編碼小麥中參與淀粉合成的酶的核酸分子的制作方法

專利名稱：編碼小麥中參與淀粉合成的酶的核酸分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼小麥中參與植物淀粉合成的酶的核酸分子，這些酶是淀粉合酶的同種型。
本發明另外涉及含有這些核酸分子的載體和細菌，以及被所述核酸分子轉化的植物細胞和植物。另外，本發明還描述了產生轉基因植物的方法，由于整合了編碼小麥淀粉合酶的DNA分子，所述轉基因植物合成的淀粉在其特性上有所修飾。
鑒于最近被歸于作為原料的再生來源的植物性物質的漸增的重要性，生物技術研究的一個目的是嘗試使植物性原料適應加工工業的需要。為了能在盡可能多的領域內使用經修飾的再生性原料，得到多種物質也很重要。除了油類、脂肪和蛋白質以外，多糖構成得自植物的必不可少的再生性原料。除了纖維素以外，淀粉在多糖中保持重要的地位，在高等植物中淀粉是最重要的儲藏物質之一。在高等植物中，小麥是有趣的栽培植物，因為它產生的淀粉占歐盟淀粉生產總量的20％。
多糖淀粉是由化學上同質的基本組分即葡萄糖分子組成的聚合物，然而，它由多種類型的分子構成了高度復合的混合物，所述分子在它們的聚合程度和葡萄糖鏈的分支程度方面各不相同，因此，淀粉不是同質的原料。人們特別地區分了直鏈淀粉和支鏈淀粉，所述直鏈淀粉是由α-1，4-糖苷分支的葡萄糖分子組成的基本上未分支的聚合物，而支鏈淀粉是具有多種分支的葡萄糖鏈的復合混合物。額外的α-1，6-糖苷互連導致了分支。對于小麥而言，根據品種的不同，合成的淀粉由約11-37％的直鏈淀粉組成。為了使淀粉能得到盡可能廣泛的應用，似乎需要提供能合成經修飾之淀粉的植物，所述淀粉特別適用于多種用途。育種可以提供這種植物，然而由于栽培小麥的多倍體特性(四-和六-倍體)使得這種方法很難用于小麥。僅在最近，科學家通過將天然產生的突變體雜交成功地培育出“waxy”(不含直鏈淀粉)小麥(Nakamura等，Mol.Gen.Genet.248(1995)，253-259)。利用重組DNA技術對產淀粉植物的淀粉代謝進行特異性的遺傳修飾也可以提供這種植物，然而，其前提是要鑒定和表征參與淀粉合成和/或淀粉修飾的酶以及分離編碼這些酶的各個DNA分子。
導致淀粉產生的生化途徑基本上是已知的，植物細胞中的淀粉合成發生于質體中。在具有光合活性的組織中為葉綠體，在無光合活性的貯存淀粉的組織中為造粉體。
參與淀粉合成的最重要的酶是淀粉合酶以及分支酶。已描述了淀粉合酶的多種同種型，這些酶都可以通過將ADP-葡萄糖的葡糖基殘基轉移至α-1，4-葡聚糖而催化聚合反應。分支酶催化將α-1，6分支引入線性α-1，4-葡聚糖中。
淀粉合酶可分成兩組與顆粒結合的淀粉合酶(GBSS)和可溶性的淀粉合酶(SSS)，這種區分經常不明顯，因為一些淀粉合酶可與顆粒結合，并且也是可溶性的(Denyer等，植物學雜志，4(1993)，191-198；Mu等，植物學雜志，6(1994)，151-159)。在這些分類中，描述了多種植物的多種同種型，這些同種型的不同之處在于它們對引物分子的依賴程度(所謂的“引物依賴型”(II型)和“引物非依賴型”(I型)淀粉合酶)。
迄今為止，僅成功地測定出同種型GBSS I在淀粉合成過程中的確切功能。在此酶活性急劇下降或完全降低的植物中合成了無直鏈淀粉的淀粉(所謂的“waxy”淀粉)(Shure等，細胞，35(1983)，225-233；Visser等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，289-296；WO 92/11376)；因此，在合成直鏈淀粉時此酶起著決定性的作用，在綠藻萊因哈德衣藻的細胞中也觀察到這一現象(Delrue等，細菌學雜志，174(1992)，3612-3620)。另外，已經闡明在衣藻中GBSS I不僅參與直鏈淀粉的合成，也對支鏈淀粉的合成具有影響。在未顯示出任何GBSS I活性的突變體中，表現為長鏈葡聚糖的正常合成的支鏈淀粉的某些組分消失了。
迄今為止，仍不清楚與顆粒結合的淀粉合酶尤其是GBSS I以及可溶性淀粉合酶的其它同種型的功能。估計可溶性淀粉合酶與分支酶一起參與支鏈淀粉的合成(例見Ponstein等，植物生理學，92(1990)，234-241)，它們對調節淀粉合成速率起著重要的作用。對于小麥而言，已在蛋白質水平上鑒定了與顆粒結合的淀粉合酶的至少兩種同種型(60kDa和100-105kDa)和可能代表可溶性淀粉合酶的其它同種型(Denyer等，Planta 196(1995)，256-265；Rahman等，澳大利亞植物生理學雜志，22(1995)，793-803)。通過層析法已證明了幾種SSS-同種型的存在(Rijven，植物生理學，81(1986)，448-453)。已描述了編碼小麥GBSS I的cDNA(Ainsworth等，植物分子生物學，22(1993)，67-82)。
編碼小麥淀粉合酶其它同種型的核酸序列仍是未知的。
迄今為止，僅描述了編碼豌豆(Dry等，植物學雜志，2(1992)，193-202)，水稻(Baba等，植物生理學，103(1993)，565-573)和馬鈴薯(Edwards等，植物學雜志，8(1995)，283-294)的除GBSS I以外的其它淀粉合酶的cDNA序列。
已在除小麥以外的幾種其它植物種類中鑒定出可溶性的淀粉合酶，例如，已從豌豆(Denyer和Smith，Planta 186(1992)，609-617)和馬鈴薯(Edwards等，植物學雜志，8(1995)，283-294)中以均質的形式分離出了可溶性的淀粉合酶。在這些情況下發現被鑒定為SSS II的可溶性淀粉合酶同種型與同顆粒結合的淀粉合酶GBSS II相同(Denyer等，植物學雜志，4(1993)，191-198；Edwards等，植物學雜志，8(1995)，283-294)。對于其它植物種類，如大麥而言，通過層析法描述了幾種SSS同種型的存在(Tyynela和Schulman，Physiologia Plantarum 89(1993)835-841；Kreis，Planta 148(1980)，412-416)，然而，至今仍未描述編碼這些蛋白質的DNA序列。為使有可能修飾任何所需的儲藏淀粉的植物，尤其是小麥，以使其合成經修飾的淀粉，不得不鑒定編碼淀粉合酶其它同種型的各個DNA序列。
因此，本發明的目的是提供編碼參與淀粉合成的酶、尤其是得自小麥的酶的核酸分子，利用所述核酸分子可產生經遺傳修飾的植物，該植物顯示出增加或降低的酶活性，籍此促進對這些植物中合成的淀粉的化學和/或物理特性的修飾。通過權利要求書中所述的方案已達到此目的。
因此，本發明的第一方面涉及編碼小麥中具有可溶性淀粉合酶之生物活性的蛋白質的核酸分子，優選這種分子編碼的蛋白質含有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。本發明具體地涉及含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的全部或部分的核酸分子，優選含有SEQ ID NO1所示的編碼區、或某些情況下也可以是含有其相應的核糖核苷酸序列的分子。
本發明還涉及編碼小麥的可溶性淀粉合酶并能與上述分子之一雜交的核酸分子。
編碼小麥的可溶性淀粉合酶的核酸分子和因遺傳密碼的簡并性而序列與上述分子的核苷酸序列有所不同的核酸分子也是本發明的主題。
本發明也涉及具有與上述序列的全部或部分互補之序列的核酸分子。
由上述核酸分子編碼的蛋白質是源于小麥的可溶性淀粉合酶，這些蛋白質與目前已知的其它植物種類的可溶性淀粉合酶顯示出某些同源區域。
本發明的另一方面涉及編碼具有小麥中可溶性淀粉合酶之生物活性的蛋白質的核酸分子，優選這種分子編碼的蛋白質含有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。本發明具體地涉及含有SEQ ID NO5所示的核苷酸序列或其部分的核酸分子，優選含有SEQ ID NO5所示的編碼區、或某些情況下也可以是含有其相應的核糖核苷酸序列的分子。
本發明還涉及編碼小麥的可溶性淀粉合酶并能與上述分子之一雜交的核酸分子。
編碼小麥的可溶性淀粉合酶的核酸分子和因遺傳密碼的簡并性而序列與上述分子的核苷酸序列有所不同的核酸分子也是本發明的主題。
本發明也涉及具有與上述序列的全部或部分互補之序列的核酸分子。
由上述核酸分子編碼的蛋白質是具有小麥淀粉合酶生物活性的蛋白質。當與其它已知序列比較同源性時，發現其與豌豆編碼的同顆粒結合之淀粉合酶的序列具有最高程度的同源性，因此，推測所述核酸分子編碼小麥的同顆粒結合的淀粉合酶。
本發明的核酸分子可以是DNA或RNA分子，例如相應的DNA分子是基因組的或cDNA分子。可從天然來源分離或通過已知方法合成本發明的核酸分子。
在本發明中，術語“雜交”指的是在常規雜交條件下，優選在如Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版(1989)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約中所述的嚴格條件下進行的雜交。
例如可從由小麥組織產生的小麥基因組中或cDNA文庫中分離出能與本發明的分子雜交的核酸分子。
因此，通過使用本發明的分子或這些分子的一部分，或某些情況下可使用這些分子的反向互補鏈，通過例如根據標準方法的雜交(例見Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版(1989)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)可鑒定和分離這樣的核酸分子。
至于雜交所用的探針，可使用諸如確切地或基本上含有SEQ IDNO1或SEQ ID NO5所示核苷酸序列或其部分的核酸分子。用作雜交探針的片段也可以是使用常規的合成法產生的合成片段，此片段的序列與本發明的核酸分子的序列基本上相同。鑒定和分離出可與本發明的核酸分子雜交的基因之后，必須測定序列并分析由此序列編碼的蛋白質的特性。
可與本發明的核酸分子雜交的分子也包括編碼本發明所述之小麥蛋白質的上述核酸分子的片段、衍生物和等位基因變體。因此，片段限定為核酸分子的一部分，它們應足夠長以使其能編碼所述蛋白質之一。這也包括缺乏編碼信號肽的核苷酸序列的本發明核酸分子的一部分，所述信號肽負責將蛋白質轉移到質體中。這種片段是諸如編碼SEQ IDNO2所示氨基酸殘基34-671的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO6所示氨基酸殘基58-799或61-799的核苷酸序列。另外，本發明特別優選的片段是含有SEQ ID NO1之核苷酸186-2239的片段以及在其5’末端含有一額外的G殘基的片段，和含有SEQ ID NO2之核苷酸1084-2825的片段。在本申請中，術語“衍生物”指的是這些分子的序列與上述核酸分子的序列在一個或多個位置上有所不同，它們表現出與上述核酸分子有高度的同源性，這里的同源性指的是序列至少40％相同，特別是至少60％相同，優選80％以上相同，更優選90％以上相同。與上述核酸分子相比時出現的偏差可能是由缺失、取代、插入或重組引起的。
另外，同源性指的是各個核酸分子之間或由它們編碼的蛋白質之間存在著功能和/或結構上的等同。與上述分子同源并代表這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些分子的變異，所述變異構成可產生相同的生物學功能的修飾。這些變異可以是自然發生的變異，例如源于其它生物體的序列或突變，因此這些突變可以是自然發生的或可以是通過特異性誘變而導入的。另外，變異可以是合成產生的序列，等位基因變體可以是自然產生的變體以及合成產生的變體或由重組DNA技術產生的變體。由本發明核酸分子的多種變體編碼的蛋白質表現出某些共有的特性。酶活性、分子量、免疫反應性、構象等屬于這些特性，如在凝膠電泳中的遷移率、層析特性、沉降系數、溶解性、光譜特性、穩定性、pH最適值、溫度最適值等的物理特性也屬于這些特性。淀粉合酶的顯著特征是i)它們定位于植物細胞質體的基質內；ii)它們具有使用ADP-葡萄糖為底物合成線性α-1，4-連接的聚葡聚糖的能力。按Denyer和Smith(Planta 186(1992)，606-617)所示方法或如實施例中所述的方法可測定此活性。
可特異性地與本發明核酸分子的鏈雜交的核酸分子也是本發明的主題，優選這些核酸分子是長度至少為10，尤其是長度至少為15，更優選長度至少為50個核苷酸的寡核苷酸。這些核酸分子可特異性地與本發明核酸分子的鏈雜交，即它們不與或僅在低水平上與編碼其它蛋白質，尤其是其它淀粉合酶的核酸序列雜交。可將本發明的寡核苷酸用作諸如PCR反應的引物，它們也可以是反義構建體或編碼適當核酶的DNA分子的組分。
另外，本發明涉及載體，尤其是質粒、粘粒、病毒、噬菌體和基因工程中通用的其它載體，所述載體含有上述的本發明的核酸分子。
在優選的實施方案中，載體中所含的核酸分子與確保可翻譯的RNA能在原核或真核細胞中轉錄和合成的調控元件連接。
