專利名稱：一種適用于秈稻離體培養的分化培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于新植物技術領域。具體涉及一種秈稻的離體培養方法，更具體地說，涉及到秈稻愈傷組織繼代和分化培養基的改良及其在秈稻離體培養和轉基因中的應用。
背景技術：
培養基是植物離體培養方法的關鍵，任何植物離體培養方法的建立都主要是圍繞培養基的篩選來進行。植物離體培養是室內人工模擬植物自然生長的過程，不同物種有不同的生長條件和環境，因此，可以想象，設計一種適合所有物種組織培養的培養基是不可能實現的，每種培養基都有其最適的物種甚至基因型范圍。眾所周知，目前已經廣泛應用的幾種經典培養基，由于其組分含量不同。其作用和效果也不相同。B5培養基(Gamborg OL等，1968.Nutrient requirements of suspension culture of soybean roots cells.Exp Cell Res，50150-158)主要適用于十字花科植物的離體培養；N6培養基(Chu CC等.1975.Establishment of an efficientmedium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources.ScientiaSinica，18659-668)主要適合于粳稻的組織培養；MS培養基(Murashige T，Skoog F.1962.Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures.Plant Physiol，15473-493)使煙草、番茄、馬鈴薯等茄科植物的離體培養變得十分容易和方便。這些培養基被稱為植物組織培養的常用培養基而被沿用至今。
上述這些經典培養基的組成一般是由基本培養基和附加成分組成，其中基本培養基主要包括無機鹽(大量元素和微量元素)，維生素、甘氨酸和肌醇等有機營養成份，碳源等。植物激素和有機添加物，則是根據不同的培養目的、不同的培養對象和不同的培養時期進行調整的。對基本培養基的部分成分進行調整的培養基稱為改良的基本培養基，如改良的MS、改良的B5培養基等等。
至今，在秈稻品種離體培養過程中，愈傷組織不耐繼代以及繼代后愈傷組織難以分化仍是很突出的問題，這也是秈稻成為轉基因的遺難物種的主要原因。因為現在用于植物轉基因的任何成熟方法都是建立在植物離體培養方法基礎之上，且需要一個較長時間的抗性愈傷的篩選和繼代過程。目前，絕大多數關于秈稻品種離體培養過程中的愈傷組織繼代和分化報道試驗都是采用MS或N6培養基進行的，但使用這類培養基效果非常不能令人滿意。主要問題是現有的繼代的的愈傷組織生長速度很慢，而且愈傷組織的褐化嚴重，不能連續繼代培養，從而導致整個試驗失敗。因此，篩選適合秈稻愈傷組織繼代和分化的培養基，從而建立一種秈稻品種的離體培養方法對于秈稻的組織培養和轉基因研究及其應用具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于建立一種秈稻離體培養的方法，篩選適合于秈稻離體培養用的愈傷組織繼代和分化培養基，這種新的培養方法和培養基，能夠廣泛地適應于離體條件下的秈稻組織培養和轉基因的應用。
本發明通過以下技術方案實現一種秈稻離體培養的方法，其步驟包括1)將去殼的成熟種子、幼胚或花藥的秈稻外植體，置于75％酒精中清洗1分鐘，0.15％升汞浸泡10-15分鐘，無菌水漂洗，接入MS+2，4-D 2.5mg/L+谷氨酰胺300mg/L+脯氨酸500mg/L+3-5％蔗糖+0.3％植物膠(Phytagel)的培養基上，該培養基的pH為5.9，培養條件為26±1℃，暗培養，將所述的外植體誘導出愈傷組織；2)將步驟1)所得到的愈傷組織接入繼代培養基(編號為J3)培養，該培養基的組分為KNO31900-2000mg/L，NH4NO31500-1650mg/L，KH2PO4150-170mg/L，MgSO4·7H2O350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，煙酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麥芽糖30g/L，植物膠3.0g/L，pH為5.9，培養條件為26±1℃，暗培養，每隔20天繼代一次；3)取步驟2)所得到的繼代愈傷組織接入分化培養基(編號為DL3)，該培養基的組分如下KNO32800-3000mg/L，(NH4)2SO4350-450mg/L，KH2PO4300-400mg/L，MgSO4·7H2O180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，煙酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麥芽糖30-50g/L，6-芐基氨基嘌呤2mg/L，激動素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物膠5g/L，pH為6.0，培養條件為26±1℃，光照培養(16小時光/8小時暗)，再生出植株。
