細胞色素p450基因遺傳變異的檢測芯片及其應用的制作方法

專利名稱：細胞色素p450基因遺傳變異的檢測芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物基因檢測芯片，尤其涉及一種與人體藥物代謝相關的細胞色素P450基因遺傳變異的檢測芯片及其應用。
背景技術：
長期以來，臨床醫生往往根據藥物的臨床試驗，對同一種疾病按照相同的劑量服用同樣的藥物，或根據臨床經驗對劑量做出稍微的調整。在臨床的疾病治療中，經常出現相同的藥物治療同一病癥的不同病人時，產生大相徑庭的療效，甚至有些病人發生嚴重的副作用或無反應，除造成巨大的浪費之外，有時則直接耽擱了疾病的及時治療，延誤病情。每年因藥物不良反應以及藥源性疾病造成的死亡率和相應衛生資源花費極其驚人，美國每年在這方面的費用達到1360億美元。這種對藥物的個體差異成為困擾臨床用藥和制藥廠研制新藥的難題。不同個體對于藥物治療反應的殊異可由多種因素造成，并產生不同的相應后果。其中20-95％藥物處置和效應差異由遺傳因素所致，涉及藥物靶體基因、藥物代謝酶基因、藥物轉運相關基因、DNA修復酶基因以及一些輔基合成酶基因等[Kalow W，Tang BK，Endrenyi I.Hypothesiscomparisonsof inter-and intra-individual variations can substitute for twin studies indrug research.Pharmacogenetics，1998，8283-9.]。這些基因中的遺傳變異是形成藥物療效產生個體差異的基礎，主要是一些單個堿基的改變即單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)的遺傳變異。其他影響因素尚有年齡、性別、疾病以及環境因素。
藥物在體內的代謝過程由各種酶來參與完成。催化I相藥物代謝的酶主要是細胞色素P450酶系(CYP)，具有顯著意義遺傳多態性的酶包括CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A5等；催化II相藥物代謝的酶主要有硫嘌呤甲基轉移酶(TPMT)、N-乙酰基轉移酶(NAT)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等。這些與人體內藥物代謝相關的酶，至少可分為30多個家族[Evans WE，Relling MV.Pharmacogenomicstranslating functional genomics into rational therapeutics.Science，1999，286487-91；Ingelman-Sundberg M，Oscarson M，McLellan RA.Polymorphic humancytochrome P450 enzymesan opportunity for individualized drug treatment.Trends Pharmacol Sci，1999，20342-9.]。其中CYP酶系為人體內代謝藥物的主要酶系統，約有50％藥物主要是經CYP酶系代謝的，CYP基因多態性以及對藥物代謝的影響，也是藥物遺傳學研究的最早對象之一。
在I相藥物代謝中，約有40-45％的藥物是由CYP3A4所催化[Ingelman-Sundberg，M.Pharmacogenetics of cytochrome P450 and its applications in drug therapythe past，present and future.Trends Pharmacol Sci.2004，25193-200.]，這些藥物包括乙酰氨基酚、卡馬西平、洛伐他汀、硝苯地平等。雖然在CYP3A4基因至今已發現了不少的遺傳變異，但更為重要的是功能性變異至今尚未在高加索和中國人中發現，并且CYP3A4和CYP3A5底物特異性有重疊。CYP3A4和CYP3A5同屬CYP3A家族，CYP3A底物清除方面的個體差異主要是由于CYP3A5的多態性表達所造成。CYP3A5代謝的藥物種類很多，但在人群中喪失表達有功能的CYP3A5的頻率較高，主要表現為多態性表達。現已清楚，CYP3A5基因表達水平的喪失是由于第3個內含子中的一個SNP(A→G)所致，該SNP使得CYP3A5基因產生了異常剪切，引起翻譯提前終止，產生無功能的CYP3A5截短蛋白[Kuehl P，Zhang J，Lin Y，Lamba J，Assem M，Schuetz J，Watkins PB，Daly A，Wrighton SA，Hall SD，Maurel P，Relling M，BrimerC，Yasuda K，Venkataramanan R，Strom S，Thummel K，Boguski MS，Schuetz E.Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the geneticbasis for polymorphic CYP3A5 expression.Nat Genet，2001，27383-91.]。并且異常剪切產物穩定性較差，易于被快速降解，這也可以解釋AA純合者為何CYP3A5表達水平低下。帶有該SNP的G等位基因的CYP3A5為CYP3A5*3。CYP3A5*3的頻率在高加索人、亞洲人和非洲人中的頻率分別是88％，75％和35％。
CYP2D6代謝藥物的種類僅次于CYP3A4，與大約25％已知藥物的代謝有關，包括異喹胍、丙咪嗪、氯氮平、β-腎上腺素受體阻滯藥等[Ingelman-Sundberg.Geneticpolymorphisms of cytochrome P450 2D6(CYP2D6)clinical consequences，evolutionary aspects and functional diversity.Pharmacogenomics J.2004，56-13]。如果病人CYP2D6基因發生突變就會對降壓藥異喹胍產生明顯的副作用，大約3％~10％的高加索人缺乏該酶基因的活性，在東方人中約占1％～2％[Bertilsson L，Dahl ML，Dalen P，Al-Shurbaji A.Molecular genetics of CYP2D6clinicalrelevance with focus on psychotropic drugs.Br J Clin Pharmacol.2002，53111-22.]。這種CYP2D6酶活性缺乏者稱為慢代謝型(poor metabolizer，PM)，由于藥物不能被代謝，容易產生副作用，或藥物前體不能被有效地轉為活性成分，導致治療失敗。正常人的兩條22號染色體上的CYP2D6基因都正常，其代謝類型為快代謝型(extensive metablizer，EM)。而中間代謝型(intermediate metablizer，IM)者并不缺乏CYP2D6，只是由于基因突變導致CYP2D6活性較正常人為低。