在如大腸桿菌的原核細胞中表達本發明的核酸分子是有趣的，原因在于這可以更精確地鑒定這些分子編碼的酶的酶促活性，具體地說，可以在缺乏參與植物細胞淀粉合成的其它酶的情況下表征由各個酶合成的產物，從而可以推論出各個蛋白質在植物細胞內淀粉合成過程中發揮的功能。
另外，利用常規的分子生物學技術(例見Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版(1989)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約)可將多種突變導入本發明的核酸分子，從而誘導具有可能被修飾的生物學特性的蛋白質的合成。利用此技術，一方面可以產生缺失突變體，其中通過在編碼序列的DNA的5’或3’末端連續地缺失可產生核酸分子，這些核酸分子可導致相應的縮短的蛋白質的合成，這種在核苷酸序列5’末端的缺失使得例如有可能鑒定出負責質體中酶轉運的氨基酸序列(轉運肽)。由于除去了有關序列，使得酶的特異性生產不再位于質體中而是位于胞質溶膠內，或者由于其它信號序列的加入使得酶的特異性生產位于其它區室中。
另一方面，在氨基酸序列的修飾會影響諸如酶活性或酶調節的位置處也可導入點突變。通過此方法，可產生諸如具有經修飾的Km值的突變體，或產生不再受細胞中經常出現的通過別構調節或共價修飾而發生的調節機制所支配的突變體。
另外，可產生表現出經修飾的底物或產物特異性的突變體，如使用ADP-葡萄糖-6-磷酸代替ADP-葡萄糖為底物的突變體，而且，可產生具有經修飾的活性-溫度分布圖的突變體。
為了在原核細胞中進行遺傳操作，可將本發明的核酸分子或這些分子的部分整合到允許誘變或通過DNA序列重組進行序列修飾的質粒中。利用標準方法(參見Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第2版(1989)冷泉港實驗室出版社，紐約，美國)，可進行堿基替換或加入天然或合成的序列。為了連接DNA片段，可將銜接子或接頭與片段連接。另外，可利用能提供適當限制性位點或能除去多余的DNA或限制性位點的操作。在利用插入、缺失或取代的任何地方，都可使用體外誘變、“引物修復”、限制性酶切或連接。為了分析，通常使用序列分析、限制性酶切分析和其它的生物化學-分子生物學方法。
在另一個實施方案中，本發明涉及經上述本發明的核酸分子或本發明的載體轉化和/或遺傳修飾的宿主細胞，特別是原核或真核細胞，還涉及來源于以上述方式被轉化和/或遺傳修飾并含有本發明的核酸分子或本發明的載體的細胞。優選所述宿主細胞為細菌細胞或植物細胞。這種細胞的特征在于被導入的本發明的核酸分子對于被轉化的細胞而言可以是異源的，即該核酸分子不會天然存在于這些細胞中；或者該核酸分子可以位于基因組中其它位置，而不是其相應的天然存在的序列。另外，由本發明的核酸分子編碼的蛋白質，以及所述蛋白質的生產方法都是本發明的主題，所述方法包括在允許蛋白質合成的條件下培養本發明的宿主細胞，然后從經培養的細胞和/或培養基中分離所述蛋白質。
另外，本發明也涉及被一種或多種本發明的核酸分子轉化的轉基因植物細胞。這種細胞含有一種或多種本發明的核酸分子，優選將該/這些核酸分子與可確保在植物細胞中轉錄的調控DNA元件、尤其是啟動子連接。這種細胞與天然存在的植物細胞的不同之處在于它們至少含有一種不會天然存在于這種細胞中的本發明的核酸分子，或者在于這種分子整合到細胞基因組中的某個位置，而不是其天然存在的位置，即基因組環境不同。
利用本領域技術人員已知的方法，可將轉基因的植物細胞再生為整個植株，因此，通過再生本發明的轉基因植物細胞而得到的植物也是本發明的主題。本發明的另一個主題是含有上述轉基因植物細胞的植物。轉基因植物理論上可以是任何所需種類的植物，即可以是單子葉植物以及雙子葉植物。這些植物、特別是合成淀粉或儲藏淀粉的植物，如谷類(黑麥、大麥、燕麥、小麥等)、水稻、玉米、豌豆、木薯或馬鈴薯是較優選的有用植物。
通過利用本發明的核酸分子，目前可以通過重組DNA技術以通過育種不可能實現的方式特異性地干擾植物的淀粉代謝，籍此，可以合成的經修飾淀粉與野生型植物中合成的淀粉相比在其物理-化學特性上已經被修飾的方式修飾淀粉代謝，所述特性具體地為直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率，分支的程度，平均鏈長，磷酸含量，成糊特性，淀粉顆粒的大小和/或形狀。通過增加本發明所述蛋白質的活性，例如，通過過量表達各個核酸分子，或利用不再受細胞特異性調控機制支配和/或其活性為不同的溫度依賴性的突變體有可能增加經遺傳修飾的植物的產量。干擾小麥淀粉合成的可能性的經濟意義不言而喻，因為此植物產生相當量的淀粉。
因此，可以在植物細胞中表達本發明的核酸分子以增加各個淀粉合酶的活性，或者可將它們導入通常不表達所述酶的細胞中。另外，可通過本領域技術人員已知的方法修飾本發明的核酸分子以產生本發明的淀粉合酶，該淀粉合酶不再受細胞特異性調控機制的支配，或可顯示出經修飾的溫度依賴性或底物相對產物特異性。
在植物中表達本發明的核酸分子時，合成的蛋白質理論上可位于植物細胞內任何所需的區室中。為了使蛋白質位于特定的區室內，必須缺失確保在質體中定位的序列，余下的編碼區可任選地與確保在各個區室中定位的DNA序列連接，這樣的序列是已知的(例見Braun等，EMBOJ，11(1992)，3219-3227；Wolter等，美國國家科學院院報，85(1988)，846-850；Sonnewald等，植物學雜志，1(1991)，95-106)。
本發明也涉及本發明植物的增殖材料，如果實、種子、塊莖、根莖、秧苗、插枝、愈傷組織、細胞培養物等。
源于本發明的轉基因植物細胞、植物以及增殖材料的淀粉也是本發明的主題。
由于至少一種本發明的核酸分子的表達、或(某些情況下為)額外的表達，本發明所述的轉基因植物細胞和植物合成的淀粉與野生型植物合成的淀粉相比，在其物理-化學特性方面有所修飾，特別是在其直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率、分支的程度、平均鏈長、磷酸含量、成糊特性、淀粉顆粒的大小和/或形狀等方面有所修飾。與野生型淀粉相比，這樣的淀粉特別是在其粘度和/或此淀粉膠的凝膠結構特性方面有所修飾。
與未經轉化的植物相比，其中至少一種本發明的蛋白質的活性有所降低的轉基因植物細胞是本發明的另一個主題。
利用本發明的核酸分子可以產生其中至少一種本發明的蛋白質的活性有所降低的植物細胞和植物，這也可導致與野生型植物細胞產生的淀粉相比具有經修飾的化學和/或物理特性的淀粉的合成。
使用本發明的核酸分子，通過表達至少一種有義RNA的至少一種相應的反義RNA以達到共抑制的效應，或表達至少一種相應構建的可特異性切割編碼本發明蛋白質之一的轉錄物的核酶，即可產生其內至少一種本發明的蛋白質活性降低的植物細胞。為了表達反義RNA，一方面可使用含有編碼本發明蛋白質之完整序列、包括可能存在的側翼序列的DNA分子，以及僅含有編碼序列的一部分的DNA分子，所述部分序列應足夠長以促進細胞內的反義效果。基本上，序列長度最低為15bp，優選長度為100-500bp，為了有效地進行反義抑制，尤其可使用長度超過500bp的序列。通常使用的DNA分子小于5000bp，優選序列長度小于2500bp。
也可使用與本發明DNA分子的序列具有高度同源性但不完全相同的DNA序列，最低的同源性應大于65％，優選利用同源性為95-100％的序列。
本領域技術人員熟知利用共抑制效應降低植物細胞中本發明酶之活性的方法，有關描述參見例如Jorgensen(生物技術動態(TrendsBiotechnol.)，8(1990)，340-344)，Niebel等(現代微生物學和免疫學專題(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)，197(1995)，91-103)，Flavell等(現代微生物學和免疫學專題，197(1995)，43-46)，Palaqui和Vaucheret(植物分子生物學，29(1995)，149-159)，Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.，248(1995)，311-317)，de Borne等(Mol.Gen.Genet.，243(1994)，613-621)等其它文獻。
本領域技術人員已知為了降低細胞中某些酶的活性可表達相應的核酶，有關描述可參見例如EP-B1 0 321 201，有關植物細胞中核酶的表達描述于Feyter等(Mol.Gen.Genet.250(1996)，329-338)。
另外，含有上述本發明的轉基因植物細胞的植物也是本發明的主題。利用本領域技術人員熟知的方法可使本發明的植物細胞再生為整個植株。優選這些植物是上文提及的那些，特別是有用的植物，尤其是合成淀粉或(某些情況下可以是)儲藏淀粉的植物，本發明中特別優選的是小麥。
本發明也涉及本發明植物的增殖材料，特別是果實、種子、塊莖、根莖、秧苗、插枝、愈傷組織、細胞培養物等。
另外，得自上述轉基因植物細胞、植物以及增殖材料的淀粉也是本發明的主題。
由于至少一種本發明蛋白質的活性的降低，本發明的轉基因植物細胞和植物合成的淀粉與野生型植物合成的淀粉相比，其物理-化學特性有所修飾，特別是其直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率、分支的程度、平均鏈長、磷酸含量、成糊特性、淀粉顆粒的大小和/或形狀等方面有所修飾。與來源于野生型植物的淀粉相比，這種淀粉比如可能在其粘度和/或其膠的凝膠結構特性方面有所修飾。
可根據本領域技術人員熟知的技術修飾本發明的淀粉；未經修飾的淀粉以及修飾形式的淀粉適用于糧食或非糧食行業。
淀粉可能的用途基本上可次分為兩個主要的領域，一個領域包括通過酶解或化學方法得到淀粉的水解產物，主要是葡萄糖和葡聚糖組分，可將所述水解產物用作其它化學修飾和方法(如發酵)的起始物質。在本申請中，重要的是水解過程可簡單地、便宜地進行。最近，基本上使用淀粉葡糖苷酶酶解進行水解反應。可以想象通過因淀粉結構的變化如谷物表面的增加所致的水解酶使用量的減少、因限制所用酶進入能力的分支或空間結構較少所致的可消化能力的改善可以降低花費。因淀粉的聚合物結構為所謂的天然淀粉而使用淀粉的其它領域可被次分為另外兩個領域1.用于糧食淀粉是多種糧食的典型添加物，其中淀粉的主要目的是結合含水的添加物和/或導致粘度增加或凝膠結構增加。重要的特性是流動和吸附作用，膨脹和成糊溫度，粘度和稠化特性，淀粉的溶解性，透明度和糊劑結構，對熱、剪切力和酸的抗性，反向傾向，薄膜形成能力，對冷凍/融化的抗性，可消化能力以及與如無機或有機離子形成復合物的能力。
應用天然淀粉的優選領域是面包房-食品和面團領域。
2.用于非糧食類淀粉的其它主要應用領域是用作多種生產過程中的佐劑或技術產物中的添加物。淀粉用作佐劑的主要應用領域首推造紙和紙板工業，在此領域中，淀粉作為固化物主要用于保留(阻擋固體)，給填料和精細顆粒上漿并可用于脫水。另外，可利用淀粉在粘稠性、硬度、可靠性(sound)、握力、光澤度、光滑性、拉扯強度以及外觀方面的有利特性。
2.1造紙和紙板工業在造紙過程中，可將四個應用領域，即表面處理、涂層、聚集和噴涂分開。
在表面處理方面對淀粉的需求實質上為高水平的亮度、相應的粘度、高粘度穩定性、形成良好的薄膜以及形成較少灰塵。當用于涂層時，固體含量、相應的粘度、高結合能力以及高的顏料親和性起著重要的作用。作為聚集時的添加物，重要的是快速、均一、無損耗的分散、高機械穩定性和完全保留在紙漿中。當使用淀粉噴涂時，固體的相應含量、高粘度以及高結合能力也很重要。
2.2粘合劑工業應用的主要領域是例如粘合劑工業，該應用領域可次分為四個領域用作純粹的淀粉膠，用于用特殊化合物制備的淀粉膠，將淀粉用作合成樹脂和聚合物分散相的添加物，以及將淀粉用作合成添加物的膨脹劑。所有基于淀粉的添加物中有90％被用于生產波面紙板，硬紙袋和包，紙和鋁的組合材料，紙箱，以及信封、郵票的濕潤膠等。
2.3紡織品和紡織品維護工業作為佐劑和添加物的另一種可能的用途是生產紡織品和紡織品維護產品。在紡織工業中，可區分下列四個應用領域淀粉用作上漿劑，即作為光滑和強化除草籽特性的佐劑以獲得抗紡織中活躍之張力的保護作用以及在紡織過程中增加磨損抗性；作為主要在使質量退化的預處理，如漂白、染色等之后改良紡織品的試劑；作為染料糊劑生產中的增稠劑以防止染料擴散；和作為縫合紗的扭曲劑的添加物。
2.4建筑工業淀粉應用的第四個領域是用作建筑材料的添加物，一個例子是生產灰膠紙柏板，其中用水使混合于稀灰漿中的淀粉糊化，淀粉在灰膠紙柏板的表面進行擴散，從而使紙板與板結合。應用的其它領域是將淀粉與灰漿和礦物纖維混合。在混合好的凝結物中，可使用淀粉以使上漿的進程減速。
2.5研磨的穩定化另外，淀粉利于生產用于研磨穩定化的設備，該設備可用于臨時保護研磨顆粒抗人工土轉動中的水。根據現有技術的知識，可認為由淀粉和聚合物乳劑組成的混合產物與目前使用的產品具有相同的可減少腐蝕和結殼的效果，但前者相對較便宜。
2.6淀粉用于植物保護劑和肥料另一個應用領域是將淀粉用于植物保護劑以修飾這些制品的特殊特性，例如，淀粉可用于改善植物保護劑和肥料的濕度，活性組分的劑量釋放，將液體的、易揮發的和/或有氣味的活性組分轉變為微晶的、穩定的、可變形的物質，混合不相容的組合物，以及因破碎減少而導致的作用時期延長。
