一種β-淀粉酶的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及檢測【技術領域】，公開了一種β-淀粉酶的檢測方法，包括β-淀粉酶分子量的檢測方法和β-淀粉酶活力的檢測方法。本發明使用SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色的方法檢測β-淀粉酶的分子量，從而確定β-淀粉酶的存在，該方法簡單易操作。本發明使用硫代硫酸鈉滴定代替傳統的淀粉-碘滴定，根據使用的硫代硫酸鈉的量計算一定時間內可溶性淀粉在β-淀粉酶催化作用下消耗的淀粉的量，以酶的催化速率來代表酶的活力單位。本發明的檢測方法滴定終點容易判斷，準確性和穩定性高。本發明又以碘化鉀和碘酸鉀在酸性條件下生成碘的方式來代替傳統的直接使用碘溶液滴定的方式，避免了碘溶液易揮發造成的滴定終點判斷失誤的發生，進一步提高了檢測結果的準確性，同時本發明檢測β-淀粉酶活力的方法測定線性范圍廣，重復性好，適合工業和臨床應用。
【專利說明】—種β-淀粉酶的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及檢驗測定【技術領域】，具體而言涉及β-淀粉酶的檢測方法，更具體而言，本發明涉及β-淀粉酶分子量的檢測方法和β-淀粉酶活力的檢測方法。【背景技術】
[0002]淀粉酶是一種水解酶，是目前發酵工業上應用最廣泛的一類酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4_糖苷鍵的酶，根據作用的方式可分為α-淀粉酶與β-淀粉酶。
[0003]α -淀粉酶廣泛分布于動物(唾液、胰臟等)、植物(麥芽、山崳菜)及微生物。微生物的酶幾乎都是分泌性的。此酶以Ca2+為必需因子并作為穩定因子，既作用于直鏈淀粉，亦作用于支鏈淀粉，無差別地切斷α-1，4_鏈。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反應的消失，最終產物在分解直鏈淀粉時以麥芽糖為主，另一方面在分解支鏈淀粉時，除麥芽糖外，還生成分支部分具有α-1，6_鍵的α-極限糊精。
[0004]β -淀粉酶與α -淀粉酶的不同點在于從非還原性末端逐次以麥芽糖為單位切斷α-1，4_葡聚糖鏈。主要見于高等植物中(大麥、小麥、甘薯、大豆等)，但也有報告在細菌、牛乳、霉菌中存在。對于像直鏈淀粉，如可溶性淀粉那樣沒有分支的底物能完全分解得到麥芽糖。作用于支鏈淀粉或葡聚糖的時候，切斷至α-1，6_鍵的前面反應就停止了，因此生成分子量比較大的極限糊精。
[0005]SDS-PAGE考馬斯亮藍染色法是常見的蛋白質分離方法。但是使用該方法來檢測β -淀粉酶的分子量，還未見報道。
[0006]現在已有的檢測β_淀粉酶活力的方法主要包括:黏度測定法、比濁法、糖化法、淀粉-碘比色法、酶速率法與染料釋放法等。其中，黏度測定法和比濁法由于影響因素較多，缺乏特異性和靈敏度，己被淘汰。糖化法雖然可以直接測定酶活性，但是操作復雜。目前應用較為廣泛的是碘量法、酶速率法和染料釋放法。其中，淀粉-碘法因具有成本低、檢測不需要昂貴儀器、試劑穩定、操作簡便、結果可靠，所以應用范圍最廣。
[0007]淀粉-碘比色法測定β -淀粉酶的基本原理是:淀粉在β -淀粉酶的作用下生成部分糊精，淀粉與碘結合生成紫藍色的絡合物，而糊精與碘結合生成紅棕色絡合物，測定酶促反應分解一定量淀粉的時間，以紅色糊精與碘反應的顏色作為終點指示(所給定的淀粉都已轉化為糊精的時間)，用此方法的酶活力定義:60°C I小時內將Ig淀粉轉化為糊精的酶量為一個酶活力單位:
[0008]酶活力單位=60/t*20*2%*Ν/0.5 = 48N/t (U/ml)
[0009]t為反應達到終點所需要的時間；
[0010]N為酶的稀釋倍數
[0011]但是淀粉-碘比色法測定β -淀粉酶活力存在以下缺點:紅棕色滴定終點的觀察因人而異，滴定終點不明顯，存在誤差較大，并且在碘滴定的過程中，由于碘液易升華揮發造成成分減少影響顯色反應，致使檢測結果準確性降低。
【發明內容】
[0012]本發明的目的在于提供一種檢測β -淀粉酶分子量的方法。
[0013]本發明的另一目的在于提供一種穩定性高，準確性高的檢測β -淀粉酶活力的方法。
