專利名稱：采用非均相酶催化法生產d－對羥基苯甘氨酸的方法
技術領域：
本發明屬于醫藥原料的生產，特別是指采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法。
背景技術：
D-對羥基苯甘氨酸主要用于生產阿莫西林、頭孢羥氨芐、頭孢哌酮和頭孢曲嗪等半合抗。采用生物法生產的技術目前報道的有“兩步酶法”和“一步酶法”兩種，其酶源有假單孢桿菌Pseudomonas sp.和土壤放射菌Agrobacterium radiobacter。在均相工藝中這兩株菌產生的酶可以用于DL-對羥基苯海因轉化水解生產D-對羥基苯甘氨酸，而在非均相工藝中凸顯其催化能力的不足，轉化率低且反應時間過長。上述現有技術存在著裝置的生產能力嚴重地受到D-對羥基苯甘氨酸本身溶解度很小的限制，液-液轉化溶液體積過大，產量低，能耗高的問題。
發明內容
本發明的目的在于提供一種采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法以解決現有均相轉化工藝中存在的產量低、能耗高的問題。
本發明屬于一步酶法，其技術能實現的基礎是以產生海因酶的菌株Arthrobacter aurescens和熱穩定性的氨甲酰胺水解酶的菌株Agrobacterium radiobacter。并利用生物發酵制備海因酶制劑和N-氨甲酰胺水解酶制劑，以下所說的酶制劑包括海因酶制劑和N-氨甲酰胺水解酶制劑。
本發明的整體技術解決方案是采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，包括如下工藝步驟(1)在酶催化反應罐中，投入DL-對羥基苯海因和溶劑，調整DL-對羥基苯海因投料量為溶劑體積的4％-28％；(2)加入酶活高于0.3U/mL的酶制劑，加入量為反應液總質量的1-12％，在pH為6.2-8.6、溫度為30-44℃條件下，開始攪拌反應；
(3)取樣并用高壓液相色譜檢測反應情況，當反應進行6-12h后，則有D-對羥基苯甘氨酸晶體開始析出，待反應體系中N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸濃度降至0.25％以下時，反應結束。
本發明的具體工藝步驟和工藝條件是步驟(1)中溶劑選用水。其中優選無氧水。
步驟(2)中酶制劑的酶活高于0.4U/mL能滿足實際要求，步驟(2)中酶制劑溶液的酶活高于0.55U/mL是比較適宜的，其中酶制劑溶液的酶活最好為高于0.65U/mL。
步驟(3)中的取樣采用間隔3-6小時取樣。
步驟(2)中的攪拌轉速為40-110r/min。
步驟(2)中罐內壓力低于0.06Mpa。
1、轉化液轉化率的測定及計算這里的轉化率指的是將D，L-對羥基苯海因轉化成D-對羥基苯甘氨酸的百分數。測定采用高壓液相色譜法。
具體測定步驟為待轉化反應完成后取10ml轉化液于離心試管中，在3500-4000r/min的離心機上離心30min。待離心結束后取上清液1ml用事先配制好的流動相稀釋200倍用高壓液相色譜儀進行測量，并根據測量結果計算峰峰面積及轉化率。
轉化率的計算公式如下所示Y＝X1/(X1+X2+----+Xn)×100％式中，Y為樣品的轉化率；X1為樣品中的D-對羥基苯甘氨酸的峰面積；X2、....Xn分別為樣品中其它成分的峰面積。
2、根據轉化的反應原理，在高濃度轉化的過程中有氨氣、二氧化碳及D-對羥基苯甘氨酸的產成，因此pH在轉化過程中會呈現有規律的變化。在進入反應的后期，pH快速升高，從而強烈地抑制了N-氨甲酰胺水解酶的催化活性，導致反應速度減慢，甚至停止。
3、pH值對轉化率的影響根據取樣檢測結果，pH選用6.2-8.6是較為適宜的，且在該pH值下反應過程較短。pH增大或減小后，轉化液達到相同轉化率所需時間都顯著變長。
4、D，L-對羥基苯海因的加入量是一個較為重要的技術參數，當其投料量高于4％時，由于反應過程中生成的產物部分以晶體的方式析出，因此稱為“非均相轉化”，但是當其投料量過高，則會影響電機的轉速，嚴重的甚至導致電機停轉，影響物料的傳質過程。所以，DL-對羥基苯海因投料量以不超過28％較為適宜。
本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在于在水系中實現了微生物催化轉化從液——液到固——固工藝的革新，與現有一步酶法結合后形成了D-對羥基苯甘氨酸的全新生產技術；產率達到78-80％(w/w)，能耗降低40％以上，節水效果明顯，產品一次合格率達到99％以上，達到了清潔生產的要求。
具體實施例方式
