豚鼠胃促胰酶的制作方法

專利名稱：豚鼠胃促胰酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及到豚鼠胃促胰酶、編碼豚鼠胃促胰酶的核苷酸序列、以及基于豚鼠胃促胰酶的鑒定抑制胃促胰酶活性和PAOD(周圍動脈閉塞性疾病)以及抑制哮喘的化合物的辦法。
胃促胰酶是一種胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，除大鼠以外，該酶存在于肥大細胞的分泌顆粒中。在免疫學上，肥大細胞由于其在變態反應和纖維變性反應中的重要作用而著稱。如果肥大細胞被活化，胃促胰酶與組織胺和許多其它中間物一起經由脫粒作用釋放入細胞外間隙。釋放以后，胃促胰酶產生廣泛的重要促炎癥效應。胃促胰酶裂解多種生理上和病理上重要的蛋白質，例如干細胞因子、大血管內皮素、TGF-β或者載脂蛋白，并且胃促胰酶還能夠通過蛋白水解活化膠原酶。除了這些作用之外，可以假定人胃促胰酶的主要作用之一是從血管緊張素I產生血管緊張素II。為此，人們還推測胃促胰酶在心臟衰竭、高血壓、變態反應、皮炎、風濕性關節炎、哮喘和慢性炎癥情況中具有重要作用。
人類物種僅具有一種胃促胰酶基因，而其他物種具有多種胃促胰酶基因。如果在一種生物體中僅包含一種胃促胰酶，則胃促胰酶彼此之間似乎非常相似。如果存在幾種胃促胰酶，那么它們表現出不同的任務和適應性。因此僅具有一種胃促胰酶的動物模型最適宜用于臨床試驗，因為人類同樣僅具有一種胃促胰酶。尤其以嚙齒類如小鼠和大鼠為例，我們發現了多種胃促胰酶基因，并且甚至在倉鼠中我們也發現了兩種胃促胰酶基因。
本發明的目的是發現僅具有單一一種胃促胰酶異形體(同時該異形體與人胃促胰酶高度同源)的動物物種。
本發明通過克隆和制備豚鼠胃促胰酶實現該目的。為此，從豚鼠器官樣品、尤其是心臟中分離基因組和總RNA。為了能夠以靶向方式復制胃促胰酶或胃促胰酶樣序列，有必要設計對這些序列具有特異性的引物。這里設計產生的引物列于表5。應用這些引物，從基因組DNA開始進行PCR擴增。為了能夠描述PCR結果，必須確定質粒插入部分的序列。經由數據庫檢索，將這些序列與目前已知的全部DNA序列進行比較，并檢查同源性。因此也可以將DNA序列轉換成為所得蛋白質的氨基酸序列。
對11個樣品進行測序得到了已經所知且與胃促胰酶非常相似的絲氨酸蛋白酶的DNA序列。然而，對于一個樣品首次發現了胃促胰酶樣豚鼠部分序列，其示于圖4。加下劃線的堿基對應著引物部分。與其他DNA序列的同源性搜索顯示，該序列與已知DNA分子例如小鼠的粒酶(gep_mmmmcp5a)或者胃促胰酶1(gep_mmctala1)十分相似，但是并不是完全相同。此種序列比較示于圖5。
得到結果的反應包含引物GP_CHY_12_F和GP_CHY_17_R以及引物GP_CHY_15_F和GP_CHY_17_R。因此在目前所產生的所有引物中，引物GP_CHY_17_R與豚鼠胃促胰酶樣序列具有最高特異性。
接著，基于從基因組DNA分離的序列確定了所編碼的序列，這是因為使用特異性引物(表6)從作為模板的豚鼠cDNA中擴增了豚鼠胃促胰酶的更多片段。從該部分序列開始，選擇了更多引物(表7)以便確定豚鼠胃促胰酶的更多cDNA序列。在多種反應中，可以確定更多的序列，其示于

圖1(Seq ID No.1)。對圖1中核酸序列進行翻譯得到圖2所示無信號肽的成熟胃促胰酶多肽序列(Seq ID No.2)。
總共對437條序列進行了測序。在該過程中，7次出現豚鼠胃促胰酶，7次出現粒酶，但是沒有發現備選的胃促胰酶。
因此，本發明涉及包含序列Seq ID No.1的核酸序列。優選地，核酸序列是序列Seq ID No.1。此外，本發明還涉及包含序列Seq ID No.2的多肽序列，其中多肽序列優選地為序列Seq ID No.2。此外，本發明還涉及包含編碼上面指定多肽序列的核酸序列的核酸序列。而且，本發明涉及包含上述核酸序列的表達載體。而且，本發明涉及包含上述表達載體的宿主細胞。
將豚鼠胃促胰酶多肽序列與已知序列進行了比較(表1和2)。
表1已知胃促胰酶序列與成熟豚鼠胃促胰酶多肽序列的比較
表2與人成熟胃促胰酶多肽序列的比較
在此處所比較的動物物種當中，豚鼠是一種其胃促胰酶與人類胃促胰酶具有高度同一性和同源性(77.9和86.3％)的動物。人類、小鼠和豚鼠的胃促胰酶彼此之間如此相似以致于所有這些胃促胰酶都是α胃促胰酶。圖3顯示豚鼠胃促胰酶包含胃促胰酶的所有重要特征·二硫鍵在相同的位置，·活性三角的位置同樣也是相同的，
·兩條序列在口袋1的入口處具有甘氨酸，·糖類一致。
既然豚鼠是最適合的動物模型，本發明涉及在體細胞和生殖細胞帶有突變的胃促胰酶基因的豚鼠，其中至少一個等位基因通過突變的胃促胰酶基因的同源重組在功能上被阻斷，其中該功能性阻斷抑制功能性胃促胰酶基因在豚鼠細胞中的表達。
因此，本發明還涉及以下鑒定胃促胰酶調節物和PAOD抑制劑的方法。
公開了篩選調節胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步驟a)將化合物與根據權利要求3或4的所分離的豚鼠胃促胰酶多肽相接觸；和b)測定豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是調節豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
還公開了鑒定調節胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步驟a)將化合物與根據權利要求3或4的所分離多肽相接觸；和b)確定豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是調節豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
另一個方法是鑒定調節胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步驟a)將化合物與根據權利要求7的宿主細胞相接觸；和b)測定在宿主細胞中表達的豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是調節豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
