用脂質膜被覆粒子的方法

專利名稱：用脂質膜被覆粒子的方法
技術領域：
本發明涉及用脂質膜被覆粒子的方法。
背景技術：
近年來，為了將藥物、核酸、肽、蛋白質、糖等準確遞送到靶向部 位的載體的開發很盛行。例如，在基因治療過程中，開發了將目的基因 導入靶細胞的載體-逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒等的病毒載體。但 是，病毒栽體存在大量生產的困難性、抗原性、毒性等問題，因此，少 有這樣的問題出現的脂質體載體正在引起人們的關注。脂質體載體具有 通過向其表面導入抗體、蛋白質、糖鏈等的功能性分子，能夠提高對靶 向部位的耙向性這一優點。
公知的脂質體的制備方法，例如有脂質膜的單純水合法。根據脂質 膜的單純水合法，在基因等目的物質的存在下，能夠通過將脂質膜水合 制備將目的物質封入其中的多層膜脂質體(非專利文獻1 )。通過對這樣 制備得到的多層膜脂質體再次進行脂質膜的單純水合法，能夠在多層膜 脂質體外側得到多層新的脂質膜。就這樣通過反復進行脂質膜的單純水 合法，能夠增加多層膜脂質體中含有的脂質膜的數量。
非專利文獻l: Kogure等，"Journal of Control led Release", 2004 年，98巻，317-323頁。
但是，采用脂質膜的單純水合法等以往的方法，脂質膜被不均勻的 多層化，很難控制多層膜脂質體含有的脂質膜的數量。另外，采用脂質 膜的單純水合法等以往的方法，脂質膜只能像地層一樣層層重疊在一塊， 脂質膜之間很難形成空間。

發明內容
因此本發明的目的在于提供一種能夠用兩張其間形成空間的脂質膜 來被覆對象粒子的方法，以及提供通過該方法用兩張脂質膜將對象粒子 被覆而得到的脂質體。
本發明的第一種方法為，用兩張脂質膜將帶正電粒子被覆的方法，
其特征在于，使所述帶正電粒子與多個帶負電suv型脂質體接觸，形成 含有所述帶正電粒子和已與所述帶正電粒子靜電結合的所述帶負電suv 型脂質體的帶負電復合物，用陽離子處理所述帶負電復合物。
根據本發明的第 一種方法，能夠用其間形成空間的兩張脂質膜被覆 帶正電粒子。通過本發明的第一種方法被覆帶正電粒子得到脂質體，在 被覆帶正電粒子的兩張脂質膜(形成于帶正電粒子外側的第一脂質膜以 及形成于第一脂質膜外側的第二脂質膜)之間形成空間，所要求的物質 能夠保留在該空間。
本發明的第一種方法中，所述帶正電粒子優選為目的物質的聚集物。 此時，通過本發明的第一種方法能夠制作封入目的物質的聚集物，且被 覆目的物質的聚集物的兩張脂質膜之間形成有空間的兩張膜脂質體。
本發明的第一種方法中，所述帶正電粒子優選為帶正電的n張膜脂 質體(n是大于1的整數)。此時，通過本發明的第一種方法能夠制作被 覆帶正電的n張膜脂質體的兩張脂質膜之間形成有空間的(n+2)張膜脂 質體。
本發明的第一種方法中，所述帶正電粒子的g電位優選為20~ 30mV,所述帶負電SUV型脂質體的^電位優選為-2G -30mV。此時，能 夠很有效地形成含有帶正電粒子和已與該帶正電粒子靜電結合的多個帶 負電SUV型脂質體的帶負電復合物。
本發明的第一種方法中，所述帶正電粒子的粒徑優選在50mn以上。 此時，能夠很有效地形成含有帶正電粒子和已與該帶正電粒子靜電結合 的多個帶負電SUV型脂質體的帶負電復合物。
本發明的第二種方法為，用兩張脂質膜將帶負電粒子被覆的方法， 其特征在于，使所述帶負電粒子與多個帶正電SUV型脂質體接觸，形成
脂質體的帶正電復合物，用陰離子處理所述帶正電復合物。
根據本發明的第二種方法，能夠用在其間形成空間的兩張脂質膜被 覆帶負電粒子。通過本發明的第二種方法被覆帶負電粒子得到脂質體， 在被覆有帶負電粒子的兩張脂質膜(形成于帶負電粒子外側的第一脂質 膜以及形成于第一脂質膜外側的第二脂質膜)之間形成空間，所要求的 物質能夠保留在該空間。
本發明的第二種方法中，所述帶負電粒子優選為目的物質的聚集 物。此時，通過本發明的第二種方法能夠制作封入目的物質的聚集物， 且被覆目的物質的聚集物的兩張脂質膜之間形成有空間的兩張膜脂質 體。
本發明的第二種方法中，所述帶負電粒子優選為帶負電的n張膜脂 質體(n是大于1的整數)。此時，通過本發明的第二種方法能夠制作被 覆帶負電的n張膜脂質體的兩張脂質膜之間形成有空間的(n+2 )張膜脂 質體。
本發明的第二種方法中，所述的帶負電粒子的《電位優選為-20~ -30mV，所迷帶正電SUV型脂質體的g電位優選為20~ 30mV。此時，能 夠很有效地形成含有帶負電粒子和已與該帶負電粒子靜電結合的多個帶 負電SUV型脂質體的帶正電復合物。
本發明的第二種方法中，所述帶負電粒子的粒徑優選在50nm以上。 此時，能夠很有效地形成含有帶負電粒子和已與該帶負電粒子靜電結合 的多個帶負電SUV型脂質體的帶正電復合物。
根據本發明的方法，能夠用兩張其間形成空間的脂質膜來被覆對象 粒子。因此，如果使用目的物質的聚集物作被覆的對象粒子，能夠制作 封入目的物質的聚集物，且被覆目的物質的聚集物的兩張脂質膜之間形 成有空間的兩張膜脂質體；如果使用n張膜脂質體(n是大于1的整數) 作被覆的對象粒子，能夠制作被覆n張膜脂質體的兩張脂質膜之間形成 有空間的(n+2)張膜脂質體。通過本發明的方法被覆帶正電粒子或帶負 電粒子得到的脂質體，在被覆帶正電粒子或帶負電粒子的兩張脂質膜之 間形成空間，要求的物質能夠保留在該空間。


