專利名稱：神經營養因子BDNF、NT－3信號通路新成員Dok5的鑒定和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因克隆和功能、藥物研發和治療領域。具體地說，本發明涉及人基因dok5的克隆，涉及神經營養因子BDNF、NT-3信號通路的新成員Dok5的鑒定和應用，涉及使用酵母雙雜交技術、Western Blot技術和細胞熒光技術驗證蛋白相互作用，涉及利用Dok5基因和蛋白以及Trk-Dok5介導的BNDF、NT-3信號通路進行藥物設計以及臨床診斷和治療等領域。
背景技術：
神經系統是目前所知的最為復雜的系統之一。神經系統相關疾病一直困擾著人類健康。尤其是隨著全球逐漸步入老齡化社會，神經系統退行性疾病例如阿爾茨海默病(Alzheimer’sDisease)、帕金森病(Parkinson’s Disease)等已經成為威脅人類健康和社會正常發展的重要因素。尋找和開發治療神經系統相關疾病的新藥物、新方法已經成為各國和各大制藥巨頭的研發重點和熱點。
神經退行性疾病多是由于神經元的凋亡引起的，如阿爾茨海默病表現為廣泛的大腦皮層神經元喪失，尤其是海馬和基底前腦的膽堿能神經元的退化；帕金森病表現為黑質紋狀體多巴胺能神經元的大量缺失。除了環境中的氧化應激損害導致的神經元凋亡，隨著年齡的增長，中樞神經系統的神經元不能獲得足夠的營養因子，也是神經元大量死亡的重要原因。而如果為神經元提供充足的營養因子就能夠有效維持神經元的存活，延緩神經退行性疾病的進程。因此，有效增加神經元外部環境的營養因子濃度或是增加神經元對有限的營養因子的反應性，成為治療神經退行性疾病重要的選擇方案之一。
神經營養素家族營養因子是神經系統重要的營養因子，參與神經細胞的增殖、發育、分化、遷移和損傷后再生等。該家族因子BDNF(brain derived neurotrophic factor)和NT-3(neurotrophin-3)能夠有效保護神經元，維持神經元的存活，并參與神經損傷后的修復過程。目前，已有美國醫藥公司正在進行BDNF、NT-3的開發與臨床實驗。
本發明克隆了人神經系統高表達的dok5基因，該基因編碼一個細胞信號蛋白。我們通過酵母雙雜交實驗證明了Dok5參與BDNF、NT-3信號轉導。隨后我們通過突變分析、pulldown實驗、免疫共沉淀實驗證明Dok5以依賴于受體磷酸化的方式結合BDNF、NT-3的受體TrkB、TrkC胞內區的NPQY模體。在PC12細胞中Dok5與TrkB、TrkC受體共定位。通過對信號通路的檢測，我們發現Dok5能夠有效提高BDNF、NT-3誘導的MAPK信號通路的活化程度和延長其活化時間。因此，Dok5參神經營養因子BDNF、NT-3的信號轉導，并可以有效增強其效果。Dok5作為BDNF、NT-3信號通路新成員的發現，為治療神經退行性疾病提供了新的靶點，以TrkB、TrkC和Dok5為把點的藥物設計可以增強神經元對有限的BNDF、NT-3的反應性，具有十分廣闊的臨床應用前景。
發明內容
本發明是在研究神經營養因子BDNF、NT-3信號通路在神經系統中的功能和應用的基礎上進行的。通過生物信息學分析和相關文獻分析，我們鑒定了BDNF、NT-3信號通路的一個新成員Dok5。Dok5是神經系統高表達的接頭蛋白，是細胞信號網絡的重要成員之一。已有文獻報道Dok5參與神經系統重要的營養因子神經膠質細胞衍生生長因子(GDNF，glial cell line-derivedneurotrophic factor)的信號傳導，并可能參與神經元的發育分化。
本發明克隆了人dok5基因，并首次證明Dok5能夠參與神經營養因子BDNF、NT-3的信號通路。通過酵母雙雜交實驗，我們證明Dok5通過PTB結構域結合神經營養因子BDNF、NT-3受體TrkB、TrkC的胞內區。隨后通過突變分析，我們確定Dok5以依賴于受體磷酸化的方式結合TrkB、TrkC受體胞內區的NPQY模體。GST pulldown實驗證明GST-Dok5-PTB融合蛋白可以在體外結合BDNF、NT-3刺激后活化的TrkB、TrkC受體。通過免疫共沉淀實驗進一步證明，Dok5能夠結合磷酸化的TrkB、TrkC受體NPQY模體。PC12細胞系是研究神經細胞體外分化的很好的模型，細胞熒光實驗顯示Dok5與TrkB、TrkC受體在分化的PC12細胞中共定位。通過對MAPK信號通路的檢測，我們發現Dok 5能夠有效增強BDNF、NT-3介導的MAPK信號通路的活化并延長該通路的活化時間。
