專利名稱：：具有不可磷酸化的乳糖透性酶的乳酸菌突變株的制作方法具有不可磷酸化的乳糖透性酶的乳酸菌突變株本發明涉及乳發酵領域。更具體而言，本發明涉及嗜熱鏈球菌(&r印toco^^yAe，opMw)的新型突變體，其表達突變的乳糖透性酶，從而改善其乳糖的轉運活性。這些菌株以及含有它們的發酵物可用于獲得具有良好保藏性能的發酵乳制品。酸奶(yogurts)通常通過混合的多種乳酸菌乳而發酵獲得，這些乳酸菌選自嗜熱鏈球菌(&^tococc^Ae，o;/n7w)和保加利亞乳酸桿菌(Zflcto^c/〃wZw/g"Wc^)。在發酵期間，發酵溫度為約4045。C，菌株主要利用乳糖作為能量底物，并產生能導致乳液凝結的乳酸；當pH值達到約4.8~4.5時，通過冷卻產物終止發酵步驟(也稱為酸化)。產物在隨后的生產和包裝過程需一直保持冷卻狀態，直至其食用。然而，冷卻并不能完全終止乳酸的發酵；甚至當產品保藏在4。C下時，其酸度都會隨著時間逐漸升高。這種現象被稱作后酸化，其導致在貯存期間產品的感官品質下降。后酸化基本上是由于細菌對酸化控制步驟的末期存留在產品中的乳糖的使用。為了防止這種現象，已提議采用不發酵乳糖或基本上不發酵乳糖的乳酸菌菌株進行發酵。嗜熱鏈球菌(5V/tococcwAwwop/n'/w)禾B保力卩禾U亞乳酸桿菌(i^cto^cz7/^^/gaWc^)中主要用于乳糖發酵的酶是由乳糖操縱子編碼，該操縱子包含編碼乳糖透性酶的基因和編碼P-半乳糖苷酶的/^Z基因。這些蛋白分別負責乳糖的轉運和水解。為了獲得乳酸菌的非后酸化菌株，已建議生產人造突變株或選擇天然突變株，這些菌株中的至少一種所述酶的活性會受到影響。專利EP1078074(GervaisDanone公司)涉及缺少(3-半乳糖苷酶活性的Z.^/gw/c^突變株，其包括至少一種乳糖操縱子基因的無義突變。該專利更具體地描述了一種突變株，通過對其序列的分析顯示了兩個點突變一個是將終止密碼子引入p-半乳糖苷酶基因，其導致該突變株不能利用乳糖；另一個突變導致透性酶基因的氨基酸發生改變(122位點上的Lys變成Asn);EP1078074并沒有報導該突變對突變株表型有何影響。WO01/88150描述了乳酸桿菌(丄a"okc///^)菌株的突變株。這些突變株雖不能利用乳糖，但仍具有表達(3-半乳糖苷酶的能力。WO01/88150沒有具體描述所討論的突變的性質和位置，只是簡單指出突變可能位于乳糖操縱子的諸多結構基因之一中，例如透性酶中，或位于乳糖操縱子的調節性區域中，或位于參與控制乳糖操縱子表達的基因中。上述文獻中描述的突變株具有的共性就是完全不能利用乳糖。當僅添加糖(通常為葡萄糖)而沒有乳糖時，這些菌株僅在牛奶中生長。這些突變株的酸化和后酸化特性受到所添加的葡萄糖的控制。為了提供這些突變株的替代菌株，本發明人研究了是否能獲得具有如下特性的乳酸菌株，首先其在生長期具有與野生型菌株相似的利用乳糖的能力，其次，在靜止期其利用乳糖的能力又受到限制，從而減少或消除后酸化現象。出于此目的，本發明人將注意力放在了對將乳糖轉運至乳酸菌尤其是嗜熱鏈球菌(S.Awmop/H7w)細胞內的調節進行操作的可能性上。將細胞外的乳糖轉運至嗜熱鏈球菌細胞內是通過乳糖透性酶LacS進行的。該乳糖轉運是通過與質子進行同向轉運，或與細胞內乳糖降解產生的半乳糖進行反向轉運而進行。