在中國人群中，最為常見的基因型是CYP2D6*10(由于第一個外顯子中第100位核苷酸C→T的改變所致)，頻率為51-70％[Ji L，Pan S，Marti-Jaun J，Hanseler E，Rentsch K，HersbergerM.Single-step assays to analyze CYP2D6 gene polymorphisms in Asiansallelefrequencies and a novel *14B allele in mainland Chinese.Clin Chem.2002，48983-8.]。超快代謝型(ultrarapid metablizer，UM)者往往是由于攜帶有多個拷貝的有功能的CYP2D6基因所致，因此UM患者服用經CYP2D6代謝的標準劑量的藥物，將不能達到有效治療效果。UM分布頻率可從瑞典人群中的2％到埃塞俄比亞人群中的30％，但在亞洲人群中頻率較低。根據個體CYP2D6代謝型不同，需要對常規用藥劑量做調整，以獲得可以接受的藥物療效及安全性，這在精神類藥物中研究的較為明確[Kirchheiner J，Nickchen K，Bauer M，Wong ML，Licinio J，Roots I，BrockmollerJ.Pharmacogenetics of antidepressants and antipsychoticsthe contributionof allelic variations to the phenotype of drug response.Mol Psychiatry，2004，9442-473.]。迄今發現的CYP2D6的變異已超過80多種，涉及單個堿基改變、短片段插入/缺失、基因部分缺失，甚至整個基因的缺失和重復，是CYP450超基因家族中多態性最高的。
CYP2C9是一種重要的藥物代謝酶，參與臨床上大約10％的常用藥物的代謝，以及多種內源性物質的體內轉化[Xie HG，Prasad HC，Kim RB，Stein CM.CYP2C9 allelicvariantsethnic distribution and functional significance.Adv Drug Deliv Rev.2002，541257-70；Lee CR，Goldstein JA，Pieper JA.Cytochrome P450 2C9polymorphismsa comprehensive review of the in-vitro and human data.Pharmacogenetics.2002，12251-63.]。常見的藥物有華法林、苯妥英、甲苯磺丁脲、苯妥因、丙咪嗪、氟伐他丁及一些非甾體類抗炎藥(如雙氯滅酸、布洛芬)等。CYP2C9有一些功能性SNP，能導致酶活性的顯著改變。在高加索人群中，CYP2C9*2和CYP2C9*3是CYP2C9的兩種常見等位基因，分別位于外顯子3和外顯子7，造成第144位精氨酸→半胱氨酸和第359位異亮氨基酸→亮氨基酸的改變。CYP2C9*2和CYP2C9*3的酶活性低于CYP2C9*1(野生型)，因此CYP2C9*2和CYP2C9*3純合子、CYP2C9*2/CYP2C9*3雜合子者是慢代謝型，占總人數的4％，對華法林等抗凝藥物非常敏感，相對于擁有CYP2C9*1的人來說，他們只需要很小的劑量即可。在東方黃種人中，發生率最高、最為常見的基因型式CYP2C9*3，頻率約為3％，而其他遺傳變異在黃種人中十分罕見或不存在。
CYP2C19與CYP2C9同屬CYP2C家族，是重要的P450酶，具有明顯的遺傳多態，能催化許多臨床藥物，包括奧美拉唑、安定、環己巴比妥、普萘洛爾等。目前至少已確定6種有缺陷的等位基因。如果個體帶有CYP2C19的多態性基因，在代謝奧美拉唑時，失活的酶會導致血藥濃度過高，增加藥物反應。CYP2C19基因缺陷的人，對甲妥英、環己烯巴比妥等藥物高度敏感。有12％-23％的亞洲人無CYP2C19或活性很低，故這些人群為慢代謝型，而白種人和黑人僅3％-5％無CYP2C19或活性很低，故這些人群為快代謝型。在日本人的慢代謝型個體中，70％為CYP2C19*2，其次為CYP2C19*2。CYP2C19*3是亞洲人的特征性基因型[Nagata K，Yamazoe Y.Genetic polymorphism ofhuman cytochrome p450 involved in drug metabolism.Drug Metab Pharmacokinet.2002；17(3)167-89.]。在日本人中，約有1/5為慢代謝型，質子泵抑劑奧美拉唑(活賽克)和普奈活爾(心得安)在體內難以代謝。慢代謝型和快代謝型個體的血藥濃度可相差7倍之多，這也不難理解為何在日本人群中這兩種藥物的不良反應較多。
CYP基因的多態性是造成個體對藥物治療反應的差異的主要原因之一，因此若能將藥物遺傳學的研究結果應用于疾病治療，通過檢測患者的CYP基因的遺傳變異，使臨床醫生獲得病人的遺傳信息，以判斷哪些藥物治療有效，有針對性地使用藥物和劑量，有效地提高藥物的療效和降低藥物的毒副作用，從而有望大幅降低醫療費用。而對于醫藥企業，根據藥物遺傳學和藥物基因組學的信息，以及藥物靶點和藥物代謝的途徑，選擇合適的臨床試驗的人群，以提高藥物對疾病治療的療效，降低藥物的無效率和毒副作用，縮短藥物的研究與開發的周期，提高藥物的臨床批準率；根據本國人的遺傳結構，進行藥物衍生物或同類藥物開發。
由于CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A5等CYP基因在各群體中的等位基因型分布已研究的較為清楚，并且發現一種新的功能性遺傳變異的概率是非常小的，因此完全可以利用現有的藥物遺傳學研究結果，對CYP基因的功能性或標記性遺傳變異進行檢測即可。其他一些單個堿基變異和短片段的插入/缺失，基本都可用一些常規的單核苷酸多態性分型方法檢測，主要方法包括限制性酶切片段長度多態性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、等位基因特異性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、等位基因特異性錯配引物法、侵入切割、單堿基延伸SNaPshot和基因芯片。CYP2D6基因的缺失和重復除了RFLP外，還可用特殊的PCR方法和定量檢測[Johansson I，Lundqvist E，Dahl ML，Ingelman-SundbergM.PCR-based genotyping for duplicated and deleted CYP2D6 genes.Pharmacogenetics.1996，6351-5.Schaeffeler E，Schwab M，Eichelbaum M，Zanger UM.CYP2D6 genotyping strategy based on gene copy number determinationby TaqMan real-time PCR.Hum Mutat.2003，22476-85.]