神經營養因子BNDF、NT-3在神經系統中具有重要的功能，參與神經元的增殖、發育、分化、維持其正常的生理功能和存活。BDNF、NT-3在神經系統退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側索硬化等的臨床治療中具有廣泛的應用前景，目前BDNF、NT-3作為神經系統疾病的治療藥物在美國已經進入臨床試驗。Dok5作為BDNF、NT-3信號通路新成員的鑒定，為研發治療多種神經退行性疾病的藥物提供了新的靶點。并且，Dok5能夠增強細胞對BDNF、NT-3的反應性，有效增強MAPK信號通路的活化程度，而該通路在神經損傷后修復、保護神經細胞免受外界氧化損害維持神經元存活等過程具有重要作用。因此，Dok5參與BDNF、NT-3信號通路的發現具有重要的臨床意義，可能在針對神經系統疾病的藥物研發和治療中具有潛在的應用價值。
本發明的主要技術特征在于(1)人神經系統高表達基因dok5的克隆；(2)利用酵母雙雜交實驗和GST pulldown實驗確定Dok 5通過PTB結構域結合TrkB、TrkC受體的胞內區；(3)利用酵母雙雜交實驗和免疫共沉淀實驗確定Dok5以依賴于受體磷酸化的方式結合TrkB、TrkC受體胞內區的NPQY模體；(4)細胞熒光實驗顯示Dok5與TrkB、TrkC在PC12細胞中共定位；(5)MAPK信號通路檢測顯示Dok5有效增強BDNF、NT-3信號通路的活化水平并延長其活化時間。
下面結合所附圖表對本發明作進一步詳細描述。
序列表1，人dok5的cDNA序列。
序列表2，人Dok5蛋白的氨基酸序列。
圖1，酵母雙雜交驗證Dok5與BDNF、NT-3受體TrkB、TrkC胞內區相互作用。
上圖Dok5結合TrkB、TrkC受體胞內區。
下圖Dok5 PTB結構域結合TrkB、TrkC受體。
圖2，酵母雙雜交驗證Dok5結合TrkB、TrkC受體胞內區NPQY模體。
上圖TrkB突變體M1，M2不能結合Dok5，說明Dok5以依賴于磷酸化方式結合TrkB受體。TrkB突變體BM1(K572A)，BM2(Y516F)，BM3(Y702A)，BM4(Y706D)，BM5(Y707E)，BM6(Y817F)。
下圖TrkC突變體M1，M2不能結合Dok5，說明Dok5以依賴于磷酸化方式結合TrkC受體。TrkB突變體CM1(K572A)，CM2(Y516F)，CM3(Y705A)，CM4(Y709D)，CM5(Y710E)，CM6(Y820F)。
圖3，GST pulldown實驗驗證Dok5 PTB結構域在體外結合磷酸化的TrkB、TrkC受體。GST-Dok5PTB融合蛋白只能結合BDNF、NT-3刺激后活化的(磷酸化的)TrkB、TrkC受體，不能結合未活化的受體。
圖4，免疫共沉淀實驗證明Dok5以依賴于磷酸化的方式結合TrkB、TrkC受體NPQY模體左圖Dok5以依賴受體磷酸化的方式結合TrkB受體的NPQY模體。
右圖Dok5以依賴受體磷酸化的方式結合TrkC受體的NPQY模體。
圖5，Dok5與TrkB、TrkC受體在分化的PC12細胞中共定位A Dok5-EGFP在分化的PC12細胞中的定位B TrkB-mRFP在分化的PC12細胞中的定位C Dok5-EGFP與TrkB-mRFP在分化的PC12細胞中共定位D Dok5-EGFP在分化的PC12細胞中的定位E TrkC-mRFP在分化的PC12細胞中的定位F Dok5-EGFP與TrkC-mRFP在分化的PC12細胞中共定位圖6，Dok5參與BDNF、NT-3介導的MAPK信號通路的活化，可以有效增強活化強度延長活化時間。
ADok5增強BDNF誘導的MAPK信號通路的活化水平，并延長活化時間BDok5增強NT-3誘導的MAPK信號通路的活化水平，并延長活化時間具體實施方式
在下面的實施例中進一步說明了本發明，但并不限制本發明的范圍。
實施例1本發明中使用的引物序列及用途