圖1 (a)為表示通過DNA瓊脂糖凝膠電泳測定各分離物的DNA含量 的結果的圖，(b)為表示通過熒光強度測定各分離物的羅丹明含量以及 NBD含量的結果的圖。
圖2 (a)為表示通過DNA瓊脂糖凝膠電泳測定各分離物的DNA含量 的結果的圖，(b)為表示通過焚光強度測定各分離物的羅丹明含量以及 NBD含量的結果的圖。
圖3為表示通過各種多層脂質體被導入細胞內的熒光素酶基因的表 現活性的圖。
具體實施例方式
在本發明的第一種方法中，首先，使帶正電粒子與多個帶負電suv 型脂質體接觸，形成含有帶正電粒子和已與帶正電粒子靜電結合的帶負
電suv型脂質體的帶負電復合物。
在本發明的第二種方法中，首先，使帶負電粒子與多個帶正電suv
型脂質體接觸，形成含有帶負電粒子和已與帶負電粒子靜電結合的帶正 電suv型脂質體的帶正電復合物。
帶正電粒子的g電位沒有特別限制，只要它的e電位是正值即可，
通常為10 60mV，優選為20 50mV，更優選為20 30mV。帶負電粒子 的g電位沒有特別限制，只要它的g電位是負值，通常為-10 -60mV,
優選為-20~-50mV，更優選為-20 --30mV。 ？電位的測定條件無特別限 定，溫度條件通常為25°C。
帶正電粒子以及帶負電粒子的粒徑沒有特別限制，粒徑的下限值優 選為50nm,更優選為70nm,粒徑的上限值優選為500nm,更優選為200nm。 如果帶正電粒子的粒徑在上述范圍內，在用陽離子處理已與帶正電粒子 靜電結合的帶負電SUV型脂質體的時候，能夠用兩張脂質膜很有效地被 覆帶正電粒子。另外，如果帶負電粒子的粒徑在上述范圍內，在用陰離 子處理已與帶負電粒子靜電結合的帶正電SUV型脂質體的時候，能夠用 兩張脂質膜很有效地被覆帶負電粒子。
帶正電粒子在整體為正值時，加入到陽離子物質，即使含有中性物 質和/或陰離子物質也可以。帶負電粒子在整體為負值時，加入到陰離子 物質，即使含有中性物質以及/或者陽離子物質也可以。
帶正電粒子或者帶負電粒子，能夠使用例如，目的物質(例如應遞 送到細胞內或核內的物質)的聚集物。帶正電粒子或者帶負電粒子在使 用目的物質的聚集物時候，通過用兩張脂質膜被覆帶正電粒子或者帶負 電粒子，能夠制作封入有目的物質的兩張膜脂質體。目的物質的聚集物 可以只由目的物質構成，也可以含有目的物質以外的物質(例如保留 目的物質的栽體)。
目的物質帶正電的時候，例如，可以通過使目的物質和陰離子物質 靜電結合，使其復合物化的方法來制備目的物質的聚集物。目的物質帶 負電的時候，例如，可以通過使目的物質和陽離子物質靜電結合，使其 復合物化的方法來制備目的物質的聚集物。目的物質既不帶正電也不帶 負電的時候，通過目的物質和陽離子物質以適當方式(例如物理性吸 附、疏水性結合、化學結合等)，使其復合物化，制備目的物質的聚集物。 復合物化時，通過調整目的物質和陽離子物質或者和陰離子物質的混合 比，能夠制備整體帶正或負電的目的物質的聚集物。
目的物質沒有特別的限定，例如，可以是核酸、肽、蛋白質、藥物、 糖以及它們的復合物等。并且，向核酸中加入DNA或者RNA，就會含有 它們的類似物或者衍生物(例如肽核酸(PNA))、石危代磷酸酯DNA等。此 外，核酸可以是一條鏈或兩條鏈，可以是線狀也可以是環狀。
目的物質為核酸的時候，通過核酸和陽離子物質靜電結合復合物化， 制備核酸的聚集物。復合物化的時候，通過調整核酸和陽離子物質的混 合比，能夠制備整體帶正或負電的核酸聚集物。
制備目的物質的聚集物的時候使用的陽離子物質沒有特別限制，只 要分子中具有陽離子基團的物質即可。陽離子物質能夠使用的有，例如， 陽離子脂質(例如Lipofectamine ( Invitrogen乂A司制))；具有陽離
子基團的高分子；聚賴氨酸、聚精氨酸、賴氨酸和精氨酸的共聚物等的 堿性氨基酸的單聚物或者共聚物或者這些的衍生物(例如硬脂酰衍生 物)；聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨、氨基葡萄糖等 的多陽離子聚合物；硫酸精蛋白等。陽離子物質具有的陽離子基團的數 目沒有特別的限定，優選2個以上。陽離子基團帶有正電荷即可，沒有 特別的限定，例如，可為氨基；曱胺基、乙胺基等單烷胺基；二曱胺基、 二乙胺基等二烷胺基；亞氨基；胍基等。
制備目的物質的聚集物的時候使用的陰離子物質沒有特別的限制， 只要分子中具有陰離子基團的物質即可。陰離子物質能夠使用的有，例 如，陰離子脂質；具有陰離子基團的高分子；聚天門冬酰胺等酸性氨基 酸的單聚合物或者共聚合物或者這些的衍生物；黃原膠、聚羧乙烯、羧
曱基纖維素聚苯乙烯砜酸鹽、多糖類、鹿角菜膠、等的多陰離'子聚合物。 陰離子物質具有的陰離子基團的數目沒有特別的限定，優選2個以上。 陰離子基團帶有負電荷即可，沒有特別的限定，例如，可為具有末端羧 基的官能團(例如琥珀酸殘基、丙二酸殘基等)、磷酸根、硫酸根等。
例如，帶正電或者帶負電的n張膜脂質體(n為大于1的整數)，可 以當作帶正電或帶負電的粒子使用。在使用n張膜脂質體為帶正電或者 帶負電的粒子的時候，通過用兩張脂質膜被覆帶正電或者帶負電的粒 子，能夠制作(n+2)張膜脂質體。可以將目的物質封入帶正電或者帶負 電的n張膜脂質體內部，也可以不封入。帶正電的n張膜脂質體僅在整 體帶正電荷的時候，加入到陽離子物質，即使含有中性物質以及/或者陰 離子物質也可以。帶負電的n張膜脂質體僅在整體帶負電荷的時候，加 入到陰離子物質，即使含有中性物質以及/或者陽離子物質也可以。
