巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶催化-電子轉移亞基共表達載體的制作方法
【專利摘要】一種基因工程【技術領域】的巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶催化-電子轉移亞基共表達載體，首先測定巨大芽孢桿菌全基因組序列作為模板，根據設計出的PCR引物擴增出含有酶切位點硝酸鹽還原酶催化亞基(Bm-Nas?B)和電子轉移亞基(Bm-Nas?C)的基因序列，并依次連接到共表達載體pETDuet-1上，通過菌落PCR技術挑選含有目的基因片段的大腸桿菌DH5α的陽性克隆。本發明克服現有技術中由于硝酸鹽還原酶電子轉移亞基基因序列在天然的巨大芽孢桿菌中表達量非常低，嚴重限制使用效果，實現極大的提高該基因的表達量。
【專利說明】巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶催化-電子轉移亞基共表達載體
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種基因工程【技術領域】的方法，具體是一種硝酸鹽還原酶催化-電子轉移亞基基因序列、含有該基因的重組載體、重組菌以及利用該重組菌產生該基因的表達產物及其應用。
【背景技術】
[0002]隨著設施農業的發展，栽培面積不斷擴大，氮素化肥使用量大幅度上升，大大超過植物的需求量。由于土壤中硝酸鹽未能被植物及時吸收轉化，造成大量鹽分在植物體和土壤中積累，從而造成設施栽培土壤次生鹽潰化。
[0003]研究表明，設施栽培次生鹽潰化土壤中除HC03_外，Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl' SO42'N03_均有不同程度的積累。研究表明，次生鹽潰化土壤的陽離子組成中，Na+已不是主要離子，陽離子以Ca2+為主，其含量約占陽離子總量的60%以上，Mg2+含量在15%-20%之間；陰離子以NO3-和SO/—為主，NO3-含量約為陰離子總量的56%-76%。N03_可在植物體內累積，最終通過食物鏈進入人體，過量的N03_在體內易被還原成為N02_，N02_可使細胞組織缺氧，嚴重時使人窒息死亡。因此治理設施栽培中過量的硝態氮已成為設施農業一項重要且刻不容緩的工作。目前針對我國設施栽培大棚鹽潰化，采取了一些治理措施，如灌水洗鹽，土壤改良劑法和半腐熟有機肥法等方法。雖然這些方法有不少優點，但也存在很大的不足:灌水洗鹽會把硝態氮淋洗到地下，不僅造成土壤氮素的損失，而且還污染地下水；土壤改良劑法成本比較高，易產生二次污染；半腐熟有機肥法存在肥效慢，使用不便等缺點。
[0004]與傳統治理次生鹽潰化方法相比，生物法尤其是生物酶法有許多突出優點，比如見效快、不會給周邊環境帶來負 擔。但是一般而言硝酸鹽還原酶在微生物體內的表達量很低，不能滿足修復環境的要求，于是構建一種高效的硝酸鹽還原酶表達載體，實現硝酸鹽還原酶的聞效表達就顯得尤為關鍵。
【發明內容】
[0005]本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶催化-電子轉移亞基共表達載體，克服現有技術中由于硝酸鹽還原酶電子轉移亞基基因序列在天然的巨大芽孢桿菌中表達量非常低，嚴重限制使用效果，應用基因工程菌表達本發明所述的硝酸鹽還原酶電子轉移亞基基因序列，實現極大的提高該基因的表達量。
[0006]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0007]本發明涉及一種巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶催化-電子轉移共表達載體，由硝酸鹽還原酶催化亞基Bm-Nas B，其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，以及硝酸鹽還原酶電子轉移亞基Bm-Nas C，其核苷酸序列如Seq ID N0.2所示組成。
[0008]所述的催化亞基和電子轉移亞基的基因序列分別由2346和2151個堿基對組成。
[0009]所述的共表達載體為包含硝酸鹽還原酶催化亞基序列Bm-Nas B以及硝酸鹽還原酶電子轉移亞基序列Bm-Nas C的pETDuet-Ι質粒。
[0010]本發明涉及上述共表達載體的構建方法，首先測定巨大芽孢桿菌全基因組序列作為模板，根據設計出的PCR引物擴增出含有酶切位點硝酸鹽還原酶催化亞基(Bm-Nas B)和電子轉移亞基(Bm-Nas C)的基因序列，并依次連接到共表達載體pETDuet-Ι上，通過菌落PCR技術挑選含有目的基因片段的大腸桿菌DH5 α的陽性克隆。
[0011]所述的大腸桿菌DH5a的陽性克隆是指:含有重組表達質粒pETDuet-1-Bm-NasB-Nas C 的大腸桿菌 BL21 (DE3)。
[0012]本發明涉及上述大腸桿菌DH5 α的陽性克隆的應用，將其發酵后修復次生鹽潰化土壤。
[0013]所述的應用進一步是指:將該共表達載體倒入大腸桿菌BL21(DE3)內，通過加入IPTG進行誘導，使該重組菌表達出具有生物學活性的硝酸鹽還原酶，進而優化發酵條件提高硝酸鹽還原酶的表達量，最終實現酶制劑法修復次生鹽潰化土壤。
技術效果
