聚合物結合的抗體癌癥治療劑的制作方法

專利名稱：聚合物結合的抗體癌癥治療劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及癌癥治療劑，其包括結合有多個抗腫瘤抗體的聚合物，以及所述治療劑在癌癥治療中的應用。
背景技術：
下面對本發明背景的討論僅僅是被提供用來幫助讀者理解本發明，不意圖于描述或構成本發明的現有技術。
單克隆抗體(MABs)已經成為人類惡性淋巴瘤和其它癌癥的重要治療模式。針對CD20標志物的抗體產品RITUXAN、ZEVALIN和BEXXAR，已經得到美國FDA的批準，用于淋巴瘤治療。這些試劑的應用正在幫助腫瘤學家設計更加有效的方案。
CD20是一種非糖基化的33-37KD的磷蛋白，表達于＞95％的正常和贅生性B細胞上(1)。從發育的前B期到最終分化為漿細胞，CD20表達于細胞表面。單核細胞、靜息和活化的T細胞、裸細胞以及非淋巴細胞始終是CD20陰性的(2)。CD20的氨基酸序列提示，它由四個跨膜區組成，氨基和羧基末端均位于質膜的胞質側(3)。目前認為CD20起鈣離子通道的作用，用以引發細胞內信號，并且調節細胞生長和分化(4)。
CD20以高表面密度在惡性淋巴瘤細胞上的表達為針對這種細胞表面靶標開發MAbs提供了理論基礎。此外，在抗體結合之后，CD20沒有顯示出內化或調制的趨向(5)。
RITUXAN(通用名利妥昔單抗)是針對CD20的嵌合單克隆抗體。在臨床上，給予利妥昔單抗在25-50％的患者中誘導客觀治療反應(6)。為了了解對利妥昔單抗的差異反應，已努力研究了其抗腫瘤活性的潛在機制和每一機制的相對貢獻。已經顯示，CD20和抗-CD20抗體如利妥昔單抗的連接激活與CD20非共價締合的酪氨酸蛋白激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，從而誘導磷脂酶C-γ(PLCγ)的酪氨酸磷酸化(7、8)。而且，已經顯示，交聯CD20和抗-CD20二抗(例如，羊抗鼠抗體(GAM))，從細胞內儲備中動員出鈣離子(9)。有趣的是，不同的抗-CD20抗體對CD20的功能有不同的影響。例如，抗體IF5刺激B細胞周期從G0轉變為G1(10)，而抗體B1抑制B細胞在促有絲分裂劑刺激后從細胞周期的G1期進展到S/G2+M期(4)。已顯示，這些差異與抗CD20抗體將CD20抗原移位到去污劑不溶性脂微域的能力相關，所述脂微域通常被稱作“筏(rafts)”，在觸發細胞內信號或激活細胞溶解型補體中，這是必須的(11-14)。
Harjunpaa等人(15)和Manches等人(16)已經報道，直接補體殺傷作用是利妥昔單抗給予的快速和有效的效應物機制，但在近來，Weng和Levy(16)提出了不同的結果，表明利妥昔單抗的治療活性和補體防御分子CD55或CD59的表達水平不相關。因為這些結果，CDC在利妥昔單抗治療中的作用受到質疑，并且在利妥昔單抗治療期間觀察到的補體消耗可能事實上反映了毒性而不是療效。
近來研究了用利妥昔單抗抗體或帶有FcR的巨噬細胞或浸潤腫瘤的其它輔助細胞對CD20的交聯而引發的、導致凋亡和細胞死亡的細胞內事件的作用(9、18、19)。臨床研究表明，表達FcγRIIIa的高親和力變體(158V同種異型)的患者對利妥昔單抗的反應好于攜帶低親和力158F同種異型的那些患者(20)。作為一般機制，也已報道了B-細胞表面抗原和其它抗原，包括表面IgM(21、22)、獨特型(23)、CD19(24)、CD21(28)、CD22(9)和HER-2(28)以及主要組織相容性復合體(MHC)II類抗原(25)引起小鼠和人B細胞的細胞周期停滯和/或凋亡。與抗-IgM或抗-MHC II類分子抗體結合可以直接誘導B淋巴細胞凋亡，而抗-CD19、CD20和CD22抗體僅在包含與第二抗體(例如，羊抗鼠抗體或GAM)交聯的附加步驟時誘導凋亡(26)。在表達CD20的淋巴瘤細胞中，通過用EGTA或細胞內鈣螯合劑Bapta AM進行Ca2+螯合處理，用GAM抗體交聯對凋亡產生的誘導顯示出顯著的降低(9)。
發明概述 在一方面，本發明提供了由聚合物制成的癌癥治療劑，多個抗腫瘤細胞抗體與所述聚合物連接，所述抗體可以和腫瘤細胞抗原結合。癌癥治療劑誘導腫瘤細胞的凋亡或細胞死亡，癌癥治療劑的抗腫瘤細胞抗體與所述腫瘤細胞結合。該癌癥治療劑不是脂質體或脂質體的一部分。
如此處所用，“腫瘤細胞抗原(tumor cell antigen)”或“腫瘤抗原(tumorantigen)”是指在腫瘤細胞上存在的蛋白質，以及在胎兒期的正常細胞上(癌胚抗原)、出生后在選擇的器官中存在，或在許多正常細胞上存在，但是較在腫瘤細胞上的濃度低得多的蛋白質。腫瘤抗原也被稱為“腫瘤相關抗原”(TAA)。腫瘤抗原也包含本領域中所稱的腫瘤特異性抗原(TSA)(也稱作“腫瘤特異性移植抗原或TSTA)。TSA是指腫瘤細胞上存在而在非腫瘤細胞上不存在的蛋白質。TSA通常在感染病毒使得細胞變得永生并且表達病毒抗原時出現。不由病毒誘導的TSAs可以是B細胞淋巴瘤上的免疫球蛋白的獨特型或T細胞淋巴瘤上的T細胞受體(TCR)。腫瘤相關抗原(TAA)比TSA更為普遍。
選擇用于本發明治療劑的抗體的一個特征是它們能夠誘導腫瘤細胞的凋亡或細胞死亡。在一種實施方案中，抗體的特征是，當其被直接施用于腫瘤細胞時，并不實質地誘導凋亡或細胞死亡，但是當腫瘤細胞結合的抗體通過第二抗體被交聯時(例如，羊抗鼠抗體或GAM；參考文獻26)或通過加入帶有FcR的巨噬細胞被交聯時，誘導凋亡或細胞死亡(術語“交聯”用在涉及二抗的內容中時，在本領域中也被稱作“超交聯(hyper-cross-linking)”)。CD19、CD20、CD21、CD22和HER-2的抗體是這種類型抗體的示例。這樣的抗體可以被稱作交聯依賴性腫瘤細胞凋亡誘導抗體。如此處所述，連接有這種抗體的聚合物與不與聚合物連接時的抗體相比，表現出增強的誘導凋亡或細胞死亡的能力。
因此，本發明提供了將抗腫瘤抗體轉變為癌癥治療劑的方法，所述抗腫瘤抗體需要第二交聯(secondary cross-linking)來誘導該抗體引起的實質性凋亡或細胞殺死，所述癌癥治療劑直接誘導凋亡和腫瘤細胞殺死。根據本方法，抗體如本文所公開地被偶聯在聚合物上。
在另一種實施方案中，連接于聚合物的抗體的一個特征是，在直接與腫瘤細胞結合之后誘導凋亡或細胞死亡。這樣的抗體包含與表面IgM(21、22)，獨特型(23)和主要組織相容性復合體(MHC)II類抗原(25)結合的那些抗體。MHC II類和獨特型可以被認為是一種腫瘤相關抗原。
在一種優選實施方案中，聚合物包括3個或更多個這樣的抗體。在一種實施方案中，聚合物包括至少5個抗體。在另一實施方案中，聚合物包括至少10個抗體。在又一實施方案中，聚合物包括至少25個抗體。在又一實施方案中，聚合物包括至少50個抗體。在又一實施方案中，聚合物包括至少100個抗體。在再一實施方案中，聚合物包括至少300個抗體，或者包括至少1000個抗體。
在一種優選的實施方案中，聚合物包括3個或更多個抗體結合位點。在一種實施方案中，聚合物包括至少5個抗體結合位點。在另一實施方案中，聚合物包括至少10個抗體結合位點。在又一實施方案中，聚合物包括至少25個抗體結合位點。在又一實施方案中，聚合物包括至少50個抗體結合位點。在又一實施方案中，聚合物包括至少100個抗體結合位點。在再一實施方案中，聚合物包括至少300個抗體結合位點，或者包括至少1000個抗體結合位點。
如此處所用，“聚合物”意味著天然發生的化合物或合成的化合物，其為由連接的一系列重復的簡單單體組成的大分子。一個聚合物通常包含至少約50個單體。天然聚合物包含蛋白質、糖類或核酸，以及非天然的水溶性生物相容聚合物。非天然聚合物包含水溶性聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇等。聚合物可以用功能基團如羥基、氨基、硫醇和羧基取代。
在一種實施方案中，聚合物的大小是至少1,000道爾頓。在另一種實施方案中，聚合物的大小是至少2,000道爾頓。在又一種實施方案中，聚合物的大小是至少3,000道爾頓。在又一種實施方案中，聚合物的大小是至少4,000道爾頓。在又一種實施方案中，聚合物的大小是至少5,000道爾頓。在又一種實施方案中，聚合物的大小是至少6,000道爾頓。在又一種實施方案中，聚合物的大小是6,000至8,000道爾頓。在又一種實施方案中，聚合物在1Kd至30Kd之間。
在一種實施方案中，聚合物是同聚物。在另一種實施方案中，聚合物是雜聚物。在又一種實施方案中，聚合物選自葡聚糖、聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺類樹枝狀聚合物(PAPAM)，N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)的合成共聚物，和N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)。
在另一種實施方案中，聚合物是可溶性聚合物。在另一種實施方案中，聚合物是線性聚合物。在又一種實施方案中，聚合物是支化聚合物。在另一種實施方案中，聚合物是不可溶性的。
在一種實施方案中，結合于相同腫瘤抗原的抗體被偶聯在聚合物上。如果抗體是相同的，則聚合物對于偶聯物的抗體部分而言是同聚物。如果抗體是不同的，則聚合物對于偶聯物的抗體部分而言是雜聚物。
在另一種實施方案中，結合于相同腫瘤的不同表位的抗體被偶聯到聚合物上。在又一種實施方案中，結合于不同腫瘤抗原的抗體被偶聯到聚合物上。后兩種實施方案對于偶聯物的抗體部分而言是雜聚物。因此，聚合物偶聯物可以包括與其連接的兩種或更多種不同抗體。在這些實施方案的任意方案中，偶聯于聚合物的抗體的形式可以不同。因此，聚合物可以與完整抗體和/或抗體片段偶聯。而且，聚合物可以與多于一種類型的抗體片段偶聯。
在一種實施方案中，抗腫瘤抗體選自抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD22。在一種實施方案中，抗CD20抗體是利妥昔單抗。如此處所用，利妥昔單抗是來自轉染瘤的嵌合抗CD20抗體，所述轉染瘤包括抗CD20，在TCAE 8中，如在ATCC編號69119下保藏的(參見美國專利5,776,456)。在另一種實施方案中，腫瘤抗體選自抗肺、抗乳腺、抗結腸、抗卵巢、抗前列腺和抗肉瘤抗體。
在另一種實施方案中，本發明的癌癥治療劑被用于癌癥治療。本發明的癌癥治療劑可以被用來降低個體的腫瘤體積或減慢個體的腫瘤生長，包括給予有效量的試劑，其中所述試劑靶向于體內腫瘤。
本發明的又一方面是降低或抑制遭受癌癥個體中的轉移(metastasis)發展的方法，包括給予有效量的癌癥治療劑，其中所述試劑在體內靶向于轉移性細胞(metastatic cell)。
在上述治療方法中，對于治療特別適合的癌癥患者是與年齡匹配的正常個體相比，表現出降低水平的抗體依賴性細胞介導細胞毒性的患者。ADCC的程度可以如已述地進行測定(24、25)。