本發明還公開了鑒定調節胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步驟a)將化合物施用于豚鼠；和b)測定豚鼠胃促胰酶活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是調節豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
最后，本發明涉及鑒定抑制PAOD的化合物的方法，其包括以下步驟a)將抑制豚鼠胃促胰酶的化合物施用于豚鼠；b)引起PAOD，和c)確定PAOD的程度；其中抑制PAOD的化合物是導致由步驟b引起的PAOD在一定程度上減輕的化合物。優選地，PAOD是通過施用月桂酸、通過球囊導管損傷脈管或者通過飼喂高脂肪含量的餌料引起的。通過施用月桂酸引起PAOD是特別優選的。引起PAOD的另一個特別優選的方式是通過球囊導管損傷豚鼠的脈管，其中脈管優選地為以頸動脈。
使用熟悉的方法來確定PAOD的程度。例如，通過確定球囊導管損傷后豚鼠頸動脈中新血管內膜的形成來確定PAOD的程度。另一種可能性是確定月桂酸模型中在踏旋器上跑動的豚鼠疲勞程度(Kawamura等人，1985，Arzneimittelforschung 35/7A1154-1156)。
本發明涉及鑒定抑制哮喘的化合物的方法，其包括以下步驟a)將抑制豚鼠胃促胰酶的化合物施用于豚鼠；b)引起哮喘；和c)確定哮喘的程度，其中抑制哮喘的化合物是導致由步驟b)引起的哮喘在一定程度上減輕的化合物。在該方法中，使用常見方法誘發哮喘和確定哮喘程度。
本發明還涉及如上所述的、尤其與下列實施例相關的序列、方法和豚鼠。
附圖簡述圖1豚鼠胃促胰酶的核酸序列(Seq ID No.1)圖2成熟豚鼠胃促胰酶的氨基酸序列(Seq ID No.2)圖3人胃促胰酶和豚鼠胃促胰酶的比較圖4從基因組DNA分離的豚鼠胃促胰酶的第一個序列圖5小鼠胃促胰酶與所克隆的豚鼠序列的序列比較圖6用于豚鼠胃促胰酶cDNA擴增和克隆的引物的位置圖7來自cDNA的豚鼠序列圖8豚鼠胃促胰酶與倉鼠胃促胰酶1和2的比較圖9用于克隆更多的豚鼠胃促胰酶序列的引物的位置實施例實例1細胞破裂和從豚鼠心臟獲得RNA為了能夠證明胃促胰酶在豚鼠中的存在和活性，分離了總RNA。豚鼠心臟用作器官樣品。
實施例1.1為獲得RNA的細胞破裂通過使用所謂的Lysing Matrix D柱將細胞破裂。為此，分別將5×10mg和5×30mg的豚鼠心臟裝入帶有小陶瓷球的管內，并且覆蓋300μlRLT緩沖液(RNeasy試劑盒)和β-巰基乙醇的混合物(每1ml RLT緩沖液加入10μl β-巰基乙醇)。隨后，使用FastPrep勻漿器將管振蕩2×20秒，通過剪切力使細胞破裂。通過離心，粗的細胞碎片沉淀下來，并將上清液轉移至干凈的管中。
隨后，向每個管中加入590μl蒸餾水和10μl1mg/ml的蛋白激酶K，通過顛倒將溶液混勻并在55℃孵育10分鐘以分解蛋白質。室溫下以10,000轉/分離心3分鐘，沉淀粗細胞碎片并將900μl上清液轉移至干凈的管中。
實例1.2RNA分離用RNeasy Mini試劑盒按照說明書從該種蛋白質和其它細胞成分的混合物中分離總RNA(見RNeasy試劑盒，“從心臟、肌肉和皮膚組織分離總RNA”的方法)。
1.向每一反應加入450μl 100％EtOH用于變性RNA，顛倒混勻溶液。
2.向柱中加入700μl該混合物，于4℃以10,000轉/分離心30秒，丟棄流出液，使RNA結合至帶有收集管的RNeasy柱的二氧化硅薄膜上。
3.向柱子中加入350μl RW1緩沖液，于4℃以10,000轉/分離心30秒洗滌柱子，丟棄流出液。
4.將柱子轉移至新收集管中，向柱子中加入500μl RPE緩沖液并于4℃以10,000轉/分離心30秒以洗滌柱子。
5.再向柱子中加入500μl RPE緩沖液并于4℃以10,000轉/分離心2分鐘，以便干燥二氧化硅薄膜。
6.轉移柱子至干凈的1.5ml管中。
7.向每個柱子里加入30μl無RNA酶水，隨后通過于4℃以13,000轉/分離心30秒洗脫RNA。
隨后通過分光光度法在260nm波長下測定所得到的多種RNA溶液的濃度。
實例1.3從豚鼠RNA產生cDNA如下所述，使用Transcriptor第一鏈cDNA合成試劑盒按照說明書產生cDNA。在這里，準備了使用兩種不同引物的兩個不同反應。
1.用移液管混合8μl RNA 30.11μl oligo(dT)引物或者2μl接頭引物(Invitrogen)用H2O加至13μl2.在65℃孵育反應物10分鐘以便將引物加到RNA上。
3.在冰上冷卻反應物2分鐘。
4.每一反應中，加入4μl 5×反應緩沖液0.5μl RNA酶抑制劑2μl dNTP0.5μl反轉錄酶5.50℃孵育反應物1小時進行反轉錄酶反應。
6.85℃孵育5分鐘使反轉錄酶失活。
7.冰上冷卻反應物2分鐘。
為了去除低分子片段和RT-PCR中未使用成分，利用QIAquick PCR純化試劑盒按照適用于微量離心機法的說明書純化不同的反應物，如下1.向每一RT-PCR反應中加入250μl PB緩沖液，混合溶液。
2.將每一反應物加到具有收集容器的QIAquick柱子上，于4℃以13,000轉/分離心1分鐘使DNA結合至柱子的二氧化硅薄膜上，丟棄流出液。
3.為了洗滌柱子，向每個柱子中加入750μl PE緩沖液，于4℃以13,000轉/分離心1分鐘，丟棄流出液。
4.于4℃以13,000轉/分離心柱子1分鐘以便干燥二氧化硅薄膜。
5.轉移柱子至一干凈的1.5μl管中。
6.向每個柱子中加入30μl EB緩沖液，室溫孵育1分鐘，隨后于4℃以13,000轉/分離心1分鐘洗脫cDNA。
實施例2細胞破裂和從豚鼠心臟獲得基因組DNA證明豚鼠存在胃促胰酶的另一種可能性是利用基因組DNA。既然不能確定所找到的基因事實上是否表達，所以使用了該方法。
實例2.1細胞破碎與RNA的獲得一樣，為了獲得基因組DNA必須將細胞破碎。再次，使用上述Lysing Matrix D柱實現該過程。為此，分別將2×100mg的豚鼠心臟加入到帶有小搪瓷球的管中并覆蓋1.2μl消化緩沖液。該緩沖液的組成示于表3表3消化緩沖液