乳糖轉運依賴于兩個方面第一是乳糖透性酶的磷酸化狀況，第二是編碼該乳糖透性酶的/^^基因的表達。以下將詳細描述這兩個方面。乳糖透性酶的磷酸化LacS蛋白由轉位結構域和調節結構域(IIA)構成。這兩個結構域含有多個組氨酸殘基，其磷酸化與乳糖轉運的調控有關。尤其是，IIA結構域可在組氨酸552處被磷酸化。該磷酸化是通過HPr蛋白(含組氨酸的磷載體蛋白)進行，HPr蛋白的磷酸化已提前完成。HPr可被磷酸化-由依賴ATP的蛋白激酶在絲氨酸處進行；逆反應Pr(Ser-P)的水解是通過磷酸酶活性(HPr(Ser-P)磷酸酶)催化的；-在組氨酸HPr(HisP)處用磷酸烯醇丙酮酸的磷酸基團，通過酶I(EI)的方法進行。。只有在組氨酸處進行磷酸化的HPr形式才使乳糖透性酶在組氨酸552處被磷酸化。已有評述，在由蛋白脂質體重建的LacS蛋白和通過HPr(HisP)進行磷酸化的膜環境的體外模型中，該磷酸化對通過與質子進行同向轉運的乳糖轉運并不產生作用(GunnewijkandPoolman,2000a)，但增加了乳糖/半乳糖的交換約2倍。/a"基因的轉錄乳糖操縱子的轉錄是通過在含乳糖的培養基中生長而被誘導。基因和Z基因的啟動子含有"e(分解代謝物響應元件)位點，其允許通過CcpA的調控CcpA抑制了/acS禾n/acZ的表達。另外，CcpA對編碼乳酸脫氫酶的基因的轉錄具有活化作用(vandenBogaard""/.，2000)。HPr(Ser-P)形式能與CcpA相互作用。這些蛋白可共同形成具有位點的復合物，由此抑制/acS基因的轉錄(Jones^a/.,1997)。己有評述(GunnewijkandPoolman,2000b)，HPr(Ser-P)形式在嗜熱鏈球菌指數生長期的開始階段占大多數，但隨該生長期而減少；而HPr(HisP)形式是在指數生長期期間開始出現而在進入靜止期時數量最大。從HPr(Ser-P)到HPr(HisP)的轉變與培養基中乳糖的減少和半乳糖的增加并行，并伴有乳糖透性酶表達的大量增加。因此，HPr蛋白的磷酸化狀況似乎通過補償培養基中乳糖的減少而在乳糖轉運的調控中發揮著作用，第一通過LacS蛋白表達的水平發揮作用，第二通過對活性的調控發揮作用。在上述觀察的基礎之上，Gunnewijk和Poolman提出以下模型當培養基中富含乳糖時，/acS基因的表達受到HPr(Ser-P)/CcpA復合物的抑制。在發酵期間，隨著培養基中半乳糖的累積和可用乳糖的減少，導致細菌滲透乳糖的能力降低(因此培養基中的酸化減少)。這種降低導致糖分解活性減小和ATP濃度的降低以及無機磷酸鹽濃度的增加，從而導致對HPr(Ser-P)磷酸酶活性有益的HPr(Ser-P)激酶活性的降低，因此具有使HPr(Ser-P)濃度減少的效果。HPr(Ser-P)濃度的減少使得lacS基因的分解代謝抑制得到增強，從而增加了乳糖透性酶的產生。并行地，HPr(HisP)的增加會增加乳糖透性酶在組氨酸552處的磷酸化，因此增加了通過半乳糖的反向轉運乳糖的能力。該模型提示了乳糖透性酶通過HPr(HisP)在組氨酸552處的磷酸化在培養基中底物的量減少時會增加細胞內乳糖的流出，從而可以假設當該磷酸化受到抑制時，指數生長期末期的酸化會減緩。