一種用于離體培養的秈稻愈傷組織繼代培養基(編號為J3)，其組分如下
KNO31900-2000mg/L，NH4NO31500-1650mg/L，KH2PO4150-170mg/L，MgSO4·7H2O350-370mg/L，CaCl2·2H2O 350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，煙酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麥芽糖30g/L，植物膠3.0g/L。
一種用于離體培養的秈稻愈傷組織分化培養基(編號為DL3)，其組分如下KNO32800-3000mg/L，(NH4)2SO4350-450mg/L，KH2PO4300-400mg/L，MgSO4·7H2O180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，煙酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麥芽糖30-50g/L，6-芐基氨基嘌呤2mg/L，激動素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物膠5g/L。
本發明的方法可應用于秈稻組織培養或轉基因上。
本發明的秈稻愈傷組織繼代培養基和/或分化培養基，可應用于秈稻組織培養或轉基因上。
本發明的優點在于利用生產上廣泛種植的、基因型差異較大的四個秈稻品種如明恢63(一種秈稻三系恢復系)、珍汕97B(一種秈稻三系保持系)、中419(一種秈稻三系或兩系恢復系)和W9864S(一種秈稻兩系不育系)為試驗材料，以現有的經典培養基做平行對比試驗，篩選得到的秈稻愈傷組織繼代培養基和分化培養基以及由此建立的秈稻離體培養方法，具有廣泛的針對性和適用性，可用于大多數秈稻品種的組織培養和轉基因的研究與應用。
具體實施例方式
實施例1秈稻愈傷組織繼代培養基的篩選試驗設計共分兩部分1、用MS、N6、B5和N6B(該培養基為N6的大量營養成分和B5的微量和有機營養成分)四種最常用的基本培養基(參見表5所示)為基礎，設置1倍(以X表示，下同)、2X，與蔗糖、麥芽糖兩種碳源組合成16種培養基；2、以MS大量營養元素為基礎，麥芽糖為碳源，設置MS、N6、B5的微量元素，每種微量元素設1X、2X、5X、10X四個水平，Fe2+設1X、1.5X、3X、5X四個梯度組合成48種培養基。將設計的共64種培養基分別接種秈稻愈傷組織進行繼代，每種培養基分別接愈傷組織5瓶。在26±1℃下暗培養20天。通過觀察比較各種培養基上的愈傷組織的生長情況(生長速度、質地和顏色)，篩選出適合秈稻離體愈傷組織的繼代培養基(編號為J3)。該培養基的組分如下KNO31900-2000mg/L，NH4NO31500-1650mg/L，KH2PO4150-170mg/L，MgSO4·7H2O 350-370mg/L，CaCl2·2H2O350-400mg/L，FeSO4·7H2O 35-42mg/L，Na2EDTA 50-56mg/L，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，煙酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，2，4-D 2.0-3.0mg/L，麥芽糖30g/L，植物膠3.0g/L，pH為5.9。
實施例2秈稻愈傷組織繼代效果的比較試驗試驗采用中國目前生產上廣泛種植的、基因型差異較大的并具有代表性的四個秈稻品種明恢63(一種秈稻三系恢復系)、珍汕97B(一種秈稻三系保持系)、中419(一種秈稻三系或兩系恢復系)和W9864S(一種秈稻兩系不育系)。將本發明的J3培養基與另外三種由常用的基本培養基MS(編號為J1)、N6(編號為J2)和B5(編號為J4)組成的繼代培養基，這些培養基中添加的附加成分和植物激素如2，4-D、脯氨酸、谷氨酰胺、麥芽糖和植物膠用量相同，區別僅僅在于基本培養基的成分及用量，pH均為5.9。做培養基性能的比較試驗。