隨后，使用FastPrep勻漿器將管振蕩2×20秒，通過剪切力將細胞破裂。
實例2.2通過酚抽取和乙醇沉淀分離DNA
使用相固定凝膠(Phase Lock Gel)按照說明書經酚抽取將蛋白質和DNA分離，如下1.以13,000轉/分離心20-30秒將凝膠離心到管(2.0毫升)底部。
2.向每個管中加入100-750μl的破裂細胞。
3.加入同樣體積的有機溶劑，在該例中為酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)。
4.通過間或顛倒混合10分鐘(不進行旋渦)。
5.以13,000轉/分離心5分鐘進行相分離。
6.取上清液進行進一步處理。
隨后，如下詳述經乙醇沉淀洗滌并濃縮DNA。
1.將酚抽取后的上層相轉移至一個新的杯中并加入其自身體積1/10的3M醋酸鈉(NaAc)pH 5.0和其自身體積2.5倍體積的100％EtOH。
2.用無菌接種環撈取變性DNA分子并轉移到新的杯中。
3.在1.5ml 10mM tris-HCl pH 7.5中復性DNA并重復加入EtOH、NaAc。
4.于4℃以11,200轉/分離心15分鐘。
5.去除上清液并將沉淀重懸于1.5ml 75％EtOH中。
6.為了去除鹽分，顛倒懸浮液10分鐘。
7.于4℃以11,200轉/分離心10分鐘，去除上清液，將沉淀空氣干燥10-15分鐘。
8.將沉淀溶解于1.5ml 10mM tris-HCl pH 7.5。
實施例3在基因組DNA中查找胃促胰酶編碼序列為了能夠鑒定其中各個基因失活的胃促胰酶序列，必須用PCR方法從基因組DNA模板中擴增這些序列。在該部分實驗中，為了該目的，設計并使用了對豚鼠胃促胰酶具有特異性的不同簡并性引物。
實例3.1豚鼠胃促胰酶引物設計據認為，胃促胰酶在所有動物模型中具有高的同源性。因此從已知的倉鼠胃促胰酶1序列出發，開始進行數據庫搜索，查找盡可能相同的其它已知DNA序列。然后將此次搜索的陽性序列(其包括例如許多小鼠和大鼠絲氨酸蛋白酶和胃促胰酶)彼此之間進行比較，并且從各個序列之間具有最廣泛變異的區域設計引物，可以設想這些引物將結合胃促胰酶和胃促胰酶樣序列。為了獲得更大的序列選擇，在各個引物中允許在一定程度上存在變異。通過在序列的各個位置上允許出現幾種不同的殘基產生了這些變異。此類引物稱為簡并性引物。變異通過表4中所示的普遍應用的字母代碼表示；這些引物由合同公司生產。
表4字母代碼
表5引物設計
實施例3.2使用所產生引物的PCR使用簡并性引物，嘗試擴增了胃促胰酶或者胃促胰酶樣序列。為此，每個F引物與每個R引物組合。
PCR反應體系如下1μl 模板(基因組DNA)1μl 第一個引物(GP_CHY_12_F至16_F)1μl 第二個引物(GP_CHY_17_F至21_R)20μlHotStarTaq Master Mix17μl H2OPCR反應按照以下程序進行95℃ 10分鐘
72℃ 10分鐘4℃ 保存使用1％瓊脂糖/EtBr凝膠分析PCR產物。
實施例4已獲得PCR產物的擴增為了獲得足夠量的關于已得到PCR產物的材料用于進一步研究，通過轉化方式并經由細菌培養將這些PCR產物擴增。
實施例4.1PCR反應物的純化為了去除低分子片段和干擾后續轉化的其他物質，如上所述使用QIAquick PCR純化試劑盒按照說明書將所選則的PCR反應物純化。
實施例4.2用TOPO TA克隆試劑盒進行轉化既然在PCR反應物中經常存在幾種產物或低分子干擾片段，在絕大多數情況下直接測序是不可能的。因此，為了分離和擴增，將PCR產物整合入細菌載體中并隨后將質粒導入感受態細胞。如下所述，這可以通過使用TOPO TA克隆試劑盒進行。
1.混合4μl PCR反應物，1μl鹽溶液和1μl TOPO載體。室溫孵育反應物5分鐘。
2.向每管冰浴融化的感受態TOP 10F’細胞中加入2.5μl該混合物。
3.冰上孵育細胞5分鐘，使質粒進入細胞。
4.42℃熱休克30秒鐘以終止細胞攝取DNA，并立即冰浴2分鐘。
5.向每管細菌中加入300μl LB培養基并在振蕩器上于37℃培養1小時。
6.對于每一反應物，涂布接種兩塊LB/amp平板，并且于37℃培養過夜。
實施例4.3PCR產物在培養物中的增殖和質粒分離為了獲得僅擴增特定質粒的培養物，使用無菌移液管尖從4.2部分中獲得的平板挑取菌落接種于1.5ml LB/amp培養基中，對于每一反應物挑取8個單獨菌落。在搖床上37℃培養過夜。
培養完成后，取1ml每種培養物轉移至干凈的1.5ml管中或者96孔板中(取決于樣品數量)。然后，將細胞于4℃以3,000轉/分離心15分鐘并去除上清液。隨后，如下所述使用QIAprep 8Turbo小量制備試劑盒按照說明書利用QIAvac 6S設備進行質粒分離。
1.通過渦旋將細菌沉淀重懸于250μl P1緩沖液中。
2.每管加入250μl P2緩沖液以裂解細菌并小心顛倒混合4分鐘。
3.加入350μl N3緩沖液以沉淀蛋白質并小心顛倒混合4分鐘。
4.設定QIAvac 6S設備。
5.將上清液轉移至上盤的渦輪過濾帶(turbo filter strip)內并應用真空直到全部樣品進入下面的柱子。
6.除去渦輪過濾帶并將帶有樣品的柱帶(column strip)放在上盤，用收集槽代替在基底盤內的帶固定器(strip holder)。
7.應用真空直到全部液體已經流過柱子。
8.加入1ml PB緩沖液洗滌柱子并應用真空直到液體流過柱子。
9.加入1ml PE緩沖液洗滌柱子并應用真空直到液體流過柱子。重復此步驟一次。
10.應用最大真空5分鐘以干燥柱薄膜，然后去除全部上層盤并用高度吸水的紙巾使柱子出口干燥。
11.用已經通過下面放置的微管架升高的96孔空板替換收集槽。
12.將上層盤安裝到設備中并向每個柱子中加入100μl EB緩沖液，室溫孵育1分鐘。
13.為了洗脫樣品，應用最大真空5分鐘。
實施例4.4所分離質粒的限制性消化為了從細菌載體中分離插入部分并檢測它們，按照以下方案進行限制性消化10μl 質粒1.5μl10×EcoRI緩沖液0.15μl BSA1μl EcoRI2.5μl H2O在37℃孵育1小時進行限制性消化，隨后用1％的瓊脂糖/EtBr凝膠檢查。
