專利名稱：一種細胞遷移相關蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及來源于斑馬魚的一種細胞遷移相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
細胞遷移是個體發育過程中一種最基本的運動過程，很多缺陷和疾病也和細胞遷移能力的變化相關，因此細胞遷移的調控成為當前發育生物學、細胞生物學以及生物醫學的重要研究內容。
雖然在眾多的細胞生物學研究方向中影響細胞遷移的基因很多，但是目前已經報道的motin家族成員中只有人類的angiomotin具有促進細胞遷移的功能(該家族包括人類的angiomotin，angiomotin-like1和angiomotin-like2以及小鼠的angiomotin，angiomotin-like1和angiomotin-like2)。但在模式生物斑馬魚中還沒有克隆到該家族基因，因此也就更沒有細胞遷移方面的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種細胞遷移相關蛋白及其編碼基因。
本發明所提供的細胞遷移相關蛋白，來源于斑馬魚(Danio rerio)，名稱為AMOTL2，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與細胞遷移相關的蛋白質。
其中，序列表中的序列2由721個氨基酸殘基組成。自氨基端的第718位至721位氨基酸殘基為PDZ蛋白結合區。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述細胞遷移相關蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。
上述細胞遷移相關蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述細胞遷移相關蛋白的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
序列表中的序列1由2166個脫氧核苷酸組成，其編碼序列為自5′端第1位核苷酸至2166位脫氧核苷酸。序列3由15558個脫氧核苷酸組成。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
含有上述細胞遷移相關蛋白編碼基因的表達載體、細胞系和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。
體內和體外實驗證明，AMOTL2與細胞遷移相關，它的過量表達可以促進細胞遷移，而它的瞬時敲除可以抑止細胞遷移。用含有C末端缺失78個氨基酸殘基的AMOTL2編碼基因的質粒pAmotl2dPDZ-GFP和含有全長的AMOTL2編碼基因的質粒pAmotl2-GFP轉染293T細胞和cos7細胞的實驗表明AMOTL2可促進293T和cos7細胞的遷移，AMOTL2的C末端缺失掉78個氨基酸殘基后抑制293T和cos7細胞的遷移。本發明的細胞遷移相關蛋白的編碼基因可用于構建轉基因細胞模型和轉基因動物模型，進行篩選預防和/或治療與細胞遷移有關疾病的藥物。本發明的細胞遷移相關蛋白及其編碼基因也可用于制備預防和/或治療與細胞遷移有關疾病的藥物。同時，也可在斑馬魚中利用組織特異性的啟動子得到特定組織表達AMOTL2的轉基因斑馬魚，從而進行更精細的發育生物學研究。
圖1為AMOTL2下調表達的斑馬魚胚胎表型。
圖2為注射AMOTL2特異性MO和對照MO后斑馬魚胚胎動物極與胚盤邊緣之間的距離差異統計。
圖3為在斑馬魚胚胎的64細胞時期單細胞注射不同MO產生的不同遷移效果。
圖4為傷口愈合實驗的細胞熒光、亮場和疊加圖。
圖5為體外遷移實驗傷口愈合實驗的統計學分析。
圖6為AMOTL2下調的斑馬魚胚胎細胞骨架變化圖。
圖7為AMOTL2下調的Hela細胞的細胞骨架變化圖。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。除非有其它說明，本發明的實施使用本領域中的傳統分子生物學、細胞生物學，和克隆技術。