在又一方面，提供了鑒定抗體的方法，與不和聚合物連接的抗體相比，在至少兩個這樣的抗體被連接于聚合物時，所述抗體表現出增強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力。該方法包括，將被期望進行這樣的試驗的候選抗體連接到不溶性顆粒，以及使連接有抗體的顆粒與腫瘤細胞接觸，所述腫瘤細胞表達該候選抗體能夠與之結合的抗原。合適的時間后，測定在腫瘤細胞中誘導的凋亡程度。將該凋亡程度與另外一批相同腫瘤細胞中被誘導的凋亡程度相比較，所述另外一批腫瘤細胞是與未連接于任何顆粒的候選抗體接觸。在一種實施方案中，與未連接于任何顆粒的抗體相比，應用連接有抗體的顆粒時，誘導腫瘤細胞凋亡的增強的能力被測定為至少2倍的增加，更優選地至少3倍。在另一實施方案中，顆粒是珠子。在又一實施方案中，珠子的直徑是約2至約5微米長度之間。更優選地，直徑是約3微米長度。
如此處所用，“約”意味著加10％或減10％。如此處所用，“實質地(substantially)”意味著10％或更多、更優選地是20％或更多、更優選地是30％或更多、更優選地是40％或更多，以及更優選地是50％或更多。


圖1A-1K顯示了在不同的已確立的B細胞淋巴瘤和霍奇金病細胞系中，通過FACS分析得到的CD20表達情況。
圖2顯示了，在存在Lym-1抗體和對照IgG的情況下，懸浮培養物中的Raji細胞增殖。
圖3A-3G顯示了，與第二抗體超交聯和不與第二抗體超交聯的利妥昔單抗和Lym-1抗體(對于利妥昔單抗，第二抗體是羊抗人IgG“GAH”，對LYM-1，是羊抗鼠IgG“GAM”)對懸浮液中的Raji細胞的凋亡誘導。凋亡是通過膜聯蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)復染以及FACS分析評價的。使用對照IgG的Raji細胞染色被顯示，用于比較。
圖4A-4C顯示抗淋巴瘤抗體，LYM-1和利妥昔單抗，以及對照抗體(chTV-1)誘導的懸浮液中的Raji細胞中的DNA片段化。利用檢測BrdU的TUNEL分析產生了用FITC-標記抗-BrdU抗體染色的DNA鏈斷裂，隨后進行FACS分析。
圖5A-5B顯示了，用考馬斯藍染色的SDS-PAGE(非還原條件)對聚合物抗體的分析。泳道分子量(MW)(分子量標準是123Kd和204Kd)；泳道a利妥昔單抗；泳道b葡聚糖-利妥昔單抗；泳道c葡聚糖-Lym-1；和泳道dLym-1。
圖6顯示了，對照IgG、利妥昔單抗、葡聚糖-利妥昔單抗、LYM-1和葡聚糖-LYM-1對Raji細胞懸浮液的凋亡誘導。凋亡是經膜聯蛋白V-FITC和碘化丙啶染色以及FACS分析證實的。
圖7A-7B顯示了，靜脈給予三日后，利妥昔單抗和葡聚糖-利妥昔單抗在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。結果表示為百分注射劑量/克數(圖7A)和腫瘤/正常器官的比值(圖7B)。
圖8A-8B顯示了，靜脈給予三日后，LYM-1和葡聚糖-LYM-1在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。結果表示為百分注射劑量/克數(圖8A)和腫瘤/正常器官的比值(圖8B)。
圖9顯示了，在Raji異種移植物模型中，利妥昔單抗和葡聚糖-利妥昔單抗免疫療法。帶有0.5cm直徑皮下腫瘤的裸鼠被隔日處理3次(箭頭，1、3和5天)，通過靜脈給予對照IgG、利妥昔單抗或葡聚糖-利妥昔單抗偶聯物來實施。腫瘤體積在縱軸上表示，時間在橫軸上表示。天數1表示開始處理的時間，這通常是腫瘤移植后14天。
圖10顯示了，在Raji異種移植物模型中，LYM-1和葡聚糖-LYM-1免疫療法。細節如圖9所述。
圖11A顯示了，對照IgG、利妥昔單抗、羊抗人IgG(″GAH″)和利妥昔單抗+GAH處理在Raji細胞中誘導的凋亡。凋亡是通過膜聯蛋白V-FITC和碘化丙啶染色及FACS分析測定的。
圖11B1-B4顯示了，對與圖11A所述相同地處理的Raji細胞的TUNEL分析得到的凋亡情況。
圖12A顯示了，用Dynabeads、連接于Dynabeads的對照IgG和連接于Dynabeads的利妥昔單抗處理，在Raji細胞中誘導的凋亡。凋亡是通過膜聯蛋白V-FITC和碘化丙啶染色及FACS分析測定的。
圖12B1-B3顯示了，對與圖12A所述相同地處理的Raji細胞的TUNEL分析得到的凋亡情況。
圖13A-13C顯示了，用多種抗體處理后5小時(左手圖)和24小時(右手圖)，Raji細胞中的胱天蛋白酶3活性。細胞用產熒光蛋白酶底物Phiphilux，(FL1-H)染色并用FACS評價。
圖14A-14B顯示了，靜脈給予三日后，利妥昔單抗、利妥昔單抗二聚體(二聚體)和葡聚糖-利妥昔單抗聚合物(聚合物)在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。結果表示為百分注射劑量/克數(圖14A)和腫瘤/正常器官比值(圖14B)。
圖15顯示了，利妥昔單抗、利妥昔單抗二聚體(二聚體)和葡聚糖-利妥昔單抗聚合物(聚合物)以及磷酸鹽緩沖液(PBS)在Raji異種移植物模型中的免疫療法。箭頭表示通過靜脈給予進行的處理。
發明詳述 根據本發明的一方面，提供了癌癥治療劑，其包括連接有抗腫瘤細胞抗體的聚合物。癌癥治療劑誘導腫瘤細胞的凋亡和細胞死亡，其中癌癥治療劑的抗腫瘤細胞抗體結合到所述腫瘤細胞上。
如此處所用，“凋亡”是指細胞的生理性死亡或程序性死亡，由特定的形態學特征來表征，所述特征包括細胞和細胞核固縮、細胞質空泡化，以及由于核小體內DNA片段化而造成的濃縮染色質在核膜周圍邊緣化并產生通過瓊脂糖凝膠電泳可見的DNA梯(DNA ladders)。參見，例如，參考文獻27。對于寬范種類的癌癥，凋亡性細胞殺傷在用特定的抗癌劑處理之后發生。凋亡是免疫B細胞的重要調節機制，并且在惡性轉化后仍然有充分的功能。凋亡可以如本文所述和如以前所報道地(參見，例如，美國專利6,368,596)進行測定。
利妥昔單抗抗體與CD20+淋巴瘤細胞的結合沒能誘導凋亡至顯著的程度(16)。為了增強凋亡，利妥昔單抗可以被超交聯，這是通過包含羊抗人/鼠IgG、加入帶有FcγR的細胞、或在體外將抗體固定在塑料上來實施的(16-19)。利妥昔單抗的超交聯使CD20重新分布到Triton X-不溶性細胞膜信號轉導-加工中心(20、21)，隨后發生脂膜筏群集(lipid raft clustering)并反式激活Src-家族酪氨酸激酶如Lyn、Fyn和Lyc，這進一步導致淋巴瘤細胞的凋亡(19、22-24)。
Ghetie等人(29)報道，與從藥房得到的單體制備物相比，利妥昔單抗的四價同型二聚體在人類惡性淋巴瘤細胞系中能夠誘導出更高的凋亡率。在這些研究中，觀察到的凋亡率與通過羊抗鼠超交聯獲得的凋亡率相當，并且當與化療劑如阿霉素聯合測試時，同型二聚體制備物產生明顯更好的腫瘤細胞殺傷作用。
認為抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)，特別是Fc:FcR相互作用，是利妥昔單抗療法的主要效應機制(25、26)。效應細胞上的Fcγ受體似乎對抗CD20抗體在小鼠中的體內活性負責，這通過應用基因敲除小鼠模型被證實，在基因敲除模型中顯示，Fc:FcR相互作用對于循環和滲出B淋巴細胞的耗盡是必需的(25)。目前的臨床研究集中于FCGR3A基因的二態性，所述基因編碼在殘基158處具有苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)的FcγRIIIa，它以不同的親和性(V＞F)與IgG1的低鉸鏈區特異地反應(27-29)。觀察到純合FCGR3A-158V患者具有經歷臨床反應的更高概率，這支持了Fc:FcR相互作用的關鍵作用(27、29)。為了使ADCC有效，假定帶有Fc受體的細胞必須進入腫瘤微環境，以直接與其靶標接觸。如果情況是這樣，則帶有Fc受體的細胞可以作為ADCC和超交聯誘導凋亡的媒介物起作用，以破壞腫瘤。因此，腫瘤相關效應細胞的缺乏可以解釋特定患者中的利妥昔單抗失效。應用本發明的抗體聚合物對于ADCC能力降低的個體的治療性癌癥干預是有用的。
本發明的包括抗體如利妥昔單抗的癌癥治療劑代表了高價試劑，在體外和體內試驗中，它都是比單體或二聚體制備物更有效的凋亡誘導物。由于其可溶性質，聚合物連接的利妥昔單抗是已經在CD20+Raji異種移植物中顯示出好的腫瘤靶向和治療潛能的臨床相關試劑。含有多個抗腫瘤抗體的可溶性聚合物提供了顯著改進的基于抗體的免疫療法，特別是在具有低親和力FcγR同種異型的患者中。
抗腫瘤抗體可以用美國專利6,368,596中描述的氚標記胸苷摻入試驗來鑒定，所述抗體被表征為，當不與第二抗體交聯(或與帶有Fc受體的巨噬細胞接觸)時，不能誘導實質性的凋亡或細胞死亡。被表征為在二級誘導的交聯之后凋亡或細胞殺傷增強的抗腫瘤抗體包含抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD22和HER-2。在一種實施方案中，抗CD20抗體是利妥昔單抗。其它抗體包含針對多種癌中的任意癌的抗體，所述癌包含肺癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢、前列腺癌以及肉瘤。其它此類抗體在美國專利6,368,596中有所描述，或者可以通過本文公開的方法容易地被鑒定。
CD19(也稱為B4抗原)是95Kd的B細胞標志物，其通過抗-CD19抗體(例如，抗體FMC63)來檢測，包括這些抗體的嵌合形式。Zola等人，Immunol Cell Biol.69(Pt6)411-22(1991)；Pieterxz等人，Cancer Immunol Immunother.41(1)53-60(1995)。CD19是B譜系特異性的并且表達于早期B細胞前體、前-前-B細胞、前-B細胞、B細胞、中間B細胞、成熟B細胞和一些漿細胞樣細胞。漿細胞和骨髓瘤細胞是CD19陰性的。
CD21是補體片段C3d、C3dg或ic3D并且也是EBV的受體(約145Kd)。CD21也是CD23的配體并且參與IgE合成。抗CD21抗體已經被描述。已報道，結合于B細胞的抗CD21抗體保護細胞免遭凋亡。Bonnefoy等人Eur.J.Immunol.23,969-972(1993)。
CD22是人類B淋巴細胞上表達的130Kd蛋白質。CD22的人源化抗體(例如，Epratuzumab，Amgen，CA)已經被描述。Carnahan等人，Clin Cancer Res.9(10Pt2)3982S-90S(2003)。正常T細胞、多形核白細胞、單核細胞和血小板是CD22陰性的。細胞系SB、Raji和NALM-1如CALLA-ALL一樣是陽性的。CLL和NHL的表達型是可從弱陽性到陰性變化的。PLL是明顯陽性的，毛細胞白血病是非常強陽性的。
原癌基因Her-2/neu(C-erbB2)已被定位在染色體17q并且編碼跨膜酪氨酸激酶生長因子受體。Her-2/neu基因的蛋白產物在25-30％的乳腺癌中被過表達，并且在約90-95％的這些情形中，增量調節是基因擴增的直接結果。HER2的抗體可以阻斷腫瘤的增殖信號通路，這導致腫瘤生長的抑制和腫瘤細胞凋亡的誘導。參見，例如，Clin.Cancer Res.81720-30(2002)；Brodowicz等人Br.J Cancer851764-70(2001)；Crombet-Ramos等人，Int.J.Cancer101567-75(2002)；Herbst等人，Expert Opin.Biol.Ther.1719-32(2001)。HER-2抗體在以前已被描述過(參見，美國專利6,054,561；5,169,774；4,938,948；4,753,894；6,387,371；6,399,063；6,627,196；6,821,515；6,719,971和美國專利6,800,738。