實施例5擴增PCR產物的序列測定為了能夠檢測已經通過細菌質粒擴增的PCR產物是否為胃促胰酶序列，目前已經確定了胃促胰酶的序列。
實施例5.1所選質粒的序列測定由于采用限制性消化，可以鑒定具有不同插入部分的質粒，從而避免對相同插入部分進行重復測序。對于序列測定，首先必須使用熒光標記的ddNTP進行鏈終止合成反應。這些熒光標記的ddNTP可與反應緩沖液和正常dNTP一起以稱作Big Dy的預混合物的形式得到。
以下體積用于序列測定5μl 質粒溶液5μl Big Dye1μl 引物M13-R引物M13-R用于序列測定，這是因為該引物結合到緊靠多克隆位點外面，因此每一插入部分可以完全不依賴于其類型而進行測序。
按照以下程序進行鏈終止合成反應95℃ 2分鐘 4℃ 保存隨后使用Dye Ex 2.0試劑盒按照說明書除去反應物中的剩余熒光染料，因為這些熒光染料將干擾序列測定。
1.將具有凝膠物質的Dye Ex柱子渦旋30秒鐘。
2.將蓋旋轉1/4打開擋板。
3.通過彎曲(不要扭曲)折斷柱子的擋板。
4.把柱子放入收集器并以3,000轉/分離心3分鐘。
5.將柱子轉移到干凈的1.5ml管中。
6.將樣品點在傾斜凝膠表面的中心而不要用移液管頭接觸它。
7.以3,000轉/分離心柱子3分鐘以洗脫樣品。
然后使用測序儀對純化的樣品進行自動測序，并且經過數據庫檢索將所得到的堿基序列與全部已知DNA分子進行比較。此外，同樣經過數據庫檢索，從得到的DNA序列確定了所得到蛋白質的相應氨基酸序列。
實施例6使用特異引物尋找RNA中的胃促胰酶編碼序列實施例6.1豚鼠序列特異引物的產生借助于來自豚鼠的第一條DNA部分序列，設計了對其特異的引物。為此，選擇了豚鼠序列中與倉鼠和人類對照DNA序列最明顯不同的那些部分序列，并設計了長度為30個堿基的引物。然后這些引物由合同公司合成。
表6豚鼠胃促胰酶的特異引物
用于隨后PCR的引物示于圖6。
實施例6.2使用不同引物進行PCR目的是再次在豚鼠RNA中大范圍的尋找胃促胰酶序列。為此，將已經設計或迄今為止所使用的最不同的引物彼此相組合；在其它情況中，再次使用倉鼠胃促胰酶引物，并且還使用了oligo(dT)引物以及通用接頭引物(UAP，Invitrogen)。使用引物oligo(dT)和接頭引物產生的cDNA溶液用作模板。對于F和J的反應，僅使用接頭引物模板，而對于G和K的反應，使用oligo(dT)引物模板。所有其它反應使用兩種模板進行。此外，對于G和K的反應退火溫度為45℃，而對于其它的反應退火溫度為58℃。
使用這些引物組合準備反應物AHaChym_3_f+GP_CHY_17_RBGP_CHY_12_F+HaChym_4_rCGP_CHY_15_F+HaChym_4_rDGP_CHY_22_F+GP_CHY_17_REGP_CHY_22_F+HaChym_4_rFGP_CHY_22_F+UAP引物GGP_CHY_22_F+Oligo(dT)引物HGP_CHY_24_F+GP_CHY_17_RIGP_CHY_24_F+HaChym_4_rJGP_CHY_24_F+UAP引物KGP_CHY_24_F+Oligo(dT)引物LGP_CHY_24_F+GP_CHY_23_RMHaChym_3_f+GP_CHY_23_R反應物組成如下1μlcDNA模板1μl第一個引物1μl第二個引物20μl HotStarTaq Master Mix17μl H2OPCR反應按照以下程序進行95℃ 10分鐘 72℃ 10分鐘4℃ 保存使用1％瓊脂糖/EtBr凝膠檢測PCR反應物。
實施例7所選PCR產物的研究和擴增為了有足夠材料用于研究，所選的有希望的PCR產物通過轉化和細菌培養進行擴增，并且隨后研究可能的豚鼠序列。為此，選擇了反應FAP、JAP、HdI、HAP、IdI、IAP、LdI和LAP。
實施例7.1通過TOPO TA克隆擴增和質粒分離將所獲得的并使用QIAquick純化試劑盒純化的PCR產物再次通過TOPO TA克隆試劑盒整合入細菌載體，并通過轉化導入感受態細胞。將所得到的LB/amp平板在孵箱中于37℃培養過夜。
實施例7.2菌落PCR和細菌培養對于每一個反應物，用無菌的移液管尖從來自7.1部分的平板挑取6個單獨菌落。這些菌落首先在PCR反應物中浸幾次。在這個過程中，細菌被釋放，它們在隨后的PCR中被殺死并在第一個95℃步驟中破裂，以致于其中包含的質粒能夠用作模板。
所產生的各反應物的組成如下1μl引物M13-F1μl引物M13-R5μl HotStarTaq Master Mix3μlH2OPCR反應按照以下程序進行95℃ 15分鐘 72℃ 5分鐘
4℃ 保存此外，將這些移液管尖然后照例用于接種，在每一情況下接種于48孔板中1.5ml LB/amp培養基中。液體培養物在搖床上于37℃培養過夜。隨后，如上所述使用QIAprep 8 Turbo小量制備試劑盒分離質粒。
檢測菌落PCR通過與培養同時進行的菌落PCR，本發明使得在早期就知曉液體培養物中所包含插入片段成為可能，并因此能夠預選進一步操作的培養物。通過1％瓊脂糖/EtBr凝膠研究菌落PCR的結果。
實施例7.3所選質粒的序列測定使用QIAprep 8 Turbo小量制備試劑盒分離質粒。對于來自上面所列反應物的質粒的序列測定，有必要使用預先熒光標記的ddNTP進行鏈終止合成反應。
每一反應的組成如下5μl質粒溶液5μl Big Dye1μl引物M13-RPCR序列測定按照以下程序進行95℃1分鐘 4℃ 保存隨后，使用Dye Ex 2.0試劑盒去除各反應中的剩余熒光染料，因為這些染料會干擾序列測定。然后使用測序儀對純化的樣品進行自動測序，并且經過數據庫搜索將所獲得的序列與全部已知DNA分子進行比較。此外，同樣通過數據庫搜索，從所獲得的DNA序列確定了所得到蛋白質的相應氨基酸序列。
如此獲得的豚鼠序列示于圖7。
實施例8豚鼠胃促胰酶序列的完成在倉鼠胃促胰酶序列已經全部已知的情況下，到目前為止已經發現并測序的假定豚鼠胃促胰酶序列大致對應編碼成熟胃促胰酶的核酸序列。目前的任務是從該部分序列確定胃促胰酶5’方向的剩余序列。這通過所謂的5’RACE進行。
實施例8.1設計新引物根據最近確定的序列選擇新的特異性引物(表7)。引物由合同公司合成。
表7所設計引物
引物的位置如圖9所示。
