專利名稱：從胰酶粉中提取多酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種從鹽析物(胰酶粉)中提取多酶的方法，尤其涉及在一條工藝生產線上從鹽析物(胰酶粉)中提取及純化激肽酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、糜胰蛋白酶等酶的方法。
背景技術：
由于各種酶在不同的溫度和酸堿度的變化的情況下活性也隨之變化，甚至失去活性，這就提出了一個問題，在什么酸堿度什么溫度下能保證酶在層析過程，無論上樣、洗拄，洗脫等環節不失活或損失最小才是最合理的生產工藝。目前國內普遍采用的方法是單酶進行生產操作，大多都是使用一種層析方法及交換設備，提取單酶。該方法存在的主要問題在于I、由于鹽析物(胰酶粉)為多種酶的混合物，每種酶的純度很低，許多酶具有相似的分子結構和理化性質，因此往往在提取一種酶的同時，其它酶被當作雜質處理掉了，造成了極大的浪費。2、一種層析方法及設備的控制運用，只能提取一種酶，設備利用率很低，浪費了資源；操作容積極小，成本較高不可能用于工業化生產。3、層析使用的介質均為進口，價格昂貴，尤其親和層析使用介質為進口，價格貴，操作容量小，不適合工業化生產。4、操作波動性大，在線監測效果不能實現，生產效果不理想，降低了酶的提取收率。5、酶在提取后排出的廢液不利環保處理，對環境污染很大。這就導致了胰酶中在一條生產線上多酶聯產的工藝極為少見，而且已有工藝都有各自的不足。隨著酶分離純化技術的發展，人們迫切需要建立新的聯產工藝以適應工業化的需求。將離子交換層析和親和層析兩種分離純化法相結合，建立一種從鹽析物(胰酶粉)中提取及純化激肽酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶等酶的提取方法。
發明內容
針對上述問題，通過多年的研究，特別是對酶活性特點研究，本發明提供一種從胰酶粉中提取多酶的方法，解決了親和、除雜、洗脫的過程對生物活性的影響，大大提高酶生物活性的穩定性和提取收率，建立了一種低成本可行的聯產工藝，從而使產品質量和技術水平達到國內外最前沿的水平，具有工業化生產的潛力。本發明的技術方案如下I)預處理過程將胰酶粉溶解、過濾、脫鹽濃縮除雜，提取濾液；2)提取及純化激肽酶在第I層析柱中通過離子交換樹脂層析，然后通過濃縮脫鹽，凍干得到激肽酶；3)提取及純化糜蛋白酶在第2層析柱中通過離子交換樹脂層析，然后通過濃縮脫鹽，凍干得到糜蛋白酶；以及4)提取及純化胰蛋白酶，在第3層析柱中通過離子交換樹脂層析，然后通過濃縮脫鹽，凍干得到胰蛋白酶，其中在上述層析柱中使用的鹽溶液濃度不同。本發明采用多個離子交換柱，在不同的交換柱中放入不同的離子交換介質，一種親和樹脂、一種離子樹脂。根據多種酶的特性差異在不同的條件下，使混合在一起的不同的酶在不同的樹脂上親和層析。具體而言，離子交換柱中的交換劑以自身所帶相反電荷與蛋白質的靜電相結合，蛋白質進入離子交換柱后，與離子樹脂無吸引力的蛋白質被洗脫下來，余下的蛋白質結合在樹脂上。再利用其蛋白質表面電荷性質不同，與樹脂親和力不同，在不同的交換柱中使用不同的濃度的鹽溶液，經過檢測洗脫活性物質的數量將其分別洗脫下來達到分離純化。本發明提供一種從鹽析物(胰酶粉)中提取及純化激肽酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶等酶的工藝方法，在一條生產線上實現了把不同酶從復合酶粉中提出，提高了酶的提取收率 及設備的利用率，降低了生產成本，減少了廢水排放數量，有利于環保，為大規模生產奠定了經濟基礎。與現有單一酶的提取技術相比，本發明具有以下優點I、在酶的活性不降低的情況下，在一條生產線上實現分步驟提純并獲得多種酶產品，實現多酶聯產，生產周期短、運行穩定、連續性好，避免了人為操作帶來的各種影響因素。