，(1)限制性酶切片段長度多態性(RFLP)檢測技術這是于80年代后期首先建立的對CYP基因的多態性進行檢測的DNA分析技術[Newton CR，Graham A，Heptinstall LE，Powell SJ，Summers C，Kalsheker N，SmithJC，Markham AF.Analysis of any point mutation in DNAThe amplificationrefractory mutation system(ARMS).Nucleic Acids Res.1989，172503-2516；Orita M，SuzukiY，Hayashi K.Rapid and sensitive detection of point mutationsand DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction.Genomics.1989，5874-879.]。個體間細胞色素P450酶系活性差異是由其編碼基因的堿基序列不同、基因缺失或重復所導致。這種堿基順序的差別造成限制性內切酶識別位置及酶切位點數目的不同，從而產生數量和長度不一的DNA酶切片段。用特異性探針對整個基因組DNA酶切片段進行雜交，即可分析限制性長度片段多態性(RFLP)。一定的內切酶組合所得到的RFLP可以和傳統方法測定的代謝類型相關。80年代末發展起來的PCR技術已被用于RFLP分析，即用等位特異限制酶裂解PCR擴增的片段，然后再進行分析，從而大大提高了靈敏度。其缺點是獲得完整的CYP基因的遺傳變異的分型至少需要幾天的時間，若需要分析的基因越多，遺傳位點也越多，則可能需要一周以上的時間。并且直接利用基因組DNA進行RFLP，探針的放射性標記使得該技術只能在少數實驗室中進行。
(2)等位基因特異性聚合酶鏈反應(ASPCR)
等位基因特異性聚合酶鏈反應是根據各等位基因的核苷酸序列，設計出一套針對每一等位基因特異性的(allele-specific)、或組特異性(group-specific)的引物，此即為序列特異性引物(SSP)。SSP只能與某一等位基因特異性片段的堿基序列互補性結合，通過PCR特異性地擴增該基因片段，從而達到分析基因多態性的目的[Ji L，Pan S，Marti-Jaun J，Hanseler E，Rentsch K，Hersberger M.Single-step assaysto analyze CYP2D6 gene polymorphisms in Asiansallele frequencies and a novel*14B allele in mainland Chinese.Clin Chem.2002，48983-8；Hiratsuka M，Agatsuma Y，Omori F，Narahara K，Inoue T，Kishikawa Y，Mizugaki M.Highthroughput detection of drug-metabolizing enzyme polymorphisms byallele-specific fluorogenic 5’nuclease chain reaction assay.Biol Pharm Bull.2000，231131-5.]。該方法的缺點是每個反應只能對一個位點進行檢測，通量水平低下，并且易于產生假陽性結果。
(3)等位基因特異性錯配引物法等位基因特異性錯配引物法[Ishiguro A，Kubota T，Soya Y，Sasaki H，YagyuO，Takarada Y，Iga T.High-throughput detection of multiple geneticpolymorphisms influencing drug metabolism with mismatch primers inallele-specific polymerase chain reaction.Anal Biochem.2005，337256-61.]是通過在等位基因特異性引物的3’端第2位堿基對上引入錯配堿基來區分野生型和突變型的序列。除此以外，還在3’端第3位堿基對上引入錯配堿基以提高ASPCR在分型突變類型為點突變的突變基因型時的特異性。該方法不僅能分型點突變，而且亦能分型CYP2D6基因的結構性改變，包括缺失和重復。但其缺陷亦是不能多重水平分型，通量水平較為低下。
(4)侵入切割侵入切割是依據FEN酶的酶切特性來設計一條侵入探針(與多態位點3’端序列互補，錯配的3’末端堿基與SNP重疊)和兩條SNP等位基因特異性探針(含有與多態位點及其5’端序列互補的序列)，將多態性位點置于侵入探針和等位基因特異性探針之間的重疊處[Olivier M.The Invader assay for SNP genotyping.Mutat Res.2005，573(1-2)103-10；Nevilie M，Selzer R，Aizenstein B，Maguire M，HoganK，Walton R，Welsh K，Neri B，de Arruda M.Characterization of cytochrome P4502D6 alleles using the Invader system.Biotechniques Suppl.2002，34-8，40-3.]。正確的重疊結構僅在侵入探針和完全匹配的等位基因特異性探針間形成，而非單堿基錯配的探針。這樣等位基因特異性探針的5’端就如同在侵入探針的侵入下而呈翼狀探出，進而被FEN酶切下。等位基因特異性探針被切割后，導致5’端的熒光基團和內部的淬滅基團分離，從而產生熒光信號。所設計的侵入探針在檢測溫度中與靶核苷酸序列保持結合狀態，而等位基因特異性探針的退火溫度與反應溫度非常接近，使得等位基因探針處于退火和分離的動態變化之中。一旦退火的等位基因特異性探針被FEN酶切割后，殘留的探針片段脫落離開后，新的未切割的等位基因特異性探針又可結合到同一位點上。這種設計在90分鐘內，每個靶核苷酸分子的切割率大約在3000個探針分子[Lyami chev V，Mast AL，Hall JG，Prudent JR，Kaiser MW，Takova T，Kwiatkowski RW，Sander TJ，de Arruda M，Arco DA，Neri BP，Brow MA.Polymorphismidentification and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavageof oligonucleotide probes.Nat Biotechnol.1999；17292-296.]，足夠不經靶序列擴增即可檢測。此方法的優點在于等溫反應，無需PCR擴增即可分型。然而由于CYP基因家族成員之間序列的高度同源性，需要預先擴增目的基因方能用于侵入切割檢測，并且無法做到多重水平，顯然對于多個SNP位點的分型，通量水平也較為有限。