實施例8.2不同cDNA模板的產生為了取得最可能的結果并且能夠排除任何模板降解，如下所述，通過使用兩種不同的試劑盒產生了4種不同的cDNA模板。
Transcriptor第一鏈cDNA合成試劑盒
1.用移液管混合，2×2μl RNA 30/1(見部分1.2)2μl 隨機引物(cDNA 1)或接頭引物(cDNA 2)9μl H2O2.在65℃孵育混合物10分鐘以便引物加入。
3.冰上冷卻2分鐘。
4.向每一反應物中加入4μl 反應緩沖液0.5μl RNA酶抑制劑2μl dNTP0.5μl 反轉錄酶5.將反應物在50℃孵育1小時進行反轉錄反應過程。
6.在85℃失活反轉錄酶5分鐘。
7.冰上冷卻反應物。
用于cDNA末端快速擴增的5’RACE試劑盒1.產生cDNA·用移液管混合，2×0.25μl 20μM GP_CHY_28_R8μl RNA 30/3和30/4(見部分1.2)7.25μl H2O·在70℃孵育10分鐘以便引物加入。
·冰浴1分鐘。
·向每一反應物中加入2.5μl 10×PCR緩沖液2.5μl MgCl2溶液1μl dNTP2.5μl DTT·在42℃預熱1分鐘。
·向每一反應物中加入1μl SS II反轉錄酶。
·在42℃孵育50分鐘以便進行反轉錄酶反應過程。
·在70℃失活反轉錄酶15分鐘。
·在37℃孵育1分鐘。
·向每一反應物中加入1μl RNA酶混合物。
·在37℃孵育30分鐘以降解RNA。
·將反應物貯存于冰上。
2.反應物的S.N.A.P.純化·向每一樣品加入120μl結合緩沖液。
·將樣品轉移入S.N.A.P.柱子，于4℃以13,000轉/分離心20分鐘。
·為了安全起見，將流出液保存于冰上。
·向每個柱子中加入400μl冷的1×洗滌緩沖液，離心并丟棄流出液。重復此步驟3次。
·用400μl冷的70％EtOH洗滌柱子并丟棄流出液。
·于4℃以13,000轉/分離心1分鐘干燥薄膜。
·轉移柱子到一個新管中，向每管中加入50μl已預熱至65℃的水。
·以13,000轉/分離心20秒鐘洗脫cDNA(cDNA3)。
3.經dC加尾向一部分cDNA 3添加多聚胞嘧啶尾·用移液管混合6.5μl DEPC處理水5μl 5×加尾緩沖液2.5μl 2mM dCTP10μl純化cDNA·94℃孵育2分鐘。
·冰上冷卻1分鐘。
·向每一反應加入1μl TdT(名稱)。
·在37℃孵育10分鐘以便進行dC加尾過程。
·在65℃失活TdT 10分鐘。
·將反應物在冰上冷卻(cDNA 4)。
實施例8.3PCR擴增最新獲得的cDNA片段因為已獲得的cDNA數量太少不能進行深入的研究，通過如下描述的PCR對它們進行擴增。
對于PCR，在冰上用移液器混合34.4μl H2O5μl Expand High Fidelity PCR緩沖液+MgCl21μl dNTP2μl 第一個引物2μl 第二個引物5μl cDNA0.6μl Taq聚合酶(3.5U/μl)這里使用了這些引物的組合cDNA1GP_CHY_17_R+27_FcDNA2GP_CHY_17_R+27_F和UAP+GP_CHY_27_FcDNA3GP_CHY_24_F+29_RcDNA4GP_CHY_24_F+29_R和UAP+GP_CHY_29_R對于使用cDNA 2的反應(其中使用了UAP)進行3’RACE，并且相應地對于使用cDNA 4的反應進行5’RACE。
PCR反應按照以下程序進行95℃10分鐘 72℃10分鐘
4℃ 保存用1％瓊脂糖/EtBr凝膠檢測樣品。
實施例8.4巢式擴增由于單一PCR幾乎不足以產生可見數量的所獲得cDNA，所以進一步PCR，關于這一點，其稱為“巢式擴增”。
為此，用移液管混合36.4μl H2O5μl Expand High Fidelity PCR緩沖液+MgCl21μl dNTP1μl 第一個引物1μl 第二個引物5μl 來自PCR 1的cDNA(以1∶100稀釋)0.6μl Taq聚合酶(3.5U/μl)在這里所使用了這些引物組合cDNA1GP_CHY_17_R+26_F(1)和GP_CHY_17_R+25_F(2)cDNA2-17GP_CHY_17_R+26_F(3)和GP_CHY_17_R+25_F(4)cDNA2-UAPUAP+GP_CHY_26_F(5)和UAP+GP_CHY_25_F(6)cDNA3GP_CHY_24_F+30_R(7)cDNA4-24GP_CHY_24_F+30_R(8)cDNA4-UAPGP_CHY_24_F+30_R(9)和UAP+30_R(10)隨后用1％瓊脂糖/EtBr凝膠檢測擴增產物。
隨后，將巢式擴增產物如上所述進行克隆、擴增和測序。
實施例9重組豚鼠胃促胰酶的表達利用克隆的序列(Seq ID No.1)在適當表達系統如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達重組豚鼠胃促胰酶并純化(Nakabuko等人，2000，Yeast 16(4)，315-23；Takai等人，1997，Clin.Chim.Acta 265，13-20；Schechter等人，1993，J.Biol.Chem.268，23626-23633)。
實施例9.1豚鼠胃促胰酶的表達和純化重組豚鼠胃促胰酶在BL21(DE3)細胞中作為N端融合蛋白表達，其中N端融合蛋白含有攜帶6×His標簽和腸激酶切割位點的26個氨基酸多肽。由于蛋白質表達形成不可溶的包涵體，所以必須進行復性。在變性條件下用谷胱苷肽修飾所分離和純化的包涵體，然后溶解于6M鹽酸胍，20mMEDTA pH 4.5。通過將蛋白質溶液以1∶100稀釋于大體積的重折疊緩沖液(50mM Tris/HCl pH 8.0，750mM精氨酸，1mM EDTA，2mM半胱氨酸)進行重折疊。選擇堿性pH以促進硫醇陰離子的形成及由此發生的二硫化物交換。溶液在4℃保存兩天。由于重折疊緩沖液的高離子強度，全部溶液不得不通過超濾進行濃縮并且在第一次層析之前進行透析。透析緩沖液包含50mM Tris/HCl、300mM NaCl和1mM β-巰基乙醇。通過使用相同緩沖液在Ni-NTA上層析并用梯度咪唑從柱子上洗脫蛋白，可以獲得粗的但仍然無活性的胃促胰酶。然后用腸激酶切除N-末端6×His標簽活化該酶。從而形成具有正確N-端的成熟豚鼠胃促胰酶。然而，除了激活作用以外，還觀察到蛋白質的部分自身消化。活化的酶在Superdex 75柱子上進行兩次層析，首先用含50mM Tris/HCl pH 8.0、300mM NaCl、1mMTCEP、10％甘油的溶液，然后用含50mM MES、300mM NaCl、1mMTCEP、10％甘油的pH5.5的微酸性溶液，因為胃促胰酶在那一pH(對應肥大細胞中的pH，在那里活性胃促胰酶被儲存起來)時是無活性的。最后，如SDS-PAGE顯示，所獲得的蛋白質純度＞98％。純化的蛋白質是單體形式的(如通過分析型超速離心所檢測)并且在熒光測定中是高活化的。