[0014]本發明所述的硝酸鹽還原酶基因序列在天然的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)中表達量非常低，嚴重限制了使用效果，本發明通過構建重組共表達菌株，實現了硝酸鹽還原酶催化亞基和電子轉移亞基的外源共表達，保證了編碼硝酸鹽還原酶的生物學活性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為實施例中pETDuet-l-Bm-Nas C重組載體驗證電泳圖。
[0016]圖2為實施例中pETDuet-l-Bm-Nas B-Nas C重組載體驗證電泳圖。
【具體實施方式】
[0017]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1
[0018]巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)NCT-2 的培養
[0019]巨大芽孢桿菌NCT-2分離自上海市崇明島設施栽培12-15年的大棚，保藏編號為CGMCC N0.4698，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學微生物研究所；保存日期為2011年3月21日。將該菌接種于LB液體培養基中，32°C培養0D_至1.5左右，離心收集菌體用于提取細菌的基因組DNA。
[0020]所述的LB液體培養基組分為:蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，去離子水1L，PH6.8-7.2。LB固體培養基即為在LB液體培養基的基礎上添加15_20g的瓊脂。
實施例2
[0021]硝酸鹽還原酶催化亞基基因(Bm-Nas B)序列驗證
[0022]根據全基因組測序結果，設計PCR引物:
[0023]正向引物Nas B-F: 5; -ATGACGAAACAAAAGCTAATATTAA-3'[0024]反向引物Nas B-R: 5; -TATAATAAATATGTGATTGCACGAG-3'
[0025]以巨大芽孢桿菌NCT-2的基因組DNA為模板，用上述兩對引物進行擴增。PCR條件為:94°C預變性5min ;94°C變性45s，53°C退火30s，72°C延伸90s ；30個循環后72°C終延伸IOmin0
[0026]將PCR擴增產物進行電泳檢測，結果表明獲得片段約為2.4kb ;然后將PCR產物切膠回收后連接到PMD19-T載體上送公司測序。經測序后得到的核昔酸序列與基因組測序結果相吻合，即為本發明序列表中SEQ ID N0.1。
實施例3
[0027]硝酸鹽還原酶電子轉移亞基基因(Bm-Nas C)序列驗證
[0028]根據全基因組測序結果，設計PCR引物:
[0029]正向引物Nas C-F: 5; -ATGACTGAGATGCTATTGAAATATT-3'
[0030]反向引物Nas C-R: 5' -TAATAGCTGCTTCTTTTTACAGAAG-3'
[0031]以巨大芽孢桿菌NCT-2的基因組DNA為模板，用上述兩對引物進行擴增。PCR條件為:95°C預變性3min ;95°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸75s ；30個循環后72°C終延伸IOmin0
[0032]將PCR擴增產物進行電泳檢測，結果表明獲得片段約為2.1kb ;然后將PCR產物切膠回收后連接到PMD19-T載體上送公司測序。經測序后得到的核昔酸序列與基因組測序結果相吻合，即為本發明序列表中SEQ ID N0.2。
實施例4
[0033]pETDuet-l-Bm-Nas C 重組載體的構建
[0034]根據測序得到的硝酸鹽還原酶電子轉移亞基(Bm-Nas C)基因序列，設計含有酶切位點的引物擴增該基因并連接到pETDuet-Ι共表達載體上。
[0035]設計引物如下:
[0036]正向引物Nas C-EcoR V-F:
[0037]5' -TGCAGGATATCATGACTGAGATGCTATTGAAATATT-3'
[0038]反向引物Nas C-Kpn 1-R:
[0039]5' -GGGGTACCTTAATAGCTGCTTCTTTTTACAGAAG-3'
[0040]上下游引物的5'端分別設計了 EcoR V和Kpn I酶切位點用于連接共表達載體pETDuet-Ι，用含有酶切位點的引物擴增硝酸鹽還原酶電子轉移亞基基因序列并將PCR產物連接PMD19-T(Simple)載體，將連接產物轉入DH5 α大腸桿菌感受態細胞內。挑取陽性克隆搖菌并回收其質粒，然后用EcoR V和Kpn I雙酶切，回收含有硝酸鹽還原酶電子轉移亞基的基因片段Bm-Nas C1。用相同的內切酶酶切共表達載體pETDuet-Ι并回收酶切產物。將片段Bm-Nas C1與pETDuet-Ι酶切產物混合，用T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接，將連接產物轉入DH5 α大腸桿菌感受態細胞內，通過菌落PCR篩選含有重組共表達質粒pETDuet-l-Bm-Nas C的陽性克隆(見圖1)。挑取陽性克隆，搖菌(培養基中氨芐青霉素濃度為50 μ g/ml) 16小時并提取其質粒。