實施例1在300L的酶催化反應罐中，先加入無氧水210kg，然后投入D，L-對羥基苯海因27-28kg。在攪拌轉速45r/min的條件下，再加入濕的酶活為0.5U/mL的酶制劑15kg。蒸汽加熱、控制溫度為32-44℃、罐內壓力不超過0.05Mpa的條件下，攪拌反應。間隔3-6h取樣并用高壓液相色譜檢測反應情況，當反應進行6-12h后，則有D-對羥基苯甘氨酸晶體開始析出，待反應體系中N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸0.25％以下時，反應基本結束，轉化率在99％以上。分離獲得的粗晶經重結晶得到純產品約13.5kg，溶液經提煉，得到成品約9kg，合計產率在80％以上。
實施例2在300L的酶催化反應罐中，加入無氧水210kg，然后投入對羥基苯海因32-38kg。在攪拌轉速65r/min的條件下，加入濕的酶活為0.62U/mL的酶制劑約15kg。加熱、控制溫度為32-44℃條件下攪拌反應。間隔3-6h取樣用高壓液相色譜檢測反應情況，當反應進行6-8h后，則有D-對羥基苯甘氨酸晶體開始析出。待反應體系中N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸0.25％以下時，反應基本結束，轉化率在99％以上。粗晶和溶液部分提煉后得到產品，合計收率在79％以上。
權利要求
1.采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于它包括如下工藝步驟(1)在酶催化反應罐中，投入DL-對羥基苯海因和溶劑，調整DL-對羥基苯海因投料量為溶劑體積的4％-28％；(2)加入酶活高于0.3U/mL的酶制劑，加入量為反應液總質量的1-12％，在pH為6.2-8.6、溫度為30-44℃條件下，開始攪拌反應；(3)取樣并用高壓液相色譜檢測反應情況，當反應進行6-12h后，則有D-對羥基苯甘氨酸晶體開始析出，待反應體系中N-氨甲酰對羥基苯甘氨酸濃度降至0.25％以下時，反應結束。
2.根據權利要求1所述的采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步驟(1)中溶劑選用水。
3.根據權利要求1所述的采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步驟(2)中酶制劑的酶活為高于0.55U/mL。
4.根據權利要求1所述的采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步驟(3)中的取樣采用間隔3-6小時取樣。
5.根據權利要求1所述的采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步驟(2)中的攪拌轉速為40-110r/min。
6.根據權利要求1或5所述的采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步驟(2)中罐內壓力低于0.06Mpa。
7.根據權利要求1或2所述的采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步驟(1)中溶劑選用無氧水。
8.根據權利要求1或3所述的采用非均相酶催化法生產D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于所述的步驟(2)中酶制劑溶液的酶活為高于0.65U/mL。
全文摘要
本發明屬于醫藥原料的生產，特別是指采用非均相酶催化法生產D－對羥基苯甘氨酸的方法。在酶催化反應罐中，投入DL－對羥基苯海因和溶劑，調整DL－對羥基苯海因投料量為溶劑體積的4％－28％；加入為反應液總量的1－12％且酶活高于0.3U/mL的酶制劑，在pH為6.2－8.6、溫度為30－44℃條件下攪拌反應；取樣并用高壓液相色譜檢測反應，反應進行6－12h后，則有D－對羥基苯甘氨酸晶體開始析出，待反應體系中N－氨甲酰對羥基苯甘氨酸濃度降至0.25％以下時，反應結束。本發明解決了現有技術存在的溶液體積過大，產量低，能耗高的問題。具有在水系中實現了微生物催化轉化從液——液到固——固工藝的革新，與現有一步酶法結合后形成了D－對羥基苯甘氨酸的全新生產技術；產率高，能耗低，合格率達99％以上等優點。
文檔編號C12P13/00GK1928103SQ200610048209
公開日2007年3月14日 申請日期2006年8月30日 優先權日2006年8月30日
發明者劉守信, 崔哲鋒, 周志輝, 付建忠 申請人:石家莊經濟技術開發區中天化工有限責任公司