2、運用純化層析系統，離子層析和親和層析相結合技術，準確的控制條件保證不同酶活性方式，保證了產品質量又保證較高收率，降低了廢水中生物活性的數量，最大限度地節約了水量和電能，有利于環保。3、運用在線動態監測系統，通過在線檢測，既保證了良好的提純效果，又最大限度地節約了時間和洗脫液和洗柱液數量，節約了成本，提高效益且有利于環保；在線檢測同時能夠保證生產連續化，滿足大規模生產的需求，系統控制更加科學化、人性化。4、應用國產離子交換劑，替換了高價進口交換劑，降低了成本，為多酶聯產系統進行大規模生產奠定了基礎。5、多酶聯產可隨時根據原料各生物酶含量調整生產方式，可實現兩酶、三酶的生產，將來可實現多酶生產的變化需要，使多酶聯產實現產業化。6、具有簡單、快速、低成本、高活性回收率和比活力相對較高的優勢。
圖I是本發明的流程圖；圖2是應用本發明的方法的生產系統示意圖；圖3顯示了激肽酶在不同鹽濃度下的層析圖譜；圖4顯示了優化后的激肽酶的層析圖譜；圖5顯示了優化后激肽酶洗脫峰SDS-PAGE ；圖6顯示了糜蛋白酶的初步層析圖譜；圖7A顯示了糜蛋白酶樣品分步純化的電泳分析圖7B顯示了糜蛋白酶樣品隨時間自溶的電泳分析圖；圖8顯示了糜蛋白酶在不同濃度下的洗脫圖譜；圖9顯示了優化工藝后的糜蛋白酶的層析圖譜；圖10顯示了優化工藝后的電泳分析圖；圖11顯示了胰蛋白酶在親和介質上的初步層析結果；圖12顯示了胰蛋白酶在不同鹽濃度下的初步層析圖譜；圖13顯示了胰蛋白酶的洗脫峰SDS-PAGE。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明圖I為本發明的方法的處理流程圖。如圖所示，首先是準備階段將鹽析物放在純化水里進行溶解，并將其PH值調至弱酸性。對上述溶液進行壓濾，以過濾除渣，將過濾后的溶液進行濃縮和脫鹽，得到上樣液。將得到的上樣液的PH值調整為與第I層析柱內的平衡液的PH值一致，并測電導，然后取樣用雙層濾紙過濾測活性。通過第I層析柱對上樣液進行層析純化得到酶成品I :第I層析柱是填充交換介質的容器，其柱中放入離子交換介質(一種離子樹脂)。離子交換柱中的交換劑以自身所帶相反電荷與蛋白質的靜電相結合，蛋白質進入離子交換柱后，與離子交換介質無吸引力的蛋白質被洗脫下來，余下的蛋白質結合在介質上，再利用其蛋白持表面電荷性質不同，與介質親和力不同，使用不同濃度的鹽溶液，經過檢測洗脫活性物質的數量將其分別洗脫下來達到分離純化。具體而言，第I層析柱先進行預處理，通過堿洗、水洗、酸洗、水洗、平衡后準備上樣。在第I層析柱中上樣液部分被柱體膠吸附，未被柱體膠吸附的穿柱液進入第2層析柱。吸附到第I層析柱的上樣液經過洗柱、洗脫后為提純液，然后進行濃縮脫鹽，再進行干燥，成為酶成品I。優選地，在上述濃縮脫鹽過程之前，可以對經過第I層析柱后得到的所述提純液由第I’層析柱再進行一次層析純化，第I’層析柱與第I層析柱的區別在于離子交換介質不同，PH值不同，以得到純度更高的產品。通過第2層析柱對上樣液進行層析純化得到酶成品2 :未被柱體膠吸附在第I層析柱的穿柱液經過處理進入第2層析柱。在第2層析柱進行的操作與第I層析柱相同，區別在于所使用的離子交換介質不同。第2層析柱先進行預處理，通過堿洗、水洗、酸洗、水洗、過平衡后準備上樣。取第一層析柱的通過液及活性高的的洗柱液調PH值、測電導，為上樣液，上樣到第2層析柱。在第2層析柱中上樣液部分被柱體膠吸附，未被柱體膠吸附的穿柱液流入在下面詳述的第3層析柱。吸附到第2層析柱的上樣液經過洗柱、洗脫后為提純液，然后進行濃縮脫鹽，再進行干燥，成為酶成品2。優選地，在第2層析柱之后，可以對經過第2層析柱后得到的所述提純夜由第2’層析柱再進行一次層析純化，第2’層析柱與第I層析柱的區別在于離子交換介質不同，PH值不同，以得到純度更高的產品。