2.7藥物、藥品和化妝品工業淀粉也可用于藥物、藥品和化妝品工業領域。在制藥工業中，淀粉可用作片劑的結合劑或用于膠囊內的結合劑的稀釋中。另外，淀粉也適用于片劑的崩解劑，因為通過吞咽，淀粉吸收了液體，短時間后，淀粉膨脹以使活性組分被釋放出來。為了質量的原因，藥品的流動性和噴灑的粉末是另一個應用領域。在化妝品領域，淀粉可用作例如粉末添加物的載體，所述添加物為香味劑和水楊酸。淀粉相對較廣泛的應用領域是牙膏。
2.8淀粉用作煤炭和煤球的添加物淀粉也可用作煤炭和煤球的添加物。通過加入淀粉，煤炭可以定量凝聚和/或以高質量成球，從而防止煤球在球化之前崩解。燒烤用的煤炭含有4-6％加入的淀粉，加熱用的煤炭含有0.1-0.5％加入的淀粉。另外，淀粉適于用作結合劑，因為將淀粉加入煤炭和煤球中可以在很大程度上減少有毒物質的散發。
2.9礦石和煤漿的加工另外，在礦石和煤漿的加工過程中，淀粉也可用作絮凝劑。
2.10淀粉用作鑄造中的添加物另一個應用領域是用作鑄造中加工材料的添加物。對于多種鑄造過程而言，需要由粗礦石與結合劑混合以產生核心。目前，最常用的結合劑是與經修飾的淀粉、多半為膨脹淀粉混合的膨潤土。
加入淀粉的目的是增加流動抗性以及改善結合強度，另外，膨脹淀粉可滿足更多的生產過程中的先決條件，如在冷水中的分散能力、重新水合的能力、與粗礦石良好的混合能力和高的結合水的能力。
2.11淀粉用于橡膠工業在橡膠工業中，淀粉可用于改良技術和光學質量，原因是可改良表面光澤度、握力和外觀。為此，在冷硬化之前將淀粉分散于橡膠物質粘性的涂有橡膠的表面。淀粉也可用于改良橡膠的可印刷能力。
2.12生產皮革代用品經修飾之淀粉的另一個應用領域是生產皮革代用品。
2.13合成聚合物中的淀粉在塑料市場出現了下列應用領域在加工過程中摻入源于淀粉的產物(淀粉僅是填料，合成的聚合物和淀粉之間沒有直接的連鍵)或，另一種選擇是生產聚合物時摻入源于淀粉的產物(淀粉和聚合物形成穩定的鍵)。
純粹只用作填料的淀粉不能與其它物質比如滑石競爭。當特殊的淀粉特性變得有效，從而終產物的特性分布明顯改變時情況會有所不同。一個例子是在加工熱塑材料如聚乙烯時使用淀粉產物，籍此，利用共表達，按1∶1的比率混合淀粉和合成的聚合物以形成母料，由此可通過使用顆粒化聚乙烯的普通技術產生多種產物。淀粉摻入聚乙烯薄膜中可增加中空體中物質的滲透性，改良水蒸氣的滲透性，改良抗靜電特性，改良抗阻塞特性以及改良含水染料在其上的印刷能力。淀粉還可以用于聚氨酯泡沫，由于淀粉衍生物的變動以及由于加工技術的最優化，可以特異性地控制合成聚合物和淀粉羥基之間的反應，結果因使用了淀粉使得聚氨酯薄膜具有下列特性分布熱擴張系數降低，收縮特性降低，壓力/張力特性得以改良，水蒸氣滲透性增加而接受水的能力未變，燃燒能力和裂化密度降低，不會脫落易燃的部分，不含鹵化物，并能減緩老化。目前仍存在的不利之處是壓力和沖擊強度有所降低。
薄膜的產品開發不是唯一的選擇，利用超過50％的淀粉含量也可產生固體塑料產品，如盆、盤和碗。另外，淀粉/聚合物混合物提供了更易于生物降解的優點。
另外，由于淀粉與水結合的極端能力，淀粉移植的聚合物最為重要。這些產品具有淀粉骨架和根據基鏈機理移植到淀粉上的合成單體的側格。目前可用的淀粉移植聚合物的特色在于其具有高粘度的達1000克水/克淀粉的改良的結合和保留能力。這些超級吸附劑主要用于衛生學領域如尿布和床單這類的產品，以及農業部門如種子顆粒。
如何選擇使用經重組DNA技術修飾的新淀粉一方面取決于結構，水含量，蛋白質含量，脂質含量，纖維含量，灰分/磷酸含量，直鏈淀粉/支鏈淀粉比率，相對分子量的分布，分支的程度，顆粒大小和形狀以及結晶作用；另一方面取決于導致下列特征的特性流動和吸附特性，糊化溫度，粘度，增稠特性，溶解性，糊劑結構，透明度，對熱，剪切力和酸的抗性，反向傾向，形成凝膠的能力，對冷凍/融化的抗性，形成復合物的能力，碘結合性，薄膜形成，粘附強度，酶穩定性，可消化能力和反應性。
經遺傳操作轉基因植物對已修飾淀粉的生產可以某種途徑修飾源于所述植物的淀粉的特性從而沒有必要通過化學或物理方法對其進一步修飾。另一方面，通過重組DNA技術修飾的淀粉可能會經受進一步的化學修飾，由此導致進一步改善上述某些應用領域的質量。這些化學修飾理論上是本領域技術人員已知的，它們尤其是通過-熱處理-酸處理-氧化處理和-酯化處理進行的修飾，所述修飾會導致磷酸酯、硝酸酯、硫酸酯、黃原酸酯、醋酸酯和檸檬酸酯淀粉的形成。其它有機酸也可以用于酯化-形成淀粉醚淀粉烷基醚，O-烯丙醚，羥烷基醚，O-羧甲基醚，含N的淀粉醚，含P的淀粉醚，和含S的淀粉醚-形成分支淀粉-形成淀粉移植的聚合物。
優選將本發明的淀粉用于生產包裝和一次性使用的材料。
為了在植物細胞中以有義或反義方向表達本發明的核酸分子，可將所述核酸分子與確保在植物細胞中轉錄的調控DNA元件連接。特別地，這種調控DNA元件是啟動子，基本上在植物細胞中有活性的任何啟動子都可用于表達。
可選擇啟動子以便組成型表達或在某個組織中表達，在植物發育的某個時間點或由內部環境決定的某個時間點表達。對于植物而言，啟動子可以是同源的或異源的。用于組成型表達的適當啟動子是例如花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子和玉米遍在蛋白啟動子。為了在馬鈴薯中進行塊莖特異性表達，可使用patatin基因啟動子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.，8(1989)，23-29)。可確保僅在光合活性組織中表達的啟動子的一個例子是ST-LS1啟動子(Stockhaus等，美國國家科學院院報，84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.，8(1989)，2445-2451)。小麥HMG啟動子、USP啟動子、云扁豆蛋白啟動子或玉米醇溶蛋白基因啟動子適用于胚乳特異性表達。另外，也可存在終止序列，該序列可用于正確地終止轉錄并給轉錄物加上一polyA尾，據信這可以穩定該轉錄物。這樣的元件描述于文獻中(參見Gielen等，EMBO J.，8(1989)，23-29)，并可根據需要進行更換。
本發明提供了編碼兩種不同類型的小麥淀粉合酶的核酸分子，從而能夠鑒定這些同種型在淀粉生物合成中的功能，而且能夠生產經遺傳修飾的植物，所述植物中至少一種所述酶的活性有所修飾。這樣使得可在按此方式操作得到的植物中合成具有經修飾的結構因而具有經修飾的物理-化學特性的淀粉。
也可使用本發明的核酸分子來生產植物，該植物中至少有一種本發明的淀粉合酶的活性有所增加或降低，或者是在此同時，該植物參與淀粉生物合成的其它酶的活性也有修飾。因此，所有種類的組合和替代都是可以想到的。通過修飾植物中一種或多種淀粉合酶同種型的活性，即可合成其結構經過修飾的淀粉。通過增加經轉化植物的淀粉儲存組織(如玉米或小麥的胚乳或馬鈴薯的塊莖)的細胞中一種或多種淀粉合酶同種型的活性，即可增加產量。例如，編碼本發明蛋白質的核酸分子或相應的反義構建體可整合到植物細胞中；因反義效應或突變，該細胞中內源GBSS I-、SSS-或GBSS II-蛋白的合成已被抑制，或該細胞中分支酶的合成已被抑制(例見Nakamura等(文獻同上))。
如果想抑制轉化植物中幾種淀粉合酶的合成，可使用DNA分子進行轉化，所述DNA分子同時含有幾個反義方向的受適當啟動子控制的區域，所述區域編碼相應的淀粉合酶。此處每個序列可由其自身的啟動子控制，或者這些序列也可以共同啟動子的融合形式轉錄。一般優選后者，因為在這種情況下，各個蛋白質的合成應可以抑制到大致相同的程度。
另外，可以構建DNA分子，其中除了含有編碼淀粉合酶的DNA序列以外，還含有編碼參與淀粉合成的其它蛋白質或其修飾形式的DNA序列。可再次將序列按順序連接，并通過共同的啟動子轉錄。至于這種構建體中所用的各個編碼區的長度，與涉及反義構建體產生的上述討論是一樣的。由這種DNA分子中的啟動子轉錄的反義片段的數目沒有上限，然而所得轉錄物應該不大于10kb，優選為5kb。
與其它編碼區一起位于這樣的DNA分子中適當啟動子之后的反義方向上的編碼區可得自編碼下列蛋白質的DNA序列與顆粒結合的淀粉合酶(GBSS I和II)，其它可溶性淀粉合酶，分支酶，去分支酶，歧化酶和淀粉磷酸化酶，這種列舉只是為了舉例，也可以在這樣的聯合構架內使用其它DNA序列。
利用這種構建體可以在被這些分子轉化的植物細胞內同時抑制幾種酶的合成。
另外，構建體也可整合到標準的突變體中，所述突變體中一個或多個淀粉生物合成的基因有缺陷。這些缺陷與下列蛋白質有關與顆粒結合的淀粉合酶(GBSS I和II)和可溶性淀粉合酶(SSS I和II)，分支酶(BEI和II)，去分支酶(R-酶)，歧化酶和淀粉磷酸化酶，這種列舉只是為了舉例。
利用這種策略，還可以在被這些核酸分子轉化的植物細胞內同時抑制幾種酶的合成。為了使外源基因整合到高等植物中，可使用大量克隆載體，所述載體含有大腸桿菌的復制信號和用于選擇經轉化的細菌細胞的標記基因。這種載體的例子是pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。所需序列可整合到載體中的適當限制性位點處。將所得質粒用于轉化大腸桿菌細胞，在適當培養基中培養經轉化的大腸桿菌細胞，隨后收集細胞并裂解之，回收質粒。至于鑒定所得質粒DNA的分析方法，通常使用限制性分析、凝膠電泳和其它生物化學-分子生物學方法。每次操作后，可切割質粒DNA，將所得DNA片段與其它DNA序列連接。可將每種質粒DNA克隆到相同的或其它質粒中。可使用多種技術將DNA整合到植物宿主細胞中，這些技術包括使用根癌土壤桿菌或發根土壤桿菌作為轉化介質用T-DNA轉化植物細胞、原生質體融合、DNA注射和電穿孔，利用biolistic法整合DNA以及其它技術。
對于注射、biolistic法和將DNA電穿孔至植物細胞的技術而言，對所用的質粒沒有特別的要求，可使用如pUC衍生物這樣的簡單質粒。然而，在由按此方式轉化的細胞再生整個植株的情況下，應存在選擇性的標記基因。
取決于將所需基因整合至植物細胞的方法，可能必需其它的DNA序列。如果使用Ti或Ri質粒轉化植物細胞，通常應至少將Ti和Ri質粒T-DNA的右邊緣序列、然而更通常應將其右和左邊緣序列與外源基因連接以作為側翼區域整合。
如果使用土壤桿菌轉化，應將待整合的DNA克隆至特殊的質粒中，即或者克隆至中間載體中，或者克隆至二元載體中。由于與T-DNA序列同源的序列，中間體載體可因同源重組整合到土壤桿菌的Ti或Ri質粒中。所述質粒也含有T-DNA轉移所必需的vir-區域，中間載體在土壤桿菌中不能復制。利用輔助質粒可使中間載體轉移至根癌土壤桿菌中(接合)。二元載體在大腸桿菌以及土壤桿菌中都可復制，它們含有選擇性標記基因以及由右和左T-DNA邊緣區域所包圍的接頭或多接頭。可直接將它們轉化至土壤桿菌中(Holsters等，Mol.Gen.Genet.，163(1978)，181-187)。用作宿主細胞的土壤桿菌應含攜有vir-區域的質粒。通常vir-區域是將T-DNA轉移到植物細胞中所必需的。也可能存在其它的T-DNA。使用以此方式轉化的土壤桿菌轉化植物細胞。
使用T-DNA轉化植物細胞已得到深入研究，詳細的描述見EP120516；Hoekema，二元植物載體系統Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等，植物科學的評論性綜述，4，1-46和An等，EMBO J.，4(1985)，277-287。
為了將DNA轉移至植物細胞，植物外植體適于與根癌土壤桿菌或發根土壤桿菌共培養。然后在適當的培養基中由被感染的植物材料(如葉片、莖的節段、根、以及原生質體或懸浮培養的植物細胞)再生整個植株，所述培養基中含有抗生素或殺生物劑(biozide)以選擇經轉化的細胞。然后檢測以此方式得到的植物中是否存在整合的DNA。通過使用biolistic法或通過轉化原生質體整合外源DNA的其它方法是本領域技術人員已知的(例見Willmitzer，L.，1993，轉基因植物生物技術，多卷論文集(H.J.Rehm，G.Reed，A.Puhler，P.Stadler編)，第2卷，627-659，VCH Weiheim-New York-Basel-Cambridge)。
轉化單子葉植物的其它系統是利用biolistic法轉化、電學或化學誘導DNA整合至原生質體中、部分滲透細胞的電穿孔、將DNA大量注射到花序中、將DNA微量注射到微孢子和原胚中、通過使花粉萌發整合DNA、通過膨脹將DNA整合到胚中(參見Potrykus，植物生理學(1990)，269-273)。
盡管通過利用根癌土壤桿菌的Ti質粒載體系統轉化雙子葉植物是成熟的方法，但最新研究表明也可使用基于土壤桿菌的載體轉化單子葉植物(Chan等，植物分子生物學，22(1993)，491-506；Hiei等，植物學雜志，6(1994)，271-282；Bytebier等，美國國家科學院院報，84(1987)，5345-5349；Raineri等，Bio/Technology 8(1990)，33-38；Gould等，植物生理學，95(1991)，426-434；Mooney等，植物、細胞組織和器官培養，25(1991)，209-218；Li等，植物分子生物學，20(1992)，1037-1048)。