(5)單堿基延伸SNaPshotSNaPshot的原理是預先擴增含靶SNP位點的核苷酸序列后，反應體系中未使用的PCR引物和游離的dNTPs同時分別被E.coli exonuclease I(ExoI)和ShrimpAlkaline Phosphatase(SAP)降解。然后加入另一條5’末端堿基緊鄰SNP位點的位點特異性引物和熒光標記的ddNTPs而非dNTPs。考慮到ddNTPs的結構，只有一個堿基才可以添加到引物上，而且與SNP位點配對。SNaPshot技術類似于測序試劑盒，只是在反應體系中只加入熒光標記的ddNTP，不加入dNTP，因此，測序反應只延伸一個堿基，反應結束之后，即可利用毛細管電泳和片段分析軟件分析這單個堿基。通過在每個SNP的位點特異性引物中引入長度填充片段，根據每個SNP位點特異引物長度的布通來區分SNP，達到多重水平的目的[Sistonen J，Fuselli S，Levo A，SajantilaA.CYP2D6 genotyping by a multiplex primer extension reaction.Clin Chem.2005，511291-5.]。其缺點是需要預先擴增CYP2D6基因，并且多重水平仍很有限，所能分型的CYP2D6基因非常有限。
(6)基因芯片2004年9月，Roche與Affymetrix合作開發的基因分析芯片AmpliChip CYP450正式獲得了歐盟的核準，成為全球第一片針對人體藥物代謝基因CYP450的藥物基因檢測芯片產品[Kling J.Roche’s microarray tests US FDA’s diagnostic policy.Nat Biotechnol.2003，21(9)959-60.]。AmpliChip CYP450芯片擁有15,000點的核酸探針，可以用來檢測患者體內負責藥物代謝的CYP2D6和CYP2C19的基因型。這二個基因與目前大約25％的處方藥代謝有關，若能在臨床診斷之前給予檢測，將有助于醫療人員開立正確的處方用藥。此次Roche的AmpliChip CYP450基因檢測芯片能獲得歐盟核準，除了象征藥物基因組學已由研究跨入基因檢測之外，亦對基因芯片的產品開發開拓了新的應用商機。AmpliChip CYP450的主要缺陷是僅含CYP2D6和CYP2C19，所能分析的CYP450基因型仍屬有限。另一個P450基因芯片是CodeLink P450生物芯片，該芯片由通用電氣醫療集團(GE Healthcare)開發推出的，采用了等位基因特異性引物延伸(allele-specific Primer extension，ASPE)技術。盡管CodeLinkP450生物芯片能檢測9個CYP450基因的110種多態性，但是需要12個多重反應進行DNA制備，因此它的DNA制備方法多重水平低下，而顯得十分繁瑣，限制了它的實際應用。
快速、準確的基因多態性檢測對藥物的開發研究、藥物的毒理實驗、改善藥物的臨床實驗、監測藥物的有效性和安全性都具有重要的作用。檢測單個CYP基因的遺傳變異，由于所能分型的基因型有限，臨床檢測診斷的實用性較低。只有集合CYP超基因家族中多個重要基因的遺傳變異，盡可能分型所有功能相關基因型，方能對個體的代謝表型做出準確預測，達到臨床檢測診斷的目的。并且由于CYP基因的高度多態性，所涉及的遺傳變異在幾十至幾百不等，顯然傳統的檢測方法由于通量水平低，難以應用于個性化醫療中。為此，尋求一種高通量的基因篩檢方法尤為重要。與傳統檢測方法相比，基因芯片技術具有高通量，平行性和微量化等特點，可以同時對很多疾病相關基因或藥物效應相關基因進行檢測，避免了繁瑣而費時的常規基因分型，且這些特點使得醫務人員在短時間內便可以掌握患者大量的遺傳信息，有助于醫生及時找到正確的用藥方案，指導患者合理用藥。作為第一張藥物基因臨床檢測芯片，AmpliChipCYP450僅含CYP2D6和CYP2C19，所能分型的基因仍很有限。在I相藥物代謝中，約有40％的藥物是由CYP2C9、CYP2C19或CYP2D6代謝的。另一方面，盡管CYP3A4代謝的藥物種類最多，但由于缺乏功能性變異，以及與CYP3A5存在著廣泛的底物重疊，CYP3A5的多態性表達基本代表了CYP3A個體間的代謝差異。因此，CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5這四個基因所代謝的藥物種類，基本涵蓋了CYP基因超家族所代謝的藥物種類。檢測分型CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的遺傳變異，將至少能對40％以上的臨床常用藥物的治療效應做出預測，以達到個性化醫療的目的。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種細胞色素P450基因遺傳變異的檢測芯片，它能有效檢測分型CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的遺傳變異，對40％以上的臨床常用藥物的治療效應做出預測。
本發明要解決的技術問題之二是提供一種應用上述芯片檢測細胞色素P450基因遺傳變異的方法。
為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種細胞色素P450基因遺傳變異的檢測芯片，它包括固定在固相載體上的與待測細胞色素P450基因核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交的探針。
本發明中所述固相載體可選用領域周知的載體，只要所述載體與所述反應物相容，不會影響檢測結果就可以。優選的，本發明所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
所述待測細胞色素P450基因包括CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9和CYP3A5基因。
所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度是沒有限制的，只要能完成特異性雜交的功能，與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對之間的為最佳。所述探針的自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。如果所述探針中可能還有一定程度的錯配堿基，則所述探針可以加大長度來抵消錯配堿基的不利影響，以提高雜交效率。