通過第3層析柱對上樣液進行層析純化得到酶成品3 :未被柱體膠吸附在第2層析柱的穿柱液經過處理進入第3層析柱。在第3層析柱進行的操作與第1、2層析柱相同，區別在于所使用的離子交換介質不同，第3層析柱使用的是親和介質。第3層析柱先進行預處理，通過堿洗、水洗、酸洗、水洗、平衡后準備上樣。取溶液調PH值、測電導，為上樣液，上樣到第3層析柱。在第3層析柱中上樣液部分被柱體膠吸附，吸附到第3層析柱的上樣液經過洗柱、洗脫后為提純液，然后進行濃縮脫鹽，再進行干燥，成為酶成品3。如此，通過逐級增加填充不同性質的離子交換介質，可以從一種酶中提取多種酶。圖2為一種典型的三酶聯產的生產系統圖。下面以鹽析物(胰酶粉)為例，結合該設備來描述從鹽析物(胰酶粉)中提取及純化激肽酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶的方法。其包括如下步驟I、預處理I)溶解取8. IKg鹽析物(相當于20Kg胰酶粉)放在200L涼純化水里(水溫10°C以內) 攪拌溶解，并用0. 15mol/L的乙酸-乙酸鈉溶液調PH至4. 4，加IKg助濾劑(珍珠巖)攪拌溶解，取樣用雙層濾紙過濾，濾液測活性(3-10U/mg)。配成溶液裝在溶解罐中，通過料泵I進入板框過濾除渣。2)壓濾用增強聚丙烯板框壓濾機進行壓濾，濾液進入溶解液儲罐，把200L溶液壓濾完后再用100L、PH4. 4的涼純化水沖洗壓濾機，然后用真空泵吹壓濾機至壓濾機不往下滴液滴為止。3)濃縮和脫鹽將上述壓濾后的溶液都合在一塊進行濃縮、脫鹽(液溫為13°C )。濾液大約260L，用3KD濾器濃縮成100L左右，壓力不超過0. Ikpa,濾液濃縮成100L，加PH4. 4的涼純化水脫鹽，收集濃縮脫鹽液200L，為上樣液。其中要注意的是，濃縮脫鹽液的電導略低于要上樣柱子的平衡液的電導為止，不能高于上樣柱子的平衡液的電導。最后濃縮脫鹽液大約200L左右放入儲罐1，為上樣液。4)得到上樣液先調上樣液PH值，以跟Pl上樣柱子的平衡液的PH值一致，還要測量電導，然后取樣用雙層濾紙過濾測活性，通過料泵3進入Pl層析柱。弱電解質的電離與平衡常數、濃度、電離度均有關系；同樣，對于強電解質，根據科爾勞施(F. Kohlrausch)總結的經驗式可看出溶液電導率也與濃度相關。所以通過測量電導率的大小，可以間接計算出溶液中所含電解質的濃度，了解水中電解質的含量。2、層析純化得到激肽酶Pl層析柱的柱中裝有離子交換樹脂，例如國產DEAE-瓊脂糖快膠，DEAF 一瓊脂糖快膠具有高流速、高載量，可以快速純化大量粗產品，對化學和熱穩定性好的特點。I) Pl層析柱預處理①堿洗用100L純化水+40g氫氧化鈉進行堿洗；②水洗用純化水洗至中性，試紙測PH值顯中性為止；③酸洗用100L純化水+50mL乙酸進行酸洗；④水洗用純化水洗至中性，試紙測PH值顯中性為止；⑤平衡用0. 15M乙酸銨、PH6. O、電導ll_12ms的平衡液對Pl柱進行平衡。測流出液的PH值、電導，跟平衡液的PH和電導相差不大時平衡結束，可以上樣。2)上樣①Pl上樣平衡液為0. 15M乙酸銨，PH6. 0，電導控制在ll_12ms。平衡液大約需要200升，將Pl柱平衡好后，準備上樣。上樣液為儲罐I的濃縮液，調PH值6. O、電導10-12ms，電導不能高于Pl平衡液的電導。取樣用雙層濾紙過濾測活性，收集穿柱液。其中要求注意如下幾點>上樣時，柱子液面高度要控制在0. 5-lcm左右，然后用手將噴頭拿起，讓上樣液均勻散在柱子表面，至液面高度l_2cm時，將噴頭固定好。液體和樹脂通過攪拌下吸附lh。>上樣結束后，用5升的量器三次沖洗桶，防止桶內有殘留液。然后將小濾器放水， 防止濾器有殘留液產生影響。>流速要調好，防止柱子缺水。Pl柱流速控制在I. 5左右>穿柱液進行濃縮，準備上Cl柱。(詳情見后面)②洗柱洗柱液用0. 