不同秈稻繼代培養基的試驗設計編號J1MS的無機鹽、微量元素和有機成分(下同)+2，4-D 2.5mg/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺300mg/L+3％麥芽糖(碳源)+0.3％植物膠，pH5.9；編號J2N6的無機鹽、微量元素和有機成分(下同)+2，4-D 2.5mg/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺300mg/L+3％麥芽糖+0.3％植物膠，pH5.9；編號J3J3無機鹽、微量元素和有機成分(下同)+2，4-D 2.5mg/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺300mg/L+3％麥芽糖+0.3％植物膠，pH5.9；編號J4B5的無機鹽、微量元素和有機成分(下同)+2，4-D 2.5mg/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺300mg/L+3％麥芽糖+0.3％植物膠，pH5.9。
在本試驗中，四個用于試驗的秈稻品種的愈傷組織來自于實驗室接種誘導培養30天左右的新鮮愈傷組織，將這些愈傷組織稱量后分別接入四種以及按標準滅菌程序制備的固體繼代培養基(按常量預先加入瓊脂)上，每種培養基接種供試品種的愈傷組織各5瓶，接種后立即置于26℃暗培養。培養20天后，稱量愈傷組織的重量(以鮮重計)，計算不同培養下的愈傷組織的增重率。試驗結果見表1所示。
表1 不同培養基對秈稻愈傷組織繼代培養的效果
注表中統計的接種時愈傷組織鮮重和培養20天后的愈傷組織鮮重均為每品種5瓶愈傷組織鮮重的平均重量。
從試驗及方差分析結果可以看出在設計的四種培養基中，本發明的培養基J3對四個秈稻品種愈傷組織的繼代效果大大優于其余三種培養基；且J3培養基繼代的愈傷組織的質地鮮黃緊實，呈現很強的胚性狀態，有利于進一步培養。
實施例3秈稻愈傷組織繼代培養基J3對秈稻愈傷組織連續繼代的效果試驗按實施例提供的將上述四種供試秈稻品種的愈傷組織接入所述的J3培養基，進行連續繼代培養試驗，每次繼代培養的時間為20天。每次繼代后，稱量接種每個供試品種愈傷組織各5瓶做分化活力測定，以評價本發明的J3培養基對連續繼代愈傷胚性的保持能力。試驗效果見表2所示。
表2 秈稻愈傷組織繼代培養基J3對連續繼代的秈稻愈傷組織的分化活力測定
注a接種五瓶愈傷的總重量；b五瓶愈傷總分化的植株數結果顯示，本發明的繼代培養基，雖然隨著繼代次數的增加，愈傷的分化活力呈下降趨勢。但下降速度緩慢。繼代三次后各供試材料的愈傷組織仍保持較高的分化活力。完全可滿足轉化愈傷篩選繼代的要求，實施例4秈稻分化培養基的篩選與比較試驗試驗材料和方法以及愈傷組織的處理按照實施例1的步驟進行，通過觀察比較各種培養基上的愈傷組織的分化情況(分化速度和分化苗數)，篩選出的愈傷組織分化培養基(DL3)的成分如下KNO32800-3000mg/L，(NH4)2SO4350-450mg/L，KH2PO4300-400mg/L，MgSO4·7H2O180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，煙酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麥芽糖30-50g/L，6-芐基氨基嘌呤2mg/L，激動素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物膠5g/L；pH為6.0。
以本發明的培養基DL3的基本營養組分(包括大量成分、微量成分和維生素)與MS、N6基本培養基，另添加植物激素6-芐基氨基嘌呤2mg/L、激動素2mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.2mg/L、萘乙酸(NAA)0.2mg/L、氨基酸脯氨酸500mg/L、谷氨酰胺500mg/L，與兩種不同碳源組成的培養基進行分化效率測試。結果見表3。