n張膜脂質體能夠使用，例如，水合法、超聲波處理法、注入乙醇 法、注入乙醚法、反相蒸發法、表面活性劑法、凍結溶解法等公知方法 制作。另外，使用本發明的方法，通過用兩張脂質膜被覆帶正電或者帶 負電的粒子，也能夠制得n張膜脂質體。
通過調節構成n張膜脂質體的物質(例如脂質膜構成成分、被封 入脂質體內部的物質等)的種類以及含量，能夠制作帶正電或者帶負電 的n張膜脂質體。另外，通過用陽離子物質修飾帶負電的n張膜脂質體 或者中性的n張膜脂質體，能夠制作帶正電的n張膜脂質體；通過用陰 離子物質修飾帶正電的n張膜脂質體或者中性的n張膜脂質體，能夠制 作帶負電的n張膜脂質體。
n張膜脂質體能夠通過例如水合法，按如下所述制得。將脂質膜的 構成成分溶解于有機溶劑后，通過蒸發除去有機溶劑得到脂質膜。此時， 有機溶劑，例如，可以是戊烷、己烷、庚烷、環己烷等的碳水化合物；
二氯曱烷、氯仿等卣代碳水化合物；苯、甲苯等芳香族碳水化合物；甲 醇、乙醇等低級醇類；醋酸曱酯等酯類；丙酮等酮類；可將這些有機溶 劑單獨或者兩種以上相互組合使用。然后，通過水合該脂質膜、攪拌或 者超聲波處理，可轉化為多層膜脂質體。按照公知的方法能夠進行由多 層膜脂質體向一張膜脂質體或者由一張膜脂質體向多層膜脂質體的轉 化。通過將n張膜脂質體通過預定的孔徑大小的過濾器，能夠得到有一 定粒度分布的n張膜脂質體。
目的物質為水溶性的時候，通過向制造n張膜脂質體過程中水合脂 質膜時使用的水性介質中添加目的物質或者其聚集物，能夠將目的物質 封入脂質體內部的水相中。此外，目的物質為脂溶性的時候，通過向制 造n張膜脂質體過程中使用的有機溶劑中添加目的物質或者其聚集物， 能夠將目的物質封入脂質體的脂質膜中。
在用陽離子物質修飾帶負電的n張膜脂質體或者中性的n張膜脂質 體的表面的時候，例如，向帶負電的n張膜脂質體或者中性的n張膜脂 質體的外液中添加具有疏水性基團的陽離子物質。由此，為使陽離子物 質從脂質膜露出，將疏水性基團插入脂質膜，使陽離子物質能夠導入帶 負電的n張膜脂質體或者中性的n張膜脂質體的表面。
在用陰離子物質修飾帶正電的n張膜脂質體或者中性的n張膜脂質 體的表面的時候，例如，向帶正電的n張膜脂質體或者中性的n張膜脂 質體的外液中添加具有疏水性基團的陰離子物質。由此，為使陰離子物 質從脂質膜露出，將疏水性基團插入脂質膜，使陰離子物質能夠導入帶 正電的n張膜脂質體或者中性的n張膜脂質體的表面。
疏水性基團插入脂質膜即可，并沒有特別的限定。疏水性基團可以 是，例如硬脂酰基等的飽和或者不飽和脂肪酸基團、膽固醇殘基等的固 醇殘基、磷脂質殘基、糖脂殘基、長鏈脂肪族羥基殘基(例如磷脂乙 胺殘基等)、羥基丙烯烷基、甘油脂肪酸酯殘基等，其中特別優選碳原子 數為10 20的脂肪酸基團(例如棕櫚酰基、油醇基、硬脂酰基、花生 四烯酰基等)。
n張膜脂質體中脂質膜構成成分，只要不阻礙二層脂質的形成即可， 并無特殊限定。脂質膜構成成分，例如是脂質、膜穩定劑、抗氧化劑、 荷電物質、膜蛋白質等。
調節帶正電n張膜脂質體中脂質膜構成成分的種類以及含量，以使 n張膜脂質體整體帶正電；調節帶負電n張膜脂質體中脂質膜構成成分 的種類以及含量，以使n張膜脂質體整體帶負電。賦予正電荷的脂質膜 構成成分，例如，可以是陽離子脂質、陽離子膜穩定劑等，賦予負電荷 的脂質膜構成成分，例如，可以是陰離子脂質、陰離子膜穩定劑等。并
且，向n張膜脂質體內部封入預定物質(例如目的物質的聚集物)的時 候，按照封入n張膜脂質體內部的物質整體所帶的電荷，來調節n張膜 脂質體中脂質膜構成成分的種類以及含量。
SUV (small unilamellar vesicle)型脂質體為粒徑(直徑)在lOOnm 以下的一張膜脂質體。SUV型脂質體的粒徑(直徑)只要在lOOnm以下 即可，無特別限定，通常為30 ~ lOOnm，優選30- 70nm,更優選30 ~ 50nm。
多層膜脂質體(MLV )、除SUV之外的一張膜脂質體(例如LUV( large unilamellar vesicle)、 GUV (giant unlamellar vesicle)等)粒子直 徑在lOOnm以上( 一般認為有lOOnm以上粒子直徑的脂質膜為平面膜)， 膜的曲度以及膜表面能小，脂質體之間難以產生聚集。相反，SUV型脂 質體粒子直徑沒到lOOnm,膜的曲度以及膜表面能大，脂質體之間易于 產生聚集。因此，如果用陽離子處理與帶正電粒子靜電結合的帶負電SUV 型脂質體，帶負電SUV型脂質體之間就能夠有效膜融合。另外，如果用 陰離子處理與帶負電粒子靜電結合的帶正電SUV型脂質體，帶正電SUV 型脂質體之間就能夠有效膜融合。
SUV型脂質體能夠用如超聲波法，依如下所述制作。將脂質膜的構 成成分溶解于有機溶劑后，通過蒸發除去有機溶劑得到脂質膜。此時， 有機溶劑可以是，例如戊烷、己烷、庚烷、環己烷等的碳水化合物；二 氯甲烷、氯仿等卣代碳水化合物；苯、甲苯等芳香族碳水化合物；曱醇、 乙醇等低級醇類；醋酸曱酯等酯類；丙酮等酮類；可將這些有機溶劑單 獨或者兩種以上相互組合使用。然后，通過水合該脂質膜、攪拌或者超 聲波處理可轉化為多層膜脂質體。將得到的多層脂質體再由探針型超聲 波裝置進行處理，可制得一張小的膜脂質體SUV型脂質體。
SUV型脂質體中的脂質膜構成成分沒有特別限制，只要不阻礙形成 二層脂質即可，脂質膜的構成成分，例如，可以是脂質、膜穩定化劑、 抗氧化劑、荷電物質、膜蛋白質等。