2M、PH6. O、電導16_17ms的乙酸銨緩沖液對柱進行抽濾洗滌(洗柱液大約需要150升)，取樣用雙層濾紙過濾測活性，收集洗柱峰,洗柱峰下來曲線顯直線為止。收集洗柱液和穿柱液進液儲罐2，并且一起進行濃縮。(洗柱液大約需要150升)，溶液由泵打入膜濃縮品進行脫鹽濃縮。然后濃縮液按0. 145Kg/L的標準加硫酸銨，調PH6. 0為上樣液準備上Cl柱(詳情見后面)。洗柱峰下來曲線顯直線，就可進行柱的洗脫步驟③。③洗脫對吸附了激肽酶的樹脂，用0. 4M、PH值6. 0乙酸銨的緩沖液，用其I倍體積的相同緩沖液平衡。再用20倍樹脂體積的緩沖液洗脫，洗脫流速為2 3倍樹脂體積ml/min對柱進行洗脫。收集洗脫活性峰，每個峰值，峰起、峰落、走平都要分接，并測活性。活性低、雜質高的另進行回收；活性高、雜質少的，進入酶液罐1，再由泵4打循環進行濃縮脫鹽，準備上P2層析柱。具體按實際測的結果來判定。核糖蛋白檢測曲線顯直線停止洗脫，Pl柱開始再生。含激肽酶活性高的溶液用3KD超濾器進行濃縮，超濾器壓力不能超過0. IMPa.濃縮至大約20L加3倍涼純化水進行脫鹽。④脫鹽洗脫下來的激肽酶溶液用3KD超濾器進行濃縮，超濾器壓力不超過0. IMPa,濃縮至大約20L，加3倍涼純化水進行脫鹽，在脫鹽至20L，再加3倍涼純化水，濃縮脫鹽液電導略低于P2層析柱的平衡液的電導為止，溶液量為30L就停止濃縮脫鹽，準備上P2層析柱。⑤再生液對Pl柱用再生液為I %鹽酸+10%氯化鈉溶液(實際100升水加上I升濃鹽酸)進行再生，再生的液體不需要回收，直接倒掉；常溫純化水水洗，試紙測PH值顯中性；再用平衡液平衡，Pl柱進入下一循環。。再生1%鹽酸+10%氯化鈉，不收集再生峰，直接棄去。水洗常溫純化水洗，試紙測PH值顯中性為止。平衡0. 15M乙酸銨，PH6. 0，電導ll_12ms，進入下一循環。Pl層析柱層析條件層析柱與液體體積比為I : 2 5
凝膠benzamidine-sephagroseFF流速2 3倍樹脂體積/h平衡液:0.15M 乙酸銨，PH6. 0，電導 ll_12ms洗柱液0.2M 乙酸銨，PH6. 0，電導 15_17ms洗脫液0. 4M乙酸銨，PH6. 0再生液I %鹽酸，10 %氯化鈉，不收集再生峰，直接棄去。P2柱預處理流程同Pl柱。P2柱平衡上樣平衡液0. 15M乙酸銨PH6. 0電導控制在ll-12ms.(平衡液大約需要200升將P2柱子平衡好后，準備上樣(上樣為Pl洗脫活性高的部分的濃縮脫鹽液)。 其中要求注意如下幾點>上樣時，柱子液面高度要控制在0. 5-lcm左右，然后用手將噴頭拿起，讓上樣液均勻散在柱子表面，至液面高度l_2cm時，將噴頭固定好。>上樣結束后，用5升的量器三次沖洗桶，防止桶內有殘留液。然后將小濾器放水，防止濾器有殘留液產生影響。>流速要調好，防止柱子缺水。P2柱流速控制在I. 5左右。>穿柱液洗柱液測后如果無活性倒掉，有活性進行回收。> P2柱洗柱洗柱液0. 2M乙酸銨PH6. 0電導16-17ms (洗柱液大約需要200升)溶液，對柱進行抽濾洗，洗柱峰走平便可以洗脫。>P2柱洗脫上樣液上樣后，吸附了激肽酶的層析柱用，0.4M乙酸銨PH 6. 0 (洗脫液大約需要200升)洗脫。激肽酶溶液進一步純化，活性低、雜質高的另進行回收；活性高的雜質少的，進行濃縮脫鹽，再用3KD超濾器進行濃縮，超濾器壓力不能超過0. IMPa.濃縮至大約20L加3倍涼純化水進行脫鹽。P2柱再生再生液1%鹽酸+10%氯化鈉(實際100升水加上I升濃鹽酸)再生的液體不需要回收，直接倒掉。P2柱層析條件層析柱與液體體積比為I : 2 5凝膠benzamidine_sephagrose HP流速2 3倍樹脂體積ml/min平衡液:0.15M 乙酸銨、PH6. O、電導 ll_12ms.洗柱液0. 2M乙酸銨、PH6. 