[0041]所述的菌落PCR條件為:95°C預變性3min ;94°C變性45s，56°C退火30s，72°C延伸90s ；30個循環后72°C終延伸IOmin。
實施例5[0042]pETDuet-l-Bm-Nas B-Nas C 重組載體的構建
[0043]根據測序得到的硝酸鹽還原酶催化亞基(Bm-Nas B)基因序列，設計含有酶切位點的引物擴增該基因并連接到pETDuet-l-Bm-Nas C重組載體上。
[0044]設計引物如下:
[0045]正向引物Nas B-BamH 1-F:
[0046]5' -CGGGATCCATGACGAAACAAAAGCTAATATTAA-3'
[0047]反向引物Nas B-Not 1-R:
[0048]5' -ATAGTTTAGCGGCCGCCTATAATAAATATGTGATTGCACGAG-3'
[0049]用含有BamH I和Not I酶切位點的引物擴增硝酸鹽還原酶電子轉移亞基基因序列并將PCR產物連接pMD19-T (Simple)載體，將連接產物轉入DH5 α大腸桿菌感受態細胞內。挑取陽性克隆搖菌并回收其質粒,然后用BamH I和Not I雙酶切，回收含有硝酸鹽還原酶催化亞基的片段Bm-Nas B'。用相同的內切酶酶切pETDuet-l-Bm-Nas C質粒并回收酶切產物。將片段Bm-Nas B'與pETDuet-1-Bm-Nas C酶切產物混合，用 T4DNA Ligase(TaKaRa)過夜連接，將連接產物轉入DH5 α大腸桿菌感受態細胞內，通過菌落PCR篩選含有重組共表達質粒pETDuet-l-Bm-Nas B-Nas C的陽性克隆(見圖2)。
[0050]所述的菌落PCR條件為:95°C預變性3min ;94°C變性45s，54°C退火30s，72°C延伸90s ；30個循環后72°C終延伸IOmin。`
【權利要求】
1.一種巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶共表達載體，其特征在于，其核苷酸序列由硝酸鹽還原酶催化亞基Bm-Nas B,如Seq ID N0.1所示，以及硝酸鹽還原酶電子轉移亞基Bm-NasC,如Seq ID N0.2所示組成。
2.—種pETDuet-Ι質粒,其特征在于,包含權利要求1中所述的硝酸鹽還原酶催化亞基序列Bm-Nas B以及硝酸鹽還原酶電子轉移亞基序列Bm-Nas C。
3.一種根據權利要求1所述的共表達載體的構建方法，其特征在于，首先測定巨大芽孢桿菌全基因組序列作為模板，根據設計出的PCR引物擴增出含有酶切位點硝酸鹽還原酶催化亞基(Bm-Nas B)和電子轉移亞基(Bm-Nas C)的基因序列，并依次連接到共表達載體pETDuet-Ι上，通過菌落PCR技術挑選含有目的基因片段的大腸桿菌DH5 α的陽性克隆。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的依次連接是指: 1)將Bm-NasC基因連接到pETDuet-Ι共表達載體上； 2)將Bm-NasB基因連接到pETDuet-l-Bm-Nas C重組載體上。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征是，所述的PCR引物由 用于將Bm-Nas C基因并分別連接到pETDuet-Ι共表達載體上的 正向引物 Nas C-EcoR V -F:
5' -TGCAGGATATCATGACTGAGATGCTATTGAAATATT-3' 反向引物Nas C-Kpn 1-R:
5' -GGGGTACCTTAATAGCTGCTTCTTTTTACAGAAG-3' 5' -CGGAATTCTTA TGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3'，和 用于將Bm-Nas B基因連接到pETDuet-l-Bm-Nas C重組載體上的 正向引物 Nas B-BamH 1-F:
5' -CGGGATCCATGACGAAACAAAAGCTAATATTAA-3' 反向引物Nas B-Not 1-R: 5' -ATAGTTTAGCGGCCGCCTATAATAAATATGTGATTGCACGAG-3'組成。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌DH5ci的陽性克隆是指:含有重組表達質粒pETDuet-l-Bm-Nas B-Nas C的大腸桿菌BL21 (DE3)。
7.一種根據權利要求3-6中任一所述大腸桿菌DH5ci的陽性克隆的應用，其特征在于，將其發酵后修復次生鹽潰化土壤。
8.一種涉及上述任一權利要求所述的共表達載體的應用，其特征是，將該共表達載體倒入大腸桿菌BL21(DE3)內，通過加入IPTG進行誘導，使該重組菌表達出具有生物學活性的硝酸鹽還原酶，進而優化發酵條件提高硝酸鹽還原酶的表達量，最終實現酶制劑法修復次生鹽潰化土壤。
【文檔編號】B09C1/10GK103571866SQ201310566278
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月13日 優先權日:2013年11月13日
【發明者】周培, 馮海瑋, 支月娥, 孫玉靜, 陸偉, 劉群錄, 衛星, 時唯偉, 初少華 申請人:上海交通大學