6-050的表達水平與用作參考的VB6-845相似。未經誘導的E104培養物上清液的西方墨點揭示了沒有對應的條帶，這說明這些蛋白質被特異性地以相應的抗體探測到(圖6,泳道4)。另外，在各克隆中，也獲得了在VB6-845中觀察到類似的降解產物的譜。2)VB6-050的純化對采自15升發酵器中的VB6-050進行了純化。用西方墨點對純化過程中取自各步驟的等量樣品進行了分析，以評估各柱的回收率(圖7A)。免疫印跡用抗人K輕鏈培育。在濃縮和滲透過濾的步驟中的滲透物，沒有觀察到可檢測的產物(圖7A，泳道2和4)。經滲透過濾的材料，以1/10稀釋，載入CM-瓊脂糖柱(圖7A，泳道5)。西方墨點分析顯示，CM洗脫物(圖7A，泳道8)包含了全長的VB6-050和可能的降解的VB6-050片段。泳道9的鎳柱的流經物顯示大多數VB6-050和其它產物結合到柱上。然后，將泳道13的N嚴洗脫物載入SEC200體積排斥色譜，以從降解的片段分離出完整的VB6-050(圖7A，泳道14和圖7B，泳道2)。3)由流式細胞儀檢測VB6-050的蛋白質結合對于VB6-050，根據各抗體譜的數據選擇抗原陽性和抗原陰性細胞系。通過流式細胞儀用抗bouganin的抗體檢測出了結合的Fab-de-bouganin。如所期望的，在用抗原陰性細胞系培育后，用流式細胞儀未檢測出有結合。相反，在用抗原陽性細胞系培育后，檢測到了結合的Fab-de-bouganin。此外，抗原陽性細胞用在0to500(mu)g/mL范圍內的多種濃度的Fab-de-bouganin蛋白質進行了培育，并通過流式細胞儀確定結合活性。由此生成滴定曲線(圖8)。以確定的中熒光強度的倒數作為抗體濃度的倒數的函數作圖，并通過Lineweaver-Burk方法[Lineweaver，H.等(1934)"Thedeterminationofenzymedissociationconstants"J.Am.Chem.Soc.56，658]確定K(D)。作圖產生了一條直線，且K(D)可由曲線的斜率計算出。離解常數K(D)由以下方程確定；1/F=1/Fmax+(KD./Fmax)(l/VB6),其中，F＝扣除背景的中熒光強度，Fmax由圖中計算得到(圖8)。Fab-de-bouganin的飽和點由飽和曲線確定，并用于使用了親本抗體的競爭分析。VB6-050的飽和點，250(mu)g/mL，用抗原陽性細胞在其相應親本lgG范圍由0-1000(mu)/mL增加的條件下進行培育。使用抗bouganin的抗體，通過流式細胞儀檢測出了結合的VB6-050。如所期望的，親本lgG爭奪了對Fab-de-bouganin蛋白質的結合。抑制50%的結合的Fab-de-bouganin所需要的lgG的濃度被確定為180(mu)g/mL。(表7)4)VB6-050蛋白質的細胞毒性用濃度范圍在lnM到1muM的不同濃度的VB6-050與陰性和陽性抗原細胞系培育。培育后5天，計算出VB6-050的IC50。值為400nM(圖9)(表7)。與之相比的，用抗原陰性細胞系未能確定出IC50。結論選自Hybridomics和Immunomine平臺的VB1-050IgG被改造成可溶的Fab-de-bouganin融合蛋白質，其含有經弗林蛋白酶(furin)可裂解的連接體而基因連接到VH-CH區的de-bouganin。數據證實了由IgG衍生的Fab-de-bouganin形式適合于可溶的表達，并使得下游過程易于進行。一旦經純化，流式細胞儀數據顯示出VB6形式的譜數據符合親本lgG，這說明特異性和選擇性得以保留。此外，lgG與VB6融合蛋白質的競爭說明兩個片段都結合到相同抗原。計算出的VB6形式的親和力在微摩爾級范圍內，導致IC5。^280nM。實施例9:抗原識別VB1-050Ag的初步表征在去糖基化后，VB1-050在結合上顯示出58.62%(P-值0.008)的增加。