0電導16_17ms洗脫液0. 4M乙酸銨、PH 6. 0 (洗脫液大約需要200升)再生液I %鹽酸+10%氯化鈉P2洗脫下來激肽酶溶液用3KD超濾器進行濃縮，脫鹽，超濾器壓力不超過0. IMPa,濃縮至20L，濃縮液放入凍干瓶，在-50-60度凍干機中進行凍干處理，最后冷凍干燥即得激肽酶。激肽酶活性達到2700U/g，超過國際標準1000U/g以上。圖3顯示了激肽酶在不同鹽濃度下的層析圖譜的分析結果示例，從圖中可以看出，I 7號峰為0. 1-0. 4Mol乙酸銨PH6. 0濃度下的洗脫峰，0. 4mol/LNaCl濃度已經可以洗至基線，0. 5mol/LNaCl濃度下無洗脫峰。綜上所述,層析的最優條件為平衡緩沖液為0. 15mol/乙酸銨緩沖液(pH6. 0),先用0. 15mol/乙酸銨緩沖液含0. 2mol/乙酸銨洗柱至蛋白檢測儀顯示為基線，再用0. 15mol/乙酸銨緩沖液(PH6. 0)含0. 4mol/乙酸銨洗脫，結果見圖4。圖4中的1、2號峰為雜蛋白峰，3號峰為激肽酶洗脫峰。采取優化后的工藝純化，激肽酶的比活性都在540~550U/mg，收率在7273%之間，重現性較好。圖5顯示了優化后激肽酶洗脫峰SDS-PAGE。圖5中I號為洗脫峰，2號為激肽酶標準品，3號為低分子量蛋白標準。3、提取及純化糜蛋白酶Cl層析柱(I)預處理①堿洗100L純化水+40g氫氧化鈉進行堿洗，②水洗用純化水洗至中性，試紙測PH值顯中性為止。
③酸洗100L純化水+50mL乙酸進行酸洗。④水洗用純化水洗至中性，試紙測PH值顯中性為止。⑤平衡測流出液的PH值、電導跟平衡液的相差不大時平衡結束，可以上樣。(2)上樣用10mMPB+20%硫酸銨溶液對柱進行平衡處理，準備上樣。上樣液為Pl柱的穿柱液和洗柱峰的濃縮液，按0. 145Kg/L的標準加硫酸銨、調PH至6. 0的平衡液進行上樣，取樣用雙層濾紙過濾測活性。收集穿柱液，馬上調PH至3. 0，測活性，有活性進行回收，沒活性倒掉。洗柱先用平衡液平衡層析柱。再用2倍柱體積的、同樣緩沖液以3mL/min洗滌樹月旨(洗柱液大約需要150升)，核糖蛋白檢測曲線顯直線為止，然后開始用10mMPB+15%氯化鈉進行洗柱。收集洗柱峰，馬上調到PH3.0，測活性，有活性的跟穿柱液合一塊進行回收。沒活性的不收集。核糖蛋白檢測曲線顯直線為止，開始洗脫。收集的穿柱液、洗柱液經處理待制備膜蛋白酶。洗脫用0. 1M、PH4. 0的乙酸溶液，對層析柱進行洗脫，各洗脫峰分開收集測活性，活性低的跟穿柱液、洗柱峰合一塊回收。活性高的用3KD超濾器進行濃縮、脫鹽，準備上P3柱。濃縮洗脫峰糜蛋白酶活性高的合在一塊用3KD超濾器進行濃縮，大約濃縮成10L，開始脫鹽。脫鹽10L濃縮液加30L PH3. 0的涼純化水進行脫鹽，濃縮脫鹽成IOL再加30LPH3. 0的涼純化水，濃縮脫鹽成10L，測電導，最后濃縮脫鹽液的電導lOOOus以下為止，上P3柱。Cl柱再生、平衡準備進入下一循環。①再生100L涼純化水+IOOg氫氧化鈉，(膠床體積的5倍)。②水洗中性用試紙測流出液PH，顯中性為止。③平衡測流出液的PH值、電導跟平衡液的相差不大時平衡結束，可以上樣，進入下一循環。Cl層析柱層析條件層析柱與液體體積比為I : 2 5凝膠Q-sephagroseHP流速2 3倍樹脂體積/h
平衡液10mMpB+20%硫酸銨，PH6.0，電導 ll_12ms洗柱液10mMPB+15%氯化鈉，PH6.0，電導 15_17ms洗脫液0. IM乙酸銨，PH4. 0再生液IOMM氫氧化鈉PH12，不收集再生峰，直接棄去