然而，這是部分地基于體外實驗，相對于其表達的增加，乳糖透性酶磷酸化的增加對乳糖轉入體內的真實作用并不能事先作出判斷。此外，關于HPr(Ser-P)和HPr(HisP)的濃度對LacS表達和磷酸化增加的作用是在指數生長期或靜止期開始階段的細菌中觀察到的，而對于這兩種形式HPr的濃度在靜止期之后階段的情況并沒有給出任何說明。關于缺少LacS在組氨酸552處磷酸化的效果的唯一信息可見Poolmanetal.發表的文章(Poolman"a/.,1992)，其中描述了多種含有編碼嗜熱鏈球菌LacS酶的序列的質粒，其多個組氨酸殘基位點發生了突變。這些質粒用于轉化內源性lacS基因已去除的大腸桿菌。通過與含有編碼嗜熱鏈球菌野生型LacS酶的質粒的大腸桿菌的觀察結果的比較來評估該多種突變轉化的菌株的乳糖轉運。在天然組氨酸被精氨酸替代的H552R突變體中沒有觀察到顯著區別。Poolman等將這個結果歸因于或者是大腸桿菌HPr(HisP)對嗜熱鏈球菌的野生型LacS酶的磷酸化的失效，或者是此磷酸化在乳糖轉運過程中不發生作用。本發明人對阻止LacS組氨酸殘基處磷酸化的突變是否對突變菌株的酸化和后酸化性能有影響進行了研究。在該研究中，發明人選擇了一種嗜熱鏈球菌的工業菌株。該菌株于2002年12月19日保藏在CNCM，保藏號為1-2967，該菌株可獲得具有優秀品質的發酵乳制品；但，該菌株導致嚴重的后酸化。本發明人構建并表征了該菌株的一種突變體。該突變菌株表達突變的乳糖透性酶，其組氨酸552不能磷酸化，而不是表達野生型乳糖透性酶。他們注意到該突變菌株與其親本菌株的酸化曲線不同。與親本菌株相比，突變菌株的酸化開始得更慢，其最大酸化程度也較低。然而，發酵6個小時后這兩個菌株都達到了相等的pH值。這兩個菌株的后酸化是完全不同的。在相同的貯存條件U0。C下，貯存28天)下，親本菌株的ApH(D0時的pH值與D28時的pH值之差)的級別(order)是0.6，而突變株的ApH的級別為0.4。后酸化中的差別并不是由于細菌存活的差別而導致。事實上這兩個菌株的存活相等。而且，用突變株發酵的產品與親本菌株發酵的產品質地相同。因此，本發明首先涉及一種獲得其后酸化低于其親本菌株的乳酸菌突變株，其特征在于親本菌株的基因組DNA，尤其是染色體DNA中導入了編碼乳糖透性酶IIA結構域的可由HPr(HisP)磷酸化的組氨酸的突變密碼子，所述突變密碼子導致所述組氨酸被不能磷酸化的氨基酸所替代。根據本發明的優選實施方案，所述菌株是嗜熱鏈球菌菌株，所述突變導致乳糖透性酶的552位點處的組氨酸被不能磷酸化的氨基酸所替代。所述不能磷酸化的氨基酸可以是除絲氨酸、酪氨酸、組氨酸和蘇氨酸之外的任意氨基酸。丙氨酸是優選的氨基酸。有利地，編碼乳糖透性酶552位點的組氨酸的密碼子被編碼丙氨酸的密碼子所替代。該替代產生&rtJI限制性位點從而便于所獲突變株的篩選。本發明的方法可利用本領域熟知的定點誘變尤其是PCR誘變的常規技術進行。然后將由此獲得的DNA突變體插入到載體內，用于將基因整合到細菌染色體中。所述整合優選通過載體承載的插入體與細菌染色體的同源區域進行重組而進行。通常，突變的DNA被插入到帶有選擇標記(例如抗生素抗性基因)的整合載體中，該載體再被導入到需要進行突變的細菌內。