基于環介導等溫擴增技術的h5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測方法

專利名稱：基于環介導等溫擴增技術的h5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種基于環介導等溫擴增 技術的H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測方法。 疼豕伎不
目前對H5禽流感病毒有多種檢測方法，從以病原微生物分離鑒 定、形態學鑒定和血清學鑒定為主的國家標準(GB/T 18936—2003)， 到特異蛋白的免疫學檢測技術、核酸探針、聚合酶鏈式反應(PCR)技 術等分子生物學檢測方、法(GB 19438.1-2004、 GB/T 19439-2004)。 其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準確性和靈敏性等方面都有很 大的提高，這些新技術試圖突破傳統的形態學、生化反應等微生物學 檢測舊模式，不需要對微生物進行分離提純，而直接用樣品或樣品的 增菌液對其基因及基因產物進行快速檢測，并且與分子生物學技術及 生物信息學手段相結合，向準確、快速、靈敏和自動化的方向發展。
以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在實 際應用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要 專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光 實時定量聚合酶鏈式反應(real time PCR)技術雖然較好地解決了交 叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器，因此不適用于現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術 中熒光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快 速簡便成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確 性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術發展的最 新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等 溫擴增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測 技術上的長足進步，現已建立起來的環介導等溫擴增技術(LAMP) 具有很多的優越性，且目前也未見有用環介導等溫擴增技術檢測結核 分歧桿菌的基因快速診斷試劑盒。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測成本低、 使用方便、檢測快速高效、靈敏度高的基于環介導等溫擴增技術的 H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒，該試劑盒是基于環介導等溫擴 增技術來檢測H5禽流感病毒的。
本發明的另一個目的是提供上述H5禽流感病毒基因快速診斷 試劑盒的檢測方法。
本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的
一、本發明的H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒，是由兩對引 物、B"DNA聚合酶、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、穩定液、反應液、 顯色液和陽性對照液組成，以上八種液體分別置于容器中，其中 所述兩對引物為
外引物F3: GAC AGAGC AGGTTGAC AC;夕卜弓I物B3: CCTTCTCCACTATGTAAGACC;
內引物FIP: TAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACA CATGCCCAAG;
內引物BIP: GATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGG CACATTGATGA;
上述反應液含有1.6 2mmol/L dNTP、 20 25mmol/L Tris-HCl、 10 12.5mmol/L氯化鉀、10 12.5mmol/L硫酸銨、8 10mmol/L硫酸 鎂、0.1 0.125%TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP 各1.6 2mol/L和外引物F3/B3各0.2 0.25mol/L。優選的比例是反 應液含有2mmol/L dNTP、 25mmol/L Tris-Cl、 12.5mmol/L氯化鉀、 12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125 %TritonX-100、 lmol/L 甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。 (0.1 0.125XTritonX-100是Triton X-100占反應液的體積百分比為0.1 0.125%)
上述逆轉錄酶優選為AMV逆轉錄酶。
上述陽性對照為攜帶H5禽流感病毒基因的質粒DNA。
上述顯色液優選為SYBR Green I或EvaGreen。
上述穩定液優選為石蠟油。
二、本發明基因快速診斷試劑盒的生產工藝
1、 將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測，抽樣質檢；
2、 將反應液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；3、 將穩定液無菌分裝，抽樣質檢；
4、 將逆轉錄酶無菌分裝，抽樣質檢；
5、 將RNA酶抑制劑無菌分裝，抽樣質檢；
6、 將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢；
7、 組裝試劑盒。
三、本發明基因快速診斷試劑盒的檢測方法
1、 樣品處理
樣品的采集、保存和處理，可采用GB/T 18936—2003中2.1款 進行；