P3柱預處理流程同P2柱。平衡取Cl柱洗脫峰的濃縮脫鹽液10L，平衡液10mMpB+20%硫酸銨，進行平衡，準備上P3柱上樣液為(Cl洗脫濃縮液)。洗柱P3柱上樣后，用10mMpB+20、% PH6. 0硫酸銨溶液，對柱進行抽濾洗滌,核糖蛋白檢測曲線顯直線為止，可以進行洗脫，洗柱峰不回收。P3柱洗脫洗脫液為20%硫酸銨-10MMPBPH6. 0梯度洗脫，，注意接好每個峰值，峰起、峰落、走平都要分接，并測活性活性低的回收；活性高的雜質少的，合一起，進行濃縮脫鹽。濃縮脫鹽液既是糜蛋白酶。濃縮洗脫峰糜蛋白酶活性高的合在一塊用3KD超濾器進行濃縮，濃縮成10L。IOL濃縮液加30L、PH3. 0的涼純化水進行脫鹽，濃縮脫鹽成10L，再加30L PH3. 0的涼純化水，濃縮脫鹽成10L，測電導，最后濃縮脫鹽液的電導lOOOus以下為止。再生液進行再生，再生的液體不需要回收，直接倒掉；常溫純化水水洗，試紙測PH值顯中性；平衡液平衡，P3柱進入下一循環。P3柱層析條件層析柱與液體體積比為I : 2 5凝膠pheny1-sephagrose HP流速2 3倍樹脂體積/h平衡液10mMpB+20%硫酸銨，PH6.0，電導 ll_12ms洗柱液10mMpB+20%硫酸銨，PH6.0，電導 15_17ms洗脫液20%硫酸銨-10MMPBPH6.0再生液IOMM氫氧化鈉PH12鈉，不收集再生峰，直接棄去再生液洗脫下來的糜蛋白酶用3KD超濾器進行濃縮，脫鹽，超濾器壓力不超過0. IMPa，濃縮至20L，最后冷凍干燥即得。糜蛋白酶活性超過國際標準。圖6顯示了糜蛋白酶的初步層析圖譜,從圖中可以看出，0. 8mol/L(M-14)2504不足以洗脫蛋白，1-4號峰分別為0. 6,0. 4,0. 2，0mol/L(_2504的洗脫峰。I號峰為高鹽濃度穿透峰，2號峰為低鹽濃度洗脫峰。圖7A顯示了糜蛋白酶樣品分步純化的電泳分析圖。I表示低分子量蛋白標準，2表示胰蛋白酶標準品，3表示糜蛋白酶標準品,4表示糜蛋白酶樣品,5表示鹽析后的胰酶，6表示胰酶粗提液。優化后的糜蛋白酶比活在2400u/mg以上，為藥典標準2. 4倍,收率在85%左右，重現性較好。圖7B顯示了糜蛋白酶樣品隨時間自溶的電泳分析圖。其中I表示Oh (小時)后的糜蛋白酶樣品，2表不6h后的糜蛋白酶樣品，3表不12h后的糜蛋白酶樣品，4表示24h后的糜蛋白酶樣品,5表示糜蛋白酶標準品,6表示胰蛋白酶標準品。圖8顯示了糜蛋白酶在不同濃度下的洗脫圖譜。4、提取及純化胰蛋白酶柱平衡液10mM，PH4. 4，電導控制在800-1000US檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，(平衡液大約需要200升)上樣液為Cl穿柱液、洗柱液、活性高的部分的濃縮液。C2柱洗柱洗柱液用10mM，PH4. 4檸檬酸-檸檬酸鈉，電導控制在800-1000US，(洗柱液大約需要200升)緩沖液，先平衡層析柱，再對柱進行抽濾洗滌，穿柱液、洗柱液、測后如無活性倒掉，有活性進行回收。C2柱洗脫IOmM檸檬酸-檸檬酸鈉，PH4. 4，電導控制在2000US并對柱進行洗脫。注意接好每個峰值、峰起、峰落、走平都要分接，并測活性。活性低、雜質高的進行回收，活性高的雜質少的，合并一起，進行濃縮脫鹽。濃縮脫鹽液即為胰蛋白酶，準備凍干。C2柱再生再生液IOmM氫氧化鈉PH12，再生的液體不需要回收，直接倒掉。C2柱預處理流程同Cl柱。 上樣液為Cl洗脫液的濃縮脫鹽液，IOmM檸檬酸-檸檬酸鈉，PH4. 4，電導控制在800-1000US，先平衡層析柱，再對柱進行抽濾洗滌，穿柱液沒活性，不收集。洗柱液洗柱，核糖蛋白檢測曲線顯直線開始洗脫，洗柱峰不收集。洗脫液洗脫，各峰分開收集，測活性，活性低的回收，活性高的合一塊進行濃縮脫鹽，凍干為胰蛋白酶。C2柱層析條件層析柱與液體體積比為I : 2 5凝膠SP_sephagrose流速2 3倍樹脂體積/h平衡液IOmM檸檬酸-檸檬酸鈉，PH4. 4，洗柱液IOmM檸檬酸-檸檬酸鈉，PH4. 4洗脫液IOmM檸檬酸-檸檬酸鈉，PH6. 