以前已為多種類型的谷物建立了上述轉化系統中的三個植物組織的電穿孔、原生質體的轉化和通過對再生組織和細胞進行顆粒轟擊來轉移DNA(例見Jahne等，Euphytica 85(1995)，35-44)。
在相應的文獻中以多種方式描述了小麥的轉化(參見Maheshwari等，植物科學的評論性綜述，14(2)(1995)，149-178)。Hess等人(植物科學，72(1990)，233)使用大量注射以使花粉和土壤桿菌相互靠近。通過Southern印跡分析和NPTII試驗證明了含有nptII基因作為選擇性標記的質粒的轉移。轉化體構成了正常的表型，并且是可育的，在兩個連續的世代中都證明了卡那霉素抗性。
Vasil等人(Bio/Technology，10(1992)，667-674)描述了第一個轉基因的、可育的小麥植株，該植株被與微粒結合的DNA轟擊后可再生。轟擊的靶組織是胚性愈傷組織培養物(C型愈傷組織)。使用bar基因作為選擇性標記基因，該基因編碼膦絲菌素(phosphinotricine)磷酸轉移酶因而可賦予對除草劑膦絲菌素的抗性。
Weeks等人(植物生理學，102(1993)，1077-1084)以及Becker等人(植物學雜志，5(2)(1994)，299-307)描述了其它系統。此處將未成熟胚的盾片用作DNA轉化的靶組織。在一個導入性的體外相中，處理盾片使其可誘導體細胞胚。與Weeks等人建立的系統相比，在Becker等人(文獻同上)開發的系統中轉化效率相當高，為每83個‘Florida’類的胚可得到1株轉基因植物，而前者為每1000個‘Bobwhite’類的胚僅可得到1-2株轉基因植物。
由Becker等人(文獻同上)開發的系統構成了實施例所述轉化實驗的基礎。
一旦被導入的DNA已整合到植物細胞的基因組中，通常該DNA會在基因組中持續穩定，在原始轉化細胞的子代中也能維持穩定。該DNA通常還含有選擇性標記，該標記可賦予經轉化的植物細胞對殺生物劑如膦絲菌素的抗性，或對抗生素比如卡那霉素、G418、博來霉素或潮霉素等的抗性，因此，獨立選擇的標記應可允許從缺乏整合的DNA的細胞中選擇出以被轉化的細胞。
可使用植物學中常用的方法培養經轉化的細胞(見McCormick等人，植物細胞通訊5(1986)，81-84)。可以通常的方式培養所得植物，并與具有相同的轉化遺傳特性或另一種遺傳特性的植物雜交育種，所得雜合個體具有相應的表型特征。該植物細胞可產生種子。
應培養兩代或更多代以確保表型特征是否能保持穩定，以及是否會傳遞。另外，應收獲種子以確保相應的表型或其它特性可以維持。
在實施例中使用了下列方法1.克隆為了在大腸桿菌中克隆，使用了載體pBluescipt II SK(Stra-tagene)。
2.細菌菌株針對Bluescipt載體和反義構建體使用了大腸桿菌菌株DH5α(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburgh，USA)。為進行體內切割使用了大腸桿菌菌株XL1-Blue。
3.轉化未成熟的小麥胚所用培養基MS100ml/l 大分子鹽1ml/l小分子鹽2ml/lFe/NaEDTA30g/l蔗糖(D.Becker和H.Lorz，植物組織培養手冊(1996)，B121-20)#30MS+2.4-D(2mg/l)#31MS+2.4-D(2mg/l)+膦絲菌素(PPT，除草劑BASTA的活性組分(2mg/l))#32MS+2.4-D(0,1mg/l)+PPT(2mg/l)#39MS+2.4-D(2mg/l)+各0.5M甘露糖/山梨糖醇用KOH將所述培養基的pH值調節至5.6，并用0.3％的Gelrite加固。
Becker和Lorz(D.Becker和H.Lorz，植物組織培養手冊(1996)，B121-20)開發并優化了轉化小麥未成熟胚的方法。
在下文所述的實驗中，觀察到由Becker和Lorz(文獻同上)制訂的方案。為了轉化，可在開花之后收獲12-14天發育階段中的帶穎果的復穗狀花序，并對該花序進行表面滅菌。將分離的盾片鋪平，使其胚軸線面向誘導培養基#30。
預培養(26℃，黑暗)2-4天后，將外植體轉移到#39培養基上，以進行滲透預培養(2-4小時，26℃，黑暗)。
對于biolistic轉化而言，每次轟擊使用29μg金顆粒，所述顆粒上已沉淀了5μg或73ng靶DNA。由于所進行的實驗是共轉化，按1∶1的比率在沉淀混合物中加入靶DNA，所述靶DNA由靶基因和抗性標記基因(bar基因)組成。
4.用DIG標記DNA片段通過特異性PCR摻入DIG標記的dUTP(Boehringer Mannheim，德國)可標記用作篩選探針的DNA片段。
實施例1鑒定、分離和表征編碼小麥(Tricitum aestivum L.，cvFlorida)可溶性淀粉合酶的cDNA由約21日齡的小麥穎果的poly(A)+-RNA合成cDNA，根據廠商的方案(ZAP-cDNA合成試劑盒和ZAP-cDNA Gigapack II GoldCloning試劑盒，Stratagene GmbH，Heidelberg)進行下文提及的所有實驗。
測定cDNA文庫的滴度之后，發現原始滴度為1.25×106pfu/ml。利用經DIG標記的DNA片段進行篩選。將編碼水稻可溶性淀粉合酶之亞片段的經DIG-標記的PCR片段(Baba等，文獻同上)用作探針，PCR所用引物的序列為R1ACA GGA TCC TGT GCT ATG CGG CGT GTG AAG (Seq.ID No.3)R2TTG GGA TCC GCA ATG CCC ACA GCA TTT TTT TC(Seq.ID No.4)為了進行篩選，在每個平板(直徑15cm)上平鋪約5×104pfu，挑選陽性克隆。通過體內切割得到單個分離的克隆，即pBluescript SK(-)噬菌粒。
利用少量制備法分析克隆之后和對質粒DNA進行限制性分析之后，進一步地加工TaSSS克隆。
實施例2 pTaSSS質粒的cDNA插入片段的序列分析分離克隆TaSSS的質粒DNA，通過雙脫氧核苷酸法(Sanger等，美國國家科學院院報，74(1977)，5463-5467)測定cDNA插入片段的序列。
首先測定含有SEQ ID NO1所示的核苷酸186-2239的部分序列，在該序列5’末端含有一多余的G殘基。克隆TaSSS的插入片段長度為2239bp，并構成了幾乎全長的cDNA，該核苷酸序列示于SEQ IDNO1，相應的氨基酸序列示于SEQ ID NO2。推定的信號肽切割位點位于SEQ ID NO1所示氨基酸殘基33和34之間。
序列分析和與已公開的序列的比較表明SEQ ID NO1所示序列是新序列并含有幾乎全長的編碼區，該編碼區表現出與其它生物體的可溶性淀粉合酶具有同源性。分子生物學領域的技術人員利用TaSSS的部分cDNA序列能分離出5’區缺失掉的區域，從而得到完整的cDNA克隆。為此可使用克隆TaSSS的5’區作為探針以篩選完整的cDNA，通過利用雜交的標準方法可分離完整的克隆，另一方面，通過使用5’-Race-法(如Boehringer Mannheim或其它廠商)可得到所缺失掉的5’末端。
實施例3植物轉化載體pTaSSS-as的制備為了表達小麥分離的cDNA的反義RNA，以pUC19為基本質粒設計植物轉化載體，其中在反義方向上將質粒pTaSSS的cDNA插入片段與DNA片段連接，因此表達受到遍在蛋白啟動子的控制。此啟動子由玉米遍在蛋白1基因第一個未翻譯的外顯子和第一個內含子組成(Christen-sen A.H.等，植物分子生物學，18(1992)，675-689)。
多接頭和NOS-終止子部分得自質粒pAct1.cas(CAMBIA，TG0063；Cambia，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，澳大利亞)，McElroy等人描述了具有此終止子的載體構建體和基于pAct1.cas的構建體(分子育種1(1995)，27-37)。使用如上所述的pTaSSS轉化小麥。
實施例4鑒定、分離和表征編碼小麥(Tricitum aestivum L.，cvFlorida)淀粉合酶的另一個cDNA在目前已知的編碼植物可溶性的和與顆粒結合的淀粉合酶序列的比較中，可明顯看出不同蛋白質有3個高度保守的區域。
為了分離小麥可溶性淀粉合酶，選擇這3個區域以產生多克隆的肽抗體，因此，制備具有下列氨基酸序列的3個合成多肽肽1NH2-PWSKTGGLGDVC-COOH(SEQ ID NO7)肽2NH2-PSRFEPCGLNQLY-COOH (SEQ ID NO8)肽3NH2-GTGGLRDTVENC-COOH(SEQ ID NO9)將這些肽與KLH載體(匙孔血藍蛋白)偶聯，隨后用于在兔(Eurogentec，Seraing，比利時)中制備多克隆抗體。
所得抗體被稱為
抗肽1的抗SS1多克隆抗體，抗肽2的抗SS2多克隆抗體，抗肽3的抗SS3多克隆抗體。
隨后使用抗體以在小麥穎果的cDNA文庫中篩選出編碼小麥淀粉合酶的序列。為此，可使用按實施例1所述產生的cDNA表達文庫。為了分析噬菌體的噬斑，將所述文庫轉移到硝酸纖維素濾膜上，該濾膜已預先在10mM IPTG溶液中保溫30-60分鐘，并在Whatman濾紙上干燥好。37℃下轉移3小時，然后于室溫下將濾膜與封閉溶液保溫30分鐘，再用TBST-緩沖液洗滌兩次達5-10分鐘。將濾膜與適當稀釋度的多克隆抗體一起在室溫下振蕩1小時或在4℃下振蕩16小時。根據廠商的說明書，利用Immun-Blot Assay試劑盒和山羊抗兔IgG(Biorad)鑒定出表達了已被一種抗體所識別的蛋白質的噬斑。使用標準方法進一步純化cDNA文庫中表達了已被一種抗體所識別的蛋白質的噬菌體克隆。利用體內切割法(Strategene)由陽性噬菌體克隆產生大腸桿菌克隆，該大腸桿菌克隆含有雙鏈pBluescript II SK質粒，相應的cDNA插入片段位于多接頭的EcoRI和XhoI位點之間。檢查插入片段的大小和限制性切割的模式之后，對適當的克隆TaSSS進行序列分析。
實施例5 pTaSS1質粒的cDNA插入片段的序列分析由pTaSS1克隆分離質粒DNA，通過使用雙脫氧核苷酸法(Sanger等，美國國家科學院院報，74(1977)，5463-5467)的標準方法測定cDNA插入片段的序列。
首先測定含有SEQ ID NO5所示的核苷酸1084-2825的部分序列。pTaSS1克隆插入片段的長度為2825bp，并構成了完整的cDNA，該核苷酸序列示于SEQ ID NO5，相應的氨基酸序列示于SEQID NO6。
序列分析和與已公開的序列的比較表明SEQ ID NO5所示序列是新序列并含有編碼區，該編碼區表現出與其它生物體的淀粉合酶具有同源性。推測此cDNA編碼的蛋白質具有與顆粒結合性淀粉合酶的生物活性。
另外，由于與信號肽切割位點的已知一致序列具有同源性，已發現推定的信號轉運肽在SEQ ID NO6所示氨基酸序列的第57和58或第60和61位之間發生切割。
實施例6植物轉化載體pTaSS1-as的制備為了表達小麥分離的cDNA的部分反義RNA，以pUC19為基本質粒構建植物轉化載體，植物轉化載體在反義方向上部分含有質粒pTaSS1的cDNA插入片段。表達受遍在蛋白啟動子的控制，此啟動子由玉米遍在蛋白1基因第一個未翻譯的外顯子和第一個內含子組成(Christen-sen A.H.等，植物分子生物學，18(1992)，675-689)。
多接頭和NOS終止子部分得自質粒pAct.cas(CAMBIA，TG0063；Cambia，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，澳大利亞)，McElroy等人描述了具有此終止子的載體構建體和基于pAct1.cas的構建體(分子育種，1(1995)，27-37)。
使用如上所述的pTaSS1-as載體轉化小麥。
實施例7大腸桿菌突變體與編碼小麥可溶性淀粉合酶的cDNA克隆互補通過互補實驗分析由cDNA克隆TaSSS(實施例2)編碼的可溶性淀粉合酶的酶活性，所述互補實驗使用了大腸桿菌突變體Hfr G6MD2(M.Schwartz菌株；CGSC#5080；大腸桿菌遺傳保藏中心，NewHavan，美國)作為宿主以表達基因。該大腸桿菌突變體表現出編碼細菌ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(glg C)、糖原合酶(glg A)和分支酶(glg B)的glg操縱子的缺失。該突變導致不能經ADP-葡萄糖途徑合成糖原。另外，mal A操縱子的缺失阻止了由淀粉麥芽糖酶合成線性α-1，4-葡聚糖(mal Q)。
通過質粒pTaSSSΔ188和pACAG共轉化突變體G6MD2來檢測可溶性淀粉合酶的功能性。質粒pTaSSSΔ188含有所說的2239bp cDNA序列的核苷酸188-2239，此段序列編碼可溶性淀粉合酶。將此cDNA作為EcoRI/XhoI片段插入pBluescript載體(Stratagene)的多接頭區域，這使得由載體編碼的β-半乳糖苷酶α肽的N末端與可溶性淀粉合酶的一部分讀框一致地融合。