該在去糖基化后觀察到的抗原結合的增加表明，多糖部分可能部分地掩蓋了細胞表面的抗原位點，而去糖基化可能是識別抗原的關鍵步驟。免疫沉淀用N-聚糖酶對等量的分別取自四種陽性細胞系:MCF-7、MDA-MB-435S、A-375、HepG2，和三種陰性細胞系:Panc-l、Daudi、C-33A的細胞膜制劑進行去糖基化，并用40嗎的VB1-050和4B5-IgG回轉。上述過程均是在模擬體內環境的條件下，以及有蛋白酶抑制劑存在下進行。免疫復合物經離心，并用RIP-A溶解緩沖劑清洗，及用0.2M甘胺酸pH2.5洗脫。基于凝膠的分析和西方墨點由上述所有細胞系獲得的免疫沉淀物暴露于樣品制備物的還原的和非還原的條件下，然后進行SDS-PAGE和西方墨點分析。所得墨點用4B5-IgG和VB1-050同時探測，以及相應的第二抗體偶聯到HRP上，從而通過化學發光顯示出了經免疫沉淀的蛋白質。在所有細胞系的1D-PAGE上，檢測出了位于VB1-050的免疫沉淀物的約50kDa的條帶，2D-PAGE未產生任何結果。4B5-IgG未檢測出任何條帶。由于用傳統的方法未顯示出任何不同表達的抗原，于是探索出另一種用于抗原識別的方法。先后使用ProteomeLabTMPF-2D和nano-ESI-MS/MS得到的HTP畫抗原IDHepG2，MCF-7，Panc-l和C-33A的PF2D分級由細胞膜制備物獲得的預分級的VB1-050免疫沉淀物通過高速離心清除所有的顆粒物質。清澈的上清液用初始(Start)緩沖劑平衡，并在第一維的色層聚焦柱上分級。在pH=7.4-7.6洗脫的峰值流分用溶劑A(0.1。/。TF八)以1:4的比率平衡，并在HPRP柱上分級，并用到含有微量TFA的濃度梯度在0-100%范圍的乙腈。通過在色層聚焦柱上的分級(CF)，HepG2和MCF-7顯示出單一的在pH7.4-7.6洗脫出的寬峰含有兩個流分(構成弁B6禾卩B7)，分別出現在68分鐘和65分鐘。另外，還在圖IOA和B中觀察到，從HPRP柱洗脫出的HepG2和MCF-7的膜顯示出不同的分離譜，且完全依賴于VB1-050反應性抗原的存在。這兩個峰在陽性細胞系中顯示出有差異的調節，而這在陰性細胞系Panc-l和C-33A的膜(圖10A和B)中可忽略或完全不存在。對在陽性細胞系(MCF-7和HepG2)中的蛋白質峰的詳細分析表明，從RP-HPLC柱洗脫的峰的保留時間分別為15和18分鐘。這些峰在抗原-陰性細胞系(Panc-l禾QC-33A)中未觀察到。相反，在陰性細胞系中觀察到了在稍早于12分鐘時洗脫出的單峰。使用ProteoVueTM/DeltaVueTM軟件進行的分級分析將由HPRP柱獲得的色譜譜圖輸入到ProteoVueTM文件中，轉化成可接受的形式，再用于在DdtaVueTM上進行最后分析。這些分析結果經合并用于來自陽性(HepG2和MCF-7)和陰性(Panc-1和C-33A)細胞系的抗原分級，并用ProteoVue⑧軟件編排處理，以產生各細胞系的完整的膜蛋白圖。然后在DdtaVueTM軟件上生成有差異地調節的蛋白質的比較譜。兩種細胞系的分級的色譜譜圖由峰轉化為帶狀圖，使得有差異地表達的區域更易于識別。陽性細胞系中的特別是差異表達的峰/帶可聚焦以獲得更好的分辨率和分析。在各實驗中獲得的陽性和陰性圖的重疊顯示出僅在陽性細胞系(HepG2禾口MCF-7)中可見到蛋白質的過度表達，這些流分被用作肽提取之用。由峰值流分提取肽用測序級胰蛋白酶進行胰蛋白酶消化，通過20小時的肽提取過程，最終獲得肽用配備了納米源且工作流速為20-50nL/min的QSTARPulsar-I(ESI-qTOF-MS/MS)進行分析。將肽離子化，并檢測二價、三價或四價的分子，然后對應到它們相應的質量。在條件允許的情況下，也進行被識別的蛋白質的重新測序。從陽性和陰性細胞系中同時提取肽，以確保抗原是正確的。由質譜獲取的肽的質量被直接用于識別抗原，所依據的是由蛋白質數據庫獲得的MOWSE分數。