本發明檢測芯片的探針為DNA，包括(1)與待測CYP2D6基因雜交的(a)SEQ IDNO1～SEQ ID NO76所示序列，(b)SEQ ID NO1～SEQ ID NO76所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO1～SEQ ID NO76所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(2)與待測CYP2C19基因雜交的(a)SEQ ID NO77～SEQ ID NO94所示序列，(b)SEQID NO77～SEQ ID NO94所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO77～SEQ IDNO94所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(3)與待測CYP2C9基因雜交的(a)SEQ ID NO95～SEQ ID NO112所示序列，(b)SEQ ID NO95～SEQ ID NO112所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO95～SEQ ID NO112所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(4)與待測CYP3A5基因雜交的(a)SEQ ID NO113～SEQ ID NO163所示序列，(b)SEQ ID NO113～SEQ ID NO163所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO113～SEQ ID NO163所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。
優選的，本發明檢測芯片的探針選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO163所示序列。
所述探針序列可包含1～10個錯配堿基，較佳地，可包含1～5個錯配堿基，更佳地，可包含1～2個錯配堿基。
本發明檢測芯片還包括至少一種對照探針，所述對照探針選自陰性對照探針、陽性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針。
本發明檢測芯片可使用任何適當的陰性對照探針，所述陰性對照探針最好能與陽性對照探針有1～5個堿基對的錯配。
本發明檢測芯片可使用任何合適的陽性對照探針，所述陽性對照探針最好能與目的核苷酸序列、以目的核苷酸序列為模板擴增產生的核苷酸序列或人工合成的核苷酸序列的一部分互補。
本發明檢測芯片可使用任何適當的雜交對照探針，所述雜交對照探針最好與人工合成的跟目的基因無關的核苷酸序列互補，也可與一段人工合成的經標記的序列互補或與一段人工合成的經標記的序列有1～10堿基對的錯配。
本發明檢測芯片可使用任何適當的固定化對照探針，它是芯片表面化學修飾、點樣和固定化過程的內部對照，它不與任何核酸序列雜交。固定化對照探針可一端進行化學修飾，另一端帶有可檢測的標記。
本發明檢測芯片所用到的芯片可包含任何一條、部分或全部陽性對照探針、陰性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針。這些對照探針可用任何排布方式固定于芯片上，如可被排布在芯片的四角、中心等進行有規律的排布或隨機排布。
所述探針可用多種方法固定于載體上，如點樣法(USA Patent No.5288514，USAPatent No.5556752)、光介導法(USA Patent No.5143854，5384261和5561071)、磁珠法(USA Patent No.5541061)等。所述探針可以通過化學或物理的方法，固定于載體上，如通過離子鍵、共價化合或其它已知的力吸附在載體上，如可用紫外交聯儀將所述探針固定于載體上。
所述探針可通過連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提供一個自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應的進行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28e66；USA Patent No.5556752]。連接臂越長，雜交效率越高。典型的連接臂包括15～30個功能基團長度。連接臂可以選用適當形式的功能基團，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與Poly T(A、C或G)的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。
所述探針或連接臂通過連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過C-C鍵實現，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時使用)。硅氧烷鍵鍵合可以通過支持物和連接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基團反應完成。氨基烷基硅烷、輕基烷基硅烷、2-輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團。
所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5’-NH2修飾、5’-SH修飾、5’-Poly T(A、C或G)修飾、5’-生物素修飾、3’-NH2修飾、3’-SH修飾、3’-Poly T(A、C或G)修飾和3’-生物素修飾等。
所述探針可以有一條或幾條，甚至全部都是經過標記的，所述標記選自熒光素標記、酶標記、放射性元素標記、發光標記、化學標記和熒光共振能量轉移標記。
在本發明的另一方面，提供了一種應用上述芯片檢測細胞色素P450基因遺傳變異的方法，包括如下步驟(1)從合適樣品中抽提待測細胞色素P450基因的核酸；(2)待測細胞色素P450基因目的核苷酸序列的制備；
(3)標記步驟(2)的目的核苷酸序列；(4)選取權利要求1所述的芯片，在適于與所選芯片進行雜交的條件下，加入經標記的目的核苷酸序列，并使其反應足夠時間；(5)檢測雜交反應的結果。
本發明的方法中所述合適樣品包括來自于人類和動物的血液、唾液、毛發及其它任何含有核酸的組織、以及來自植物和環境產物(如泥土或水)的樣品。
樣本的核酸能用任何合適的方法從樣品中被抽提出來。例如，樣本核酸能用磁珠從樣品中抽提出來，很多生物公司能提供核酸抽提的試劑盒，如Qiagen，Invitron等。
由于技術的進步，現在已可以不經核酸抽提，直接用靶樣本中的含核酸的細胞進行擴增。靶樣本的含核酸的細胞能用任何合適的方法從樣品中被抽提出來。例如，靶樣本中含核酸的細胞能用磁珠從樣品中分離出來。
所述目的核苷酸序列的制備可包括擴增的步驟，用分離的靶樣本中含核酸的細胞直接擴增，也可用抽提的靶核酸直接擴增。如用磁珠從全血中分離白細胞，直接用分離的白細胞或用全血抽提的核酸作模板，擴增目的核酸序列。擴增得到的單鏈或雙鏈的DNA或RNA可含有熒光或生物素標記，標記的DNA或RNA可不經純化直接用于雜交。與本發明中所述芯片雜交的優選靶核苷酸分子是單鏈核酸分子，雙鏈核酸分子經過變性等處理后也于本發明所述芯片雜交。