隨后，在選擇培養基(例如，如果選擇標記是抗生素抗性基因，則培養基中需含有相應的抗生素)中培養所述細菌，能夠生長在此條件下的細菌復蘇，這些細菌是插入體和細菌染色體同源區域經過同源重組而整合載體的細菌。整合到染色體內的結構體是由兩側首先為插入體的突變序列和其次為宿主細菌的同源序列的載體序列構成。將如此選擇的細菌培養在非選擇性培養基中，以切除源自載體的序列，該切除是通過這些序列的兩側區域之間的同源重組進行的。其中發生這種重組的細菌有半數含有源自宿主細菌的"野生型"序列，另一半含有源自插入體的突變序列。然后通過任何適宜的方法選擇帶有突變序列的細菌。例如，如果突變產生限制性位點，可根據突變區的PCR擴增產物中該限制性位點的存在進行選擇。可獲得多種乳酸菌的整合載體。通常，對于一種給定菌種，整合載體是可導入該菌種的菌株內，但不能在菌株內進行復制的載體。可用作嗜熱鏈球菌內的整合載體的例子可以由Pgem5、Pucl9(Mollet^a/.,1993)和Pnd324(Duan1999)組成。有利地，出于增加轉化效率的目的，在所選細菌體內有條件地進行復制的載體可用作整合載體。此時，導入載體的所述細菌首先在允許其復制的條件下進行培養，從而使載體在所轉化的細菌內確立。然后，在不能使載體進行復制的條件下培養該細菌，并與常規整合載體的情況相同，選擇載體已經整合入染色體的細菌。通過可在大量乳酸菌體內用作整合載體的條件性復制載體的例子，由Biswas等和Maguin等(Biswas"a/.，1993;Maguinef1996)和PCT申請(W093/18164)中描述的熱敏載體或載體pwv01(Law"a/.，1995)禾卩Pucl22(F認1998)組成。本發明的另一個主題是由本發明的方法所獲得的乳酸菌菌株。該菌株的特征在于其染色體組DNA包含編碼乳糖透性酶IIA結構域的可由HPr(HisP)磷酸化的組氨酸的突變密碼子的突變，所述突變導致所述組氨酸被不能磷酸化的氨基酸所替代。根據本發明的優選實施方案，所述菌株是嗜熱鏈球菌菌株，其中乳糖透性酶基因包含導致該蛋白552位點處的組氨酸被不能磷酸化的氨基酸所替代的突變。根據布達佩斯條約，本發明的乳酸菌菌株于2004年5月10日保藏在CNCM(法國微生物保藏中心，NationaledeCulturedeMicroorganismes:25meduDocteurRoux，Paris),保藏號為1-3213。該菌株為嗜熱鏈球菌的突變株，其源自CNCM菌株I-2967(2002年12月19日保藏在CNCM)，通過導入由定位誘變使組氨酸552密碼被丙氨酸密碼替代的突變而獲得該突變株。本發明的乳酸菌菌株在其生長期具有親本菌株相似的乳糖透性酶活性。因此，突變株和與其來源的親本株的乳糖同化和酸化能力相似。另一方面，與親本株相比，突變株在靜止期的乳糖透性酶活性降低，從而導致后酸化減小。有利地，本發明的乳酸菌菌株源自具有(3-半乳糖活性的乳酸菌，且這些菌株保留了該活性。本發明的菌株可正常生長在僅添加糖而沒有添加乳糖的奶中。優選地，本發明的菌株是適用于食品業的突變株(食品級突變株)。該突變株有利地源自具有優質乳制品發酵性能的菌株。本發明還涉及包括至少一種如上所述的菌株的乳酸酵素。根據本發明的一個具體實施方案，本發明的乳酸酵素包括至少一種表達乳糖透性酶(其中組氨酸552被不能磷酸化的殘基替代)的嗜熱鏈球菌的突變株和至少一種其它的乳酸菌菌株(例如保加利亞乳酸桿菌)，其任選具有減小了的后酸化性(例如，根據本發明，后酸化性的減小是由乳糖透性酶的突變導致或由l3-半乳糖失活的突變導致)。