這可通過MASCOT搜索引擎獲得。在胰蛋白酶消化后由在15-18分鐘洗脫出的所有四個樣品(MCF-7，HepG2，Panc-l和C-33A)的峰值提取肽，并進行MS分析。除了在15和18分鐘洗脫出的流分外，在12分鐘從陽性和陰性細胞系洗脫的流分也同時進行處理。圖11-14示出了由細胞系獲得的肽的TOF-MS掃描結果。如圖15所示，從兩個陽性細胞系中確認出了一種單一對應于葡萄糖轉運體8的蛋白質，而在陰性細胞系中未檢測出。兩峰(15對18分鐘)之間在洗脫上的差別可歸咎于糖基化或其它翻譯后改性上的變化。質譜分析以兩種方法進行肽的分析所有回收的和重新構建到它們的正確質量的肽均直接用于肽質量指紋技術分析步驟，以獲得蛋白質的ID。高豐度的和很好離子化的肽被進一步進行MS/MS離子碎片化，其中，y'和'b'離子被用作推導它們的主要結構。然后在蛋白質數據庫中檢索這些序列的同源物，以獲得蛋白質的ID。將肽離子化，并在LC-MS/MS系統上檢測二價、三價或四價的分子，這不同于在由矩陣輔助的離子化的如MALDI系統上檢測單價離子。具有電荷差異的肽隨后在質量重建步驟，被歸屬于它們各自對應的質量。這些肽的質量隨后用基于矩陣科學的mascot搜索引擎進行直接分析以獲得抗原ID。由質譜獲取的肽的質量被直接用于識別抗原，所依據的是由蛋白質數據庫獲得的MOWSE分數。這可通過搜索引擎如MASCOT,SEQUEST,禾BProspector獲得。由于QSTAR-pulsar-I的購買包括了從Pepsea服務器得到大多數近期蛋白質數據庫新增內容的許可，且又與MASCOT兼容，因此選用該搜索引擎于所有的蛋白質檢索。圖15，16和表8給出了回收的肽和它們在葡萄糖轉運體8中繪制成的序列位置。所有的具代表性的肽均通過重新測序獲得。圖17確認了葡萄糖轉運體8為抗原。四個肽的MS/MS片段化(1401.54-466.600000，3+;1070.785448-536.400000，2+;1998.272862-667.098230，3+;1176.185448-589.100000，2+)產生了示于圖18-21的碎片離子，繪制成葡萄糖轉運體8的肽。由于這些2種肽均在TOF-MS中檢測出，除源自質譜指紋法的肽外，這些肽也被用作MS/MS離子片段化。安裝在納米源上的離散納噴霧頭被用于此用途。碰撞能量為48V，氣簾氣體和CAD氣體分別維持在25和6，樣品循環1.667分鐘(100個循環)以獲得穩定的質譜離子片段化。源自譜圖的肽與葡萄糖轉運體8的序列明顯吻合，因此被視作主要的命中。離子片段化的數據進一步確認了葡萄糖轉運體8為VB1-050的同源抗原。肽的質量指紋和抗原-陽性流分的MS/MS片段化解釋了葡萄糖轉運體-8/GLUTXl/SLC2A8基因產物是VB1-050的同源結合抗原。葡萄糖轉運體-8是約50kDa的二型跨膜蛋白質，在細胞內具有N-末端。在回收的的肽中，獲得了34%的序列覆蓋率。由流動選擇為陽性的細胞系表現出在免疫沉淀后抗原的存在。對兩個肽的MS/MS分析為1070.785，表現為二價分子(536.40000，2+);1401.54,表現為三價分子(466.60000，3+)，分別確認了兩個肽序列，SLASVVVGVIQ(292-303)和KTLEQITAHFEGR(466-477)。與對應于葡萄糖轉運體-8的蛋白質序列明顯吻合。由MCF-7回收的另外兩個肽的MS/MS測序，U76.3547和1997.9992，與GLUT8的相應的肽具有68.2%的序列同源性，在7個位置，即7,10，12-15,18發生了氨基酸的改變。該并入的改變對于由Shin等報道的在12，13的位置從LL到AA的改變(2004,J.Neuro.Res.75:835)，這導致GLUT8從細胞溶質到細胞質膜的定向。盡管本發明已通過目前被認為是優選的實施例加以了說明，但應當理解本發明并不限于上述揭示的例子。