4再生液IOmM氫氧化鈉，PH12圖9顯示了優化工藝后的糜蛋白酶的層析圖譜。圖10顯示了優化工藝后的電泳分析圖，I表示胰蛋白酶標準品，2表示糜蛋白酶樣品，3表不膜蛋白酶樣品，4表不糜蛋白酶標準品。圖11顯示了胰蛋白酶在親和介質上的初步層析結果，其中I號峰為穿透峰，2號峰為洗脫峰。圖12顯示了胰蛋白酶在親和介質上的初步層析結果的又一示例，其中I號峰為穿透峰，2-5號峰分別為不同濃度下的洗脫峰。圖13顯示了胰蛋白酶的洗脫峰SDS-PAGE。采取優化后的工藝純化，所得胰蛋白酶比活在2400u/mg以上，為藥典標準2倍，收率在85%左右，重現性較好。利用本方法可同時進行多酶和一酶轉化，此方法也可隨時根據原料各生物酶含量調整生產控制過程，可實現多酶生產的變化需要，使多酶聯產實現產業化。下面的表顯示了由美國sgs公司為北京康寶欣諾科技有限公司進行的檢驗報告A-糜蛋白酶
權利要求
1.一種從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 1)預處理過程將胰酶粉溶解、過濾、脫鹽濃縮除雜，提取濾液； 2)提取及純化激肽酶在第I層析柱中通過離子交換樹脂層析，然后通過濃縮脫鹽，凍干得到激肽酶； 3)提取及純化糜蛋白酶在第2層析柱中通過離子交換樹脂層析，然后通過濃縮脫鹽，凍干得到糜蛋白酶；以及 4)提取及純化胰蛋白酶在第3層析柱中通過離子交換樹脂層析，然后通過濃縮脫鹽，凍干得到胰蛋白酶， 其中在上述層析柱中使用的鹽溶液濃度不同。
2.根據權利要求I所述的從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，所述步驟I)包括 11)溶解步驟，將胰酶粉放在涼純化水里溶解，并用乙酸-乙酸鈉溶液調節PH值至弱酸性； 12)壓濾步驟，用增強聚丙烯板框壓濾機進行壓濾；除去雜質，濾液另接； 13)濃縮和脫鹽步驟，將上述壓過程所接的溶液都合在一塊，在液溫13°C、壓力不超過0.Ikpa下進行濃縮、脫鹽。
3.根據權利要求I所述的從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，所述步驟2)包括 21)對第I層析柱進行預處理的步驟，用0.4氫氧化鈉溶液進行堿洗，用純化水洗至中性，再用乙酸溶液進行酸洗，再用純化水洗至中性，然后用PH值為6. O、電導為ll-12ms乙酸銨的平衡液進行平衡，用準備好的上樣液上樣到第I層析柱； 22)洗柱步驟，用0.15M、PH值為6. O、電導為ll_12ms的乙酸銨對第I層析柱進行抽濾洗滌，取樣用雙層濾紙過濾測活性，收集洗柱峰，直至洗柱峰下來曲線顯直線；以及 23)洗脫步驟，用0.4M、PH值為6. O、電導為ll-12ms的乙酸銨緩沖液進行洗脫，收集洗脫活性峰進行透析，每個峰值，峰起、峰落、走平都要分接，并測活性，直至核糖蛋白檢測曲線顯直線；并回收活性低、雜質高的。
4.根據權利要求3所述的從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，所述步驟23)包括洗脫過程中活性高、雜質少的合并一起進入到第I’層洗柱進行純化。
5.根據權利要求4所述的從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，在所述第I’層洗柱中，進行如下步驟 21’)對第I’層析柱進行預處理的步驟，用0. 4氫氧化鈉溶液進行堿洗，用純化水洗至中性；再用0. 5M乙酸溶液進行酸洗，再用純化水洗至中性；然后用0. 15M、PH值為6. 0的乙酸銨的平衡液進行平衡，并用調好的上樣液上樣到第I’層析柱； 22’ )洗柱步驟，用0. 2M、PH值為6. O、電導16_17ms的乙酸銨對第I’層析柱進行抽濾洗，直到洗柱峰走平；以及 23’ )洗脫步驟，用0. 4M、PH值為6. 0的乙酸銨緩沖液進行洗脫，對每個峰值，峰起、峰落、走平進行分接，并測活性；活性低、雜質高的進行回收。