如此處所用，術語“蛋白質”是指可以從天然來源分離的、或應用重組DNA技術從分離的cDNA產生的一條或多條多肽。如果一個蛋白質包含多于一條多肽，則這些多肽通過共價和/或非共價力作為單個分子結合在一起(即，多聚體)。由多條多肽組成的蛋白質的一個例子是含有重鏈和輕鏈的抗體。術語蛋白質包含具有其它化學實體的蛋白質如糖蛋白、蛋白聚糖、脂蛋白和類似物。
如此處所用，術語“核酸”一般指多脫氧核糖核苷酸(含2′-脫氧-D-核糖或其修飾形式)、多核糖核苷酸(含有D-核糖或其修飾形式)，也指作為嘌呤或嘧啶堿基或者修飾的嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷的任何其它類型的多核苷酸。
如此處所用，術語“純化的”在談及多肽(或蛋白質)時，并不要求絕對純凈。相反，它代表了這樣的提示，感興趣的多肽(例如抗體)處于分立的環境中，在該環境中，所述多肽相對于其它蛋白質的豐度(以質量為基礎)大于在生物學樣品中的豐度。“分立的環境”是指單一介質，如單一溶液、單一凝膠、單一沉淀物等。純化的多肽可以通過許多方法獲得，包括，例如實驗室合成、色譜法、制備電泳、離心、沉淀、親和純化等。一種或多種感興趣的“純化的”多肽優選地為分立的環境中蛋白質含量的至少10％。一種或多種“基本上純化的”多肽為分立的環境中蛋白質含量的至少50％，更優選地為分立的環境中蛋白質含量的至少75％，更優選地為分立的環境中蛋白質含量的至少95％。可以用牛血清白蛋白作為蛋白標準，用Hartree，Anal Biochem 48422-427(1972)描述的、對Lowry等人J.Biol.Chem.193265，1951中的方法的修改來測定蛋白質含量。
可以用本發明方法治療的癌癥包含癌、肉瘤以及白血病和淋巴瘤以及其它類型的癌癥。癌包含肺癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、前列腺癌和類似癌癥。對于治療為優選的癌癥是淋巴瘤。
偶聯有抗體的聚合物優選地是可溶性聚合物。它優選地是約1,000道爾頓或更大。聚合物可以是同聚物或雜聚物。聚合物可以選自葡聚糖、聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺類樹枝狀聚合物(PAPAM)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的合成共聚物(HPMA)和N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)，和類似物。參見Ulbrich等人(2002)Materials Structure 10(1)3。水溶性非抗原性聚合物可以如美國專利6,113,906中所述被應用。水溶性聚合物載體可以是可生物降解的。聚合物可以是多肽。
聚合物的分子量可以從1,000至30,000。聚合物的大小優選地是約6,000-8,000道爾頓或更小。
可以用本文描述的化學方法以及本領域中已知的其它化學方法將抗體偶聯于聚合物。連接化學術可以復制用于制備半抗原載體偶聯物或藥物載體偶聯物的化學策略，其中，抗體與半抗原或藥物類似，聚合物與載體類似。
多個肽或蛋白質分子可以被連結到單個改性聚乙二醇(PEG)聚合物上，如Jones等人，Bioconjugate Chem.(2003)14，1067-76所述。具體地，聚乙二醇聚合物的一個末端或兩個末端被修飾，以使各自包含兩個、四個或八個氨基氧基團。也公開了連接四個改性PEG聚合物分子以便提供對四個肽或蛋白質分子的連結的連接結構。偶聯物是通過在PEG的氨基氧基團和多肽的N-末端乙醛酸化區域之間形成肟鍵而制備的。Jones等人描述了β2GPI的B細胞表位的偶聯物，目的是誘導B細胞對β2GPI的耐受。相關的美國專利6,458,953描述了類似的化合物(帶有或不帶有PEG)，它們用作用于連結包括抗體在內的生物分子的多價平臺。肽或蛋白質可以通過多種鍵如硫醚鍵被連結到該平臺上。然而，偶聯于抗腫瘤細胞抗體的PEG聚合物的制備還沒有被描述過，所述抗體用于誘導腫瘤細胞的凋亡。也可以用5,670,132、5,234,903和5,234,903中描述的方法實施對抗體的PEG偶聯。
在用于進行偶聯的抗體的屬性以及抗體與偶聯物的比例方面，本發明的聚合物偶聯物不同于以前已知的那些偶聯物。在以前的研究中，聚合物被偶聯于抗體，但比例是每個抗體帶有多于一個聚合物。與之不同，本發明的聚合物抗體偶聯物是每個聚合物帶有多于一個抗體。單個聚合物包括至少3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000或更多個抗體。在另一實施方案中，單個聚合物包括至少3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000或更多個抗體結合位點。
如此處所用，術語“抗體”包含免疫球蛋白，免疫球蛋白是B細胞的產物及其變體，以及T細胞受體(TcR)，T細胞受體是T細胞產物及其變體。免疫球蛋白是包括一條或多條多肽的蛋白質，所述多肽基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因，以及各種免疫球蛋白可變區基因編碼。輕鏈被分類為κ鏈或λ鏈。重鏈被分類為γ鏈、μ鏈、α鏈、δ鏈或ε鏈，它們分別依次定義出免疫球蛋白的種類，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重鏈的亞類也是已知的。例如，人類的IgG重鏈可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類中的任意一類。
已知典型的免疫球蛋白結構單位包括四聚體。每一四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每一對多肽鏈具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的N末端限定出主要負責抗原識別的約100至110或更多個氨基酸的可變區。術語輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈。
抗體以全長的完整抗體(二價體)存在，或者以經各種肽酶或化學品消化產生的許多被很好地表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下游消化抗體，產生F(ab′)2，F(ab′)2是Fab的二聚體，Fab本身是通過二硫鍵連接于VH-CH1的輕鏈。F(ab′)2可以在溫和條件下被還原，鉸鏈區的二硫鍵斷裂，從而將F(ab′)2二聚體轉變為Fab′單體(單價)。Fab′單體實質上是帶有部分鉸鏈區的Fab片段(對于其它抗體片段的更詳細描述，參見Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993))。雖然多種抗體片段是根據完整抗體的消化來限定的，但技術人員將理解，多種抗體片段中的任意抗體片段可以通過化學方法從頭合成或通過重組DNA方法合成。因此，如此處所用，術語抗體也包含通過完整抗體的修飾或從頭合成產生的抗體片段或者應用重組DNA方法得到的抗體和片段。
重組抗體可以是常規的全長抗體、來自蛋白水解消化的已知抗體片段、獨特的抗體片段如Fv或單鏈Fv(scFv)、結構域被刪除的抗體，和類似抗體。片段可以包括少至一個或幾個氨基酸被刪除或突變的結構域或多肽，而更廣泛的缺失也是可能的，如一個或多個結構域的缺失。
Fv抗體的大小是約50Kd，包括輕鏈可變區和重鏈可變區。單鏈Fv(″scFv″)多肽是共價連接的VH::VL雜二聚體，它可以由包含VH和VL編碼序列的核酸表達，VH和VL編碼序列或是直接連接或是經肽編碼接頭連接。參見Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，855879-5883。許多結構用于將抗體V區的天然聚集、但化學上被隔離的輕鏈和重鏈多肽鏈轉化為scFv分子，所述分子將折疊成與抗原結合位點的結構基本上相似的三維結構。參見，例如，美國專利5,091,513，5,132,405和4,956,778。
抗體可以是非人抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，后者包括人抗體序列和非人抗體序列。如本領域已知，嵌合抗體是通過交換非人抗體恒定區(重鏈、輕鏈或兩者)和人抗體恒定區制備的。參見，例如，授予Cabilly等人的美國專利4,816,567。從非人抗體如鼠抗體制備人源化抗體的方法也是公知的(參見，例如，授予Winter的美國專利5,565,332)。
抗體可以共價或非共價地連接于聚合物。如此處所用，“連接”意味著，在生理條件的pH、離子強度和滲透壓下，所述實體的大多數平衡地彼此相連。共價連接可以通過多種化學交聯劑中的任意交聯劑形成，包括例如，同型雙功能交聯劑或異型雙功能交聯劑，其中的許多是可以經商業途徑得到的(參見，例如，PierceChemical Co.或Sigma Chemical Co.)。交聯可以通過本領域中熟知的許多化學術實現，包括例如，活化的聚乙二醇、醛、異氰酸鹽、馬來酰亞胺和類似物。從抗體制備二聚體和多聚體的進一步描述提供在實施例中。
可以用重組表達方法，如本領域熟知的例如在原核或真核細胞中的重組表達方法制備抗體(參見，例如，美國專利5,116,943和6,331,415)。一般而言，可以將編碼抗體的核酸克隆入表達載體，用于高產量地表達編碼產物。表達載體可以是質粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表達載體包含表達序列盒，編碼抗體的核酸被克隆入所述序列盒，與啟動子和任選地增強子可操作地相連。表達序列盒也可以包含其它特征，如復制起點和/或染色體整合元件如反轉錄病毒LTRs或腺相關病毒(AAV)ITRs。如果需要抗體分泌，則可以將編碼信號序列的DNA放在編碼成熟抗體氨基酸的核酸上游。可以將編碼用于協助隨后的純化(例如，組氨酸標簽)或協助標記抗體的、短的蛋白質序列的DNA包含在抗體編碼核酸中或抗體編碼核酸的末端。
適于復制和支持抗體重組表達的細胞是本領域中熟知的。可以用特定的表達載體適當地轉染或轉導這種細胞，并且可以使大量的含載體細胞生長，用于接種大規模發酵罐，得到臨床應用的足夠量的蛋白質。這樣的細胞可以包含原核微生物如大腸桿菌，或多種其它真核細胞如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞，或類似細胞。在這些系統中表達外源基因的標準技術是本領域已知的。
可以將本發明的癌癥治療劑用于在遭受癌癥的個體中的癌癥治療。因此，本發明的另一方面是降低個體中的腫瘤大小或減緩個體中腫瘤生長的方法，包括給予有效量的本發明組合物，其中所述癌癥治療劑定位于個體中的癌細胞。本發明的又一方面是降低或抑制遭受癌癥的個體中的轉移進展的方法，包括給予有效量的本發明組合物，其中所述癌癥治療劑定位于個體中的轉移性癌細胞。
可以通過耗盡或失活個體中的免疫調節T細胞，增加應用本發明癌癥治療劑的治療有效性。如此處所用，術語“免疫調節T細胞”是指，直接或間接起作用，以抑制宿主對腫瘤的免疫應答的T細胞群。免疫調節T細胞可以是CD4+，CD25+，或這兩種標志物均是陽性。