調節帶正電SUV型脂質體中脂質膜構成成分的種類以及含量，以使 SUV型脂質體整體帶正電；調節帶負電SUV型脂質體中脂質膜構成成分 的種類以及含量，以使SUV型脂質體整體帶負電。賦予正電荷的脂質膜 構成成分，例如，可以是陽離子物質、陽離子膜穩定化劑等；賦予負電 荷的脂質膜構成成分，可以是陰離子物質、陰離子膜穩定化劑等。帶正 電SUV型脂質體只要整體帶正電，加入到賦予正電荷的脂質膜構成成分， 可以含有賦予負電荷的脂質膜構成成分和/或中性的脂質膜構成成分；帶 負電suv型脂質體只要整體帶負電，加入到賦予負電荷的脂質膜構成成
分，可以含有賦予正電荷的脂質膜構成成分和/或中性的脂質膜構成成 分。
帶正電SUV型脂質體含有的賦予正電荷的脂質膜構成成分為陽離子 脂質的時候，陽離子脂質的配量通常為脂質的總配量的5~30%(摩爾 比)，優選10~20% (摩爾比)，更優選10~ 15% (摩爾比)。
帶負電SUV型脂質體含有賦予負電荷的脂質膜構成成分為陰離子脂 質的時候，陰離子脂質的配量通常為脂質的總配量的5~ 30% (摩爾比), 優選10-20% (摩爾比)，更優選10~ 15% (摩爾比)。
帶正電SUV型脂質體的g電位沒有特別限制，只要它的g電位是正 值即可，通常為10-60mV，優選為20 50mV，更優選為20 - 30mV。帶 負電SUV型脂質體的g電位沒有特別限制，只要它的^電位是負值，通 常為-10~-60mV,優選為-20 -50mV，更優選為-20 ~-30mV。
^電位的 測定條件無特別限定，溫度條件通常為25。C。
在n張膜脂質體或SUV型脂質體中，脂質是脂質膜的必要成分，其 配量通常為脂質膜構成成分的總配量的30~100% (摩爾比)，優選50~ 100% (摩爾比)，更優選70~ 100% (摩爾比)。
脂質，可以為例如，磷脂、糖脂、固醇、飽和或者不飽和的脂肪酸 等。磷脂，例如，可以是磷脂酰膽堿(例如二油酰磷脂酰膽堿、二月 桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酸酰磷脂酰膽堿、二 硬脂酰磷脂酰膽堿等)、磷脂酰甘油(例如二油酰磷脂酰甘油、二月桂 酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂 酰磷脂酰甘油等)、磷脂酰乙醇胺(例如二油酰磷脂酰乙醇胺、二月桂 酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺等)、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心肌 磷脂、神經鞘髓磷脂、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、它們的氫化物等。糖 脂質，例如，可以是甘油糖脂(例如次石危酸核糖基甘油酯、二糖基二 甘油酯、二半乳糖基二甘油酯、半乳糖基二甘油酯、糖基二甘油酯)、鞘 糖脂(例如半乳糖基糖脂、神經節苷脂)等。固醇，例如，可以是來 源于動物的固醇(例如膽固醇、膽固醇琥珀酸、羊毛甾醇、二氫羊毛 甾醇、鏈甾醇、二氫膽固醇)、來源于植物的固醇(植物甾醇)(例如 豆甾醇、谷甾醇、菜子甾醇、菜油甾醇)、來源于微生物的固醇(例如 酵母甾醇、麥角甾醇)等。飽和或者不飽和的脂肪酸，例如，可以是棕 櫚酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸等的碳原子數12 20的飽 和或者不飽和的脂肪酸。
脂質分中性脂質、陽離子脂質以及陰離子脂質，中性脂質，例如， 可以是二酰磷脂酰膽義威、二酰磷脂酰乙胺、膽固醇、神經酰胺、神經鞘 磷脂、腦磷脂、腦苷脂等；陽離子脂質，例如，可以是DODAC (dioctadecyldimethylammonium chloride ) 、 DOTMA ( N- ( 2 ，
3-dioleyloxy ) propyl-N ，N , N-trimethylammonium ) 、 DDAB ( didodecylammonium bromide )、 D0TAP ( 1 ， 2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane )、 DC-Chol ( 3 P -N- (N ',N' -dimethyl-aminoethane ) -carbamolcholesterol )、 DMRIE ( 1， 2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium )、 D0SPA (2 ， 3- dioleoyioxy-N-[2 ( sperminecarboxamido ) ethyl]-N， N-dimethyl-l-propanaminum trifluoroacetate )等；P月離子月旨質，例 如，心肌磷脂、二酰磷脂酰絲氨酸、二酰磷脂酸、N-琥珀酰磷脂酰乙胺 (N-琥珀酰PE)、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙二醇、 膽固醇琥珀酸等。