提取樣品核酸，可采用GB/T 19439-2004進行樣品核酸提取獲 得樣品模板或使用等同的商品化核酸提取試劑盒按說明書操作提取 RNA模板。
2、 環介導等溫擴增技術反應過程
在反應管中加入反應液38 40體積％、 Bst DNA聚合酶0.9 1.8體積％、逆轉錄酶0.9 L8體積％、 RNA酶抑制劑0.9 1.8體 積％、穩定液52 54.5體積X、樣品模板RNA4.5 7.3體積％，63 65"C恒溫反應45 90min。所述體積百分比是指占六個組分總體積 的體積百分比。
3、 反應后處理
在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組 顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。
本發明所說的基于環介導等溫擴增技術(loop-mediated isotherm
al amplication of DNA，簡稱LAMP)快速檢測H5禽流感病毒的方 法，是利用DNA聚合酶和根據靶基因序列設計的兩對特殊的內、 外引物(即內引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上 的六個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈 合成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結 構的莖-環DNA混合物。LAMP反應過程中，從dNTP析出的焦磷 酸根離子與反應溶液中的Mg^結合，產生副產物——焦磷酸鎂乳白 色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結果。LAMP反應是在恒溫(63 6 5°C)條件下45 90分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒 有溫度循環使所需儀器簡單化，克服了傳統PCR固有的檢測時間長、 容易污染及檢測成本高等缺點。此外，這種檢測方法對檢測人員的 技術素質要求較低，實際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器 設備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、 快速、高度特異性的基因擴增法。將恒溫基因擴增技術與PCR技術 (包括熒光實時定量PCR技術)進行比較，可以發現該技術在靈敏 度、特異性和檢測范圍等方法學指標上相當于或優于PCR技術，且 不依賴任何專門的儀器設備即可實現現場高通量快速檢測，而且檢 測成本遠低于熒光定量PCR技術。國內目前尚未有這方面的試劑盒 出售。目前國家標準中以微生物分離培養和形態學鑒定為主、結合 生化分析和血清學分型鑒定的通行方法，初步鑒定需2 3天，完成 鑒定報告需10 15天；采用本發明的基因快速診斷試劑盒僅需2 小時。并且，本發明的反應液中加入了顯色液，鑒定結果更為直觀 清晰。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果l.本發明的基因快 速診斷試劑盒只需一個恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與 設備，檢測成本低；2.本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段， 四條引物，根據是否擴增就能判斷耙標物質的存在與否，因此具有 高特異性；3.本發明的基因快速診斷試劑盒擴增快速且高效，在不到 l小時即可完成擴增，且產率高；4.本發明的基因快速診斷試劑盒靈 敏度高，擴增模板僅需10拷貝或更少；5.本發明的基因快速診斷試 劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2 +結合，產生副產物一焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加 入顯色液后，陰陽性結果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠。
具體實施例方式
實施例l試劑盒的制備
(1) 按以下序列經DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 夕卜弓I物F3: GACAGAGCAGGTTGACAC;
外引物B3: CCTTCTCCACTATGTAAGACC; 內引物FIP: TAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACA CATGCCCAAG;
內引物BIP:
GATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGGCACATTGATGA;
(2) 購置DNA聚合酶fofDNA聚合酶置于容器。
(3) 配制反應液反應液含有2mmol/LdNTP、 25mmol/L Tris-Cl、 12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol7L硫酸鎂、0. 125體積XTritonX-100、 lmol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mol/L 和外引物F3/B3各0.25mol/L，置于容器。
(4)購置逆轉錄酶AMV逆轉錄酶置于容器。
(5) 購置RNA酶抑制劑RNA酶抑制劑置于容器。
(6) 購置穩定液石蠟油，置于容器。
(7) 購置顯色液SYBRGreenI，置于容器。
(8) 提取陽性對照提取含H5禽流感病毒基因的質粒DNA，置 于容器。
(9) 將上述8個容器裝成試劑盒，封裝。 制備工藝簡述如下
1、 將內引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測，抽樣質檢；
2、 將反應液無菌分裝，并按照實驗用進行濃度確定，抽樣質檢；
3、 將穩定液分裝，抽樣質檢；
4、 將BW酶分裝，抽樣質檢；
5、 將逆轉錄酶分裝，抽樣質檢；
6、 將RNA酶抑制劑分裝，抽樣質檢；
7、 將陽性對照標本制備，分裝，抽樣質檢； .8、將顯色液分裝，抽樣質檢；
9、組裝試劑盒。
實施例2試劑盒的制備