對G6MD2中糖原合酶(glg A)突變的成功互補取決于ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的表達，該酶負責提供可作為α-1，4-葡聚糖合成之底物的ADP-葡萄糖，因此，共轉化質粒pACAG(Abel G.J.W.，(1995)，Untersuchungen zur Funktion von Starke-Synthasen in derKartoffel(Solanum tuberosum L.)，Dissertation，Freie UniversitatBerlin)，該質粒含有分離自大腸桿菌菌株LCB618的glg C基因座的編碼區(Baecker等，生物化學雜志，258(1983)5084-5088)，該編碼區受lacZ啟動子的控制。所編碼的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性受激活劑果糖-1，6-二磷酸和抑制劑AMP的影響較小，從而可以充足地提供ADP-葡萄糖。
將被構建體pTaSSSΔ188和pACAG共轉化的細胞平鋪在補加了1％葡萄糖、1mM IPTG和50μM二氨基庚二酸鹽的LB-瓊脂平板上。通過碘氣流染色所得菌落，經轉化的G6MD2細胞顯示出亮藍褐色，而未經轉化的菌落顯示出黃色，藍褐色表明表達的融合蛋白具有ADP葡萄糖α-1，4-葡聚糖4-α-葡糖基轉移酶的活性。
通過碘染色經構建體pACAG和pEc5.3共轉化的G6MD2細胞檢查該系統。質粒pEc5.3含有通過PCR技術分離自大腸桿菌菌株DH5α的糖原合酶(glg A)基因(Abel G.J.W.，(1995)，Untersuchungen zurFunktion von Starke-Synthasen in der Kartoffel(Solanum tuberosumL.)，Dissertation，Freie Universitat Berlin)。經碘染色后，已轉化的細胞顯示出暗藍色，這表明合成了α-1，4-葡聚糖。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)姓名Hoechst Schering AgrEvo GmbH(B)街道Miraustrasse 54(C)城市柏林(E)國家德國(F)郵編(ZIP)13509(ii)發明題目編碼小麥中參與淀粉合成的酶的核酸分子(iii)序列數9(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度2239個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA至mRNA(iii)假設否(iv)反義否(vi)原始來源(A)生物Triticum aestivum L.
(B)品系cv.Florida(E)單元型約21日齡的穎果(vii)直接來源
(A)文庫pBluescript sk(-)中的cDNA文庫(B)克隆TaSSS(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置3…2017(xi)序列描述SEQ ID NO1CG ACG CAG CCG CCC CTG CCG GAC GCC GGC GTG GGG GAA CTC GCG CCC 47Thr Gln Pro Pro Leu Pro Asp Ala Gly Val Gly Glu Leu Ala Pro1 5 10 15GAC CTC CTG CTC GAA GGG ATT GCT GAG GAT TCC ATC GAC AGC ATA ATT 95Asp Leu Leu Leu Glu Gly Ile Ala Glu Asp Ser Ile Asp Ser Ile Ile20 25 30GTG GCT GCA AGT GAG CAG GAT TCT GAG ATC ATG GAT GCG AAT GAG CAA143Val Ala Ala Ser Glu Gln Asp Ser Glu Ile Met Asp Ala Asn Glu Gln35 40 45CCT CAA GCT AAA GTT ACA CGT AGC ATC GTG TTT GTG ACT GGT GAA GCT191Pro Gln Ala Lys Val Thr Arg Ser Ile Val Phe Val Thr Gly Glu Ala50 55 60GCT CCT TAT GCA AAG TCA GGG GGG TTG GGA GAT GTT TGT GGT TCG TTA239Ala Pro Tyr Ala Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Val Cys Gly Ser Leu65 70 75CCA ATT GCT CTT GCT GCT CGT GGT CAC CGA GTG ATG GTT GTA ATG CCA287Pro Ile Ala Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Met Val Val Met Pro80 85 90 95AGA TAC TTA AAT GGG TCC TCT GAT AAA AAC TAT GCA AAG GCA TTA TAC335Arg Tyr Leu Asn Gly Ser Ser Asp Lys Asn Tyr Ala Lys Ala Leu Tyr100 105 110ACT GCG AAG CAC ATT AAG ATT CCA TGC TTT GGG GGA TCA CAT GAA GTG383Thr Ala Lys His Ile Lys Ile Pro Cys Phe Gly Gly Ser His Glu Val115 120 125ACC TTT TTT CAT GAG TAT AGA GAC AAC GTC GAT TGG GTG TTT GTC GAT431Thr Phe Phe His Glu Tyr Arg Asp Asn Val Asp Trp Val Phe Val Asp130 135 140CAT CCG TCA TAT CAC AGA CCA GGA AGT TTA TAT GGA GAT AAT TTT GGT479His Pro Ser Tyr His Arg Pro Gly Ser Leu Tyr Gly Asp Asn Phe Gly145 150 155GCT TTT GGT GAT AAT CAG TTC AGA TAC ACA CTC CTT TGC TAT GCT GCA527Ala Phe Gly Asp Asn Gln Phe Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ala Ala160 165 170 175
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ATT GAT CTC ATT AAA ATG GCC ATT CCA GAG CTC ATG AGG GAG GAC GTG1199Ile Asp Leu Ile Lys Met Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg Glu Asp Val385 390 395CAA TTT GTC ATG CTT GGA TCT GGG GAT CCA ATT TTT GAA GGC TGG ATG1247Gln Phe Val Met Leu Gly Ser Gly Asp Pro Ile Phe Glu Gly Trp Met400 405 410 415AGA TCT ACC GAG TCG AGT TAC AAG GAT AAA TTC CGT GGA TGG GTT GGA1295Arg Ser Thr Glu Ser Ser Tyr Lys Asp Lys Phe Arg Gly Trp Val Gly420 425 430TTT AGT GTT CCA GTT TCC CAC AGA ATA ACT GCA GGT TGC GAT ATA TTG1343Phe Ser Val Pro Val Ser His Arg Ile Thr Ala Gly Cys Asp Ile Leu435 440 445TTA ATG CCA TCG AGA TTT GAA CCT TGC GGT CTT AAT CAG CTA TAT GCT1391Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala450 455 460ATG CAA TAT GGT ACA GTT CCT GTA GTT CAT GGA ACT GGG GGC CTC CGA1439Met Gln Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Gly Thr Gly Gly Leu Arg465 470 475GAC ACA GTC GAG ACC TTC AAC CCT TTT GGT GCA AAA GGA GAG GAG GGT1487Asp Thr Val Glu Thr Phe Asn Pro Phe Gly Ala Lys Gly Glu Glu Gly480 485 490 495ACA GGG TGG GCG TTC TCA CCG CTA ACC GTG GAC AAG ATG TTG TGG GCA1535Thr Gly Trp Ala Phe Ser Pro Leu Thr Val Asp Lys Met Leu Trp Ala500 505 510TTG CGA ACC GCG ATG TCG ACA TTC AGG GAG CAC AAG CCG TCC TGG GAG1583Leu Arg Thr Ala Met Ser Thr Phe Arg Glu His Lys Pro Ser Trp Glu515 520 525GGG CTC ATG AAG CGA GGC ATG ACG AAA GAC CAT ACG TGG GAC CAT GCC1631Gly Leu Met Lys Arg Gly Met Thr Lys Asp His Thr Trp Asp His Ala530 535 540CCG AGC AGT ACG AGC AGA TCT TCG AGT GGG CCT TCG TGG ACC AAC CCT1679Pro Ser Ser Thr Ser Arg Ser Ser Ser Gly Pro Ser Trp Thr Asn Pro545 550 555ACG TCA TGT AGA CGG GGA CTG GGG AGG TCC AAG TGC GAG TCT CCT TCA1727Thr Ser Cys Arg Arg Gly Leu Gly Arg Ser Lys Cys Glu Ser Pro Ser560 565 570 575GCT CTG AAG ACA TCC TCT TCA TCC TTC CGC GGC CCG GAA GGA TAC CCC1775Ala Leu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Phe Arg Gly Pro Glu Gly Tyr Pro580 585 590