實施例10胃促胰酶活性測定使用常見方法(Muramatsu等人，2000，J.Biol.Chem.275，第5546頁；Uehara等人，1999，Hypertension 35，第57頁；Takai等人，1997，Clin.Chim.Acta 265，第15頁)測量豚鼠胃促胰酶的活性。
實施例10.1胃促胰酶抑制作用的測定對于胃促胰酶，選擇包含4氨基酸肽AAPF的底物作為胰凝乳蛋白酶樣化合物標準底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-[7-氨基-4-甲基香豆素]；Lockhart BE，等人，“Recombinant human mast-cell chymasean improvedprocedure for expression in Pichia pastoris and purification of the highlyactive enzyme.”Biotechnol Appl Biochem.在2004年5月26日的即刻出版物作為手稿BA20040074出版)。由Bachem(Bubendorf，瑞士)合成的肽的純度為95％。從Calbiochem(Merck Biosciences，San Diego，California，美國)獲得從人皮膚肥大細胞純化的胃促胰酶。測定緩沖液為0.15MNaCl、0.05M Tris HCl、0.05％CHAPS、0.1mg/ml肝素(肝素鈉，Sigma，豬腸粘膜)、0.02mM AAPF底物、1nM胃促胰酶，pH 7.4。測定在96孔板上(Packard Optiplate)進行，體積為0.05ml，室溫。胃促胰酶的活性以從底物釋放的游離的7-甲基-4-甲基香豆素在340/440nm(激發光/發射光)處熒光的初始增加率表示。與胃促胰酶在不含AAPF-底物的測定緩沖液中室溫預孵育30分鐘后，讀取抑制化合物對活性的抑制作用。然后通過加入所指出濃度的AAPF-底物起始測定。
表8豚鼠胃促胰酶活性的抑制作用IC50nMGP胃促胰酶人胃促胰酶coli940570ref cpd Meiji Seika Kaisha SF2809-V345590ref cpd Toa Eiyo TY-51076
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>豚鼠胃促胰酶<130>case 23232<160>21<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>954<212>DNA<213>豚鼠(Cavia porcellus)<220>
<221>豚鼠胃促胰酶<222>(1)..(954)<400>1agcacctgct gtgggcagcc tccctgagaa gatgtgtctt ctttctctcc ctctactact 60ctttctccag tacaccagag ccaaagctgg ggaagtcatc ggtggcacag agtgcaagcc120acactcccgc ccctacatgg cttacctaga aattgtctct tctgagggat atgagaaaga180ctgtagtggt ttcttgatac gacggaattt tgtgctaaca gcagctcact gtgcaggaag240gtctctaaca gtcaacctag gggtccacaa caaaaaaatg aaagaagaca catggcagag300gcttaaggtt ataaagcaat tcctgcatcc aaactacaat agctctgtac ttctccacga360catcatgtta ctcaagttgg agaagaaagc caacctgacc ctagccgtgg gcacactccc420cctcccacct gaatgcaact tcctcacatc tggaagaatg tgccgagcag caggctgggg480gcgcacgaat gtggaggagc ctgcctccga cactcttcag gaggtgaagc tgagactcat540ggatccccaa gcctgcaaac acttcccaaa ctttaaccac aatctccagc tgtgtgtggg600taatcctagg aagagaaaat ctgtattcaa gggagactct ggaggtcccc tcctgtgtgc660agggatagcc cagggcattg tatcctatgc acatcggaat gcaaaacctc ctgttgtctt720cacccgaatc tcccattacc ggccgtggat caacaagatc ttgaaagcaa attaaccatg780gagcctcggc cagccctgaa aggaaatctg gaactggatc tgagcaggtt ttctgtacca840cttactctgg ccctgtctct ggttcctgtt gaagccagcc catgtccttg agactccaga900aagtccctac aactcataga actctcaata aagcttcagc aaaaatccca aaaa 954<210>2<211>247<212>PRT<213>豚鼠
<220>