實施例2酵母雙雜交驗證Dok5與TrkB、TrkC受體的相互作用選擇數個直徑為2-3mm的酵母菌落，接入10ml YPD液體培養基中，30℃振蕩培養過夜。將這些過夜培養物轉入200-500ml的YPD培養基，230rpm培養3-5小時，使OD600nm達到0.4～0.5。室溫下(20-21℃)，4,000rpm離心15分鐘，棄去上清。用300ml無菌去離子水洗滌細胞，4,000rpm離心15分鐘，棄上清。用新配制的1×TE/LiAc溶液重懸細胞即成為感受態細胞。在1.5ml離心管中加入100ul變性的鮭精DNA(10mg/ml)和一定量的轉化質粒，混勻后加100ul感受態細胞，再加入0.6mlPEG/LiAc溶液，劇烈振蕩混勻。30℃，200rpm，振蕩培養30分鐘。加入約70ulDMSO至終濃度為10％，顛倒數次混勻，42℃熱擊15分鐘(每5分鐘振蕩混勻)，后置冰浴中冷卻。室溫，12,000rpm離心30秒收集細胞，沉淀用50ul 1×TE溶液重懸。將酵母細胞鋪于特定的營養缺陷選擇培養基上，30℃倒置培養4-7天。將長出的陽性克隆從培養板上挑到標記的新的SD/-Trp，-Leu，-His，20mmol/L3-AT培養基上，倒置培養24～36小時。將各個克隆印記到濾紙上，涂布均勻。將濾紙在液氮中處理15秒，立即取出，室溫放置直至融化，如此反復凍融數次。在平皿中加2ml Z buffer/X-gal緩沖液，將涂布有酵母菌的濾紙菌放置于被Zbuffer/X-gal溶液中，于30℃溫浴。每隔30分鐘觀察濾紙上菌落顏色的變化情況，記錄下內菌落變藍的時間，直至8小時。
實施例3GST Pulldown驗證Dok5PTB結構域結合活化的TrkB、TrkC受體1.GST融合蛋白的表達純化構建pGEX6P-1-Dok5 PTB原核表達克隆，測序證實插入序列正確，讀碼框正確。將該克隆轉化進入大腸桿菌菌株中誘導表達GST融合蛋白。挑取上述轉化陽性的大腸桿菌單菌落，加入5ml新鮮的含相應抗生素的LB液體培養基中，37℃劇烈搖動培養過夜。將過夜菌液按1/20比例接種到500ml含相應抗生素的LB錐形瓶中，37℃劇烈振蕩培養，至菌液的OD600nm值達0.6-0.8。加入適當濃度的IPTG誘導表達3-4小時。5000rpm離心10分鐘收集菌體。PBS溶液洗滌菌體沉淀。按照5ml/g(約為菌液體積的1/25，即20ml)的量用PBS溶液重懸菌體沉淀，冰浴下超聲破碎細胞工作10秒(300W)，冷卻20秒，共75次。12,000rpm離心20分鐘，收集上清。
取一定量Glutathione Sepharose 4B樹脂樹脂懸液加到聚丙烯柱內，使樹脂在重力作用下沉積。以5倍柱體積的PBS溶液洗滌樹脂。將收集的蛋白上清溶液加入柱子，使樣品靠重力緩慢流過柱子。以30倍柱體積的PBS溶液洗滌樹脂。加入1倍柱體積的GST洗脫緩沖液(50mmol/LTris-HCl pH 8.0，10mmol/L Glutathione)，室溫孵育10分鐘后，收集流出液，其中含有被純化蛋白質。
2.細胞抽提物的制備將細胞以3×106接種于90mm培養板，過夜培養至90％匯合后進行轉染。DNA用量為40μg，LIPOFECTAMINETM2000用量為60μl。48小時后收獲細胞。PBS溶液洗滌細胞后，將培養板置于冰上，每個培養板加入1ml裂解液，重復幾次，讓細胞充分裂解。收集裂解液，于4℃12,000rpm離心20分鐘，收集上清，-70℃保存備用。
3 Pull-Down實驗在兩個平行裝有50μl Glutathione Sepharose 4B的柱中，分別加入GST-HSD-0.7(1.1nmol)和GST(1.3nmol)，并以10倍柱體積的PBS沖洗。在兩個柱中各加入500μl睪丸提取液，孵育1h后，以50倍柱體積PBS-T(138mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4，0.05％Tween 20)沖洗。以100μl GST Elution Buffer(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/L Glutathione)洗脫。洗脫液進行SDS-PAGE，并以相應抗體進行Western印跡分析。
實施例4免疫共沉淀實驗驗證細胞內Dok5與TrkB、TrkC受體相互作用1)lysis buffer150mM NaCl，50mM Tris，pH8.0，1％Triton-X-100.向lysis buffer中加入混合蛋白酶抑制劑10μM leupeptin，1mM EDTA，1μM pepstatin，1μM PMSF.