如此處所用，術語“耗盡或失活(depleting or inactivating)”是指有效降低免疫調節T細胞介導的免疫系統抑制的方法。這樣的方法可以從個體去除(耗盡)細胞，或可以使細胞功能失活，所述的細胞功能導致抗腫瘤免疫應答的抑制。耗盡或失活免疫調節T細胞的方法無需僅限于此類細胞，而是可以作用于其它類型的免疫細胞。
免疫調節T細胞通過本領域熟知的多種方法中的任意方法被耗盡或失活。例如，可以通過流式細胞術或通過采用例如裝填有抗體的柱子或過濾器的免疫吸附細胞去除，將這樣的細胞從個體的循環中去除。這樣的柱子或過濾器含有特異于CD4抗原的抗體和/或特異于IL-2受體(例如CD25)的抗體。耗盡或失活免疫調節T細胞也可以通過給予個體抗CD4和/或抗CD25特異性抗體來實施。可以用一種或多種抗體，優選地是人抗體或人源化抗體。例如，可以應用與IL-2受體(CD25)的α亞基結合的人源化單克隆抗體Daclizumab或巴利昔單抗(basiliximab)(嵌合抗體)(均來自Novartis Pharma AG)。完全的人抗體HuMax-CD4，由GenMab制備。抗CD40配體也可以被用來耗盡或失活免疫調節T細胞。
耗盡或失活免疫調節T細胞的處理可以被重復。而且，不同的方法可以一起使用(免疫吸附細胞去除和體內抗體給予)。為了耗盡或失活而被給予的抗T細胞抗體的量可以和移植領域中應用的量類似。參見，例如，Meiser等人，Transplantation.(1994)27；58(4)419-23。
免疫調節T細胞可以在給予本發明的癌癥治療劑之前、期間和/或之后被耗盡或失活。免疫調節T細胞優選地在給予本發明的癌癥治療劑之前被耗盡。
在又一實施方案中，本發明用于癌癥治療的方法可以包括免疫細胞的過繼性轉移，用以增強抗腫瘤免疫。這些方法優選T細胞，其可以被離體活化，用以增強它們支持抗腫瘤免疫應答作用的能力。被過繼性轉移的免疫細胞可以用多種熟知試劑中的任意試劑被離體活化，包括，例如，暴露于IL-2和/或抗CD3抗體。離體活化也可以包含暴露于癌細胞疫苗。這樣的癌細胞疫苗可以是活的(但不復制)或被殺死的癌細胞，它們來自待治療的個體或完全來自其它癌癥。疫苗也可以是癌細胞提取物或來自癌細胞的純化的疫苗制備物。癌細胞疫苗是本領域熟知的，并且可以根據熟知的方法制備。
被過繼性轉移的T細胞可以在給予本發明的癌癥靶向劑組合物之前、期間和/或之后被給予。被過繼性轉移的T細胞優選地在給予本發明的癌癥靶向劑組合物之后被給予。在這種治療形式中，患者接受多次T細胞輸注，所述T細胞是經IL-2(62)或其它試劑如抗CD3+和抗CD28+抗體(63)離體刺激之后得到的。
在一些實施方案中，通過結合耗盡或失活免疫調節T細胞的方法和過繼性轉移免疫細胞的方法，可以使應用本發明癌癥治療劑的療法的有效性得以增加。在這樣的實施方案中，有利的是，在耗盡或失活免疫調節T細胞的步驟之后進行過繼性轉移。
本發明的癌癥治療劑可以以用藥學上可接受的載體配制的藥物或藥劑給予。因此，化合物可以用于藥劑或藥物組合物的配制。本發明的藥物組合物可以被配制為溶液或凍干粉末，用于腸道外給予。可以通過在使用之前加入合適的稀釋劑或其它藥學上可接受的載體，對粉末進行重構。液體制劑可以是緩沖的、等張的水溶液。粉末也可以以干燥形式被噴霧。合適稀釋劑的例子是普通等張鹽溶液，標準的5％葡萄糖水溶液，或緩沖醋酸鈉或醋酸銨溶液。這樣的制劑特別適于腸道外給予，但也可以用于經口給予或包含在計量吸入器或噴霧器中用于吸入。可能需要加入賦形劑如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯樹膠、聚乙二醇、甘露醇、氯化鈉、檸檬酸鈉和類似物。
可選地，化合物可以被包囊、壓片或制備于乳劑或糖漿中，用于經口給予。可以加入藥學上可接受的固體或液體載體，以增強或穩定組合物，或協助組合物的制備。固體載體包含淀粉、乳糖、二水合硫酸鈣、白土、硬脂酸鎂或硬脂酸、云母、果膠、阿拉伯樹膠、瓊脂或明膠。液體載體包含糖漿、花生油、橄欖油、鹽水和水。載體也可以包含緩釋物質如單獨應用或帶有蠟的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固體載體的量是變化的，但是優選地，將為每劑量單位約20mg至約1g。藥物制備物按照制藥學常規技術制備，對于片劑形式，在需要時，涉及研磨、混合、顆粒化和壓縮；或對于硬明膠膠囊形式，涉及研磨、混合和裝填。應用液體載體時，制備物可以是糖漿、酏劑、乳劑或含水或非含水懸浮液。對于直腸給予，本發明的化合物可以和賦形劑如可可脂、甘油、明膠或聚乙二醇結合并模塑為栓劑。
可以將本發明的化合物配制為，包含其它醫學上有用的藥物或生物試劑。化合物也可以和用于本發明化合物所涉及的疾病或狀態的其它藥物或生物試劑的給予聯合應用。例如，本發明的癌癥治療劑可以和其它凋亡誘導劑如放射線或化療劑(例如，阿霉素；參見美國專利6,090,365)聯合。
如此處所用，短語“有效量”是指提供足以對其接受者施加有益效果的足夠高濃度的劑量。對于任何特定對象而言，具體的治療有效劑量水平將取決于多種因素，包含被治療的疾病、疾病的嚴重程度、具體化合物的活性、給予路徑、化合物的清除率、治療的持續時間、與化合物聯合應用或同時應用的藥物、對象的年齡、體重、性別、飲食，和對象的一般健康狀態，和醫學領域及醫學科學中熟知的類似因素。在確定“治療有效量”中被考慮的各種一般事項是本領域技術人員已知的，在例如Gilman等，eds.，Goodman And Gilman′sThe PharmacologicalBases of Therapeutics，8th ed.，Pergamon Press，1990；和Remington′s PharmaceuticalSciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990中有描述。劑量水平典型地落入約0.001至100mg/kg/日的范圍；通常應用的水平是約0.05至10mg/kg日范圍。化合物可以被腸道外給予，如血管內、靜脈內、動脈內、肌內、皮下或類似地給予。給予也可以是經口、經鼻、經直腸、經皮或通過氣霧劑吸入。化合物也可以作為丸劑給予，或緩慢輸注。
可以通過確定IC50從細胞培養物試驗初步估計治療有效劑量。隨后，可以在動物模型中配制劑量，用以達到一定的循環血漿濃度范圍，所述范圍包含如在細胞培養物中測定的IC50。可以用此類信息更加精確地確定人類中的有用劑量。血漿中的水平可以，例如，通過HPLC測定。確切制劑、給予路徑和劑量可以由各醫生根據患者的狀態進行選擇。
下列實施例用來解釋本發明。這些實施例不意圖于限制本發明的范圍。
實施例 實施例1材料和方法 1.試劑 分子生物學試劑購自New England BioLabs(Beverly，MA)或BoehringerMannheim(Indianapolis，IN)。免疫學試劑和交聯劑購自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO)或Pierce Biotechnology(Rockford，IL)。已表征和透析(diaylyzed)的胎牛血清購自Hyclone Laboratories(Logan，Utah)。碘-125和碘-131獲自DuPont/New England Nuclear(North Billerica，MA)。BALB/c鼠和無胸腺裸鼠購自Harlan Sprague Dawley(San Diego，CA)。
2.抗體和細胞系 嵌合抗-HLA-Dr MAb(chLym-1)如上所述根據已公開的結果制備(41)。IDEC Pharmaceuticals(San Diego，CA)開發的嵌合抗-CD20 MAb(利妥昔單抗)獲自藥店。用于超交聯試驗的羊抗人IgG(Fc特異性)購自Caltag laboratories(Burlingame，CA)；用于免疫熒光顯微術研究的異硫氰酸熒光素(FITC)-標記的羊抗鼠F(ab′)2購自ICN-Cappel(Aurora，OH)，用于測定CD20表達的藻紅蛋白(PE)標記的抗-CD20抗體購自BD Pharmingen(San Diego，CA)。
Raji細胞系(42)和其它北美和非洲伯基特淋巴瘤細胞系(B35M，DG-75，RAMOS，Chevallier)獲自美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection)(Rockville，MD)。Farage、Granda 519和L540淋巴瘤以及霍奇金病細胞系獲自DSMZ德國保藏中心(Braunschweig，Germany)。SU-DHL-4、SU-DHL-6、SU-DHL-10、SU-DHL-16和NU-DHL-1人B淋巴瘤細胞系如以前所述被開發(43、44)。所有細胞系在RPMI 1640(Life Technologies，San Diego，CA)中生長，RPMI1640中補充有10％特征胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logan，Utah)、1％谷氨酰胺和青霉素(100單位/mL)以及鏈霉素(100μg/mL)(Gemini Bio-Products，Woodland，CA，USA)抗生素，并且在潮濕的5％CO2培養箱中，37℃，作為靜止懸浮培養物被培養。
3.抗體超交聯 將Raji細胞(2.5×104)在V-底96孔板中，在5％CO2培養箱中，37℃溫育，96孔板中含有系列稀釋的Lym-1、chLym-1、利妥昔單抗或其它抗體。隨后用RPMI1640洗滌細胞2次，并將細胞分為試驗組和對照組。隨后將試驗組細胞與25ug/ml羊抗人(GAH)IgG(對于嵌合Lym-1和利妥昔單抗MAbs)或羊抗鼠(GAM)IgG(對于鼠Lym-1)溫育，體積是100μl/孔。18小時之后，用膜聯蛋白V-FITC/PI染色，如下所述地測定凋亡細胞上的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露情況。
4.利用免疫熒光顯微術進行的交聯分析 通過免疫熒光顯微術觀察用不同抗體制備物處理的細胞表面上的抗原交聯程度和型式。對于這些研究，用每一抗體制備物20μg在37℃處理5×105Raji細胞，用稀釋于PBS中的2％多聚甲醛(Polysciencs，Inc.Warrington，PA；Cat.No.4018)室溫固定，隨后用PBS(1％BSA)洗滌2次。隨后用25μg GAM F(ab′)2(ICN-Cappel)溫育被固定的細胞，4℃ 30分鐘，隨后用PBS(1％BSA)洗滌2次。對于二抗羊抗鼠IgG F(ab′)2的超交聯研究，用20μg利妥昔單抗在37℃處理5×105Raji細胞1小時。用PBS洗滌細胞2次，并與25μg GAM F(ab′)2溫育，4℃ 30分鐘。隨后用PBS(1％BSA)洗滌細胞2次，隨后用2％多聚甲醛在室溫固定細胞。然后用PBS洗滌細胞2次。最后，1,250×g 10分鐘，制備細胞旋轉沉降物(cytospin preparation)，將玻片在Vectorshield中用4′，6′-二氨基-2-吲哚苯(DAPI，Vector Laboratories，Burlingame，CA)固定，用于在相差熒光顯微鏡(Leitz Orthoplan，Wetzlar，Germany)下，用50×水浸透鏡進行觀察。