相反，本發明還包括在權利要求所表現的本發明的精神和范圍中的各種變化和等同的情況。正如各單獨的出版公開物、專利和專利申請被具體和單獨地完全引用，在此，所有的出版公開物、專利和專利申請均被全文引入作為參考。表1:CDR序列<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>表2:腫瘤和正常細胞與VBl-050的表面活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>'N表示每種癥狀測試的細胞系的數目。2MF:數值表示各癥狀中，從所有細胞系獲得的由相對于對照抗體的中熒光強度的增加的平均倍數的總值計算出的平均值。0值表示相對于對照抗體，沒有可測量的相對反應性。3表示由AnticancerInc.提供的常位模型。b可進行GFP(綠色熒光蛋白)-轉染的細胞系。cHer2/neif,ER+.dHer2/neu，ER-，p53wt,raswt.eHer2/neu-,ER-,P53mt,raswt.f雄激素-響應的.g雄激素-不響應的。表3:VB1-050的福爾馬林固定的重要正常組織的LD陣列<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>、平分標準基于0-3+級，O表示沒有染色，且微量少于l+，但大于O。分數l+到3+表示染色強度的增加，3+為強的深褐色的染色。通常，6個不同患者的單一樣品被篩選。其中，少于6個患者被篩選出的表明分數或者是丟失，或者不是有代表性的被染色的組織。括號中的值表明在評分范圍內被染色的細胞的百分比。2僅使用了相鄰的正常組織。35個中的4個為相鄰的正常組織樣品。表4:VB1-050的HD福爾馬林固定的正常TMA<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>H平分標準基于0-3+級，O表示沒有染色，且微量少于l+，但大于O。分數l+到3+表示染色強度的增加，3+為強的深褐色的染色。通常，8個不同患者中的兩個樣品被篩選。其中，少于8個患者被篩選出的表明分數或者是丟失，或者不是有代表性的被染色的組織。括號中的值表明在評分范圍內被染色的細胞的百分比。表5:VBl-050的HD福爾馬林固定的腫瘤TMA<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>*評分標準基于0-3+級，0表示沒有染色，且微量少于l+，但大于0。分數l+到3+表示染色強度的增加，3+為強的深褐色的染色。通常，8個不同患者中的兩個樣品被篩選。其中，少于8個患者被篩選出的表明分數或者是丟失，或者不是有代表性的被染色的組織。頭和頸癌包括咽喉、唇、喉、口、扁桃腺和齒齦表面的癌癥。括號中的值表明在評分范圍內被染色的細胞的百分比。用粗體表示的癌癥癥狀指示出VB1-050的反應性。表6:以時間和溫度的函數作為抗體結合的流式細胞儀的評核<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>1示出了代表性的實驗。2MF增加高于陰性對照，小鼠骨髓瘤IgG或人IgG(4B5)。3從腫瘤細胞的細胞表面的MF降低的百分比。4(-)是在冰上培育120分鐘的細胞。表7:VB6-050的生物學表征<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>ND:未確定。*抑制50M的VB6結合的lgG的濃度。表8:回收的肽<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>權利要求1.一個包含氨基酸序列SEQIDNO1或其變異體的分離的輕鏈互補決定區1。2.—個編碼權利要求1的輕鏈互補決定區1的分離的核酸序列，或其變異體。3.—個包含氨基酸序列SEQIDNO:2或其變異體的分離的輕鏈互補決定區2。