6.根據權利要求I所述的從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，所述步驟3)包括31)對第2層析柱進行預處理的步驟，用0.4氫氧化鈉溶液進行堿洗，用純化水洗至中性；再用0. 5乙酸溶液進行酸洗，再用純化水洗至中性；然后用0. 2M、PH6. O、電導ll-12ms的硫酸銨平衡液進行平衡，并準備用調好的上樣液上樣到第2層析柱； 32)洗柱步驟，用0.15M、PH6. O、電導15_17ms的氯化鈉溶液對第2層析柱進行抽濾洗滌，取樣并用雙層濾紙過濾測活性，有活性的跟穿柱液合一塊進行回收，沒活性的不收集，直到核糖蛋白檢測曲線顯直線為止；以及 33)洗脫步驟，用0.1M、PH4. 0的乙酸銨緩沖液，對層析柱進行洗脫，各洗脫峰分開收集測活性，活性高的另接，活性低的跟穿柱液、洗柱峰合一塊回收。
7.根據權利要求6所述的從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，所述步驟33)包括洗脫過程中活性高的用3KD超濾器進行濃縮、脫鹽，進入到第2’層析柱進行純化。
8.根據權利要求7所述的從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，在所述第2’層洗柱中，進行如下步驟 31’ )對第2’層析柱進行預處理的步驟，用0.4氫氧化鈉溶液進行堿洗，用純化水洗至中性；再用0. 5M、乙酸溶液進行酸洗，再用純化水洗至中性；然后用10mM、PH4. 4的檸檬酸-檸檬酸鈉的平衡液進行平衡，并用調好的上樣液上樣到第2’層析柱； 32’ )洗柱步驟，用10mM、PH4. 4的檸檬酸-檸檬酸鈉對第2’層析柱對柱進行抽濾洗滌，洗柱液測無活性倒掉，有活性回收，直至洗柱峰走平；以及 33’ )洗脫步驟，用10mM、PH4. 4的檸檬酸-檸檬酸鈉的緩沖液進行洗脫，對每個峰值，峰起、峰落、走平都要分接，并測活性；活性低、雜質高的也要進行回收。
9.根據權利要求I所述的從胰酶粉中提取多酶的方法，其特征在于，所述步驟4)包括 41)對第3層析柱進行預處理的步驟，用氫氧化鈉溶液進行堿洗，用純化水洗至中性，再用乙酸溶液進行酸洗，再用純化水洗至中性，然后用PH6. 0的硫酸銨的平衡液進行平衡，并用調好的上樣液上樣到第3層析柱； 42)洗柱步驟，用10MPB+20%、PH6.0的硫酸銨對第3層析柱進行抽濾洗滌，取樣用雙層濾紙過濾測活性，有活性的跟穿柱液合一塊進行回收，沒活性的不收集，直到核糖蛋白檢測曲線顯直線為止；以及 43)洗脫步驟，用10MPB+20%、PH6.0的乙酸銨的緩沖液進行洗脫，層析柱進行梯度洗脫，各洗脫峰分開收集測活性；活性低的另回收，活性高的合一塊進行濃縮脫鹽。
全文摘要
本發明提供了一種從胰酶粉中提取多酶的方法。本發明采用多個離子交換柱，在不同的交換柱中放入不同的離子交換介質，一種親和樹脂、一種離子樹脂。根據多種酶的特性差異在不同的條件下，使混合在一起的不同的酶在不同的樹脂上親和層析。具體而言，離子交換柱中的交換劑以自身所帶相反電荷與蛋白質的靜電相結合，蛋白質進入離子交換柱后，與離子樹脂無吸引力的蛋白質被洗脫下來，余下的蛋白質結合在樹脂上。再利用其蛋白質表面電荷性質不同，與樹脂親和力不同，在不同的交換柱中使用不同的濃度的鹽溶液，經過檢測洗脫活性物質的數量將其分別洗脫下來達到分離純化。
文檔編號C12N9/76GK102747059SQ201110096188
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月18日 優先權日2011年4月18日
發明者梁志勇, 鄭健 申請人:北京康寶欣諾科技有限公司