專利名稱：基于環狀介導等溫擴增技術的基因快速診斷方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術領域，具體地說，用基于環狀介導等溫擴增基因技術的體外生物檢測試劑快速檢測病原微生物的一種技術。
背景技術：
目前對致病微生物有多種檢測方法，從以病原微生物分離培養、形態學鑒定和自動生化鑒定為主的國家標準(GB/T 4789-2003)，到特異蛋白的免疫學檢測技術、核酸探針、聚合酶鏈式反應(PCR)技術等分子生物學檢測方法[陳福生等食品安全檢測與現代生物技術，化學工業出版社，2004年]。其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術試圖突破傳統的形態學、生化反應等微生物學檢測舊模式，不需要對微生物進行分離培養，而直接用樣品或樣品的增菌液對其基因及基因產物進行快速檢測，并且與分子生物學技術及生物信息學手段相結合，向準確、快速、靈敏和自動化的方向發展。
以聚合酶鏈式反應(簡稱PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在實際應用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光實時定量聚合酶鏈式反應(real time PCR)技術雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，因此，不適用于現場快速檢測；而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術中熒光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快速簡便成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以，及時將生物技術發展的最新成果應用于病原微生物檢測，具有重要意義。其中，等溫擴增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，現已建立起來的環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermal amplification of DNA，簡稱LAMP技術)在等溫條件下能夠特異性、高效、快速地進行核酸的擴增，具有很多的優越性，見文獻Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T， Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12)E63.。該方法通常是按如下步驟進行步驟一、對被檢標本進行預處理，快速提取被檢標本的DNA或RNA；步驟二、特異性引物的制備確定待測標本的靶基因后，取得特異性引物2對，內引物和外引物各一對；步驟三、進行環介導等溫擴增技術(LAMP)反應將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保溫0.5至1.5小時進行循環鏈置換反應；步驟四、分析判斷反應產物結果。雖然已公開的LAMP技術具有高靈敏性，能在等溫條件下高效地擴增核酸，但是現有技術也有不足之處，主要是1.其特殊引物要求極為苛刻限制該方法的廣泛應用；2.僅憑反應生成的乳白色沉淀物判斷結果，不夠清楚準確，也不易實現反應小型化，限制其進一步發展。為了克服這些缺點有必要對現有的LAMP技術進行改進。
發明內容
本發明的目的在于建立一種特異性強、靈敏度高、檢準率高的環狀介導等溫擴增基因技術檢測病原微生物的方法，廣泛應用于食品、藥品、醫療衛生等領域的檢測。
為達到本發明的目的所采用的技術方案為一種環介導等溫擴增基因快速診斷方法，包括如下步驟一、對被檢樣品的預處理用常規法快速提取DNA或快速提取RNA；二、特異性引物制備包括目標靶基因數據庫的建立；生物信息學的分析比較；基因組多態性的分型處理和簡并堿基的運用，從而獲得所需各種靶基因的特異性引物兩對，為內引物和外引物各一對，經DNA合成儀生成寡聚脫氧核苷酸引物，且分別與靶基因中的六個獨立區域序列特異性匹配；三、進行環介導等溫擴增反應將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保溫0.5至1.5小時進行循環鏈置換反應。
四、分析判斷反應產物結果在反應產物中加入熒光染料如市面銷售的熒光染料(SYBR GREEN I)，混勻，靜置5min，反應產物顯現綠色則為陽性，顯橙色則為陰性。
本發明所提供的環介導等溫擴增技術的基因快速診斷方法，有以下創新點1.特殊引物的設計原有LAMP的引物設計上條件非常苛刻，本發明運用生物信息平臺進行大規模基因組分析，引入簡并堿基和基因組分型處理，使引物設計更加完善。
2.樣品前處理根據待測樣品的不同提供與靶標配套的樣品前處理液和血樣分部離心收集程序，提高檢測靈敏度。
3.反應后加入染料，結果鑒定更為直觀清晰，避免了光線引起的誤差，在準確判結果的前提下，可大大縮小反應體積。