<221>豚鼠胃促胰酶<222>(1)..(247)<400>2Met Cys Leu Leu Ser Leu Pro Leu Leu Leu Phe Leu Gln Tyr Thr Arg1 5 10 15Ala Lys Ala Gly Glu Val Ile Gly Gly Thr Glu Cys Lys Pro His Ser20 25 30Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Glu Ile Val Ser Ser Glu Gly Tyr Glu35 40 45Lys Asp Cys Ser Gly Phe Leu Ile Arg Arg Asn Phe Val Leu Thr Ala50 55 60Ala His Cys Ala Gly Arg Ser Leu Thr Val Asn Leu Gly Val His Asn65 70 75 80Lys Lys Met Lys Glu Asp Thr Trp Gln Arg Leu Lys Val Ile Lys Gln85 90 95Phe Leu His Pro Asn Tyr Asn Ser Ser Val Leu Leu His Asp Ile Met100 105 110Leu Leu Lys Leu Glu Lys Lys Ala Asn Leu Thr Leu Ala Val Gly Thr115 120 125Leu Pro Leu Pro Pro Glu Cys Asn Phe Leu Thr Ser Gly Arg Met Cys130 135 140Arg Ala Ala Gly Trp Gly Arg Thr Asn Val Glu Glu Pro Ala Ser Asp145 150 155 160Thr Leu Gln Glu Val Lys Leu Arg Leu Met Asp Pro Gln Ala Cys Lys165 170 175His Phe Pro Asn Phe Asn His Asn Leu Gln Leu Cys Val Gly Asn Pro180 185 190Arg Lys Arg Lys Ser Val Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu195 200 205Cys Ala Gly Ile Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Ala His Arg Asn Ala210 215 220Lys Pro Pro Val Val Phe Thr Arg Ile Ser His Tyr Arg Pro Trp Ile225 230 235 240Asn Lys Ile Leu Lys Ala Asn245<210>3<211>33<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠<220>
<221>GP_CHY_12_F<222>(1)..(33)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(9)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n為a，c，g或t<400>3garkbyannc cncaytcccg nccytatcat ggc 33<210>4<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_13_F<222>(1)..(31)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(9)
<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n為a，c，g或t<400>4garkbyannc cncaytcccg nccytatcat g 31<210>5<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_14_F<222>(1)..(29)<220>
<221>misc_feature<222>(8)..(9)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>n為a，c，g或t<400>5
garkbyannc cncaytcccg nccytatca 29<210>6<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_15_F<222>(1)..(31)<400>6gagtcaaagc cacactcccg cccttacatg g 31<210>7<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_16_F<222>(1)..(31)<400>7gagtgcagac cacatgcccg cccctacatg g 31<210>8<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列
<220>
<221>GP_CHY_17_R<222>(1)..(29)<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n為a，c，g或t<400>8kyrcacasda rdggnccncc dgagtcycc 29<210>9<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_18_R<222>(1)..(29)<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n為a，c，g或t<400>9kyrcacasda rdggnccncc dgagtcycc 29