[0014]為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案:
[0015]檢測β -淀粉酶分子量的方法，包括:
[0016]步驟1、標準蛋白溶液的制備取分子量測定用標準蛋白(分子量范圍30~66kD)適量，加蛋白上樣緩沖液[取水4.8ml，濃縮膠緩沖液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸鈉溶液2.0ml, 0.5% (W/V)溴酚藍溶液0.5ml, β -巰基乙醇0.5ml，混勻]制成每I μ I中含10μ g蛋白的溶液。臨用前置水浴中5分鐘，冷卻。
[0017]步驟2、待測樣品溶液的制備取待測樣品適量(按蛋白含量計算)，加所述蛋白上樣緩沖液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，臨用前置水浴中5分鐘，冷卻。
[0018]步驟3、電泳分離照SDS-PAGE實驗方法，采用垂直板電泳，各孔加10 μ I的所述待測樣品溶液或所述標準蛋白溶液，電泳分離蛋白。
[0019]步驟4、染色步驟3結束后，將電泳膠放到染色液中(含0.2% (W/V)考馬斯亮藍G-250,45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸)，加熱煮沸染色2分鐘。
[0020]步驟5、脫色步驟4結束后，將電泳膠放入脫色液中(含7.5%乙酸和5%甲醇)，加熱煮沸脫色10分鐘。
[0021]步驟6、計算分子量以標準蛋白分子量的對數為縱座標，以遷移率為橫座標，進行線性回歸，由標準曲線上求得待測樣品的分子量。
[0022]檢測β -淀粉酶活力的方法，包括:
[0023]步驟1、在ΡΗ5.5的緩沖液中，待測樣品與可溶性淀粉混合得到混合液，反應適當時間后使用lmol/L鹽酸終止反應。
[0024]步驟2、加入麥芽糖酶與上述混合液反應(足以使可溶性淀粉在β -淀粉酶作用下生成的麥芽糖完全分解成葡萄糖)，使用2.6mol/L碳酸鈉終止反應。
[0025]步驟3、碘化鉀與酸性碘酸鉀混合加入到步驟2所得的混合液中。
[0026]步驟4、在步驟3所得的混合液中加入氫氧化鈉暗處放置，再加入硫酸，用硫代硫酸鈉滴定。
[0027]步驟5、設置空白對照(在步驟I中不加待測樣品，只加入同體積的緩沖液)。每Iml碘滴定液(0.05mol/L)相當于9.008mg無水葡萄糖。按下式計算β _淀粉酶的活力。
[0028]每Ig 含淀粉酶活力單位=(B-A) F/10* (9.008*1000/180.16*(n/ff))
[0029]式中
[0030]A為供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液的容積，ml ；
[0031]B為空白消耗硫代硫酸鈉滴定液的容積，ml ；
[0032]F為硫代硫酸鈉滴定液的濃度換算值，mol/L ；
[0033]W為供試品取樣量，g ；
[0034]η為供試品稀釋倍數，200。
[0035]在上述條件下，每分鐘水解160 μ g淀粉(相當于最終生成I μ mol葡萄糖)的酶量，為I個β -淀粉酶活力的單位。
[0036]待測樣品處理:取本品0.3g，精密稱定，置研缽中，加冷至5°C以下的磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀13.61g與磷酸氫二鈉35.80g，加水使溶解成1000ml，調節pH值至5.5)少量，研磨均勻，加上述磷酸鹽緩沖液定量稀釋制成每Iml中含淀粉酶10-20單位的溶液。
[0037]優選地，碘酸鉀與碘化鉀的摩爾比是1:4-1:6。
[0038]優選地，酸性碘酸鉀濃度為5-8mmol/L (pH2.0)。
[0039]本發明檢測方法提供了一個適宜的酸性環境，待測樣品與可溶性淀粉在pH5.5的緩沖液中混合。PH5.5的緩沖液包括:磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液和磷酸鹽緩沖液。作為優選，本發明檢測方法中PH5.5的緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。