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(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度671個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Thr Gln Pro Pro Leu Pro Asp Ala Gly Val Gly Glu Leu Ala Pro Asp1 5 10 15Leu Leu Leu Glu Gly Ile Ala Glu Asp Ser Ile Asp Ser Ile Ile Val20 25 30Ala Ala Ser Glu Gln Asp Ser Glu Ile Met Asp Ala Asn Glu Gln Pro35 40 45Gln Ala Lys Val Thr Arg Ser Ile Val Phe Val Thr Gly Glu Ala Ala50 55 60Pro Tyr Ala Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Val Cys Gly Ser Leu Pro65 70 75 80Ile Ala Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Met Val Val Met Pro Arg85 90 95Tyr Leu Asn Gly Ser Ser Asp Lys Asn Tyr Ala Lys Ala Leu Tyr Thr100 105 110Ala Lys His Ile Lys Ile Pro Cys Phe Gly Gly Ser His Glu Val Thr115 120 125Phe Phe His Glu Tyr Arg Asp Asn Val Asp Trp Val Phe Val Asp His130 135 140Pro Ser Tyr His Arg Pro Gly Ser Leu Tyr Gly Asp Asn Phe Gly Ala145 150 155 160Phe Gly Asp Asn Gln Phe Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ala Ala Cys165 170 175Glu Ala Pro Leu Ile Leu Glu Leu Gly Gly Tyr Ile Tyr Gly Gln Asn180 185 190Cys Met Phe Val Val Asn Asp Trp His Ala Ser Leu Val Pro Val Leu195 200 205Leu Ala Ala Lys Tyr Arg Pro Tyr Gly Val Tyr Arg Asp Ser Arg Ser210 215 220Thr Leu Val Ile His Asn Leu Ala His Gln Gly Val Glu Pro Ala Ser225 230 235 240
Thr Tyr Pro Asp Leu Gly Leu Pro Pro Glu Trp Tyr Gly Ala Leu Glu245 250 255Trp Val Phe Pro Glu Trp Ala Arg Arg His Ala Leu Asp Lys Gly Glu260 265 270Ala Val Asn Phe Leu Lys Gly Ala Val Val Thr Ala Asp Arg Ile Val275 280 285Thr Val Ser Gln Gly Tyr Ser Trp Glu Val Thr Thr Ala Glu Gly Gly290 295 300Gln Gly Leu Asn Glu Leu Leu Ser Ser Arg Lys Ser Val Leu Asn Gly305 310 315 320Ile Val Asn Gly Ile Asp Ile Asn Asp Trp Asn Pro Thr Thr Asp Lys325 330 335Cys Leu Pro His His Tyr Ser Val Asp Asp Leu Ser Gly Lys Ala Lys340 345 350Cys Lys Ala Glu Leu Gln Lys Glu Leu Gly Leu Pro Val Arg Glu Asp355 360 365Val Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Tyr Gln Lys Gly Ile370 375 380Asp Leu Ile Lys Met Ala Ile Pro Glu Leu Met Arg Glu Asp Val Gln385 390 395 400Phe Val Met Leu Gly Ser Gly Asp Pro Ile Phe Glu Gly Trp Met Arg405 410 415Ser Thr Glu Ser Ser Tyr Lys Asp Lys Phe Arg Gly Trp Val Gly Phe420 425 430Ser Val Pro Val Ser His Arg Ile Thr Ala Gly Cys Asp Ile Leu Leu435 440 445Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met450 455 460Gln Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Gly Thr Gly Gly Leu Arg Asp465 470 475 480Thr Val Glu Thr Phe Asn Pro Phe Gly Ala Lys Gly Glu Glu Gly Thr485 490 495Gly Trp Ala Phe Ser Pro Leu Thr Val Asp Lys Met Leu Trp Ala Leu500 505 510Arg Thr Ala Met Ser Thr Phe Arg Glu His Lys Pro Ser Trp Glu Gly515 520 525Leu Met Lys Arg Gly Met Thr Lys Asp His Thr Trp Asp His Ala Pro530 535 540
Ser Ser Thr Ser Arg Ser Ser Ser Gly Pro Ser Trp Thr Asn Pro Thr545 550 555 560Ser Cys Arg Arg Gly Leu Gly Arg Ser Lys Cys Glu Ser Pro Ser Ala565 570 575Leu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Phe Arg Gly Pro Glu Gly Tyr Pro Cys580 585 590Thr Leu Arg Cys Pro Ala Thr Val Glu Ser Gln Cys Ala Cys Leu Leu595 600 605Trp Phe Ala Gly Ser Arg Thr Tyr Asp Gly Cys Ala Ala Ala Ala Val610 615 620Thr Ala Ser Gly Gly Arg Gln Leu Gln Phe Trp Gly Ile Arg Lys Gly625 630 635 640Cys Ala Ala Gly Trp Leu Thr Ala Lys His His Ser Asp Gly Ser Leu645 650 655Ser Val Arg Val Thr Ala Glu Ile Arg Asn Gln Leu Val Thr Leu660 665 670(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(iii)假設是(xi)序列描述SEQ ID NO3ACAGGATCCT GTGCTATGCG GCGTGTGAAG 30(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(iii)假設是(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO4TTGGGATCCG CAATGCCCAC AGCATTTTTT TC32(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度2825個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA至mRNA(iii)假設否(iv)反義否(vi)原始來源(A)生物Triticum aestivum L.
(B)品系cv.Florida(E)單元型約21日齡的穎果(vii)直接來源(A)文庫pBluescript sk(-)中的cDNA文庫(B)克隆pTASS1(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置162…2559(xi)序列描述SEQ ID NO5
CTTCGGCCTG ACCCCGTTCG TTTACCCCCA CACAGAGCAC ACTCCAGTCC AGTCCAGCCC 60ACTGCCACCG CGCTACTCTC CACTCCCACT GCCACCACCT CCGCCTGCGC CGCGCTCTGG 120GCGGACCAAC CCGCGAACCG TACCATCTCC CGCCCCGATC C ATG TCG TCG GCG 173Met Ser Ser Ala675GTC GCG TCC GCC GCA TCC TTC CTC GCG CTC GCG TCA GCC TCC CCC GGG221Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser Ala Ser Pro Gly680 685 690AGA TCA CGC AGG CGG GCG AGG GTG AGC GCG CAG CCA CCC CAC GCC GGG269Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro Pro His Ala Gly695 700 705GCC GGC AGG TTG CAC TGG CCG CCG TGG CCG CCG CAG CGC ACG GCT CGC317Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln Arg Thr Ala Arg710 715 720GAC GGA GCT GTG GCG GCG CTC GCC GCC GGG AAG AAG GAC GCG GGG ATC365Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys Asp Ala Gly Ile725 730 735GAC GAC GCC GCC GCG TCC GTG AGG CAG CCC CGC GCA CTC CGC GGT GGC413Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala Leu Arg Gly Gly740 745 750 755GCC GCC ACC AAG GTC GCG GAG CGA AGG GAT CCC GTC AAG ACG CTC GAC461Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val Lys Thr Leu Asp760 765 770CGC GAC GCC GCG GAA GGC GGC GGG CCG TCC CCG CCG GCA GCG AGG CAG509Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala Ala Arg Gln775 780 785GAC GCC GCC CGT CCG CCG AGT ATG AAC GGC ATG CCG GTG AAC GGC GAG557Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro Val Asn Gly Glu790 795 800AAC AAA TCT ACC GGC GGC GGC GGC GCG ACT AAA GAC AGC GGG CTG CCC605Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp Ser Gly Leu Pro805 810 815ACG CCC GCA CGC GCG CCC CAT CCG TCG ACC CAG AAC AGA GCA CCG GTG653Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn Arg Ala Pro Val820 825 830 835AAC GGT GAA AAC AAA GCT AAC GTC GCC TCG CCG CCG ACG AGC ATA GCC701Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ile Ala840 845 850GAG GCC GCG GCT TCG GAT TCC GCA GCT ACC ATT TCC ATC AGC GAC AAG749Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser Ile Ser Asp Lys855 860 865