<210>10<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n為a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n為a，c，g或t<400>10kyrcacasda rdggnccncc dgag 24<210>11<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_20_R<222>(1)..(29)<400>11gcacacagaa gaggtccccc ggagtctcc 29<210>12<211>29<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_21_R<222>(1)..(29)<400>12ttacacacaa gaggccctcc agagtcccc 29<210>13<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>CHYGP_22_F<222>(1)..(28)<400>13gagaaagact gtagtggttt cttgatac 28<210>14<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>CHYGP_23_R<222>(1)..(28)<400>14gtatcaagaa accactacag tctttctc 28
<210>15<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>CHYGP_24_F<222>(1)..(24)<400>15atgctgcttc ttcctctccc cctg 24<210>16<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_25_F<222>(1)..(20)<400>16ctaacagtca acctaggggt20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列
<220>
<221>GP_CHY_26_F<222>(1)..(20)<400>17agctcactgt gcaggaaggt20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_27_F<222>(1)..(20)<400>18gacggaattt tgtgctaaca20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_28_R<222>(1)..(20)<400>19acccctaggt tgactgttag20<210>20<211>20<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_29_R<222>(1)..(20)<400>20accttcctgc acagtgagct20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>源自豚鼠序列<220>
<221>GP_CHY_30_R<222>(1)..(20)<400>21tgttagcaca aaattccgtc20
權利要求
1.包含序列Seq ID No.1.的核酸序列。
2.根據權利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列是根據Seq IDNo.1.的序列。
3.包含序列Seq ID No.2的多肽序列。
4.根據權利要求3所述的多肽序列，其中所述多肽序列是根據Seq IDNo.2.的序列。
5.核酸序列，其包含編碼根據權利要求3或4所述多肽序列的核酸序列。
6.表達載體，其包含根據權利要求1、2或5所述的核酸序列。
7.宿主細胞，其包含根據權利要求6所述的表達載體。
8.在體細胞和生殖細胞中帶有突變的胃促胰酶基因的豚鼠，其中至少一個等位基因通過突變的胃促胰酶基因的同源重組在功能上被阻斷，其中該功能性阻斷抑制功能性胃促胰酶基因在豚鼠細胞中的表達。
9.篩選調節胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步驟a)將化合物與根據權利要求3或4的所分離多肽相接觸；和b)測定豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是調節豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
10.鑒定調節胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步驟a)將化合物與根據權利要求7的宿主細胞相接觸；和b)測定在宿主細胞中表達的豚鼠胃促胰酶的活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是調節豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
11.鑒定調節胃促胰酶活性的化合物的方法，其包括以下步驟a)將化合物施用于豚鼠；和b)測定豚鼠胃促胰酶活性；其中抑制或刺激豚鼠胃促胰酶活性的化合物是調節豚鼠胃促胰酶活性的化合物。
12.鑒定抑制PAOD的化合物的方法，其包括以下步驟a)將化合物施用于豚鼠；b)引起PAOD；和c)確定PAOD的程度；其中抑制PAOD的化合物是導致由步驟b)引起的PAOD在一定程度上減輕的化合物。
13.根據權利要求12所述的方法，其中PAOD是通過施用月桂酸、使用球囊導管損傷脈管或飼喂含高比例脂肪的食物引起的。
14.鑒定抑制哮喘的化合物的方法，其包括以下步驟a)將抑制豚鼠胃促胰酶的化合物施用于豚鼠；b)引起哮喘；和c)確定哮喘的程度，其中抑制哮喘的化合物是導致由步驟b)引起的哮喘在一定程度上減輕的化合物。
15.如上所述的、尤其與前述實施例相關的序列、方法和豚鼠。
全文摘要
本發明涉及豚鼠胃促胰酶的序列。由于豚鼠僅僅表達一種胃促胰酶異形體，因此它們特別適宜作為模型用于鑒定調節胃促胰酶的化合物的方法。
文檔編號C12N9/64GK1896244SQ20061010144
公開日2007年1月17日 申請日期2006年7月13日 優先權日2005年7月13日
發明者J·比徹姆, J·芬格勒 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司