目的核苷酸序列可使用任何適當的擴增方法進行富集，如聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，連接酶鏈反應(ligase chainreaction，LCR)，滾環擴增(rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，鏈置換擴增(stranddisplacement amplification，SDA)和轉錄介導的擴增(transcription medicatedamplification，TMA)等。TMA方法最好使用T7啟動子。
單鏈DNA可使用不對稱PCR獲得。不對稱PCR中兩條引物可以是任何適當的比例，比如從1∶3到1∶200。不對稱PCR中兩條引物可以有相同的或者不同的Tm值，例如兩引物的Tm值的差異可以是1℃到20℃。不對稱PCR也可以使用三條引物，兩條有相同或相近的Tm，另一條相差范圍1℃到20℃。引物可以是直鏈或帶有發卡結構。可使用單一或組合的退火溫度。例如不同的退火溫度可以相差1℃到20℃。有較低的Tm值的引物可以用于雙鏈的擴增，另一條有較高的Tm值的引物可以在有一定雙鏈后擴增單鏈DNA。通過這種PCR過程產生的單鏈目的核苷酸可以不經過純化直接用于雜交。
單鏈RNA也可以通過TMA方法得到。含有一個T7啟動子的引物使用RNA聚合酶用于擴增。用單鏈DNA或RNA雜交，避免了用雙鏈所帶來的PCR產物的純化和變性以及雜交信號弱或丟失的問題。
只要用于雜交的目的核苷酸序列的長度足夠以產生特異性雜交，所述目的核苷酸序列長度在上下游方向上并無限制。合適的目的核苷酸序列長度從30到200堿基對長度。雜交用的靶核苷酸序列過長或過短，會影響雜交效率，并使得雜交在探針上的靶核苷酸序列易于被洗脫下來，導致熒光信號過弱或丟失。較長的DNA片段，可用DNase I進行片段化處理，或者在反應體系中加入適當比例的脫氧尿嘧啶，然后PCR產物用尿嘧啶DNA糖苷酶處理，片段化DNA片段。至于RNA，處理方法較為簡單，直接用高鹽和高溫處理即可。
在本發明的一個實施例中，目的核苷酸序列的制備采用PCR擴增方法，該方法所用引物含有(a)SEQ ID NO164～SEQ ID NO193所示序列的核苷酸鏈，(b)SEQ IDNO164～SEQ ID NO193所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO164～SEQ IDNO193所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。
優選的，本發明的引物序列為SEQ ID NO164～SEQ ID NO193所示序列的核苷酸鏈。
所述探針和目的核苷酸序列之間的雜交可同源，也可非同源。
所述探針或目的核苷酸序列都適合用于標記。探針在合成引入標記，目的核苷酸序列可以在擴增中引入標記，或者擴增后用合適的方法引入標記。
合適的標記包括熒光標記、放射性同位素標記、發色團、發光體、FRET、酶、生物素或有特殊結合配體的配基。
本發明方法的雜交可以在任何雜交液中進行，如含有SSPE和表面活性劑的雜交液。雜交液可以含有任何濃度的SSPE，例如1～10×SSPE。也可以使用任何適當的表面活性劑，如Triton-100，SDS，SLS(十二烷基肌氨酸鈉)，CTAB(六烷基三甲基溴化銨)等。雜交液中也可有任何濃度的表面活性劑，如0.01～1％(w/w)。所述的雜交可在任何適當的溫度下進行，如25℃～65℃，所述雜交時間為5分鐘～18小時。可以改變雜交條件以提高或降低雜交的嚴謹程度、雜交特異性。
所述雜交結果在檢測前的洗滌可使用任何適當的洗滌液，該洗滌液可含有0～3％(w/w)的表面活性劑，洗滌可持續適當的時間，如1～30分鐘。可以用室溫的洗滌液進行洗滌，或預熱后洗滌，如42℃。可用不同的洗滌液先后進行洗滌。
所述探針和目的核苷酸序列之間的雜交可以采用任何已知的方法進行檢測。根據標記的不同，可以選用合適的檢測方法，例如熒光標記的探針或目的核苷酸序列可以用激光掃描儀或熒光儀檢測，放射性元素標記的探針或目的核苷酸序列可以用放射自顯影檢測。
總體雜交特異性可以用任何適當的標準來確定，例如可按中國專利CN1566366A描述的方法來確定。
芯片的陽性信號可以用任何適當的標準來確定，例如可按中國專利CN1566366A描述的方法來確定，或以雜交信號大于平均背景噪音與3倍標準差之和的方法來確定。
本發明也可用于目的基因的拷貝數檢測。結合于芯片探針上的目的核苷酸序列的數量能夠被檢測，并且與目的基因的拷貝數相關。根據含有已知拷貝數的對照基因的核苷酸序列的數量可以對目的基因的拷貝數進行定量。熒光能用光電倍增管CCD或激光掃描探測。
本發明的細胞色素P450基因遺傳變異的檢測芯片及其應用，與傳統檢測方法相比，對基因篩檢具有高通量，平行性和微量化等優點，它能有效分型CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的遺傳變異，使醫務人員在短時間內便可掌握患者大量的遺傳信息，及時找到正確的用藥方案，指導患者合理用藥。


圖1是本發明的單對引物PCR擴增后的電泳檢測結果圖；圖2是本發明的多重PCR擴增后的電泳檢測結果圖；圖3是本發明PCR產物片段化后的電泳檢測結果圖；圖4是本發明檢測芯片的雜交結果圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。
實施例1 基因芯片的制備1.探針溶解每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10mM。將濃度為10mM的探針與濃度為200mM的PBS溶液于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，-20℃保存，以備點樣使用。
2.點樣將預先設計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質的固相載體片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型號的點樣儀，在濕度65-75％(以FullMoon片基為準)，溫度為25℃的條件下點樣，點樣的格式為1×3，每個矩陣為8×18，點樣完畢后，放置半小時后，將芯片取出，室溫干燥保存。