GCG CCG GAG TCC GTT GTC CCA GCT GAG AAG ACG CCG CCG TCG TCC GGC 797Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly870 875 880TCA AAT TTC GAG TCC TCG GCC TCT GCT CCC GGG TCT GAC ACT GTC AGC 845Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser Asp Thr Val Ser885 890 895GAC GTG GAA CAA GAA CTG AAG AAG GGT GCG GTC GTT GTC GAA GAA GCT 893Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val Val Glu Glu Ala900 905 910 915CCA AAG CCA AAG GCT CTT TCG CCG CCT GCA GCC CCC GCT GTA CAA GAA 941Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro Ala Val Gln Glu920 925 930GAC CTT TGG GAT TTC AAG AAA TAC ATT GGT TTC GAG GAG CCC GTG GAG 989Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu Glu Pro Val Glu935 940 945GCC AAG GAT GAT GGC CGG GCT GTC GCA GAT GAT GCG GGC TCC TTT GAA1037Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe Glu950 955 960CAC CAC CAG AAT CAC GAC TCC GGA CCT TTG GCA GGG GAG AAT GTC ATG1085His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Val Met965 970 975AAC GTG GTC GTC GTG GCT GCT GAG TGT TCT CCC TGG TGC AAA ACA GGT1133Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr Gly980 985 990 995GGT CTG GGA GAT GTT GCG GGT GCT CTG CCC AAG GCT TTG GCA AAG AGA1181Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys Arg100010051010GGA CAT CGT GTT ATG GTT GTG GTA CCA AGG TAT GGG GAC TAT GAA GAA1229Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu Glu101510201025GCC TAC GAT GTC GGA GTC CGA AAA TAC TAC AAG GCT GCT GGA CAG GAT1277Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gln Asp103010351040ATG GAA GTG AAT TAT TTC CAT GCT TAT ATC GAT GGA GTT GAT TTT GTG1325Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly Val Asp Phe Val104510501055TTC ATT GAC GCT CCT CTC TTC CGA CAC CGT CAG GAA GAC ATT TAT GGG1373Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu Asp Ile Tyr Gly1060106510701075GGC AGC AGA CAG GAA ATT ATG AAG CGC ATG ATT TTG TTC TGC AAG GCC1421Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe Cys Lys Ala108010851090
GCT GTT GAG GTT CCA TGG CAC GTT CCA TGC GGC GGT GTC CCT TAT GGG1469Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly Val Pro Tyr Gly109511001105GAT GGA AAT CTG GTG TTT ATT GCA AAT GAT TGG CAC ACG GCA CTC CTG1517Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu Leu111011151120CCT GTC TAT CTG AAA GCA TAT TAC AGG GAC CAT GGT TTG ATG CAG TAC1565Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly Leu Met Gln Tyr112511301135ACT CGG TCC ATT ATG GTG ATA CAT AAC ATC GCT CAC CAG GGC CGT GGC1613Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His Gln Gly Arg Gly1140114511501155CCT GTA GAT GAA TTC CCG TTC ACC GAG TTG CCT GAG CAC TAC CTG GAA1661Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu Glu116011651170CAC TTC AGA CTG TAC GAC CCC GTG GGT GGT GAA CAC GCC AAC TAC TTC1709His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His Ala Asn Tyr Phe117511801185GCC GCC GGC CTG AAG ATG GCG GAC CAG GTT GTC GTG GTG AGC CCC GGG1757Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val Val Ser Pro Gly119011951200TAC CTG TGG GAG CTG AAG ACG GTG GAG GGC GGC TGG GGG CTT CAC GAC1805Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp Gly Leu His Asp120512101215ATC ATA CGG CAG AAC GAC TGG AAG ACC CGC GGC ATC GTC AAC GGC ATC1853Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile Val Asn Gly Ile1220122512301235GAC AAC ATG GAG TGG AAC CCC GAG GTG GAC GCC CAC CTC AAG TCG GAC1901Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Asp124012451250GGC TAC ACC AAC TTC TCC CTG AGG ACG CTG GAC TCC GGC AAG CGG CAG1949Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg Gln125512601265TGC AAG GAG GCC CTG CAG CGC GAG CTG GGC CTG CAG GTC CGC GCC GAC1997Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln Val Arg Ala Asp127012751280GTG CCG CTG CTC GGC TTC ATC GGC CGC CTG GAC GGG CAG AAG GGC GTG2045Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly Val128512901295GAG ATC ATC GCG GAC GCC ATG CCC TGG ATC GTG AGC CAG GAC GTG CAG2093Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gln Asp Val Gln1300130513101315
CTG GTG ATG CTG GGC ACC GGG CGC CAC GAC CTG GAG AGC ATG CTG CAG2141Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser Met Leu Gln132013251330CAC TTC GAG CGG GAG CAC CAC GAC AAG GTG CGC GGG TGG GTG GGG TTC2189His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly Trp Val Gly Phe133513401345TCC GTG CGC CTG GCG CAC CGG ATC ACG GCG GGG GCG GAC GCG CTC CTC2237Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Ala Leu Leu135013551360ATG CCC TCC CGG TTC GAG CCG TGC GGG CTG AAC CAG CTC TAC GCC ATG2285Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met136513701375GCC TAC GGC ACC GTC CCC GTC GTG CAC GCC GTC GGC GGC CTC AGG GAC2333Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp1380138513901395ACC GTG CCG CCG TTC GAC CCC TTC AAC CAC TCC GGG CTC GGG TGG ACG2381Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly Leu G1y Trp Thr140014051410TTC GAC CGC GCC GAG GCG CAC AAG CTG ATC GAG GCG CTC GGG CAC TGC2429Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His Cys141514201425CTC CGC ACC TAC CGA GAC TTC AAG GAG AGC TGG AGG GCC CTC CAG GAG2477Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg Ala Leu Gln Glu143014351440CGC GGC ATG TCG CAG GAC TTC AGC TGG GAG CAC GCC GCC AAG CTC TAC2525Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala Ala Lys Leu Tyr144514501455GAG GAC GTC CTC GTC AAG GCC AAG TAC CAG TGG T GAACGCTAGC 2569Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp146014651470TGCTAGCCGC TCCAGCCCCG CATGCGTGCA TGACAGGATG GAACTGCATT GCGCACGCAG 2629GAAAGTGCCA TGGAGCGCCG GCATCCGCGA AGTACAGTGA CATGAGGTGT GTGTGGTTGA 2689GACGCTGATT CCAATCCGGC CCGTAGCAGA GTAGAGCGGA GGTATATGGG AATCTTAACT 2749TGGTATTGTA ATTTGTTATG TTGTGTGCAT TATTACAATG TTGTTACTTA TTCTTGTTAA 2809AAAAAAAAAA AAAAAA 2825