實施例1、AMOTL2的cDNA基因和基因組基因的獲得以野生型斑馬魚的單細胞胚胎、5體節胚胎和24小時胚胎的總RNA為模板，經過promega的A3500反轉錄系統得到斑馬魚整胚的cDNA，以該cDNA為模板，根據具有特異表達譜的已有基因片斷經過EST拼接設計引物F15’-TCGAATTCTATGAGAACGGCAGAGGAATCA-3’和R15’-CGGGATCCACTACTTTGCTCACCTTTGGC-3’，進行PCR擴增，其中PCR反應的溫度條件為94℃預變性10分鐘；再94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃3分00秒，共33個循環；最后72℃10分鐘；采用天為時代公司高保真pfu polymerase擴增。將擴增得到的約1900bp DNA片段經過EcoRI和BamHI兩個限制性內切酶的消化后，與同樣兩個內切酶消化的pEGFPN3載體(clontech)連接，內切酶檢驗有插入片段后測序檢驗，測序結果表明該PCR產物具有序列表中序列1的自5′端第1位至1941位脫氧核苷酸，編碼具有自序列表中序列2的氨基端第1至647位氨基酸殘基的AMOTL2dPDZ，即AMOTL2的C端缺失了78個氨基酸殘基，將含有該PCR產物的pEGFPN3載體命名為pAmotl2dPDZ-GFP。再按照寶生物工程(大連)有限公司提供的3’-RACE試劑盒的說明書進行3’RACE快速擴增cDNA的末端。其中，3’-RACE的引物為上游引物5‘-AgTTTgCCATggATgCTgC-3’，下游引物5‘-gACTCgAgTCgACATCgATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。回收純化PCR產物，連接克隆到pMD18-T載體上，通過菌落PCR，挑選5個陽性克隆測序，序列分析結果表明，獲得AMOTL2的cDNA基因的3′端序列(自序列1的5′端第1607位至第2166位脫氧核苷酸)。
將AMOTL2的5′端序列和3′端序列在體外拼接，得到AMOTL2的全長cDNA序列，具有序列表中序列1的核苷酸序列。為驗證該拼接得到的AMOTL2的全長cDNA序列的正確性，據拼接的AMOTL2全長cDNA序列，再設計1對特異性引物F25‘-TCgAATTCTATgAgAACggCAgAggAATCA-3’，R25‘-5’-gTCCTCgAgTggACATTgTTATCTCAgATg-3’，以斑馬魚整胚的cDNA(以野生型斑馬魚的單細胞胚胎、5體節胚胎和24小時胚胎的總RNA為模板，經過promega的A3500反轉錄系統得到)為模板，進行PCR擴增。其中PCR反應的溫度條件為94℃預變性5分鐘；再94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃3分30秒，共33個循環；最后72℃10分鐘。將擴增得到的約2200bp DNA片段經過EcoRI和XhoI兩個限制性內切酶的消化后，與同樣兩個內切酶消化的pEGFPN3載體(clontech)連接，內切酶檢驗有插入片段后測序檢驗，測序結果表明該PCR產物具有序列表中序列1的核苷酸序列，自5′端第1位核苷酸至2163位脫氧核苷酸編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基的AMOTL2，是AMOTL2的cDNA基因。將該含有AMOTL2的cDNA基因的pEGFPN3載體命名為pAmotl2-GFP。
實施例2、AMOTL2是細胞遷移相關蛋白的功能驗證1、整個胚胎體內研究AMOTL2的蛋白質減少產生的發育缺陷。
確認AMOTL2對細胞遷移的作用可以從體內和體外兩方面來證明。在體內可以通過注射嗎啉寡聚核苷酸(Morpholino oligonucleotides)來證明。
嗎啉寡聚核苷酸(Morpholino oligonucleotides，MO)是非離子型DNA類似物，其中的核糖被嗎啉所代替，磷酸二酯鍵被phosphoroamidate所代替。可以特異性地抑制某個基因的翻譯，從而降低所在細胞的該基因表達蛋白的水平。
嗎啉寡聚核苷酸一般與目標基因起始位點的序列互補。在AMOTL2的基因組基因的起始密碼子前，設計了與自序列3的自5′端第13556位至13580位核苷酸互補的特異性MO(Amotl2-MO15’-CATTTCAgTCTATgTTTAACAgACA-3’)和與自序列3的自5′端第13534位至13558位核苷酸互補的特異性MO(Amotl2-MO25’-CTgATgATTCCTCTgCCgTTCTCAT-3’)，按照隨機序列設計了對照MO(cMO5’-TACTCTTGCCgTCTCCTTAgTAgTC-3’)。Amotl2-MO1、Amotl2-MO2和cMO從GeneTools LLC公司(Corvallis，OR，USA)購得。