實施例2 待測樣品的處理和標記1.人基因組DNA抽提及目的基因的擴增采用FlexiGene DNA Kit(250)(QIAGEN，Cat.No.51206)試劑盒抽提人外周血中基因組DNA，具體步驟如下(1)將ACD(枸櫞酸8g/L，枸櫞酸鈉22g/L，葡萄糖24.5g/L)抗凝的外周全血混勻取1ml入15ml離心管，加入2.5ml緩沖液FG1，充分顛倒混勻；(2)2000g離心5分鐘，棄去上清。靜置2分鐘；(3)加入500ul緩沖液FG2/QIAGEN蛋白酶混合試劑，立即混勻，直至原有的沉淀完全消失；(4)65℃水浴10分鐘，40次/分勻速振蕩；(5)加入500ul 100％異丙醇充分混勻，直至出現可見的DNA絮狀沉淀；(6)3000g離心5分鐘，棄去上清，倒置2分鐘；(7)加入500ul 70％乙醇，振蕩；(8)3000g離心5分鐘，棄去上清，倒置約1小時，直至管內不再有水珠；(9)加入200ul緩沖液FG3溶解DNA，輕輕振蕩，溶解過夜；(10)將抽提溶解好的DNA移入高壓滅菌過的1.5ml離心管中，取1ul進行電泳(1％瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，EB，80MV，1.5小時電泳)，在FR-200紫外與可見分析裝置上拍攝照片，并對照marker(Lambda DNA/EcoRI+HindIII)進行定量。用于CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9和CYP3A5基因擴增的引物為SEQ ID NO164～SEQ IDNO191所示序列的核苷酸鏈。PCR擴增用30μl反應體系進行，反應體系是0.3mMdNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％ Q solution(Qiagen)、上游和下游引物的濃度0.16μM、基因組DNA 10ng，Taq酶0.6U(Takara)。應用Touch-downPCR反應程序[Don RH，Cox PT，Wainwright BJ，Baker K，Mattick JS.’Touchdown’PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic AcidsRes.1991，194008]94℃變性5min；94℃變性40s，64℃退火1min，每個循環降低0.5℃，72℃延伸50s，共10個循環；然后94℃變性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s，共30個循環；最后72℃延伸5min。PCR結束后用1.5％瓊脂糖凝膠檢測擴增結果，PCR產物的檢測結果如圖1所示，圖1中的PCR產物名稱和長度從左到右依次為CYP2D6P1是1184bp、CYP2C9P1是365bp、CYPA5P3是567bp、CYP3A5P2是639bp、CYP3A5P1是690bp、CYP2C19P2是400bp、CYP2D6P3是671bp、CYP3A5P4是393bp、CYP3A5P5是510bp、CYP3A5P7是668bp、CYP2D6P4是517bp、CYP2D6P2是1497bp、CYP3A5P6是473bp、CYP2C19P1是1732bp以及CYP2C9P2是914bp，與理論數值一致。
當進行多重PCR反應時，將SEQ ID NO164～SEQ ID NO191所示序列的引物放入一個反應體系中進行擴增，體系為50μl。多重PCR的反應體系為每種dNTP 0.3μmol/L，Tricine-KOH(PH8.7)40mmol/L，KCl 16mmol/L，MgCl23.5mmol/L，BSA3.75μg/ml，每條引物2μmol/L，DNA 80ng和2.2×Titanium Taq DNA聚合酶(ClontechLaboratories Inc.，USA)。多重PCR反應條件95℃變性3min；95℃變性30s，66℃退火2.5min，68℃延伸4min，共40個循環；最后68℃延長10min。PCR擴增后，取3μl PCR反應產物做瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果見圖2。這些PCR產物經處理后可用于下面的雜交步驟。
2.PCR產物純化和片段化每個樣品的所有PCR產物混合，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)純化，具體步驟如下(1)加入5倍PCR產物體積的緩沖液PB，混勻，無需去除石蠟油或煤油；(2)將QIAquick離心柱放置于試劑盒提供的2ml收集管子中；(3)將樣本加入QIAquick離心柱中，離心30-60s，以結合DNA；(4)倒掉2ml收集管子中的離心液體，將QIAquick離心柱放到原收集管子中；(5)將0.75ml緩沖液PE加入到QIAquick離心柱中進行洗滌，離心30-60s；
(6)倒掉2ml收集管子中的離心液體，將QIAquick離心柱放到原收集管子中，離心1min；(7)將QIAquick離心柱放置于高壓滅菌的1.5ml的離心管子中；(8)在QIAquick膜中央加入50μl緩沖液EB(10mM Tris-Cl，pH 8.5)或H2O以洗脫DNA，離心1min，為了提高DNA的濃度，可在QIAquick膜中央只加入30μl洗脫緩沖液，靜置1min，然后離心。
純化的PCR經測定濃度后，用DNase I進行片段化。片段化的反應體系包括 反應條件為37℃溫浴5min，然后95℃ 15min。片段化后的產物跑1.5％瓊脂糖凝膠，電泳檢測結果如圖3所示。
3.熒光素標記利用脫氧核苷酸轉移酶在3’末端進行熒光素標記，標記的反應體系包括 反應條件為37℃溫浴120min，然后95℃加熱15min。
實施例3 雜交、洗滌和結果檢測熒光標記的PCR產物95℃變性10min，立即置于冰上，用于雜交，雜交反應體系包括
反應條件為48℃溫浴120min，然后相繼用1×洗滌緩沖液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗滌緩沖液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗滌緩沖液III(1×SSC)在42℃各洗滌10min，最后用ddH2O洗滌0.5min。
洗滌后的芯片，經甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結果如圖4所示，再用GenePix Pro處理圖像得到數據文件，然后對數據文件進行分析就可以得到目的基因的基因型，圖4所示的分型結果是CYP2D6*10，CYP2C19*1，CYP2C9*1和CYP3A5*3。
序列表<110>上海生物芯片有限公司<120>細胞色素P450基因遺傳變異的檢測芯片及其應用<130>NP-10646<160>188<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1gcacgctacc caccaggcc 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2gcacgctact caccaggccc20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gcacgctacg caccaggccc20<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>4ctgccactgc ccgggctggg caacc 25<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列