反應液的配方為反應液含有1.6mmol/LdNTP、 20mmol/L Tris-Cl、 10mmol/L氯化鉀、10mmol7L硫酸銨、8mmol/L硫酸鎂、 0.1體積XTritonX-100、0.8mol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6mol/L 和外引物F3/B3各0.2mol/L。
顯色液為EvaGreen。
其他同實施例1。
實施例3 H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒的應用
1、 樣品處理(模板RNA提取)
按照GB/T 18936—2003中2.1款的方法采集樣品，
按照GB/T 19439-2004的方法進行樣品核酸提取獲得樣品模板。
2、 環介導等溫擴增技術的反應過程
(1)在200^1反應管配制反應體系反應液22^1， fi^DNA聚合 酶0.5[il (4U)， AMV逆轉錄酶0.5jJ、 RNA酶抑制劑0.5^1、穩定液 30|il，模板RNA2.5ji1。
(2)將配制好的反應管于63'C恒溫反應lh。
3、 反應后處理
向上述反應管中加入2^1 SYBR Green I，混勻，同時也向陽性對 照管(提取含H5禽流感病毒基因的質粒DNA)中加入SYBR Green I混勻，若反應管與對照管一樣顯現綠色則為陽性，若反應管顯現橙 色則為陰性。
權利要求
1、基于環介導等溫擴增技術的H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒，其特征在于由兩對引物、Bst DNA聚合酶、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、穩定液、反應液、顯色液和陽性對照液組成，以上八種液體分別置于容器中，上述兩對引物為外引物F3GACAGAGCAGGTTGACAC；外引物B3CCTTCTCCACTATGTAAGACC；內引物FIPTAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACACATGCCCAAG；內引物BIPGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGGCACATTGATGA；上述反應液含有1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-Cl、10～12.5mmol/L氯化鉀、10～12.5mmol/L硫酸銨、8～10mmol/L硫酸鎂、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L；上述陽性對照為攜帶H5禽流感病毒基因的質粒DNA。
2、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述顯色液為SYBR Green I或EvaGreen。
3、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述反應液含有 2mmol/L dNTP、 25mmol/LTris-Cl、 12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L 硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125%TritonX-100、 lmol/L甜菜堿、內 引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。
4、 利用權利要求1所述試劑盒檢測H5禽流感病毒的方法，其 特征在于該方法包括如下步驟(1) 采集樣品；(2) 提取樣品核酸；(3) 在反應管中加入反應液38 40體積％、 Bst DNA聚合酶0. 9 1.8體積％、逆轉錄酶0.9 1.8體積％、 RNA酶抑制劑0.9 1.8 體積％、穩定液52 54.5體積％、樣品模板DNA 4.5 7.3體積％，恒溫反應；(4) 在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣 品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。
5、 根據權利要求4所述檢測方法，其特征在于步驟(3)中，恒 溫反應的反應條件為溫度63 65"C，反應時間45 90min。
6、 根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于所述穩定液為石 蠟油。
7、 根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于所述逆轉錄酶為 AMV逆轉錄酶。
8、 根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于所述顯色液為S YBR Green I或EvaGreen。
全文摘要
本發明提供一種基于環介導等溫擴增技術的H5禽流感病毒基因快速診斷試劑盒及其檢測方法，該試劑盒由兩對引物、DNA聚合酶、反應液、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、穩定液、顯色液和陽性對照液組成，以上八種液體分別置于容器中。本發明的基因快速診斷試劑盒應用六個區段，四條引物，根據是否擴增就能判斷靶標物質的存在與否，因此具有高特異性。本發明的基因快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高，只需一個恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊試劑與設備。本發明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg²⁺結合，產生副產物—焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結果顯色差異顯著，更加明顯可靠。
文檔編號C12Q1/68GK101338345SQ200810030108
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月12日 優先權日2008年8月12日
發明者曹以誠, 暉 李, 李志勇, 杜正平, 柯昌文, 王志強, 譚惠媚, 洵 陳 申請人:廣州華峰生物科技有限公司