不同秈稻分化培養基的試驗設計編號DL1MS，2.0mg/l 6-芐基氨基嘌呤，2.0mg/l激動素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％麥芽糖，0.3％植物膠，pH 6.0；編號DL2MS，2.0mg/l 6-芐基氨基嘌呤，2.0mg/l激動素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％蔗糖，0.3％植物膠，pH 6.0；編號DL3DL3基本培養基，2.0mg/l 6-芐基氨基嘌呤，2.0mg/l激動素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％麥芽糖，0.3％植物膠，pH 6.0；編號DL4DL3基本培養基，2.0mg/l 6-芐基氨基嘌呤，2.0mg/l激動素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％蔗糖，0.3％植物膠，pH 6.0；編號DL5N6，2.0mg/l 6-芐基氨基嘌呤，2.0mg/l激動素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％麥芽糖，0.3％植物膠，pH 6.0；編號DL6N6，2.0mg/16-芐基氨基嘌呤，2.0mg/l激動素，0.2mg/l萘乙酸，0.2mg/l吲哚乙酸，500mg/l脯氨酸，500mg/l谷氨酰胺，5％蔗糖，0.3％植物膠，pH 6.0；說明a每個三角瓶接種的愈傷組織鮮重。
說明b每個三角瓶內分化的植株數。
表3 不同秈稻分化培養基對秈稻愈傷組織分化效率的影響
試驗結果顯示，本發明的DL3培養基的分化效率極顯著高于其它培養基，即在設計的六種分化培養基中，DL3培養基最適于秈稻愈傷組織的分化培養。
實施例5本發明的秈稻離體培養方法在農桿菌介導的轉基因上的應用采用本發明的實施例1-4所述的秈稻品種的外植體，詳細的技術步驟按照本申請人同日提出的另一份申請中關于農桿菌介導的秈稻轉基因方法的發明申請所提供的技術步驟，用本發明提供的秈稻誘導培養基誘導出愈傷組織，然后用所述的編號為J3的培養基進行愈傷組織繼代，經過愈傷組織預培養、共培養和篩選培養，在篩選培養基上長出抗性愈傷組織。將篩選獲得的抗性愈傷組織經預分化和分化培養(采用編號為DL3的培養基)，最后再生出完整的轉基因植株。試驗結果如表4所示。
表4 本發明的秈稻離體培養方法在農桿菌介導的轉基因上的應用
表4顯示四個供試的秈稻品種均獲得較高的轉化效率，說明本發明的農桿菌介導的秈稻基因轉化方法是非常有效的。
表5 MS、N6、B5培養基的基本培養基及其組成
注配方來源MS培養基(Murashige和Skoog，1962)；B5培養基(Gamborg等，1968)；N6培養基(Chu等，1975)；AA(Toriyama和Hinata，1985)。
權利要求
1.一種適用于秈稻離體培養的分化培養基，其組分如下所述KNO32800-3000mg/L，(NH4)2SO4350-450mg/L，KH2PO4300-400mg/L，MgSO4·7H2O180-200mg/L，CaCl2·2H2O 170-200mg/L，FeSO4·7H2O 45-55mg/L，60-74mg/L Na2EDTA，MnSO4·4H2O 80-100mg/L，ZnSO4·7H2O 15-25mg/L，H3BO325-30mg/L，KI 6.0-8.0mg/L，CuSO4·5H2O 0.2-0.3mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.0-3.0mg/L，CoCl2·6H2O 0.2-0.3mg/L，甘氨酸2.0-3.0mg/L，VB10.5-1.0mg/L，VB61.0-1.5mg/L，煙酸1.0-1.5mg/L，肌醇100-150mg/L，谷氨酰胺300-500mg/L，脯氨酸500-800mg/L，麥芽糖30-50g/L，6-芐基氨基嘌呤2mg/L，激動素2mg/L，吲哚乙酸0.2mg/L，萘乙酸0.2mg/L，植物膠5g/L，pH為6.0。
2.權利要求1所述的分化培養基，其特征在于在秈稻離體培養中的應用。
全文摘要
本發明屬于新植物技術領域。具體涉及一種適用于秈稻離體培養的分化培養基的制備及應用。本發明的特征是，在離體條件下先誘導秈稻外植體得到愈傷組織、再通過繼代培養，最后將繼代的愈傷組織轉移到本發明所述的分化培養基，進而分化為完整的植株。培養基組分如下KNO
文檔編號C12N5/04GK1924008SQ20061014170
公開日2007年3月7日 申請日期2004年6月24日 優先權日2004年6月24日
發明者林擁軍, 張啟發 申請人:華中農業大學