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1.一種細胞色素P450基因遺傳變異的檢測芯片，其特征在于，它包括固定在固相載體上的與待測細胞色素P450基因核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交的探針。
2.如權利要求1所述的檢測芯片，其特征在于，所述待測細胞色素P450基因包括CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9和CYP3A5基因。
3.如權利要求1所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針為DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。
4.如權利要求3所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針為DNA，包括(1)與待測CYP2D6基因雜交的(a)SEQ ID NO1～SEQ ID NO76所示序列，(b)SEQID NO1～SEQ ID NO76所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO1～SEQ IDNO76所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(2)與待測CYP2C19基因雜交的(a)SEQ ID NO77～SEQ ID NO94所示序列，(b)SEQID NO77～SEQ ID NO94所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO77～SEQID NO94所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(3)與待測CYP2C9基因雜交的(a)SEQ ID NO95～SEQ ID NO112所示序列，(b)SEQ ID NO95～SEQ ID NO112所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO95～SEQ ID NO112所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列；(4)與待測CYP3A5基因雜交的(a)SEQ ID NO113～SEQ ID NO163所示序列，(b)SEQ ID NO113～SEQ ID NO163所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO113～SEQ ID NO163所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。
5.如權利要求4所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO163所示序列。
6.如權利要求1所述的檢測芯片，其特征在于，它還包括至少一種對照探針，所述對照探針選自陰性對照探針、陽性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針。
7.如權利要求1或3或6所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針可設有連接臂，且所述探針可被修飾。
8.如權利要求1或3或6所述的檢測芯片，其特征在于，所述探針可被標記，該標記選自熒光素標記、酶標記、放射性元素標記、發光標記、化學標記和熒光共振能量轉移標記。
9.如權利要求1所述的檢測芯片，其特征在于，所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
10.一種應用權利要求1所述芯片檢測細胞色素P450基因遺傳變異的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)從合適樣品中抽提待測細胞色素P450基因的核酸；(2)待測細胞色素P450基因目的核苷酸序列的制備；(3)標記步驟(2)的目的核苷酸序列；(4)選取權利要求1所述的芯片，在適于與所選芯片進行雜交的條件下，加入經標記的目的核苷酸序列，并使其反應足夠時間；(5)檢測雜交反應的結果。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述目的核苷酸序列為單鏈或雙鏈的DNA或RNA，優選單鏈DNA或RNA。
12.如權利要求10所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述目的核苷酸序列的制備包括PCR擴增反應，該反應所用引物含有(a)SEQ ID NO164～SEQ ID NO193所示序列的核苷酸鏈，(b)SEQ ID NO164～SEQ ID NO193所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO164～SEQ ID NO193所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述引物序列為SEQ ID NO164～SEQ ID NO193所示序列的核苷酸鏈。
14.如權利要求10所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述目的核苷酸序列的標記采用熒光素、生物素、放射性元素、酶或其它化學發光元素。
15.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的雜交溫度為25℃～65℃，雜交時間為5分鐘～18小時。
全文摘要
本發明公開了一種細胞色素P450基因遺傳變異的檢測芯片，該芯片包括固定在固相載體上的與待測細胞色素P450基因核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交的探針。本發明還公開了所述芯片用于檢測細胞色素P450基因遺傳變異的方法。本發明的檢測芯片能有效檢測分型CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的遺傳變異，對40％以上的臨床常用藥物的治療效應做出預測，以實現個性化醫療。
文檔編號C12Q1/68GK1912139SQ20061002900
公開日2007年2月14日 申請日期2006年7月17日 優先權日2006年7月17日
發明者盛海輝, 肖華勝 申請人:上海生物芯片有限公司