5.胱天蛋白酶(caspase)3活性分析
使偶聯有2μg的利妥昔單抗單體、二聚體、聚合物以及利妥昔單抗和同種型對照抗體的Dynabeads與5×104Raji細胞溫育。5小時和24小時之后，用PBS洗滌細胞，在40μl的產熒光蛋白酶底物Phiphilux(OncoImmunin Inc.，MD)中重懸浮，并在30℃的水浴中溫育40分鐘。最后，將細胞重懸浮于制造商提供的培養基中，并立即用流式細胞術分析。
6.通過使用多功能交聯劑制備多聚體
多功能交聯劑是能夠形成多聚聚集體的水溶性試劑(表1)。交聯劑諸如戊二醛(45、46)、葡聚糖(47-49)和/或聚酰胺型胺類(PAPAM)樹枝狀聚合物(50-54)可以被用來制造Mabs的聚合物。
A.戊二醛是五碳二醛，作為交聯劑用于多種蛋白質用途中。抗體的親核基團如巰基和氨基在一步反應中被共價地加在醛基上，形成希夫堿(Schiff base)。簡言之，使抗體(利妥昔單抗，1ml)在暗處以5mg/ml的濃度用200ml 8％戊二醛進行透析，其中戊二醛溶于PBS(0.01M磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)，4℃透析16小時。隨后使活化的抗體用PBS(1L PBS，2次，持續幾小時)進行透析，以去除過量的戊二醛。剩下的活性戊二醛基團在2小時溫育期間被0.2M賴氨酸-HCl(0.1ml)封閉。過量的賴氨酸通過用PBS透析而被去除。隨后，將交聯的偶聯物無菌過濾并進一步進行SDS-PAGE分析。
B.葡聚糖是平均分子量1至500k的葡萄糖聚合物。葡聚糖的鄰位羥基可以被氧化為醛基，隨后與氨基反應形成希夫堿。
方法1多醛活化的葡聚糖(1∶1利妥昔單抗∶氧化葡聚糖)。葡聚糖與抗體的結合如以前所述通過應用多醛活化的葡聚糖實施(47)。這可以成功地作為多功能交聯劑并與MAbs的伯胺反應，形成希夫堿，希夫堿可以通過用硼氫化鈉還原進一步得以穩定。簡言之，使葡聚糖(100mg，平均分子量6,000，Fluka)和高碘酸鈉(120mg，Sigma-Aldrich)溶解在5ml的0.9％NaCl溶液中。暗處溫育過夜之后，使化合物通過預平衡的PD-10柱(Pharmacia)并用0.9％NaCl洗脫。純化的氧化葡聚糖于4℃保存，該混合物在暗處4℃可穩定2周。同時，使1ml的純化利妥昔單抗(10mg/ml)通過預平衡的PD-10柱并用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.1)洗脫。用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.1)將洗脫的利妥昔單抗稀釋為4.2mg/ml，隨后與氧化葡聚糖混合，二者的摩爾比是1∶1。在暗處連續振蕩4小時后，用5mg硼氫化鈉(Sigma)還原反應物1小時。最后，使1ml的葡聚糖-利妥昔單抗偶聯物通過預平衡的PD-10柱。根據抗體濃度，用UV-分光光度計測定此偶聯物的OD值。隨后，經非還原SDS PAGE測定交聯效率。
方法2多醛活化的抗體。共價結合的一種不同方法利用了抗體的糖部分。這是在兩步反應中，通過將葡聚糖-肼復合體偶聯于多醛活化的MAbs而實施的。簡言之，將純化的多醛活化的葡萄糖(如上)與0.09g肼單鹽酸鹽混合并于室溫在暗處溫育30分鐘。將葡聚糖-肼衍生物和三甲胺硼烷復合物(TMAB，5mg)混合并在室溫下再溫育2小時。最后，使葡聚糖-肼衍生物通過預平衡的PD-10柱，該柱是用0.1M NaAc pH 5.5平衡。多醛活化的利妥昔單抗通過混合300μl的純化利妥昔單抗(10mg/ml)和1ml pH 7.5PBS中的高碘酸鈉(126mg)生成。室溫下連續振蕩90分鐘后，在PD-10柱上純化氧化的RITUXAMAB(7.14mg/ml，在PBS中)并與葡聚糖-肼復合體(82μl)在暗處室溫下混合18小時。用0.1M甘氨酸pH7.5(300μl)在2小時溫育期間封閉剩余的活化基團。通過用PBS透析去除過量的甘氨酸，并將交聯的偶聯物無菌過濾，進一步用SDS-PAGE進行分析。
C.PAPAM是一類新的高度分支的球形聚合物，它是高度水溶性的并且具有大量的表面伯胺基團(50-54)。PAPAM樹枝狀聚合物與抗體的偶聯是通過應用不同代的樹枝狀聚合物實施的，可以在兩步反應過程中成功制備。簡言之，在表面擁有8至64個活性氨基的多代樹枝狀聚合物(G1至G4)(平均分子量是1.7至14.5k)被溶解在PBS中并與雜型雙功能交聯劑混合。將得到的聚合物偶聯物透析過夜，在Sephadex G-25上色譜純化，經SDS/PAGE和HPLC分析，并進一步表征以確定每一樹枝狀聚合物分子上的抗體分子數目。
表1.選擇的多功能交聯劑
7.單體和交聯制備物的體外評價
A.凋亡分析
i.膜聯蛋白V，PI染色。通過膜聯蛋白V，PI染色試驗測定抗體偶聯物誘導的凋亡百分數，該試驗允許直接測定凋亡細胞上的磷脂酰絲氨酸(PS)暴露情況和膜完整性的喪失。將系列稀釋(約2μg)的Lym-1、chLym-1和利妥昔單抗或包被了利妥昔單抗的Dynabeads(下文論述)加入到2.5×104Raji細胞，隨后37℃溫育18小時。為了超交聯，使200μl培養基中的5×104Raji細胞與2μg利妥昔單抗在37℃溫育1小時，隨后用PBS(1％BSA)洗滌細胞2次并與5μg GAH(Caltag)在37℃在5％CO2培養箱中溫育18小時。用制造商(Oncogene Research Product，Boston，MA，USA)提供的RAPID方案進行膜聯蛋白V-FITC和PI染色。簡言之，將培養基結合試劑加入細胞，隨后與FITC-標記的膜聯蛋白V溫育15分鐘。隨后將細胞懸浮在1x結合緩沖液中，在用流式細胞術(FACS-diva，Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)進行樣品分析之前即刻，加入碘化丙啶(PI)，以區分早期(膜聯蛋白V+/PI-)和晚期(膜聯蛋白V+/PI+)凋亡細胞。
ii.TUNEL試驗。此試驗是用APO-DIRECT試劑盒(Phoenix Flow Systems，San Diego，CA，USA)進行，以測定不同抗體制備物誘導的凋亡性DNA鏈斷裂。簡言之，使5×105至1×106個Raji細胞與667ng/ml至66.7μg/ml的每種MAb于37℃在5％CO2培養箱中溫育18小時。為了超交聯研究，使5×105個Raji細胞與20μg利妥昔單抗在1.5mL中37℃溫育1小時。用PBS洗滌細胞2次并進一步用50μgGAH(Caltag)在1.5mL中37℃在5％CO2培養箱中溫育18小時。將細胞在PBS中洗滌，在1％多聚甲醛中固定，在70％乙醇中進行滲透性處理。將細胞在70％乙醇中于-20℃保存過夜。用末端脫氧核苷酰轉移酶(TdT)將溴脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(BrdU)偶聯于DNA鏈斷裂處，隨后用熒光素標記的抗-BrdU抗體對凋亡細胞染色，以便用于FACS分析。細胞中的總DNA通過用PI/RNase復染測定。對于每一樣品，用流式細胞術對10,000個細胞進行分析。
8.CD20和HLA-Dr抗原表達的評價
應用標準方法，CD20和HLA-DR10抗原陽性的幾種不同的人惡性淋巴瘤(Raji、RAMOS、DG-75、Farage、Granda 519、Chevallier、SU-DHL-4、SU-DHL-10、SU-DHL-16)和霍奇金病細胞系(L540)通過FACs分析被評價，以說明這些抗原在淋巴瘤細胞表面的表達水平。
A.增殖分析。通過細胞增殖試驗對所有抗原制備物進行評價。對于此試驗，Raji細胞(7.5×104/孔)用67μg/ml的抗體培養，所述Raji細胞懸浮于RPMI-1640培養基(Life Technologies，Inc.，San Diego，CA)中，培養基中含有10％特征胎牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，UT)。應用血細胞計數器，用臺盼蘭染料排斥法，在不同時間點評價細胞增殖。對血細胞計數器的四個不同區域進行計數并將其平均，得到數據點。
B.親和常數(Avidity Constants)的測定。采用以前描述的修定過的氯胺-T方法，用125I對純化的MAb制備物進行放射性標記(56)。通過傳統的固定Raji細胞放射免疫分析對放射性標記蛋白質的體外免疫反應活性進行評價(55)。簡言之，使每毫升含有106個細胞的Raji淋巴瘤細胞懸浮液與200μl PBS中的10至110ng的125I標記抗體在室溫下溫育，同時持續混合。隨后用含1％牛血清白蛋白的PBS洗滌細胞3次，以去除未結合的抗體，并用γ計數器計數。隨后通過每管中剩余的細胞結合的放射活性(cpm)和放射性標記抗體的比活性(cpm/ng)確定結合的抗體的量。用斯卡查德作圖分析(Scatchard plot analysis)得到斜率。用公式K＝-(斜率/n)計算平衡常數或親和常數Ka，其中n是抗體的價數(對于單體，n＝2；對于二聚體，n＝4；對于聚合物，n＝10)。
C.體外穩定性。也如以前所述評價體外血清穩定性(56)。簡言之，使放射標記的制備物在鼠和/或人血清中于37℃溫育48小時。三氯乙酸沉淀和離心之后，用γ計數器測定蛋白結合的放射活性，目的是計算完整融和蛋白的百分數。此外，如上所述對血清溫育之前和之后的放射性標記MAbs的體外免疫反應活性進行測定。
9.交聯制備物的體內評價
研究了能夠在體外誘導有效凋亡的那些制備物的體內生物學活性，以確定它們的藥物動力學清除率和生物分布。此外，研究了每一試劑在帶有Raji人淋巴瘤的裸鼠中的抗腫瘤活性，通過評價它們對腫瘤生長(腫瘤大小，存活時間)和形態學的影響來實施。
A.藥物動力學研究。用以前描述的修改過的氯胺-T方法制備125/131I-標記的蛋白質(41、56)。用6周齡BALB/c鼠來測定所有制備物的全身藥物動力學清除(whole-body pharmacokinetic clearance)。將125I-標記的蛋白質(30-40μCi/小鼠)靜脈注射給予幾組小鼠(n＝5)，所述小鼠事先在飲水中給予碘化鉀1周，以封閉甲狀腺對放射性碘的攝取。用CRC-7 microdosimeter(Capintec，Inc.，Pittsburgh，PA)測定注射后即刻以及其后選擇的時間的全身活性。數據被分析，半衰期值如以前所述地被確定(41、57、58)。
B.生物分布研究。在帶有Raji腫瘤的裸鼠中進行組織生物分布研究，以檢測選擇的每一制備的靶向能力。為了這些研究，用來自銫源的350拉德照射6周齡雌性無胸腺裸鼠，三日后，在左側腹皮下注射含有1×107Raji淋巴瘤細胞和1×106人胚胎成纖維飼細胞的0.2ml接種物。先前的照射對于減少裸鼠中存在的天然殺傷細胞是有必要的。人胚胎成纖維飼細胞提供VEGF和其它生長因子，這些生長因子促進高腫瘤發生率(90％)。使腫瘤生長10-15日，直至它們的直徑達到0.5cm。在每一組中(n＝5)，將含有30-40μCi的125I-標記的蛋白質的0.1ml接種物靜脈注射給每只小鼠。在注射后3個不同時間點(24、48和72小時)，用過量戊巴比妥鈉處死動物，移去組織，稱重，用γ計數器測量。對每只小鼠，將數據表示為注射劑量/克數百分比(％ID/g)和腫瘤/器官比值(每克腫瘤的cpm/每克器官的cpm)。用魏克森秩和檢驗(Wilcoxon′s rank-sum test)測定顯著性水平。