[0040]優選地，可溶性淀粉為I %可溶性淀粉溶液。
[0041]1 %可溶性淀粉溶液處理:取經105°C干燥2小時的可溶性淀粉1.0g，加水10ml，攪勻后，邊攪拌邊添加lOmol/LNaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入2mol/L鹽酸使溶液的pH值為5.5，加水稀釋至100ml。
[0042]本發明技術方案的優點和有益效果如下:(I)本發明首次將SDS-PAGE考馬斯亮藍染色的方法用于檢測β_淀粉酶的分子量，該實驗方案具有創新性；(2)本發明以硫代硫酸鈉滴定代替傳統的淀粉-碘滴定檢測β -淀粉酶活力，克服了淀粉-碘滴定法滴定終點顏色判斷困難的缺點，使實驗結果更準確；(3)本發明以碘化鉀和酸性碘化鉀作為顯色液，碘化鉀和碘酸鉀在酸性條件下生成碘，與未反應的可溶性淀粉結合的形成藍色復合物，避免直接使用碘液易升華揮發造成成分減少變淡影響反應顯色，進一步提高了檢測結果的準確性；(4)本發明提供了一種使用NaOH室溫溶解可溶性淀粉的方法。該方法比以加熱煮沸的方式來實現可溶性淀粉溶解的方法更省時，更安全；(5)利用本發明檢測β_淀粉酶活力的方法測定的β_淀粉酶活力值更接近使用HPLC測定的β_淀粉酶活力值，因此本發明的檢測方法具有很高的準確性；(6)根據本發明的實施方案，本發明β_淀粉酶活力的檢測方法可測定的線性范圍廣(高達1600U/g)，同時具有很好的重復性。使用硫代硫酸鈉滴定法檢測大麥芽中提取的β -淀粉酶活力還未見相關報道，因此本發明的檢測方法具有創新性。
【具體實施方式】
[0043]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式并不局限實施例表示的范圍。
[0044]實施例1SDS-PAGE檢測β -淀粉酶的分子量
[0045]標準蛋白溶液的制備:取分子量測定用標準蛋白(分子量范圍30kD~66kD)適量，加蛋白上樣緩沖液[取水4.8ml，濃縮膠緩沖液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸鈉溶液2.0ml,0.5% (W/V)溴酚藍溶液0.5ml, β -巰基乙醇0.5ml，混勻]制成每I μ I中含10 μ g蛋白的溶液。臨用前置水浴中5分鐘，冷卻。
[0046]待測樣品溶液的制備:取待測樣品適量(按蛋白含量計算)，加所述蛋白上樣緩沖液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，臨用前置水浴中5分鐘，冷卻。
[0047]電泳分離:照SDS-PAGE實驗方法，采用垂直板電泳，各孔加10 μ I的所述待測樣品溶液或所述標準蛋白溶液，電泳分離蛋白。[0048]染色:將電泳膠放到染色液中(含0.2% (W/V)考馬斯亮藍G-250，45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸)，加熱煮沸染色2分鐘。
[0049]脫色:將染色后的電泳膠放入脫色液中(含7.5%乙酸和5%甲醇)，加熱煮沸脫色10分鐘。
[0050]計算分子量:以標準蛋白分子量的對數為縱座標，以遷移率為橫座標，進行線性回歸，由標準曲線上求得待測樣品的分子量。
[0051]結果分析:待測樣品經SDS-PAGE凝膠電泳，染色后可檢測到高分子量的譜帶一條(數據未顯示)，與標準蛋白質相比較，得出β_淀粉酶的分子量(表1)。由表可以看出，蛋白條帶的分子量是54.26kD，這與文獻報道的β -淀粉酶的分子量約60kD的結果是一致的。
[0052]表1 β -淀粉酶的分子量測定結果
[0053]
【權利要求】