在斑馬魚胚胎受精后的單細胞時期用Amotl2-MO2和cMO各6皮克(3納克/微升，每微升可以注射500胚胎)注射卵黃。注射過的胚胎在3小時后剔除沒有受精的胚胎，從受精后四小時開始連續觀察，并用帶有CCD的leica公司體式顯微鏡對AMOTL2特異性MO和對照MO注射過的胚胎進行拍照。如圖1所示，圖1中的HPF表示受精后的小時數，上排為注射Amotl2-MO2的胚胎，下排為注射cMO的胚胎。圖1表明從受精后4小時開始Amotl2-MO2的注射引起了胚胎細胞外包、內卷和延伸等多種運動的停滯，說明在胚胎受精后的單細胞時期注射卵黃可以使后代的所有細胞AMOTL2的蛋白水平全部下降，從而影響細胞的遷移。
為了詳細描述這種胚胎細胞運動過程的差異，對相同放大倍數(200倍)的胚胎照片進行測量，將5枚胚胎動物極與胚盤邊緣的距離取平均，將cMO注射的胚胎的平均值與Amotl2-MO2注射的胚胎的平均值的比值減去1作為標準偏差，Amotl2-MO2注射的胚胎的平均值、cMO注射的胚胎的平均值及其比值如表1所示，標準偏差如圖2所示表1.在照片中測量的動物極到胚盤邊緣的距離(厘米)、比值 注數據為5次測量的平均值表1和圖2顯示注射過Amotl2-MO2的胚胎的胚盤邊緣和動物級之間的距離明顯小于對照組，這表明胚胎細胞的外包和延伸運動比對照組有明顯的缺陷。
2、單個胚胎細胞研究AMOTL2的蛋白質降低產生的細胞遷移缺陷。
有些基因在全身水平降低會導致個體發育的缺陷，從而使得研究者無法進行有效的對比，這就要求在個體內個別細胞(或組織)中降低蛋白水平而周圍的細胞(或組織)保持天然狀態，帶有熒光的MO使得研究者可以跟蹤僅僅表達降低的細胞。
將Amotl2-MO2、cMO均與熒光染料羅丹明以1∶1的比例混和。選擇斑馬魚64細胞時期(即受精卵經過7次細胞分離)對其中一個細胞進行顯微注射Amotl2-MO2與羅丹明的混合物或Amt-cMO與羅丹明的混合物，注射劑量為6皮克，注射后24小時用熒光顯微鏡進行觀察，結果如圖3所示，右側照片為Amotl2-MO2與羅丹明的混合物注射的結果，表明在64細胞時期注射后，熒光細胞到發育晚期只是出現在卵黃的特定位置，隨機分布的很少(23％，n＝45，三次重復)；左側照片為cMO與羅丹明的混合物注射的結果，表明注射過的胚胎在24小時后熒光細胞隨機分布(79％，n＝51，三次重復)，卵黃周圍并沒有明顯的集中分布。這說明AMOTL2的降低會導致細胞遷移能力下降。
3、傷口愈合實驗在體外可以通過劃線愈合實驗來證明遷移能力的變化，具體做法是轉染pAmotl2dPDZ-GFP、pAmotl2-GFP或pEGFPN3之前，在基本長滿HEK293T細胞的蓋玻片上用1ml吸頭在表面劃出“傷口”(細胞被除掉)，然后對整個蓋玻片上的細胞進行轉染(氯化鈣沉淀法)，轉染后36小時對傷口上熒光細胞進行計數來對比遷移能力的變化。結果如圖4所示，圖4中，上面一排照片為轉染含有缺失C末端78個氨基酸的AMOTL2dPDZ編碼基因的pAmotl2dPDZ-GFP的結果，中間一排的照片為轉染含有全長的AMOTL2編碼基因的質粒pAmotl2-GFP的結果；最下面一排的照片為轉染空載體pEGFPN3的結果；右側兩個箭頭之間的寬度表示轉染前劃線的位置。圖4表明轉染含有缺失C末端78個氨基酸的AMOTL2dPDZ編碼基因的pAmotl2dPDZ-GFP的細胞愈合程度非常有限，而轉染含有全長的AMOTL2編碼基因的質粒pAmotl2-GFP和空白的GFP載體pEGFPN3的基本完全愈合。
按照上述方法，用pAmotl2dPDZ-GFP、pAmotl2-GFP或pEGFPN3分別轉染用1ml吸頭劃出“傷口”(細胞被除掉)的人胚腎細胞293T和猴的cos7細胞蓋玻片，轉染后36小時觀測傷口上細胞的數目，這里使用了機械式計數器，結果如圖5所示，表明無論在人胚腎細胞293T還是在猴的cos7細胞中，缺失C末端78個氨基酸的AMOTL2dPDZ都會抑制細胞的遷移，而全長的AMOTL2能促進細胞的遷移。圖5中，GFP vector表示轉染pEGFPN3的結果，Amotl2dp-GFP表示轉染pAmotl2dPDZ-GFP的結果，Amotl2-GFP表示轉染pAmotl2-GFP的結果；左側一組表示的是在293T細胞中的結果，右側一組表示在cos1細胞中的結果。