n張膜脂質體或者SUV型脂質體中，膜穩定劑是為了使脂質膜物理 性或者化學性穩定、調節脂質膜的流動性而添加任意成分，其配量通常 是脂質膜構成成分的總配量的10~ 50% (摩爾比)，優選20~ 50°/ (摩爾 比)、更優選30~ 50% (摩爾比)。
膜穩定劑，例如，可以是固醇、甘油或者其脂肪酸酯等。固醇，可 以是與上述同樣的具體例，甘油的脂肪酸酯，例如，可以是甘油三酸酯、 三辛酸。
n張膜脂質體或者SUV型脂質體中，抗氧化劑是為了防止脂質膜氧 化而添加的任意成分，其配量通常是脂質膜構成成分的總配量的5~30% (摩爾比)，優選10~30% (摩爾比)、更優選20~30°/ (摩爾比)。
抗氧化劑，例如，可以是生育酚、丙烷基沒食子酸、抗壞血酸棕櫚 酸脂、丁基羥基曱苯等。
n張膜脂質體或者SUV型脂質體中，荷電物質是為了賦予正電荷或 者負電荷而添加的任意成分，其配量通常是脂質膜構成成分的總配量的 5~30%(摩爾比)，優選10~ 20% (摩爾比)、更優選10~ 15% (摩爾比)。
賦予正電荷的荷電物質，例如，硬脂酰胺、油醇氨等的飽和或者不 飽和脂肪族胺；二油酰基三曱基氨基丙烷等的飽和或者不飽和陽離子合 成脂質等，賦予負電荷的荷電物質，例如，可以是二(十六烷基)磷酸 酯、膽固醇琥珀酸、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。
n張膜脂質體或者SUV型脂質體中，膜蛋白質是為了維持脂質膜的 構造和賦予脂質膜功能性而添加的任意成分，其配量通常是脂質膜構成 成分的總配量的0. 1 ~ 2%(摩爾比)，優選0. 5~2%(摩爾比)、更優選1 ~ 2% (摩爾比)。
膜蛋白質，例如，可以是膜表面蛋白質、膜內蛋白質等。 使帶正電或者帶負電粒子分別與帶負電或者帶正電SUV型脂質體接 觸的條件沒有特別的限定，溫度通常為10~40°C、優選20~3(TC， PH
通常為6, 5 ~ 8. 0、優選為7. 0 ~ 7. 5，時間通常為1 ~ 20分鐘、優選為5 ~ IO分鐘。接觸時使用的溶媒沒有特別的限定，例如，可以使用HEPES緩 沖液、生理鹽水、蔗糖溶液等。分散于溶媒中的帶負電或者帶正電SUV 型脂質體的量通常相對于帶正電或者帶負電粒子過剩，例如，為理論上 封入帶正電或者帶負電粒子的最低限量所必需的帶負電或者帶正電SUV 型脂質體的量的2~4倍量。
帶負電SUV型脂質體如果和帶正電粒子接觸，帶正電粒子和帶負電 SUV型脂質體通過靜電相互作用而結合，由多個帶負電SUV型脂質體被 覆帶正電粒子。由此，形成含有帶正電粒子和與帶正電粒子靜電結合的 多個帶負電SUV型脂質體的帶負電復合物。此時，優選形成g電位為 -20~-50mV的帶負電復合物，更優選形成g電位為-20~-30mV的帶負電 復合物。由此，能夠用陽離子有效處理與帶正電粒子靜電結合的帶負電 SUV型脂質體。帶負電復合物的《電位能夠通過調節帶正電粒子以及帶 負電SUV型脂質體的g電位、粒徑等來調節。
帶正電SUV型脂質體如果和帶負電粒子接觸，帶負電粒子和帶正電 SUV型脂質體通過靜電相互作用而結合，由多個帶正電SUV型脂質體被 覆帶負電粒子。由此，形成含有帶負電粒子和與帶負電粒子靜電結合的 多個帶正電SUV型脂質體的帶正電復合物。此時，優選形成^電位為20~ 50mV的帶正電復合物，更優選形成《電位為20 ~ 30mV的帶正電復合物。 由此，能夠用陰離子有效處理與帶負電粒子靜電結合的帶正電SUV型脂 質體。帶正電復合物的^電位能夠通過調節帶負電粒子以及帶正電SUV 型脂質體的S電位、粒徑等來調節。
按照本發明的第一種方法，接著用陽離子處理形成的帶負電復合物。 按照本發明的第 一種方法，接著用陰離子處理形成的帶正電復合物。 陽離子沒有特別的限定，例如，可以是H+等的l價陽離子；Ca2+、 Mg2+ 等的2價陽離子；A廣等的3價陽離子等。產生H+的物質，例如，可以使 用鹽酸、醋酸等，產生Ca'+的物質，例如，可以使用氯化鈣等，產生Mg" 的物質，例如，可以使用氯化鎂等，產生A廣的物質，例如，可以使用 氯化鋁等。
陰離子沒有特別的限定，例如，可以是0H—、 SO,、 P0A、離解型短 鏈脂肪酸等。產生H-的物質，例如，可以使用氫氧化鈉等，產生S0,的 物質，例如，可以使用硫酸鈉等，產生P0,的物質，例如，可以使用磷 酸鈉等，產生離解型短鏈脂肪酸的物質，例如，可以使用辛酸(CH3(CH2) 6C00H)等。
用陽離子處理帶負電復合物的條件沒有特別的限定，溫度通常為 10~40°C、優選20 30。C, pH通常為6. 5 ~ 8. 0、優選為7.0~7. 5，時 間通常為1 20分鐘、優選為5~10分鐘。陽離子處理時使用的溶^ 某沒 有特別限定于水溶液，例如，可以使用HEPES緩沖液。溶媒中添加的陽 離子的量可以按照陽離子的性質等進行適當調節，通常為脂質的50倍量 (陽離子摩爾/脂質摩爾)以上。
用陰離子處理帶正電復合物的條件沒有特別的限定，溫度通常為 10- 40°C、優選20 ~ 30°C， pH通常為6. 5 ~ 8. 0、優選為7. 0~ 7. 5,時 間通常為l-20分鐘、優選為5 10分鐘。陰離子處理時使用的溶媒沒 有特別限定于水溶液，例如，可以使用HEPES緩沖液。溶媒中添加的陰 離子的量可以按照陰離子的性質等進行適當調節，通常為脂質的50倍量 (陰離子摩爾/脂質摩爾)以上。