C.療效研究對于這些研究，將選擇的制備物的抗腫瘤活性與未偶聯的Lym-1和RITUXAN的抗腫瘤活性相比較，以幫助評價哪種偶聯制備物在Raji淋巴瘤/裸鼠模型中最為有效。對于每一制備物，隔日給予幾組小鼠(n＝5)0.1ml的兩種劑量接種物(25和100μg)，給予3次，通過測徑器在三個尺度上的測量進行腫瘤體積監測，每周3次。測定相對于未處理的對照的腫瘤生長的消退或抑制情況，用以說明治療的效率。所有劑量都是同一技術人員給予的，以保持一致性。記錄動物存活時間，并根據已建立的University Vivarium方案，將具有大于2cm直徑的腫瘤的那些鼠處死。用魏克森秩和檢驗進行統計學分析，得到P值。
實施例2結果
1.通過FACs得到的人惡性淋巴瘤細胞系上的CD20表達水平
用FACs分析霍奇金或非霍奇金淋巴瘤細胞系的CD20表達。這些研究的結果顯示在圖1A-1K中。具有均一高表達的細胞系包括Raji、Farage、SU-DHL-4、SU-DHL-16、Chevallier和Granda 519。發現RAMOS、DG75和SU-DHL-10具有兩種形式的表達水平，L540霍奇金氏病細胞系的CD20表達是陰性的。
2.抗-HLA-DR Lym-1對Raji淋巴瘤細胞增殖的影響
將Raji細胞(7.5×104/孔)在存在67μg/ml的Lym-1或陰性對照IgG(chTV-1)的情況下進行培養，Raji細胞懸浮于RPMI-1640培養基中(Life Technologies，Inc.，San Diego，CA)，培養基中含有10％特征胎牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，UT)。用血細胞計數器在多個時間點評價細胞增殖，通過臺盼蘭染料排斥確定細胞存活。在第3天時更新培養基和抗體。如圖2所示，與對照抗體相比較，發現Lym-1抑制Raji細胞增殖。
3.有和沒有超交聯時Lym-1和利妥昔單抗對Raji細胞的凋亡影響
A.膜聯蛋白V/PI染色。用膜聯蛋白V-FITC和PI復染分析每一MAb誘導凋亡的能力，所述分析分別檢測磷脂酰絲氨酸(PS)在凋亡細胞上的暴露情況和細胞膜完整性的喪失。如圖3A-3G所示，Lym-1能夠以劑量依賴方式誘導Raji細胞凋亡(使用單劑量時呈現出的數據)。在這些試驗中，利妥昔單抗對凋亡的誘導幾乎沒有影響。然而，利妥昔單抗的超交聯顯著改進了其誘導Rai細胞凋亡的能力，如圖3所示。用對照IgG染色的Raji細胞被顯示以進行比較。
B.TUNEL試驗。如圖4A-4C所示，TUNEL試驗的FACs分析顯示出由Lym-1誘導的廣泛凋亡，但利妥昔單抗和chTv-1沒有誘導廣泛調亡。
4.聚合物結合的抗體對凋亡的誘導
RITUXAN和Lym-1被結合于葡聚糖，葡聚糖是一種可溶的、多分支的、剛性聚合物。對于這些研究，將葡聚糖(200mg，平均分子量是10,000 Sigma-Aldrich)和高碘酸鈉(240mg，Sigma，Aldrich)溶解在10ml的0.9％NaCl溶液中。暗處溫育過夜后，使混合物通過預平衡PD-10柱(Pharmacia)并用0.9％ NaCl洗脫。將純化的氧化葡聚糖于暗處4℃保存。同時，用碳酸氫鈉緩沖液(0.1M，pH 8.1)透析100μlLym-1(23.6mg/ml)、利妥昔單抗(10mg/ml)和無關的IgG(chTV-1，11.8mg/ml)過夜。將透析的Lym-1、利妥昔單抗和chTV-1與氧化葡聚糖以不同摩爾比混合(1∶1和1∶2)。暗處連續振蕩6小時后，用含有5mg硼氫化鈉(Sigma)的PBS還原反應物。最后，用PBS透析每一葡聚糖-抗體偶聯物過夜。根據抗體的濃度測定每一偶聯物的OD值。隨后通過非還原SDS凝膠測定交聯效率(圖5A-5B)，其顯示，連接于葡聚糖聚合物之后，葡聚糖-Lym-1、葡聚糖-利妥昔單抗和葡聚糖-chTV-1(陰性對照)的分子量比非偶聯抗體顯著增加。
使Raji細胞與增加濃度的試劑在37℃于5％ CO2培養箱中溫育18小時。隨后用膜聯蛋白V/PI對每一樣品進行染色，并使每一樣品經歷FACs分析，如上所述。對于單一劑量，這些研究的結果顯示在下面的圖6中。用1∶1的偶聯比例，用667ng/ml濃度的葡聚糖-Lym-1，得到73％的凋亡。這些結果和圖3D-3F中所看到的用非偶聯的鼠Lym-1獲得的凋亡水平大致相同。特別地，當濃度增加至6.7μg/ml時，得到100％凋亡(數據未顯示)。與之不同，葡聚糖-利妥昔單抗制備物顯示出對凋亡誘導的顯著改進，從非偶聯利妥昔單抗(667ng/ml)的約13％至相同濃度的葡聚糖-利妥昔單抗的約30％(偶聯的比例是1∶2)。當應用更高濃度的葡聚糖-利妥昔單抗時(6.7μg/ml)，凋亡的誘導增加至52％。在這些試驗中，葡聚糖-chTV-1陰性對照不誘導任何顯著水平的凋亡，這說明這種現象是抗體相關的。這些結果說明，結合于多分支剛性聚合物如葡聚糖的抗-CD20可以直接誘導凋亡。因此，聚合物/抗體偶聯物可以模仿通過加入對于抗-CD20誘導調亡為必需的第二GAM所產生的交聯事件。
5.葡聚糖-利妥昔單抗在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布
在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中進行生物分布研究，以測定葡聚糖-利妥昔單抗聚合物靶向腫瘤和跳過非靶向的正常組織及器官的能力。如圖7A所示，相比相同劑量的單獨的利妥昔單抗，葡聚糖-利妥昔單抗在腫瘤中顯示出增強的攝取。顯著地，在脾和肺中僅觀察到攝取的輕度增加，這兩個部位具有活性網狀內皮系統。這些數據說明，葡聚糖-利妥昔單抗聚合物在體內是藥學上可行的，并且與非偶聯利妥昔單抗相比，腫瘤靶向性質得到改進。盡管不希望受限于任何理論，對葡聚糖-利妥昔單抗的增強的攝取可能歸因于更長的血清半衰期，因為對兩種試劑而言，觀察到的腫瘤/正常器官比值大約相同(圖7B)。
6.Lym-1和葡聚糖-Lym-1在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布
也用Lym-1和葡聚糖-Lym-1進行了比較性生物分布研究。圖8A-8B中顯示的3日生物分布分析說明，兩種試劑的攝取或分布幾乎沒有差異。
7.葡聚糖-RITUXAMAB在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的治療效應的增強
進行體內研究，以確定葡聚糖-利妥昔單抗對凋亡誘導的增強是否也對裸鼠中已確立的異種移植Raji腫瘤產生改進的治療效果。如圖9所示，應用已述的3次劑量隔日給予的治療方案，在此腫瘤模型中，應用葡聚糖-利妥昔單抗，清楚地看到臨床效應的劑量依賴性增強。葡聚糖-利妥昔單抗引起的腫瘤減輕比相同蛋白質劑量的單體利妥昔單抗更顯著。
8.Lym-1和葡聚糖-Lym-1免疫療法在帶有Raji淋巴瘤的裸鼠中的治療效應
圖10中顯示的用Lym-1和葡聚糖-Lym-1進行的比較性研究證明，基于聚合物的制劑沒有改進此抗體的臨床效應，按照例如圖6中看到的體外研究，此抗體已經顯示出對凋亡的明顯誘導。與對照處理鼠相比，天然Lym-1和聚合物-Lym-1均產生非常有效的腫瘤抑制。
結合于聚合物的抗-CD20(利妥昔單抗)顯示出對CD20陽性人淋巴瘤細胞系的早期和晚期凋亡誘導的顯著增強，這類似于用超交聯方法所看到的結果。當在體內測試時，這種制劑變化使得抗-CD20能夠在模型中成為有效的試劑，在所述模型中，由于裸鼠的免疫缺陷狀態，ADCC是忽略的。這些結果說明，如果抗體經聚合物配制以多聚體的形式被提供，則凋亡的誘導可以成為經CD20的腫瘤殺傷的重要機制。
實施例3.用同型雙功能交聯劑和異型雙功能交聯劑制備的抗體二聚體
1.同型雙功能交聯劑。這些交聯劑有兩個相同的活性基團(表2)并且在一步反應過程中被使用，以結合2個MAb分子(Park等，J.Biol.Chem.261205-210，1986；Browning等，J.Immunol.1431859-1867，1989)。同型雙功能交聯劑包括硫代-EGS和/或硫代-DST，它們用于結合兩個MAb分子，而不破壞抗體的S-S鍵并且不應用苛刻的還原劑。硫代-DST是水溶性類似物，可用于在一步反應中制備同型二聚體。這種交聯劑通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯與MAbs的伯胺基團反應，形成共價酰胺鍵。硫代-EGS是水溶性類似物，能夠在一步反應中通過形成共價酰胺鍵，經伯胺基團交聯MAbs。與DST相比，EGS具有降低空間位阻效應的延伸的間隔臂。根據制造商(Pierce)的指導和根據以前描述的優化方法(Khawli等人，Cancer Biother & Radiopharm.11203-215，1996；Sharifi等人，Q.J.Nucl.Med.42242-249，1998)，將所有的MAbs交聯起來。偶聯之后，將反應混合物透析過夜并在Sephadex G-25上色譜純化。將不同級分濃縮、過濾，并進一步通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和高壓蛋白色譜(HPLC)進行分析，以確定純度和每一接頭的抗體分子數目。
2.異型雙功能交聯劑。這些交聯劑有兩個不同的活性基團，其允許與蛋白質的特定基團相繼偶聯(表3)，這使得不需要的聚合和自偶聯最小化(Samoszuk等人，Antibody，Immunoconj.& Radiopharm.237-45，1989；Duncan等人，Anal.Biochem.13268-73，1983)。兩種異型雙功能交聯劑如硫代-SMCC和SATP被用于通過穩定的硫醚鍵相繼結合于兩個MAbs。二聚體是在兩步反應過程中形成的。a.SATP是可用于將受保護的SH基團引入MAbs的試劑，并且為SH基團提供了更大空間自由度。穩定的共價酰胺鍵是根據制造商(Pierce)的指導由NHS酯和MAbs的伯胺的反應形成的。脫保護以形成SH鍵是通過使用羥胺的脫乙酰化作用完成的(不應用還原劑)。b.硫代-SMCC是水溶性交聯劑類似物，由NHS酯和用限制空間位阻的間隔臂連接的馬來酰亞胺基組成。NHS酯與伯胺反應，馬來酰亞胺與SH基團反應。NHS反應首先根據制造商(Pierce)的指導和根據以前描述的優化方法(Khawli等人，Cancer Biother & Radiopharm.11203-215，1996；Sharifi等人，Q.J.Nucl.Med.42242-249，1998)被實施，隨后除去過量的交聯劑，隨后加入帶有SH基團的組分(MAb-SATP)，通過形成穩定的硫醚鍵完成交聯。
將衍生的MAbs(MAb-SMCC和MAb-SATP)混合在一起并在室溫下溫育2-3小時。將最終的混合物透析并在Sephadex G-25柱上色譜純化。將不同級分濃縮、過濾，并進一步通過SDS/PAGE和HPLC進行分析，以確定純度和每一接頭的抗體分子數目。
實施例4.通過使用三功能交聯劑制備三聚體
三功能交聯劑是相對新的形式的偶聯劑，每一分子具有三個不同的活性基團或配位基團(表4)。交聯劑如硫代-TSAT和TMEA被用來結合三個MAb分子。