2)將培養的細胞倒去培養基，用PBS清洗一次。
3)向細胞中加入lysis buffer，細胞與lysis buffer的比例大約是0.5-1×106cell1mllysis buffer。置于冰上10分鐘，小心刮下裂解物。
4)裂解物10,000g 4℃離心20分鐘。
5)小心將上清轉移到另一無菌離心管中，置于冰上。
6)每ml上清中加入50μl Protein-A Sepharose，預清除裂解物。
7)4℃搖動混勻1小時。
8)4℃10,000g離心1分鐘。
9)小心將上清轉移到另一無菌離心管中，置于冰上。
10).加入1-2μg一抗和50μl Protein-A Sepharose，4℃搖動混勻2-24小時。
11).除去上清。用lysis buffer清洗樹脂兩次。
12).加入SDS-PAGE上樣緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 6.8，100mM DTT，2％SDS，0.001％溴酚藍和10％甘油)，98℃變性5分鐘，10,000g離心1分鐘，取上清進行SDS-PAGE和western-blot檢測。
實施例5Dok5與TrkB、Trk共定位實驗1.試劑4％多聚甲醛固定液60mlPBS中加入4g多聚甲醛，60～80℃水浴中滴加1mol/L的NaOH至溶解透明。待溶液冷卻至15℃時用HCl將pH調至7.0。最后用PBS補充至100ml。
透化液0.5％Triton/PBS封閉液3％BSA/PBS封片劑以預先配制的2％DABCO/PBS(Triethy lenediamine)制備90％的甘油2.實驗步驟1)細胞轉染將細胞鋪入有蓋玻片的12孔板中，待細胞達到50％-60％滿度時進行。
2)細胞固定轉染后48小時用PBS清洗細胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10～15分鐘。
3)PBS漂洗，3×5分鐘。
4)去離子水漂洗去鹽，2×5分鐘。
5)封片取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。立刻用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。
實施例6Dok5參與Neurotrophin誘導的MAPK信號通路的激活1)胰酶消化細胞，計數并鋪入24孔板，待細胞90％滿度時進行轉染。
2)轉染細胞采用lipofectamine2000轉染細胞，轉染質粒如下ApcDNA3.1V5-Trk 3ugpcDNA3.1-Flag 3ugBpcDNA3.1V5-Trk 3ugpcDNA3.1-Flag-Dok5 3ugCpcDNA3.1V5-Trk 3ugpcDNA3.1-Flag-Dok5ΔC 3ug3)轉染8小時后換液，繼續培養24小時。
4)用相應的neurotrophin處理細胞，分別在處理后0min，5min，15min，30min，60min裂解細胞并制備蛋白樣品。
5)western bloting檢測Trk受體，Dok5及DokΔC蛋白表達情況，并檢測Erk蛋白磷酸化水平變化情況。
序列表<110>中國醫學科學院基礎醫學研究所<120>神經營養因子BDNF、NT-3信號通路新成員Dok5的鑒定和應用<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>921<212>DNA<213>人工序列<400>1atggcttcca attttaatga catagtgaag caagggtacg tgaggatccg gagcagacgc60ctcgggattt atcagcgatg ctggttagta ttcaagaaag cttcaagcaa aggtccaaaa120agactggaga aattttctga tgaacgtgct gcatatttca ggtgttatca taaggttaca180gaactcaata atgtgaagaa cgtagctcga ttgccaaaaa gcaccaagaa acatgccata240gggatttatt tcaatgacga tacctccaag acttttgctt gcgaatcaga tcttgaggct300gatgagtggt gcaaagtact ccagatggag tgtgtaggaa cacggatcaa tgacatcagc360cttggagagc ctgacttact ggccactggg gttgagagag aacagagtga gagattcaat420gtgtatttga tgccatctcc taacttagat gtacatggcg aatgtgcctt