如果用陽離子處理帶負電復合物，與帶正電粒子靜電結合的帶負電 SUV型脂質體的表面的負電荷消失，帶負電SUV型脂質體的表面的疏水 性增強，引起挨著的帶負電SUV型脂質體之間的膜融合，帶正電粒子被 兩張脂質膜被覆。此外，如果用陰離子處理帶正電復合物，與帶負電粒 子靜電結合的帶正電SUV型脂質體的表面的正電荷消失，帶正電SUV型 脂質體的表面的疏水性增強，引起挨著的帶正電SUV型脂質體之間的膜 融合，帶負電粒子被兩張脂質膜被覆。這樣，在帶正電或者帶負電粒子 的外側，重新形成了被覆帶正電或者帶負電粒子的兩張脂質膜，此時， 兩張脂質膜之間形成空間。
使用目的物質的聚集物為帶正電或者帶負電粒子的時候，封入目的 物質的聚集物，制作在被覆目的物質的聚集物的兩張脂質膜之間形成空 間的兩張膜脂質體；使用n張膜脂質體(n為大于1的整數)為帶正電 或者帶負電粒子的時候，制作在被覆n張膜脂質體的兩張脂質膜之間形 成空間的(n+2)張膜脂質體。
使用本發明的第 一種方法通過用兩張脂質膜被覆帶正電粒子得到的 脂質體，通常帶負電。但是，根據帶負電復合物的？電位的大小、陽離 子的種類等，也有帶正電的情況。使用本發明的第二種方法通過用兩張 脂質膜被覆帶負電粒子得到的脂質體，通常帶正電。但是，根據帶正電 復合物的g電位的大小、陰離子的種類等，也有帶負電的情況。
使用本發明的第一種方法或者第二種方法通過用兩張脂質膜被覆帶 正電或者帶負電粒子得到帶正電脂質體的時候，得到的帶正電脂質體能 夠當作本發明的第一種方法中的帶正電粒子；當得到帶負電脂質體或者 中性電脂質體的時候，用陽離子物質修飾該帶負電脂質體或者中性電脂 質體，制備帶正電脂質體，制備的該帶正電脂質體能夠能夠當作本發明 的第一種方法中的帶正電粒子。這樣通過反復操作本發明的第一和/或第 二種方法，能夠控制脂質膜的數量，制作多層膜脂質體。
使用本發明的第一種方法或者第二種方法通過用兩張脂質艇被覆帶 正電或者帶負電粒子得到帶負電脂質體的時候，得到的帶負電脂質體能
夠當作本發明的第二種方法中的帶負電粒子；當得到的是帶正電脂質體 或者中性電脂質體的時候，用陰離子物質修飾該帶正電脂質體或者中性 電脂質體制備帶負電脂質體，該帶負電脂質體能夠當作本發明的第二種 方法中的帶負電粒子。這樣通過反復操作本發明的第一和/或第二種方 法，能夠在已經形成的兩張脂質膜的外側形成新的兩張脂質膜，能夠控 制脂質膜的數量，制作多層膜脂質體。而且，在已經形成的兩張脂質膜 的外側形成新的脂質膜的時候，還保留著已經形成的兩張脂質膜以及該 兩張脂質膜之間形成的空間。
根據本發明的第一或者第二種方法，向通過用兩張脂質膜被覆帶正 電或者帶負電粒子得到的脂質體中，優選封入目的物質。目的物質為需 要遞送到細胞內或者核內的物質(例如核酸、肽、蛋白質、藥物、糖、 它們的復合物等)的時候，封入目的物質的脂質體能夠可作為目的物質 的細胞內或者核內遞送用載體。封入目的物質的脂質體，可通過使用目 的物質的聚集物作為帶正電或者帶負電粒子，或，通過使用封入目的物 質的n張膜脂質體作為帶正電或者帶負電粒子得到。此外，能夠通過在 帶正電或者帶負電粒子的外側新形成的兩張脂質膜之間保留目的物質 (例如通過保留含有目的物質的液體)得到。
遞送目的物質的細胞不局限于原來的生物種類，動物、植物、微生 物等任意一個都可以，優選動物，更優選哺乳動物。哺乳動物，例如， 可以是人類、猿猴、牛、羊、山羊、馬、豬、兔、狗、貓、白鼠、老鼠、 土撥鼠等。此外，遞送目的物質的細胞的種類沒有特別的限定，例如， 可以是體細胞、生殖細胞、干細胞或者它們的培養細胞等。
封入目的物質的脂質體，例如，可以在分散液狀態下使用。分散溶 媒，例如，可以使用生理鹽水、磷酸緩沖溶液、枸櫞酸緩沖溶液、醋酸 緩沖溶液等的緩沖溶液。向分散液中，例如，可以添加糖類、多元醇、 水溶性高分子、非離子表面活性劑、抗氧化劑、pH調節劑、水合促進劑 等的添加劑來使用。
封入目的物質的脂質體，可以通過in vivo以及in vitro的任意一 個來使用。在通過in vivo使用的時候，給藥途徑，例如，可以是靜樂^、 腹腔內、皮下、經鼻等的非口服給藥，給藥量以及給藥次數按照封入脂 質體的目的物質的種類或者數量等能夠進行適當調節。 實施例
實施例1
(1 ) DNA/多聚賴氨酸復合物的形成DNA以及多聚賴氨酸分別溶解于5mM HEPES緩沖劑(pH7. 4 )中。而 且，使用質體DNA (含有在CMV促進劑以及其下游連接有熒光素酶基因 全長約7kbp的質體DNA)。然后，混合DNA溶液(0. Img/mL)以及多聚 賴氨酸溶液(0. Img/mL),室溫下，用渦流攪拌，制備含有DNA/多聚賴 氨酸復合物的溶液。這樣制備得到的DNA/多聚賴氨酸復合物的粒徑約 70~100nm, g電位約30~40mV。而且，根據準彈性光散亂方法測定流 體力學的直徑，根據電泳的光散亂分光測光器(ELS-8000 )分析g電位 (以下相同)。
(2) SUV型脂質體的制備
將蛋黃磷脂酰膽堿/膽固醇琥珀酸(9: 2(摩爾比))溶解于0.5mL 氯仿中，放置溶液于玻璃試管中。通過吹入氮氣除去溶媒后，放置干燥 器中干燥1小時。將得到的脂質膜(0. 55微摩爾)用預先加熱到25。C的 lmL HEPES緩沖溶液水合，在超聲波槽內用超聲波處理剝離脂質膜。最 后用探針型超聲波裝置進行10分鐘的超聲波處理，制備SUV型脂質體。 這樣制備的SUV型脂質體的粒徑約為50~100nm， g電位約30mV。