4.一個編碼權利要求3的輕鏈互補決定區2的分離的核酸序列，或其變異體。5.—個包含氨基酸序列SEQIDNO:3或其變異體的分離的輕鏈互補決定區3。6.—個編碼權利要求5的輕鏈互補決定區3的分離的核酸序列，或其變異體。7.—個包含氨基酸序列SEQIDNO:4或其變異體的分離的重鏈互補決定區1。8.—個編碼權利要求7的重鏈互補決定區1的分離的核酸序列，或其變異體。9.一個包含氨基酸序列SEQIDNO:5或其變異體的分離的重鏈互補決定區2。10.—個編碼權利要求9的重鏈互補決定區2的分離的核酸序列，或其變異體。11.一個包含氨基酸序列SEQIDNO:6或其變異體的分離的重鏈互補決定區3。12.—個編碼權利要求11的重鏈互補決定區3的分離的核酸序列，或其變異體。13.—個包含權利要求1，3和/或5的輕鏈互補決定區的分離的輕鏈可變區，或其變異體。14.一個編碼權利要求13的輕鏈可變區的分離的核酸序列，或其變異體。15.—個包含權利要求7，9和/或11的重鏈互補決定區的分離的重鏈可變區，或其變異體。16.—個編碼權利要求15的重鏈可變區的分離的核酸序列，或其變異體。17.—個包含氨基酸序列SEQIDNO:7(圖l)的分離的輕鏈可變區，或其變異體。18.—個包含SEQIDNO:8(圖l)的輕鏈可變區的分離的核酸序列，或其變異體。19.一個包含氨基酸序列SEQIDNO:9(圖2)的分離的重鏈可變區，或其變異體。20.—個包含SEQIDNO.10的重鏈可變區(圖2)的分離的核酸序列，或其變異體。21.—個包含權利要求1，3和/或5的輕鏈互補決定區的結合蛋白，或其變異體。22.—個包含權利要求7，9和/或ll的重鏈互補決定區的結合蛋白，或其變異體。23.—個包含權利要求1，3禾B/或5的輕鏈互補決定區和權利要求7，9和/或11的重鏈互補決定區的結合蛋白，或其變異體。24.—個包含權利要求13或17的輕鏈可變區的結合蛋白，或其變異體。25.—個包含權利要求15或19的重鏈可變區的結合蛋白，或其變異體。26.—個包含權利要求13或17的輕鏈可變區和權利要求15或19的重鏈可變區的結合蛋白，或其變異體。27.權利要求21-26中任何一項的結合蛋白，其中，該結合蛋白結合到葡萄糖轉運體8或其變異體上。28.權利要求21-26中任何一項的結合蛋白，其中，該結合蛋白結合到包含了由SEQIDNOS:11-20定義的任何一個氨基酸序列或其變異體的蛋白質上。29.權利要求21-26中任何一項的結合蛋白，其中，該結合蛋白結合到包含了由SEQIDNOS:ll定義的氨基酸序列或其變異體的蛋白質上。30.權利要求21-26中任何一項的結合蛋白，其中，該結合蛋白結合到包含了由SEQIDNOS:12定義的氨基酸序列或其變異體的蛋白質上。31.權利要求21-26中任何一項的結合蛋白，其中，該結合蛋白結合到包含了由SEQIDNOS:13定義的氨基酸序列或其變異體的蛋白質上。32.權利要求21-26中任何一項的結合蛋白，其中，該結合蛋白結合到與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體上，該變異體在N-端的二-亮氨酸部分發生改性。33.權利要求32的結合蛋白，其中，在N-端的二-亮氨酸部分的改性是由二-亮氨酸改性為二-丙氨酸。34.權利要求21-33中任何一項的結合蛋白，其中，親和力成熟被用于提高結合蛋白對葡萄糖轉運體8或其變異體的親和力、或對包含任何一個SEQIDNOS:11-20的氨基酸序列中的蛋白質的親和力。35.—種結合蛋白，其中，該結合蛋白對與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體是特異性。36.根據權利要求35的結合蛋白，其中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體包含由SEQIDNOS:ll定義的氨基酸序列或其變異體。