4.反應微型化，目前1升反應混合物可作80000次檢測，為進一步集成化、高通量和自動化開發奠定基礎，并且大大降低成本。
本發明的有益效果①.只需一恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備；②.高特異性應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，陽性率可達大于99.9％假陽性率小于0.1％；③.快速、高效擴增擴增在不到1小時即可完成，且產率高；④.靈敏度高用于病原微生物的檢測和傳染病的診斷中，對病毒類微生物最低檢測極限達到0.1PFU；對細菌類微生物最低檢測極限達到10CFU/ml；標本的檢出率達到99％；⑤.鑒定簡便通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其他任何分析步驟。⑥.用途廣，可廣泛用于食品、藥品、化妝品、及其它們的原輔料質量控制的安全快速檢測；可用于環境、水質等監測；可用于傳染性疾病等醫學臨床診斷，并可擴展應用于代謝性疾病和遺傳疾病的基因診斷。
下面提供具體實施例進一步闡述本發明的技術方案，但本發明的技術應用不限于實施例。
具體實施例方式
實施例1、大腸桿菌0157基因快速診斷法步驟一被檢樣品的預處理按常規法，大腸桿菌0157基因組DNA提取過程1、取50μl過夜培養的增菌液于eppendorf管中，1000rpm離心2分鐘，去上清2、加入80μl樣品預處理液于離心管中，與沉淀所得菌體混合均勻；3、沸水中煮10分鐘后立即置于冰上冷卻10分鐘；4、10000rpm離心2分鐘，上清即可作為待用的模板DNA步驟二特異性引物制備 試劑盒成分有1.引物外引物1TGCAGGGATCAGTCGTAC
外引物2AGATCATCCAGTGTTGTACG內引物1GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC內引物2TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA2.DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)3.反應液(含80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThermoPol Buffer，20μl 150mMMgSO4)4.樣品預處理液(含20mM Tris-HCl[pH 8.0]，2mM EDTA，1.2％TritonX-100)5.熒光染料(SYBR Green I)6.陽性對照(大腸桿菌0157基因組DNA)步驟三環介導等溫擴增(LAMP)反應1.在200ulPCR管配制反應體系引物混合物1.5μl，反應液5.75μl，BstDNA聚合酶0.5μl(8U)，模板DNA 2μl，加水至11.5μl。
2.將配制好的PCR管于65℃反應1.5小時。
步驟四分析判斷反應產物結果在反應產物中加入2.5μl熒光染料(SYBR Green I)，混勻，靜置5min。若顯現綠色則為陽性，橙色則為陰性。
權利要求
1.一種基于環介導等溫擴增技術的基因快速診斷方法，包括如下步驟一、對被檢樣品進行預處理，從而快速提取DNA或快速提取RNA；二、特異性引物制備確定待測樣品的靶基因后，取得特異性引物；三、進行環介導等溫擴增技術反應將經前處理的樣品、引物、反應緩沖液與Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保溫0.5至1.5小時進行循環鏈置換反應；四、判斷結果，其特征在于所說的步驟二特異性引物制備包括目標靶基因數據庫的建立；生物信息學的分析比較；基因組多態性的分型處理和簡并堿基的運用，從而獲得所需各種靶基因的特異性引物兩對，為內引物和外引物各一對，經DNA合成儀生成寡聚脫氧核苷酸引物，且分別與靶基因中的六個獨立區域序列特異性匹配；步驟四、分析判斷反應產物結果在反應產物中加入熒光染料混勻，靜置5min，反應產物顯現綠色為陽性，顯橙色則為陰性。
全文摘要
基于環狀介導等溫擴增技術的基因快速診斷方法，涉及生物檢測技術領域，具體是用體外生物檢測試劑快速檢測病原微生物的一種技術。包括如下步驟一、對被檢樣品進行預處理；二、包括目標靶基因數據庫的建立；生物信息學的分析比較；基因組多態性的分型處理和簡并堿基的運用，獲得各種靶基因的特異性引物兩對，分別與靶基因中的六個獨立區域序列特異性匹配；三、進行環介導等溫擴增反應；四、分析判斷結果。該方法的優點不需特殊試劑與設備；高特異性；.靈敏度高；鑒定簡便；用途廣可用于食品、藥品、化妝品等領域的質量控制和環境、水質等監測；用于醫學臨床診斷，用于代謝性疾病和遺傳疾病的基因診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101082579SQ20061003565
公開日2007年12月5日 申請日期2006年5月29日 優先權日2006年5月29日
發明者石磊, 曹以誠, 李心暉, 杜正平, 張曉元, 張珍武 申請人:廣州華峰生物科技有限公司