4、細胞骨架染色實驗為了闡明AMOTL2的表達下降影響細胞遷移的原因，以及檢測缺失了C末端78個氨基酸的AMOTL2dPDZ是否真正競爭性的抑制野生型的AMOTL2，需要監測細胞骨架的變化。體內實驗的具體步驟是將分別注射了Amotl2-MO2、cMO(注射劑量均為6皮克)的中囊胚時期的斑馬魚胚胎用多聚甲醛固定20分鐘，PBS溶液清洗至少兩遍，再用0.1％的Triton X-100處理3-5分鐘，10mg/ml的BSA溶液封閉20分鐘，清洗后在Eppendorf管中加入1微升0.5mg/ml的phalloidin-TRITC染料染色，多次清洗后壓片，共聚焦顯微鏡拍照。phalloidin可以特異性地和f-actin結合，實驗結果如圖6所示，表明Amotl2-MO2注射的胚胎細胞骨架出現了明顯的空洞(B和D所示)，而注射cMO作為對照的A和C圖則顯示了豐富而均一的纖維化actin(f-actin)。說明AMOTL2的表達下降影響了細胞遷移。
用pAmotl2dPDZ-GFP和pAmotl2-GFP分別轉染Hela細胞后，按照上述方法進行處理，Hela細胞與整胚的區別僅僅在于將Eppendorf管換成裝有細胞生長玻片的六孔板，而且無須壓片，直接封閉玻璃片即可。檢測結果如圖7所示，左側圖片為轉染pAmotl2-GFP的結果，表明細胞骨架f-actin在轉染pAmotl2-GFP的細胞中呈現清晰的纖維狀分布；右側圖片為轉染pAmotl2dPDZ-GFP的結果，表明轉染pAmotl2dPDZ-GFP的細胞中f-actin總量明顯減少，而且排列發生了明顯的紊亂。說明前面闡述的細胞遷移的影響是因為細胞骨架受到了破壞，細胞失去了遷移應該依托的腳手架結構，這里的f-actin正是發揮了這種腳手架的功能。所有顯示的比例尺都是10微米。
序列表<160>3<210>1<211>2166<212>DNA<213>斑馬魚(Danio rerio)<400>1atgagaacgg cagaggaatc atcaggaacg gtgctgcacc gactgattca agagcagctt 60cgttatggaa accctaccga tcctactctg ttagccatcc agcagcaggc tctgcgtgga 120ggcagcagcg gtggaggtgc aggaagccct cgttcatcct tggaaagcct aacacaagag 180gaatcacttt ctccccagtt gtccgcccgg caagagcccc agggccaaga gcaccagggt 240gacttccagc attcagagag tcctgtttgt cacctttatc agctccacac agaggagctg 300cctacttatg aggaagcaaa ggcacactca cagtatcttg cctaccagag aggacagata 360gggcttcatc acggcagtct ggagagccct ggaggggttg gaggagccga acaggacgac 420agcatgtggg atgcgaaacg agagcatgca cgctcactaa gtgagcgtct tttgcaactc 480tcactagaga gaaattgtgc ccatgacaat attcccatga gctcatcgca tagttatccc 540caactctcta ataaccactc tgatacagtt gtgaatgagc agtcagttca tcagccagac 600caacggggtc ctcccccgga gtaccccttc atggtcagat cccctggata tatgcttagt 660cattcacagg aacatggaca ctattataat gagccccctc ctgccttcca ttcacagcat 720tacaggctat ttccaacaca gccacaagca cctcgtcaca atggcctgcc cacattgacc 780cctgctggcc aggatgtcaa tgttggagga tacagcatcc cagcgaacaa cttccaaatg 840gagcagctta ttaaagagaa cgaaagactg aaaagagaag tggacagcta cagtgagaag 900gcggcaaggt tacagaagct tgaacaggag