37.根據權利要求35的結合蛋白，其中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體包含由SEQIDN0S:12定義的氨基酸序列或其變異體。38.根據權利要求35的結合蛋白，其中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體包含由SEQIDNOS:13定義的氨基酸序列或其變異體。39.根據權利要求35的結合蛋白，其中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體包含的葡萄糖轉運體8在N-端的二-亮氨酸部分發生改性。40.根據權利要求39的結合蛋白，其中，在N-端的二-亮氨酸部分的改性是由二-亮氨酸改性為二-丙氨酸。41.根據權利要求35-40中任何一項的結合蛋白，其中，親和力成熟被用于提高結合蛋白對與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的親和力。42.—種可結合到癌細胞上的抗原上的結合蛋白，其中，可通過競爭性結合分析識別結合蛋白。43.根據權利要求42的結合蛋白，其中，競爭性結合分析包括(1)用最小濃度的根據權利要求21-42中任何一項中的結合蛋白(Abl)與固定數量的癌細胞一起溫培，這些結合蛋白對固定數量的癌細胞產生最大結合，并測量Abl的中熒光強度(MFAb,);(2)通過向Abl和癌細胞中加入Ab2，測試試驗的結合蛋白(Ab2)兩個或更多濃度，并測量中熒光強度(MF(AbHAb2));(3)測量背景熒光強度(MFbgd);(4)計算PI，其中，PI=[(MF(Abl+Ab2)—MF背景)/(MFaw-MF背景)]x100;以及(5)將PI與對照物的PI值進行比較；其中，與對照物的PI在統計學上有顯著不同的PI表明試驗的結合蛋白能夠結合到癌細胞上的抗原上。44.權利要求21-43中任何一項的結合蛋白，其中，結合蛋白是抗體。45.權利要求44的結合蛋白，其中，抗體是抗體片段。46.權利要求45的結合蛋白，其中，抗體片段是Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、其二聚體、微型抗體、雙鏈抗體或多聚抗體，或雙特異性抗體片段。47.—種組合物，包含權利要求21-46中任何一項的結合蛋白，其具有藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑或穩定劑。48.—種免疫偶聯物，包含(l)權利要求21-46中任何一項的結合到癌細胞上的抗原上的結合蛋白，其附于(2)—種癌癥治療劑上，該癌癥治療試劑是毒害細胞的、抑制細胞生長的，或者是阻止或降低癌癥細胞分裂的和/或轉移的能力。49.權利要求48的免疫偶聯物，其中，癌癥治療劑是細胞毒素。50.權利要求49的免疫偶聯物，其中，細胞毒素是核糖體-失活的多肽。51.根據權利要求50的免疫偶聯物，其中，細胞毒素選自由多花白樹素(gelonin)、bouganin、皇草毒素(saporin)、篦麻毒素(ricin)、篦麻毒素A鏈、異株瀉根毒素(bryodin)、白喉毒素(diphtheriatoxin)、局限曲菌素(restrictocin)、假單細胞菌外毒素A(PseudomonasexotoxinA)、或它們的變異體組成的組。52.權利要求50的免疫偶聯物，其中，毒素是改性的bouganin或其變異體。53.權利要求50的免疫偶聯物，其中，毒素是包含氨基酸252-608的假單細胞菌外毒素A的截去形式或其變異體。54.權利要求48-53中任何一項的免疫偶聯物，其中，免疫毒素被癌細胞內化。55.—種組合物，包含根據權利要求48-54中任何一項的免疫偶聯物，其具有藥學上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑或穩定劑。