1.β-淀粉酶的檢測方法，其特征在于，所述方法包括β-淀粉酶分子量的檢測方法和β-淀粉酶活力的檢測方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述β_淀粉酶分子量的檢測方法包括以下步驟: 步驟1、標準蛋白溶液的制備取分子量測定用標準蛋白，分子量范圍30kD-66kD，適量，加蛋白上樣緩沖液，所述上樣緩沖液配制方法為:取水4.8ml，濃縮膠緩沖液1.2ml，甘油1.0ml, 10%十二烷基硫酸鈉溶液2.0ml, 0.5% (W/V)溴酚藍溶液0.5ml, β -巰基乙醇0.5ml，混勻制成每1μ I中含IOyg蛋白的溶液，臨用前置水浴中5分鐘，冷卻； 步驟2、待測樣品溶液的制備取待測樣品適量，按蛋白含量計算，加所述蛋白上樣緩沖液制成每? μ I中含?ο μ g蛋白的溶液，臨用前置水浴中5分鐘，冷卻； 步驟3、電泳分離照SDS-PAGE實驗方法，采用垂直板電泳，各孔加10 μ I的所述待測樣品溶液或所述標準蛋白溶液，電泳分離蛋白； 步驟4、染色步驟3結束后，將電泳膠放到染色液中，所述染色液配方為:0.2% (W/V考馬斯亮藍G-250，45% (W/V)的乙醇或甲醇和10% (W/V)乙酸，然后加熱煮沸染色2分鐘；步驟5、脫 色步驟4結束后，將電泳膠放入脫色液中，所述脫色液配方為:7.5%乙酸和5%甲醇，然后加熱煮沸脫色10分鐘； 步驟6、計算分子量以標準蛋白分子量的對數為縱座標，以遷移率為橫座標，進行線性回歸，由標準曲線上求得待測樣品的分子量。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述β_淀粉酶活力的檢測方法包括以下步驟: 步驟1、在ρΗ5.5的緩沖液中，待測樣品與可溶性淀粉混合得到混合液，反應適當時間后使用lmol/L鹽酸終止反應并將混合液pH調到6.5 ； 步驟2、加入麥芽糖酶與上述混合液反應，其中，加入的麥芽糖酶足以使可溶性淀粉在β -淀粉酶作用下生成的麥芽糖完全分解成葡萄糖，然后使用2.6mol/L碳酸鈉終止反應；步驟3、碘化鉀與酸性碘酸鉀混合加入到步驟2所述的混合液中； 步驟4、在步驟3所述的混合液中加入氫氧化鈉暗處放置，再加入硫酸，用硫代硫酸鈉滴定； 步驟5、設置空白對照:在步驟I中不加所述待測樣品，只加入同體積的所述緩沖液，每Iml濃度為0.05mol/L的碘滴定液相當于9.008mg無水葡萄糖,按下式計算β -淀粉酶的活力: 每 Ig 含淀粉酶活力單位=(B-A) F/10* (9.008*1000/180.16*(n/ff)) 式中 A為供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液的容積，ml ； B為空白消耗硫代硫酸鈉滴定液的容積，ml ； F為硫代硫酸鈉滴定液的濃度換算值，mol/L ； W為供試品取樣量，g ； η為供試品稀釋倍數，200， 在上述條件下，每分鐘水解160 μ g可溶性淀粉，相當于最終生成I μ mol葡萄糖的酶量，為I個β -淀粉酶活力的單位。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述pH5.5緩沖液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述待測樣品處理如下:取酶制劑0.3g，精密稱定，置研缽中，加冷至5°C以下的pH5.5的緩沖液中磷酸鹽緩沖液少量，所述磷酸鹽緩沖液的配制方法為:取磷酸二氫鉀13.61g與磷酸氫二鈉35.80g，加水使溶解成1000ml，調節pH值至5.5，然后研磨均勻，加上述磷酸鹽緩沖液定量稀釋制成每Iml中含淀粉酶10-20單位的溶液。
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述可溶性淀粉為I%的可溶性淀粉溶液，處理如下:取經105°C干燥2小時的可溶性淀粉1.0g，加水10ml，攪勻后，邊攪拌邊添加lOmol/L NaOH溶液0.2ml，使之完全溶解，加入2mol/L鹽酸使溶液pH值為5.5，加水稀釋至100ml。
7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述碘酸鉀與所述碘化鉀的摩爾比是1:4-1:6。
8.根據權利要求3所述的方法，所述酸性碘酸鉀濃度為5mm0l/L-8mm0l/L，pH為2.0。
9.根據權利要求3所述的方法，所述麥芽糖酶加入量為150U-200U麥芽糖酶/g淀粉。
【文檔編號】C12Q1/40GK103789400SQ201410070480
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月28日 優先權日:2014年2月28日
【發明者】王發善, 韓振遠, 褚弘斌, 陳玉忠 申請人:多多藥業有限公司