1.硫代-TSAT是新的三功能交聯劑，用于在一步反應過程中制備三聚體。此交聯劑是水溶性類似物，經N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯與MAbs的伯胺基團反應，形成共價酰胺鍵。2.TMEA是三功能交聯劑，可用于在兩步反應中制備含SH蛋白的三聚復合體。異型雙功能接頭如SATP首先被用于將SH基團引入MAb(如上所述)，隨后加入TMEA。交聯是通過馬來酰亞胺(在TMEA上)與SH基團反應形成穩定的硫醚鍵而完成。
所有的三聚抗體都是根據制造商的指導(Pierce)制備的。偶聯之后，將反應混合物透析過夜并在Sephadex G-25上色譜純化。如上所述將不同級分濃縮、過濾，并進一步通過SDS/PAGE和HPLC進行分析。
表2同型雙功能交聯劑(從商業來源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)

表3.異型雙功能交聯劑(從商業來源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)



表4.三功能交聯劑(從商業來源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)
實施例5.包被有利妥昔單抗的DynabeadsM-280的制備
按照制造商的方案，將利妥昔單抗包被在甲苯磺酰基活化的DynabeadsM-280(Dynal Biotech Inc.，Brown Deer，WI)上。簡言之，用PBS洗滌7×108Dynabeads兩次，與500μl的200μg利妥昔單抗或同種型對照抗體溫育，同時持續旋轉，30℃，18-20小時。隨后用磁珠吸引器(Dynal Biotech Inc.，Brown Deer，WI)使Dynabeads沉積，通過用UV分光光度計(Ultraspec 2000，Pharmacia，Piscataway，NJ)測定280nm處的OD值，對上清液中的未偶聯的抗體進行定量。偶聯于Dynabeads的抗體總量通過公式計算(總抗體-未偶聯的抗體＝珠子上的偶聯抗體)。用PBS和1％(w/v)BSA洗滌包被有抗體的Dynabeads 2次，隨后用端對端旋轉(end-to-end rotation)，用封閉溶液(0.2M Tris-HCl pH 8.5；0.1％BSA)處理自由甲苯磺酰基基團，37℃，3-4小時，用PBS(0.1％BSA，1％ Tween-20)洗滌兩次，隨后再用PBS(0.1％ BSA)洗滌兩次。最后，將偶聯有抗體的Dynabeads重懸浮于PBS(0.05％疊氮鈉)中并于4℃保存。使用前通過洗滌去除疊氮鈉。
實施例6.葡聚糖-利妥昔單抗聚合物的產生(1∶2.4利妥昔單抗∶氧化葡聚糖) 將100mg葡聚糖(平均分子量是6,000Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)和120mg高碘酸鈉(Sigma，St Louis，MO)溶解在5mL的0.9％NaCl溶液中并于暗處室溫下溫育18h。使混合物通過預平衡的PD-10柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，用0.9％NaCl洗脫，于暗處4℃保存。使2mL利妥昔單抗(10mg/mL)通過預平衡的PD-10柱并用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.1)(Sigma)洗脫。用0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.1)將洗脫的利妥昔單抗稀釋為5mg/1ml，與480μg氧化葡聚糖以摩爾比1∶2.4(利妥昔單抗∶氧化葡聚糖)混合。暗處持續振蕩6小時后，用5mg硼氫化鈉(Sigma)還原反應物1小時，隨后在PBS中透析。隨后使透析物通過0.22μm的非熱源性注射濾器(Costar，Coming，NY)，并應用Pharmacia AKTA System(FPLC；(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)使葡聚糖利妥昔單抗混合物通過在PBS中預平衡的Superose 6柱，流速為0.5mL/分鐘，從而進行分級分離。一般地，聚合物的駐留時間是約16分鐘。用Centricon YM-100(Millipore)進一步濃縮聚合物級分，0.22μm過濾除菌，并通過SDS/PAGE進行分析。蛋白質在非還原條件下通過SDS/PAGE進行分析，濃縮膠是4％，分離膠是5％。通過考馬斯藍染色可見蛋白質條帶。
實施例7.利妥昔單抗同源二聚體的產生
用兩種異型雙功能交聯劑SATA(N-琥珀酰亞胺基S-乙酰基硫代-乙酸酯，(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和SMCC[琥珀酰亞胺基4-(馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯](Pierce)產生利妥昔單抗的同源二聚體(28、29)。
1.用SMCC衍生化處理。使濃度為5mg/mL的5mg利妥昔單抗與2.5μlSMCC(9.3mg/mL，溶于二甲基亞砜)室溫下溫育1小時，同時持續旋轉，SMCC/利妥昔單抗的摩爾比是4.5，其中利妥昔單抗溶于0.05M磷酸鹽緩沖液中，緩沖液中含有3mM Na2EDTA(PBE；pH 7.5)。在相同PBE緩沖液中在PD-10柱上通過層析純化偶聯的蛋白質。
2.用SATA衍生化處理。使PBE緩沖液中濃度為5mg/mL的5mg利妥昔單抗與2.5μL SATA(5.8mg/mL，溶于二甲基亞砜)混合，于室溫下溫育1小時，SATA/利妥昔單抗的摩爾比是4.0。隨后通過在PD-10柱上的層析移去過量的SATA，用5mg的羥胺-HCl(Sigma)對純化的蛋白質脫乙酰基，室溫下進行5分鐘。通過在PD-10柱上的層析去除過量的羥胺-HCl。
3.利妥昔單抗同源二聚體形成和生理特征
將SMCC-和SATA-衍生蛋白質混合在一起并溫育，室溫下持續旋轉1-2小時。將制備物在PBS中4℃透析過夜，通過0.22μm非熱源性過濾器(Costar，Coming，NY)過濾除菌，用上述Pharmacia AKTA在Superose 6柱(FPLC)上進一步分級分離，流速是0.5mL/分鐘。
一般地，通過FPLC，聚合物顯示的駐留時間大約是16分鐘，而二聚體顯示的駐留時間大約是29分鐘。應用Centricon YM-100(Millipore，Billerica，MA)使來自FPLC的蛋白質級分進一步濃縮，過濾滅菌，并用SDS/PAGE分析。通過非還原SDS-PAGE，對該二聚體制備物觀察到了預期的利妥昔單抗二聚體分子量。以鼠IgM作為標準(970kDa)，應用2％瓊脂糖凝膠測定聚合物的大小。通過本方法，確認一條帶是利妥昔單抗聚合物，其略高于IgM，所述IgM的分子量對應于約5個免疫球蛋白分子。
實施例8.利妥昔單抗二聚體和利妥昔單抗聚合物(1∶2.4利妥昔單抗∶氧化葡聚糖)的比較結果
1.利妥昔單抗制備物的親和研究
進行親和結合研究，其中使125I-標記的利妥昔單抗制備物與Raji淋巴瘤細胞溫育，通過斯卡查德分析法(Scatchard analysis)用結合的放射活性計算親和常數(Ka)。應用此方法，發現利妥昔單抗聚合物的親和常數是3.16×108M-1，而單體和二聚體的親和常數分別是3.6×108M-1和2.09×108M-1。這些研究表明，利妥昔單抗聚合物和二聚體對抗原的結合親和性與利妥昔單抗本身相似，這有利于隨后在體外和體內進行直接比較。
2.利妥昔單抗制備物對凋亡的誘導
在37℃單獨應用利妥昔單抗或應用超交聯利妥昔單抗處理Raji淋巴瘤細胞18-20小時。凋亡的量通過膜聯蛋白V/PI染色(圖11A)和TUNEL試驗(圖11B1-B4)測定。在本試驗中，利妥昔單抗單體在Raji細胞中僅誘導最小水平的凋亡，膜聯蛋白分析中是約26％，TUNEL試驗中是約2.99％。圖11B1-4中膜聯蛋白分析中的利妥昔單抗單體的背景凋亡高于圖6所示，差異可能是由于一段時間內的分析誤差產生的。與之相比，GAH超交聯利妥昔單抗引起更高水平的凋亡(膜聯蛋白分析中是約50％，TUNEL分析中是約30.41％；圖11A和圖11B-14)。偶聯于甲苯磺酰基活化的Dynabeads(直徑是2.8μm)的利妥昔單抗誘導出最佳的凋亡水平，所述水平通過膜聯蛋白V/PI染色和TUNEL試驗檢測(分別是約96％和83.28％；圖12A和12B1-B3)。
用凋亡試驗來分析利妥昔單抗聚合物和二聚體誘導凋亡的能力。TUNEL試驗顯示，利妥昔單抗聚合物誘導57.8％的凋亡，而二聚體僅產生2.99％(結果未顯示)。
多種利妥昔單抗制備物的凋亡誘導量在10種不同細胞系中得以測試，所述細胞系包括10種CD20+細胞系和2種CD20-細胞系。結果顯示在表5中。
表5.利妥昔單抗單體、二聚體和聚合物制備物對CD20陽性和陰性細胞系的凋亡誘導，通過膜聯蛋白V測定。


1平均熒光強度2非存活細胞百分數
在CD20+細胞系中(Raji，B35M，Ramos，Farage，Granda 519和Chevallier)，與二聚體或單體處理的那些細胞相比，利妥昔單抗聚合物處理的細胞中的凋亡顯著增加。然而，不是所有利妥昔單抗聚合物處理的CD20+細胞都表現出顯著的凋亡。認為這些淋巴瘤細胞系中的一些細胞可能具有不同的關聯于CD20連接的細胞內途徑。在用不同利妥昔單抗制備物處理的任意CD20-細胞系中均沒有檢測到明顯凋亡，這很可能是由于抗體結合的缺乏。
3.免疫熒光顯微術研究
在用第二抗體FITC-偶聯的羊抗鼠F(ab′)2染色之前，使利妥昔單抗單體、二聚體和聚合物與Raji細胞溫育，隨后用2％多聚甲醛固定。此外，通過在用2％多聚甲醛固定之前，用利妥昔單抗和FITC-偶聯的羊抗鼠F(ab′)2先后處理細胞，研究超交聯的影響。結果表明，利妥昔單抗單體和二聚體處理產生環狀形式的免疫熒光，表明CD20平均分布在淋巴瘤細胞的表面。與之不同，發現用利妥昔單抗聚合物或利妥昔單抗+二抗處理的細胞有更加分離的極性染色型，這與CD20移動和固定入脂膜筏一致。這些結果表明，CD20在脂膜筏中的群集和固定與凋亡誘導一致。
4.胱天蛋白酶3活化研究
如圖13A-13E所示，發現用利妥昔單抗單體或二聚體處理的Raji淋巴瘤細胞具基礎水平的胱天蛋白酶3活性，與對照相似。與之不同，用利妥昔單抗聚合物或包被了利妥昔單抗的Dynabeads處理的Raji淋巴瘤細胞顯示出明顯的胱天蛋白酶3活化。對于聚合物處理的細胞，胱天蛋白酶3活性在處理5小時后開始升高，在24小時達到峰值。對于用包被了利妥昔單抗的Dynabeads處理的那些細胞，胱天蛋白酶3活性在處理5小時后達到峰值，在24小時下降。從這些試驗中，似乎凋亡的早期誘導與胱天蛋白酶3的更強效活化相關，如在包被了利妥昔單抗的Dynabeads處理的樣品中所見。
5.藥物動力學和生物分布研究
在BALB/c小鼠中進行全身放射活性研究，以確立125I-標記的利妥昔單抗單體、二聚體和聚合物之間的藥物動力學特性差異。從這些研究中確定，125I-利妥昔單抗的T1/2是96小時(p＜0.01)，而二聚體和聚合物表現出更慢的總全身清除，分別是120小時和144小時(p＜0.01)。延長的清除與分子量增加有關。