56.根據權利要求48-54中任何一項的有效量的免疫偶聯物在制造治療或預防癌癥的藥物中的應用。57.根據權利要求56的應用，還包含一種或多種其它癌癥治療劑在制造同時的、分開的或連續的治療或預防癌癥的藥物中的應用。58.根據權利要求48-54中任何一項的有效量的免疫偶聯物在治療或預防癌癥中的應用。59.根據權利要求58的應用，還包含一種或多種其它癌癥治療劑在同時的、分開的或連續的治療或預防癌癥中的應用。60.—種治療或預防癌癥的方法，包含向疑似患癌癥的受治療者施用權利要求48-54中任何一項的有效量的免疫偶聯物。61.根據權利要求60的方法，進一步包含至少一個其它的抗癌癥療法。62.—種治療或預防癌癥的試劑盒，包含權利要求48-54中任何一項的有效量的免疫偶聯物，以及使用其治療或預防癌癥的指導說明。63.—種檢測或監控受測試者中的癌癥的方法，該方法包含以下步驟(1)將從所述受測試者中取出的測試樣品與權利要求21-46中任何一項的結合蛋白接觸，所述結合蛋白特異性地結合到癌細胞上的抗原，形成結合蛋白一抗原復合物；(2)測量測試樣品中結合蛋白一抗原復合物的量；以及(3)將測試樣品中的結合蛋白一抗原復合物的量與對照物比較。64.—種診斷癌癥的試劑盒，包含權利要求21-46中任何一項的結合到癌細胞上的抗原的結合蛋白，以及其使用指導說明。65.—種診斷試劑，包含(l)根據權利要求21-46中任何一項的結合到癌細胞上的抗原的結合蛋白，其附于(2)可直接或間接地生成可檢測的信號的標記物上。66.權利要求65的診斷試劑，其中，標記物是放射性同位素、熒光化合物、化學發光化合物、酶、成像試劑或金屬離子。67.—種試劑盒，包含權利要求65或66的診斷試劑以及其使用指導說明。68.—種重組表達載體，包含權利要求2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的任何一項的核酸分子。69.—種宿主細胞，包含權利要求68的重組表達載體。70.—種分離的蛋白質，包含可特異性地結合到權利要求21-46中任何一項的結合蛋白的氨基酸序列。71.權利要求70的分離的蛋白質，包含葡萄糖轉運體8或其變異體。72.權利要求70的分離的蛋白質，包含SEQIDNOS:11-20中任何一個的氨基酸序列或其變異體。73.權利要求70的分離的蛋白質，包含與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體。74.權利要求73的分離的蛋白質，其中，與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體包含的葡萄糖轉運體8在N-端的二-亮氨酸部分發生改性。75.權利要求74的分離的蛋白質，其中，在N-端的二-亮氨酸部分的改性是由二-亮氨酸改性為二-丙氨酸。76.—種分離的蛋白質，包含SEQIDNO:ll的氨基酸序列或其變異體。77.—種分離的蛋白質，包含SEQIDNO:12的氨基酸序列或其變異體。78.—種分離的蛋白質，包含SEQIDNO:13的氨基酸序列或其變異體。79.—種分離的核酸序列，其編碼權利要求70-78中任何一項的分離的蛋白質。80.—種重組表達載體，包含權利要求79的核酸序列。81.—種檢測或監控患有或懷疑患有癌癥的受測試者的癌癥的方法，該方法包含檢測權利要求70-78中任何一項的在樣品中細胞上的分離的蛋白質，其中，如果在細胞上檢測到分離的蛋白質，則表明有癌癥存在。82.—種藥物組合物，包含根據權利要求70-78中任何一項的有效量的分離的蛋白質或其片段與適合的稀釋劑或載體的混合物。83.權利要求82的藥物組合物，進一步包含佐藥。84.—種藥物組合物，包含權利要求79的有效量的分離的核酸序列與適合的稀釋劑或載體的混合物。85.權利要求84的藥物組合物，進一步包含佐藥。86.