SUV型脂質體的焚光標識通過導入羅丹明(紅色)或考NBD (4-nitrobenzo-2-oxa-l， 3-diazole )標識化二油酰磷脂酰乙胺(藍色) 來實現。此時，溶解水相標識物羅丹明于水合脂質膜的溶媒中UOmM)、 溶解脂質標識物NBD標識化二油酰磷脂酰乙胺于氯仿溶液中(相當于總 脂質的0. 1摩爾％)。
(3) 由DNA/多聚賴氨酸復合物的脂質膜被覆
將500jaL的SUV型脂質體添加到250jaL的DNA/多聚賴氨酸復合物 溶液中，令兩者接觸。據此，形成含有DNA/多聚賴氨酸復合物和與DNA/ 多聚賴氨酸復合物靜電結合的多個SUV型脂質體的復合物。此復合物的 粒徑約為500 ~ 3000nm, g電位約為-30mV。并且，在室溫(25。C)下接 觸5分鐘。
接觸后，添加0. 1N鹽酸55 mL,用H+處理所述復合物。由此，與MA/ 多聚賴氨酸復合物靜電結合的SUV型脂質體的表面的負電荷消失，SUV 型脂質體的表面的疏水性增強，緊鄰的SUV型脂質體之間發生膜融合。 H+處理后的粒徑約85 ~ 130nm， g電位約-20 ~-40mV。通過H+處理粒徑變 小，DNA/多聚賴氨酸復合物靜電結合的SUV型脂質體之間發生膜融合， 表明形成了封入有DNA/多聚賴氨酸復合物的脂質體。
H+處理后的懸濁液在不連續蔗糖密度梯度(0, 30, 60°/。)上分層， 在20。C、 160000g的條件下進行2小時的離心分離。從上部開始每lmL 回收一個分離物，測定熒光強度。通過不連續蔗糖密度梯度離心分離回 收得到的分離物里面，DNA含量高的分離物作為含有脂質體的分離物。
含有脂質體的分離物，能夠從蔗糖30 - 60%部分(境界)回收得到。 實施例2
與實施例l同樣，用脂質膜將DNA/多聚賴氨酸復合物被覆，制備封 入有DNA/多聚賴氨酸復合物的脂質體(以下稱作第一脂質體)。并且， 此時，使用NBD標識脂質(藍色)標識后的物質作為SUV型脂質體。
向第一脂質體的外液添加lmg/mL硬脂酰化辛精氨酸溶液12pL,通 過在室溫下放置30分鐘，將辛精氨酸(總脂質的5摩爾％)導入至第一 脂質體(以下稱為第二脂質體)。并且，第一脂質體的《電位為負(約 -30mV)，在第一脂質體表面上導入辛精氨酸得到的第二脂質體的^電位 為正(約30~ 50mV)。
與實施例l同樣，將SUV型脂質體(粒徑約50 100nm, g電位 約-30mV，脂質濃度Q. 55mM,添加量1. 5mL )添加到第二脂質體溶液 (0.37mM， 750juL)中，令兩者接觸。據此，形成含有第二脂質體和與 第二脂質體靜電結合的多個SUV型脂質體的復合物。并且，此時，使用 羅丹明熒光標識內水相后的物質作為SUV型脂質體。形成的復合物的粒 徑約為340 ~ 15 00nm，《電位約為-30mV。
接觸后，添加0. 1n鹽酸165mL，用H+處理所述復合物。由此，與 第二脂質體靜電結合的SUV型脂質體的表面的負電荷消失，SUV型脂質 體的表面的疏水性增強，緊鄰的SUV型脂質體之間發生膜融合。H+處理 后的粒徑約170~ 240nm， g電位約-60mV。通過H+處理粒徑變小，第二 脂質體靜電結合的SUV型脂質體之間發生膜融合，表明第二脂質體被脂 質膜被覆。
H+處理后的懸濁液在不連續蔗糖密度梯度(0， 5, 30%)上分層，在 2(TC、 160000g的條件下進行2小時的離心分離。從上部開始每lmL回 收一個分離物。通過瓊脂糖凝膠電泳測定各分離部分的DM的含量(參 照圖l(a))，同時測定羅丹明以及NBD的熒光強度，計算出羅丹明含量 以及NBD含量(參照圖1 (b))。
通過不連續蔗糖密度梯度離心分離回收得到的分離物里面，DM含 量高的分離物(分離物11)作為含有脂質體的分離物。含有脂質體的分 離物，能夠從蔗糖5~30%部分(境界)回收得到。
另外，在含有脂質體的分離物中，NBD、羅丹明以及DNA共存，SUV 型脂質體保留著含有羅丹明的內水相進行融合，在融合后的脂質體中形 成了保留著含有羅丹明的內水相的空間。
并且，含有脂質體的分離物中，NBD和羅丹明之間的熒光能量沒有 觀察到移動。第二脂質體的脂質膜和含有NBD標識化脂質(藍色)，第二 脂質體的脂質膜和含有羅丹明的內水相沒有接觸。即，通過與第二脂質
體靜電結合的suv型脂質體之間的膜融合，第二脂質體被兩張脂質膜被
覆，含有羅丹明的內水相保留在第二脂質體外側新形成的兩張脂質膜之
間的空間里。假如，如果通過與第二脂質體靜電結合的SUV型脂質體之
間的膜融合，第二脂質體被一張脂質膜被覆，含有羅丹明的內水相保留 在第二脂質體的脂質膜和第二脂質體外側形成的脂質膜之間，這樣，就
能夠觀察NBD和羅丹明之間的熒光能量移動。另外，假如，通過與第二 脂質體靜電結合的SUV型脂質體之間的膜融合，如果第二脂質體的脂質 膜和SUV型脂質體的脂質膜發生融合，(脂質膜的數量無變化)、含有羅 丹明的內水相保留在第二脂質體內部，這樣，就能夠觀察NBD和羅丹明 之間的熒光能量移動。 實施例3
DNA/多聚賴氨酸復合物被脂質膜被覆，除了制備封入DNA/多聚賴氨 酸復合物的脂質體(第一脂質體)時、使用內水相被羅丹明熒光標識后 的物質作為SUV型脂質體這一點，以及，除了形成含有第二脂質體和與 第二脂質體靜電結合的多個SUV型脂質體的復合物時，使用用NBD標識 化脂質熒光標識的物質這一點，與實施例2進行同樣的實驗。
并且，根據實施例2的結果，第一脂質體以及第二脂質體中，DNA/ 多聚賴氨酸復合物被兩張脂質膜被覆，這兩張脂質膜之間保留著含有羅 丹明的內水相。