對生物分布研究，對幾組帶有Raji的裸鼠靜脈注射125I-標記的利妥昔單抗單體、二聚體或聚合物。三日后，處死小鼠，測定每一器官的放射性，計算百分注射劑量/克(％ID/g)和腫瘤/器官比值(每克腫瘤的cpm/每克器官的cpm)。如圖14A所示，所有三種利妥昔單抗制備物都有效地定位于Raji人淋巴瘤異種移植物，這產生了大致相似的腫瘤對正常器官比值(圖14B)。數據進一步說明了所有三種利妥昔單抗制備物的腫瘤靶向特異性，如觀察到的高腫瘤攝取所提示的。
6.免疫治療研究
如圖15所示，對已建立的Raji異種移植物的處理直至第10天腫瘤的大小可以觸知時才開始。在接受利妥昔單抗單體或二聚體的這些組的小鼠中，腫瘤生長或是不受影響或是比未處理的對照組中所見的略微緩慢。與之不同，接受利妥昔單抗聚合物的小鼠表現出明顯的腫瘤消退。腫瘤移植后28天，聚合物處理組的平均腫瘤體積是PBS處理對照組的腫瘤體積的＜30％(p＜0.01)。考慮到所有這些制備物在此相同腫瘤模型中具有相當的親和常數和生物分布特性的事實，這些發現特別值得注意。
7.結論
利妥昔單抗對調亡的直接誘導是非常低效率的，除非抗體通過第二抗體被超交聯或被固定在塑料上(5-7和19)。與利妥昔單抗單體或二聚體相比，由每一葡聚糖分子至少5個免疫球蛋白組成的利妥昔單抗聚合物顯示了體外和體內的效力。與單體或二聚體制備物相比，聚合物在結合后直接誘導CD20+人淋巴瘤細胞系的凋亡。此外，應用單體和二聚體制備物幾乎沒有效果的劑量的聚合物時，利妥昔單抗聚合物在體內對移植的Raji淋巴瘤要有效得多。值得注意的是，在帶有腫瘤的裸鼠中，所有三種抗體制備物對CD20具有基本相同的親和力，并且表現出相似的藥物動力學特性和生物分布特性。
包被了利妥昔單抗的Dynabeads在Raji細胞中誘導最大水平的凋亡，其中＞90％的細胞顯示出凋亡。在體內，Dynabead遞呈可能類似于帶有FcR的細胞。包被了抗體的Dynabeads提供了鑒定抗體的簡單方法，其中通過帶有FcR的細胞遞呈而發生的凋亡誘導是重要的作用機制。
免疫熒光顯微術顯示，CD20抗原群集與利妥昔單抗抗體制劑的卓越的細胞凋亡誘導相關。因此，免疫熒光顯微術檢測的CD20抗原群集可以被用來預測能夠誘導凋亡的抗體制劑。
提出了幾種機制解釋動物模型和人體中利妥昔單抗處理的有效性。ADCC在體內起主要作用的觀念是目前流行的假說，幾種出版物都陳述了經FcRs的抗體遞呈的重要性(20、59、60)。在小鼠模型中，FcγRII對利妥昔單抗的治療效果有抑制作用(59)，但是一些研究產生了對立的結果(61)。具體而言，用FcγRII轉染的小鼠成纖維Ltk-細胞仍然促進信號誘導的凋亡(6)。在本文的結果中，利妥昔單抗聚合物制備物在抑制Raji淋巴瘤體內生長中的有效性說明，凋亡是治療淋巴瘤的有力機制。應用包被了利妥昔單抗的Dynabeads和聚合物時，看到了胱天蛋白酶3的誘導，而應用利妥昔單抗單體和二聚體時，僅觀察到基礎水平的胱天蛋白酶活性。更高和更有效的凋亡誘導與胱天蛋白酶3更早和更多的活性增加有關。
總之，除了二聚體抗體制備物外，用多聚形式的抗-CD20抗體，實現了通過凋亡誘導對淋巴瘤的有效治療。合適的凋亡誘導抗-CD20制備物的體外篩選可以用第二抗體、帶有FcR的細胞或包被了利妥昔單抗的Dynabeads來檢驗。在體內，超交聯似乎需要帶有FcR的細胞的遞呈(59)。然而，如本文所述制備的抗-CD20聚合物制備物似乎避免了對效應細胞的需求。因此，抗-CD20聚合物可以特別用于具有低FcR表型和對利妥昔單抗單一療法無反應的淋巴瘤患者(62)。
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本領域技術人員容易認識到，本發明完全可以進行調整以實現目標并獲得所提及的以及固有的結果和優勢。本文中描述的實施例，代表了優選的實施方案，是示范性的，而不意圖成為對本發明范圍的限制。其中的修改和其它用途對本領域技術人員將是明顯的。這些修改包含在本發明的精神之內并且被本發明的范圍限定。
對本領域技術人員明顯的是，可以對公開的實施方案作各種置換和修改，而不脫離本發明的精神和范圍。
本說明書中提及的所有專利和出版物指出了本發明所屬技術領域的普通技術人員的水平。所有專利和出版物通過參考并入本文至這樣的程度，如同每個單獨的出版物都表示為明確地分別并入本文，作為參考。
本文中例證性地描述的發明可以在缺少本文中未具體公開的任一元素或許多元素、限定或許多限定的情況下適宜地實施。因此，例如，在此處的任何情況下，術語“包括”、“基本上由…組成”和“由…組成”可以替換為其它兩個術語中的任一個。已被使用的術語和表述，是被用作描述性術語，而不是限定性的，并且本發明的意圖不是在使用這些術語和表述時排除顯示和描述的特征或其部分的等同物，應認識到在要求保護的發明范圍內各種修改是可能的。因此，應該理解，盡管本發明通過優選的實施方案和可選的特征被具體地公開，但本領域技術人員可以對本文公開的概念進行修改和變化，而這些修改和變化被認為包含在本發明的范圍之內，如所附權利要求所限定的。
其它實施方案在權利要求中列出。
權利要求
1.癌癥治療劑，其包括連接有多個抗腫瘤細胞抗體的聚合物，其中所述抗體可以結合于腫瘤細胞的腫瘤細胞抗原并且誘導所述腫瘤細胞的凋亡或細胞死亡。
2.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體在不與聚合物連接時的特征是，不會實質性地誘導所述腫瘤細胞的凋亡或細胞死亡。
3.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體在不與聚合物連接時的特征是，誘導所述腫瘤細胞的凋亡或細胞死亡。
4.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體結合于相同的腫瘤抗原。
5.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體結合于相同腫瘤抗原的多于一個表位。
6.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體結合于多于一種腫瘤抗原。
7.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中至少一個抗體是二價抗體。
8.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中至少一個抗體是單價抗體。
9.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中至少一個抗體是抗體片段。
10.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD21抗體和抗CD22抗體。
11.權利要求10所述的癌癥治療劑，其中所述癌癥治療劑包括抗體中的任意兩種或更多種，所述抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD21抗體和抗CD22抗體。
12.權利要求11所述的癌癥治療劑，其中所述抗體是抗HER-2。
13.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述癌癥治療劑包括至少5個抗體。
14.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述癌癥治療劑包括至少10個抗體結合位點。
15.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述腫瘤是淋巴瘤或白血病。
16.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物的大小是至少1,000道爾頓。
17.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物的大小是在6000-8000道爾頓之間。
18.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是同聚物。
19.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是雜聚物。
20.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物選自葡聚糖、聚(乙二醇)(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺類樹枝狀聚合物(PAPAM)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的合成共聚物(HPMA)，和N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)。
21.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是可溶性聚合物。
22.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是線性聚合物。
23.權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述聚合物是支化聚合物。
24.降低個體中的腫瘤體積或抑制個體中癌細胞生長的方法，包括給予有效量的權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述癌癥治療劑結合于個體中的所述腫瘤或癌細胞。
25.權利要求24所述的方法，其中所述腫瘤或所述癌細胞是淋巴瘤或白血病。
26.權利要求25所述的方法，其中所述個體表現出降低水平的抗體依賴細胞介導性細胞毒性。
27.減輕或抑制患癌癥個體中轉移性癌發展的方法，包括給予有效量的權利要求1所述的癌癥治療劑，其中所述個體具有表達腫瘤細胞抗原的癌細胞，所述癌癥治療劑中的抗體可以結合于所述腫瘤細胞抗原。
28.權利要求27所述的方法，其中所述腫瘤或所述癌細胞是淋巴瘤或白血病。
29.權利要求27所述的方法，其中所述個體表現出降低水平的抗體依賴細胞介導性細胞毒性。
30.鑒定抗體的方法，相比未連接于聚合物的抗體，所述抗體在至少兩個這種抗體被連接于聚合物時，誘導腫瘤細胞凋亡的能力增強，所述方法包括a)將期望進行這種試驗的候選抗體連接于不溶性顆粒并使所述連接有抗體的顆粒與腫瘤細胞接觸，所述腫瘤細胞表達所述候選抗體能夠結合的抗原；和b)步驟a)之后，確定所述腫瘤細胞中誘導的凋亡的程度，并將其與在另外一批相同腫瘤細胞中誘導的凋亡程度相比較，所述另外一批相同腫瘤細胞與未連接于顆粒的所述候選抗體接觸。
31.權利要求30所述的方法，其中所述誘導腫瘤細胞凋亡的能力增強是，使用連接有抗體的顆粒比未連接于顆粒的抗體相比，有至少2倍的增加。
32.權利要求30所述的方法，其中所述不溶性顆粒是直徑為約2至約5微米長度的珠子。
全文摘要
描述了包括聚合物的癌癥治療劑，三個或更多個抗腫瘤細胞抗體與所述聚合物相連接。優選大小為6－8Kd之間的可溶性聚合物。聚合物上的抗體可以和腫瘤細胞的腫瘤細胞抗原結合并誘導腫瘤細胞凋亡或細胞死亡。聚合物可以被連接于針對相同腫瘤抗原的不同抗體或針對不同腫瘤抗原的不同抗體。也描述了用該癌癥治療劑治療患有癌癥的個體的方法。
文檔編號C07K16/28GK1925871SQ200580006321
公開日2007年3月7日 申請日期2005年1月27日 優先權日2004年1月27日
發明者A·L·愛潑斯坦, L·A·赫里 申請人:南加州大學