—種藥物組合物，包含權利要求80的有效量的重組表達載體與適合的稀釋劑或載體的混合物。87.權利要求86的藥物組合物，進一步包含佐藥。88.根據權利要求70-78的任何一項的分離的蛋白質或其片段在制造治療或預防癌癥的藥物中的應用。89.根據權利要求70-78的任何一項的分離的蛋白質或其片段在制造誘發受測試者的免疫應答的藥物中的應用。90.根據權利要求79的分離的核酸序列在制造治療或預防癌癥的藥物中的應用。91.根據權利要求79的分離的核酸序列在制造誘發受測試者的免疫應答的藥物中的應用。92.權利要求80的重組表達載體在制造治療或預防癌癥的藥物中的應用。93.權利要求80的重組表達載體在制造誘發受測試者的免疫應答的藥物中的應用。94.一種治療或預防癌癥的方法，包含向患有或疑似患癌癥的受治療者施用根據權利要求70-78中任何一項的有效量的分離的蛋白質或其片段。95.—種治療或預防癌癥的方法，包含向患有或疑似患癌癥的受治療者施用根據權利要求79的有效量的分離的核酸序列。96.—種治療或預防癌癥的方法，包含向患有或疑似患癌癥的受治療者施用權利要求80的有效量的重組表達載體。97.—種在受測試者中誘發對權利要求70-78中任何一項的分離的蛋白質的免疫應答的方法，包含向所述受測試者施用根據權利要求70-78中任何一項的有效量的分離的蛋白質或其變異體。98.—種在受測試者中誘發對權利要求70-78中任何一項的分離的蛋白質的免疫應答的方法，包含向所述受測試者施用根據權利要求79的有效量的分離的核酸序列。99.一種在受測試者中誘發對權利要求70-78中任何一項的分離的蛋白質的免疫應答的方法，包含向所述受測試者施用權利要求80的有效量的重組表達載體。100.—種試劑盒，包含權利要求82-87中任何一項的藥物組合物及其使用指導說明。101.—種在受測試者中治療或預防癌癥的方法，包含阻止或降低與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體作為糖的轉運體的功能。102.根據權利要求101的方法，其中，權利要求21-46中任何一項的結合蛋白被用于阻止或降低與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體作為糖的轉運體的功能。103.根據權利要求101的方法，其中，葡萄糖轉運體抑制劑被用于阻止或降低與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體作為糖的轉運體的功能。104.根據權利要求101的方法，其中，通過阻止或降低在細胞中與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的表達，而阻止或降低與癌癥相關的葡萄糖轉運體8的變異體的功能。105.—種確認具有預防或治療癌癥的化合物的方法，包含以下步驟(a)將表達了權利要求70-78中任何一項的分離的蛋白質的細胞與測試化合物接觸；以及(b)確定分離的蛋白質作為葡萄糖轉運體的表達或功能；(c)與對照物比較的分離的蛋白質的表達或功能，其中，如果與對照物相比，分離的蛋白質的表達或功能有所降低，則表明該化合物可用作預防或治療癌癥。全文摘要本發明提供了癌癥特異性抗體的重鏈和輕鏈互補決定區的氨基酸和核酸序列。并且，本發明還提供了癌癥特異性的抗體和免疫偶聯物，其含有癌癥特異性抗體，附于毒素或標記物之上，以及它們的方法及應用。本發明還涉及使用本發明的癌癥特異性抗體的診斷方法和試劑盒。另外，本發明還提供了新的與癌癥相關的抗原和其應用。文檔編號C12N15/13GK101160402SQ200580048522公開日2008年4月9日申請日期2005年12月21日優先權日2004年12月21日發明者喬伊斯林·恩特韋斯特爾,吉恩尼克·西茲爾尤,尼古拉斯·R·格羅沃,弗蘭西娜·C·查海爾,格倫·麥克唐納申請人:維文蒂阿生物技術股份有限公司