gcagattaca480tatgagtata tctgtctttg ggacgtccag aatcccagag tcaaactcat ctcttggccg540ctaagcgccc tgcggcggta tggacgtgat actacgtggt tcacttttga ggcagggagg600atgtgtgaga ctggtgaagg gctgtttatc tttcagaccc gagacgggga ggccatctat660cagaaagtcc actctgctgc cttggccata gccgagcagc acgagcgctt gctacagagt720gtgaaaaact cgatgctcca gatgaagatg agtgagcggg ccgcctcgct gagcaccatg780gtgcccctgc ctcgcagcgc ctactggcag cacatcacac ggcagcacag cacgggacag840ctctaccgct tgcaagatgt ttccagccct ctgaagcttc atcgaacaga gacttttcca900gcctacagat ctgagcactg a 921<210>2<211>306<212>蛋白<213>人工序列<400>2MASNFNDIVK QGYVRIRSRR LGIYQRCWLV FKKASSKGPK RLEKFSDERA AYFRCYHKVT60ELNNVKNVAR LPKSTKKHAI GIYFNDDTSK TFACESDLEA DEWCKVLQME CVGTRINDIS120LGEPDLLATG VEREQSERFN VYLMPSPNLD VHGECALQIT YEYICLWDVQ NPRVKLISWP180LSALRRYGRD TTWFTFEAGR MCETGEGLFI FQTRDGEAIY QKVHSAALAI AEQHERLLQS240VKNSMLQMKM SERAASLSTM VPLPRSAYWQ HITRQHSTGQ LYRLQDVSSP LKLHRTETFP300AYRSEH
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼人Dok5蛋白的核苷酸序列，所述的核昔酸序列與序列表1中核苷酸序列有至少90％的同源性。
2.神經營養因子BDNF、NT-3信號通路新成員Dok5的鑒定與應用。Dok5以依賴于受體磷酸化的方式結合BDNF、NT-3受體胞內區的NPQY模體，并參與BDNF、NT-3誘導的MAPK信號通路的活化。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一個蛋白，該蛋白具有序列表2所示的序列。
4.一種人Dok5蛋白多肽，其特征在于，它包括具有序列表2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有序列表2序列的多肽。
6.一種權利要求1所述DNA分子的應用，其特征在于，它作為模板或引物用于核酸擴增反應或者用制造基因芯片；或者用于制備藥物以預防、診斷或治療人神經系統的疾病。
7.利用權利要求4、5所述蛋白或多肽的應用，其特征在于用于制備藥物以預防、診斷或治療神經系統的疾病。
8.利用權利要求2所述的Trk-Dok5-MAPK信號通路的藥物開發和治療方案，用于治療神經系統的疾病。
全文摘要
本發明涉及神經營養因子BDNF、NT－3信號通路一個新成員Dok5的鑒定和應用。本發明克隆了人dok5的基因，該基因編碼一個胞漿信號蛋白。通過酵母雙雜交實驗、pulldown實驗和免疫共沉淀實驗，我們證明Dok5能夠以依賴于受體磷酸化的方式結合BDNF、NT－3的受體TrkB、TrkC胞內區的NPQY模體。細胞熒光實驗顯示Dok5與TrkB、TrkC受體在PC12細胞中共定位。對MAPK信號通路的檢測顯示，Dok5能夠有效增強BNDF、NT－3誘導的MAPK信號通路的活化水平并延長其活化時間。BDNF、NT－3作為多種神經系統疾病的治療藥物，已經進入臨床實驗，而Dok5能夠結合BDNF、NT－3的受體TrkB、TrkC，并能夠有效增強BDNF、NT－3信號通路的活化，這為治療多種神經系統疾病提供了新的作用靶點，因此可用于開發神經系統疾病的藥物。
文檔編號C12Q1/68GK101078013SQ20061008123
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月26日 優先權日2006年5月26日
發明者石磊, 尤元剛, 談昕煜, 袁建剛, 彭小忠, 強伯勤 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所