r處理后的懸濁液在不連續蔗糖密度梯度(0， 5, 30%)上分層，在 20。C、 160000g的條件下進行2小時的離心分離。從上部開始每lmL回 收一個分離物。通過瓊脂糖凝膠電泳測定各分離部分的DNA的含量(參 照圖2(a))，同時測定羅丹明以及NBD的熒光強度，計算出羅丹明含量 以及NBD含量(參照圖2 (b))。
通過不連續蔗糖密度梯度離心分離回收得到的分離物里面，DNA含 量高的分離物(分離物11)作為含有脂質體的分離物。含有脂質體的分 離物，能夠從蔗糖5~30%部分(境界)回收得到。
另外，在含有脂質體的分離物中，NBD、羅丹明以及DNA共存，NBD 和羅丹明之間未觀察到熒光能移動，與第二脂質體靜電結合的SUV型脂 質體發生膜融合時，第二脂質體中存在著兩張脂質膜之間形成的空間(存 在著含有羅丹明的內水相的空間)。
實施例4
按照實施例l(l),形成DNA/多聚賴氨酸復合物。并且，與實施例 1同樣使用質體DNA(含有在CMV促進劑以及其下游連接有熒光素酶基因 全長約7037kbp的質體DNA(含有在CMV促進劑的pcDNA3. 1質體中導入 熒光素酶基因的物質))作為DM。
按照實施例1(2)，制備含有由蛋黃磷脂酰膽堿/膽固醇琥珀酸(9: 2 (摩爾比))構成的脂質膜的SUV型脂質體(以下稱作第一 SUV型脂質 體)、含有由二油酰磷脂酰乙胺/膽固醇琥珀酸(9: 2(摩爾比))構成的 脂質膜的SUV型脂質體(以下稱作第二SUV型脂質體)。
按照實施例l (3),使用第一 SUV型脂質體將DNA/多聚賴氨酸復合 物用脂質膜被覆，制備脂質體A(兩張膜)。此外，使用第二SUV型脂質 體將DNA/多聚賴氨酸復合物用脂質膜被覆，制備脂質體B(兩張膜)。另 外，使用第二S[JV型脂質體將脂質體A用脂質膜被覆，制備脂質體C(四 張膜)。另外，使用第一SUV型脂質體將脂質體B用脂質膜被覆，制備脂 質體D (四張膜)。
脂質體A ~ D的外液中添加lmg/mL的^J旨酰化辛精氨酸溶液12 p L, 通過在室溫下放置30分鐘，將辛精氨酸(總脂質的5摩爾％)導入至各 脂質體表面。并且，通過向各脂質體表面導入辛精氨酸，統一了全體脂
質體向細胞內移動路徑(微胞飲作用)。
將混懸有各脂質體(相當于DNAO. 4 ja g )的0. 25mL的不含血清的DMEM 培養基添加到在24孔板上培養的NIH3T3細胞(4 x 104細胞/孔)，在37 。C孵化3小時。3小時后，加入10%小牛血清培養基lmL，再孵化45小 時。然后，溶解細胞，將熒光素酶活性測定試劑加入到細胞溶解液中， 用亮度計(LuminescencerPSN、 ATTO)測定熒光素酶的活性。使用BCA 蛋白質定量儀(PIERCE、羅克福德(IL))測定細胞溶解液中的蛋白質舍 量。
其結果用圖3表示。如圖3所示，隨著構成脂質體的脂質膜的組成、 數量等的變化，脂質體的功能(導入基因的能力)發生變化。
權利要求
1.一種用兩張脂質膜被覆帶正電粒子的方法，其特征在于，使所述帶正電粒子與多個帶負電SUV型脂質體接觸，形成含有所述帶正電粒子和已與所述帶正電粒子靜電結合的所述帶負電SUV型脂質體的帶負電復合物，用陽離子處理所述帶負電復合物。
2. 權利要求l所述的方法，其特征在于，所述帶正電粒子為目的物 質的聚集物。
3. 權利要求l所述的方法，其特征在于，所述帶正電粒子為帶正電 n張膜脂質體(n是大于1的整數)。
4. 權利要求l所述的方法，其特征在于，所述帶正電粒子的《電位 為20~ 30mV，所述帶負電SUV型脂質體的g電位為-20 ~-30mV。
5. 權利要求l所述的方法，其特征在于，所述帶正電粒子的粒徑在 50nm以上。
6. —種用兩張脂質膜被覆帶負電粒子的方法，特征在于， 使所述帶負電粒子與多個帶正電SUV型脂質體接觸，形成含有所述帶負電粒子和已與所述帶負電粒子靜電結合的所述帶正電SUV型脂質體 的帶正電復合物，用陰離子處理所述帶正電復合物。
7. 權利要求6所述的方法，其特征在于，所述帶負電粒子為目的物 質的聚集物。
8. 權利要求6所述的方法，其特征在于，所述帶負電粒子為帶負電 n張膜脂質體(n是大于1的整數)。
9. 權利要求6所述的方法，其特征在于，所述帶負電粒子的《電位 為-20~-30mV，所述帶正電SUV型脂質體的《電位為20 ~ 30mV。
10. 權利要求6所述的方法，其特征在于，所述帶負電粒子的粒徑 在5 Onm以上。
11. 根據權利要求1至5任一項所述的方法用兩張脂質膜被覆帶正 電粒子得到的脂質體。
12. 根據權利要求6至IO任一項所述的方法用兩張脂質膜被覆帶負 電粒子得到的脂質體。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種能夠用兩張其間形成空間的脂質膜來被覆對象粒子的方法。為達到此目的，采用兩張脂質膜被覆帶正電粒子的方法，其中使所述帶正電粒子與多個帶負電SUV型脂質體接觸，形成含有由所述帶正電粒子和與所述帶正電粒子靜電結合的所述帶負電SUV型脂質體的帶負電復合物，用陽離子處理所述帶負電復合物。
文檔編號C12N15/09GK101107069SQ200680002579
公開日2008年1月16日 申請日期2006年1月18日 優先權日2005年1月18日
發明者原島秀吉, 小暮健太朗, 箕浦愛麗莎 申請人:國立大學法人北海道大學;塩野義制藥株式會社