(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度799個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser1 5 10 15Ala Ser Pro Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro20 25 30Pro His Ala Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln35 40 45Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys50 55 60Asp Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala65 70 75 80Leu Arg Gly Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val85 90 95Lys Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro100 105 110Ala Ala Arg Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro115 120 125Val Asn Gly Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp130 135 140Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn145 150 155 160Arg Ala Pro Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro165 170 175Thr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser180 185 190Ile Ser Asp Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro195 200 205Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser210 215 220Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val225 230 235 240
Val Glu Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro245 250 255Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu260 265 270Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala275 280 285Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly290 295 300Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp305 310 315 320Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala325 330 335Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly340 345 350Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala355 360 365Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly370 375 380Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu385 390 395 400Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu405 410 415Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly420 425 430Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His435 440 445Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly450 455 460Leu Met Gln Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His465 470 475 480Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu485 490 495His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His500 505 510Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val515 520 525Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp530 535 540
Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile545 550 555 560Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His565 570 575Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser580 585 590Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln595 600 605Val Arg Ala Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly610 615 620Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser625 630 635 640Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu645 650 655Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly660 665 670Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala675 680 685Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln690 695 700Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly705 710 715 720Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly725 730 735Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala740 745 750Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg755 760 765Ala Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala770 775 780Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp785 790 795
(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假設是(iv)反義否(v)片段類型內部的(xi)序列描述SEQ ID NO7Pro Trp Ser Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Cys1 5 10(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假設是(iv)反義否(v)片段類型內部的(xi)序列描述SEQ ID NO8Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr1 5 10(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度12個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(iii)假設是(iv)反義否(v)片段類型內部的(xi)序列描述SEQ ID NO9Gly Thr Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Glu Asn Cys1 5 10
權利要求
1.編碼小麥淀粉合酶的核酸分子，該分子選自(a)編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列之蛋白質的核酸分子；(b)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列或相應的核糖核苷酸序列的核酸分子；(c)能與(a)或(b)所述核酸分子雜交并編碼可溶性淀粉合酶的核酸分子；(d)因遺傳密碼的簡并性而核苷酸序列與(a)、(b)或(c)所述核酸分子的序列有所不同的核酸分子；(e)編碼含有SEQ ID NO6所示氨基酸序列之蛋白質的核酸分子；(f)含有SEQ ID NO5所示核苷酸序列或相應的核糖核苷酸序列的核酸分子；(g)能與(e)或(f)所述核酸分子雜交的核酸分子；和(h)因遺傳密碼的簡并性而核苷酸序列與(e)-(g)所述分子之序列有所不同的核酸分子。
2.權利要求1的核酸分子，它是DNA分子。
3.權利要求2的DNA分子，它是cDNA分子。
4.權利要求1的核酸分子，它是RNA分子。
5.與權利要求1至4中任何一項的核酸分子的一條鏈能特異性雜交的核酸分子。
6.權利要求5的核酸分子，它是長度至少為15個核苷酸的寡核苷酸。
7.含有權利要求1至4中任何一項的核酸分子的載體。
8.權利要求7的載體，其中核酸分子在有義方向與能確保在原核或真核細胞中轉錄和合成可翻譯的RNA的調控元件連接。
9.被權利要求1至4中任何一項的核酸分子或被權利要求7或8的載體轉化的宿主細胞，或源于這種細胞的細胞。
10.由權利要求1至4中任何一項的核酸分子編碼的蛋白質。
11.生產權利要求10的蛋白質的方法，其中在允許合成該蛋白質的條件下培養權利要求9的宿主細胞，然后從經培養的細胞和/或培養基中分離該蛋白質。
12.被權利要求1至4中任何一項的核酸分子或被權利要求7或8的載體轉化的轉基因植物細胞，或源于這種細胞的細胞，其中編碼小麥可溶性淀粉合酶的核酸分子受調控元件的控制，該元件允許在植物細胞中轉錄出可翻譯的mRNA。
13.含有權利要求12的植物細胞的植物。
14.權利要求13的植物，它是有用的植物。
15.權利要求14的植物，它是儲存淀粉的植物。
16.權利要求15的植物，它是小麥。
17.權利要求13至16中任何一項的植物的增殖材料，其含有權利要求12的植物細胞。
18.可得自權利要求13至16中任何一項的植物或權利要求17的增殖材料的淀粉。
19.轉基因的植物細胞，其特征在于該植物細胞中權利要求10的蛋白質的活性有所降低。
20.權利要求19的植物細胞，其中該細胞中所說的活性的降低是通過表達權利要求1DNA分子之轉錄物的反義RNA而達到的。
21.含有權利要求19或20的植物細胞的植物。
22.權利要求21的植物，它是有用的植物。
23.權利要求22的植物，它是儲存淀粉的植物。
24.權利要求23的植物，它是小麥。
25.權利要求21至24中任何一項的植物的增殖材料，其含有權利要求19或20的細胞。
26.可得自權利要求21至24中任何一項的植物或權利要求25的增殖材料的淀粉。
27.權利要求18或26的淀粉用于生產糧食的用途。
28.權利要求27的用途，其中所述糧食是面包房食品或面團。
29.權利要求18或26的淀粉用于生產包裝材料或一次性物品的用途。
全文摘要
本發明涉及編碼參與植物淀粉合成之酶的核酸分子，這些酶是小麥的淀粉合酶。本發明還涉及含有所述核酸分子的載體和宿主細胞，尤其是經轉化的植物細胞和由這些細胞再生的植物，它們表現出增加或減少的所述淀粉合酶的活性。
文檔編號C12N15/82GK1861794SQ20061007432
公開日2006年11月15日 申請日期1997年5月28日 優先權日1996年5月29日
發明者M·布洛克, H·洛茨, S·魯迪克, L·瓦爾特, C·弗洛比格, J·考斯曼 申請人:赫徹斯特-舍林農業發展有限公司