attcagagga tatcggaggc ctatgagact 960cttatgaagg gatctgcaaa gagagaagcc cttgagaaaa ccatgaggaa caagctagag1020agtgagatca agcgacttca tgactttaac agagatctca gggaccgcct ggaaacagcc1080aacaaacaga gagcagccat tgaagttgaa gacaagagtc ggcatgcctt cgccaaactg1140gttgagcaaa atgaggacca tcttcgagag cgggaacgtc tggaaaaaga gacacagcat1200ctaagggcct caggagaaga atggaagagg cgtcgtgaag ccttggagca agcacttatc1260acagctcaga cacgaaatag gcagctggaa gaagagttac gtaggaagag agcttatgtg1320gagaaggtgg aaaggatgca gagtgcattg gcgcaattgc aggcagcatg tgagaagagg1380gaagcactgg agttacgact tagaaccaga ctggagcagg agctgaagag tttgagagca1440cagcagtggc aggcccaaac ccagcatgca agcccagggt catacttgga ccttaatgta1500tcatcactac agcagcaact gagggagaga gaggagcagg ttttggccct ggaggctgac1560atcacccgct gggagcagaa gtatcttgag gagagcacaa tgcgtcagtt tgccatggat1620gctgctgcta ctgccgcagc tcagagggat accacaatca tcaaccattc accccgcaat1680tcacccaaca gcagcttcaa tgaggatttg ccgtccccca accacaggca tcaggagatg1740
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權利要求
1.一種細胞遷移相關蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與細胞遷移相關的蛋白質。
2.權利要求1所述的細胞遷移相關蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述細胞遷移相關蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述細胞遷移相關蛋白的基因組基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權利要求2、3或4所述細胞遷移相關蛋白編碼基因的表達載體。
6.含有權利要求2、3或4所述細胞遷移相關蛋白編碼基因的細胞系。
7.含有權利要求2、3或4所述細胞遷移相關蛋白編碼基因的宿主菌。
8.權利要求2、3或4所述細胞遷移相關蛋白編碼基因在構建轉基因細胞模型中的應用。
9.權利要求2、3或4所述細胞遷移相關蛋白編碼基因在構建轉基因動物模型中的應用。
10.權利要求1所述的細胞遷移相關蛋白及其編碼基因在制備預防和/或治療與細胞遷移有關疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種細胞遷移相關蛋白及其編碼基因與應用。該細胞遷移相關蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與細胞遷移相關的蛋白質。本發明的細胞遷移相關蛋白的編碼基因可用于構建轉基因細胞模型和轉基因動物模型，進行篩選預防和/或治療與細胞遷移有關疾病的藥物。本發明的細胞遷移相關蛋白及其編碼基因也可用于制備預防和/或治療與細胞遷移有關疾病的藥物。同時，也可在斑馬魚中利用組織特異性的啟動子得到特定組織表達該細胞遷移相關蛋白的轉基因斑馬魚，從而進行更精細的發育生物學研究。
文檔編號C12N1/21GK1793175SQ200610000498
公開日2006年6月28日 申請日期2006年1月5日 優先權日2006年1月5日
發明者孟安明, 黃慧哲, 曹瑩 申請人:清華大學