本發明還涉及制備發酵乳制品的方法，其包括利用如上所述的乳酸酵素進行奶發酵的步驟，該方法還可制備任意一種乳制品，如酸奶、發酵奶、發酵飲料、酸奶酒(kefir)、奶酪或發酵嬰兒用奶。以下的實施例通過更詳細地說明了本發明，但并不是對本發明進行任何限制。圖1:1-3213突變株的/a"基因序列與1-2967親本株的/ac5"基因序列的比較。圖2:1-3213突變株與1-2967親本株的后酸化曲線的比較。圖3:1-3213突變株與1-2967親本株后酸化比率的比較。圖4:產品貯存期間道爾尼克酸度的監測。1-3213突變株與1-2967親本株的比較。圖5:產品的粘度n的測量原理。實施例實施例1:突變株的生產原始菌株為2002年12月19日保藏在CNCM的1-2967嗜熱鏈球菌株。在/acS基因的序列中，通過雙重組(doublerecombination)使組氨酸552(該組氨酸是可以磷酸化的)的密碼子被丙氨酸密碼子替代。此外，該突變(密碼子552的第二個核苷酸被胞嘧啶替代，而不是腺嘧啶)在基因中產生BWU1限制性位點。這樣可能選擇到所需突變整合到基因的克隆體。使用所得克隆中的一個(2004年5月10日保藏在CNCM的1-3213)驗證突變的穩定性，通過對連續6代的傳代培養，再通過對Z^7S基因進行測序來驗證突變體的穩定性。圖1示出1-3213突變株的/ad基因序列(SEQIDNO:2)與1-2967親本株的/acS基因序列(SEQIDNO:l)的比較。突變清晰存在組氨酸552的密碼子目前編碼丙氨酸。Z^"基因中沒有其他不需要的突變。由于1-3213突變株不包含用于整合基因突變的質粒的任何殘留序列，因而1-3213突變株適于農業食品的用途。實施例2:對1-3213突變株的生理學測試為了驗證1-3213突變株的后酸化性能低于1-2967親本株，在純菌株中獲得產品，并進行監測直至D+28:酸化、后酸化、存活、品質。2.A方案-由兩代傳代培養再生菌株。-在添加了酵母提取物的滅菌奶上制備酵素，溫育條件為44°C，直到酸度達到85。D(相當于108109CFU/ml)。-將1%(v/v)的酵素接種到混合物(120g脫脂奶粉+930ml水+lgN3明膠蛋白胨(Organotechnie))中，95。C下巴氏消毒IO分鐘。-于44。C的培養箱內，罐中溫育，直至pH達到4.65。-將罐置于冰水中30分鐘從而使發酵停止。-在10°C的冷藏條件下貯存產品28天。2.B-監測-突變株與1-2967株的酸化比較2忍丄麼眾慮遂利用CINAC系統(酸化動力學(AcidificationKinetics),AllianceInstruments),隨時間連續測定。由此獲得-各菌株的酸化曲線，-一階時間導數給出酸度比率。pi/游淑定利用MP220pH計(MettlerToledo)測量產品貯存期間的pH值變化。2.幻.遣眾yg克麼度0)謹.函7/,游撒定測量道爾尼克酸度(D。)可對H30+離子的摩爾濃度進行滴定。道爾尼克數值相當于中和10.32g奶的0.1N氫氧化鈉溶液的毫升數的十分之一。通過顯色指示劑，酚酞指示達到中性。在其變化顏色的區域(pH為8.2)周圍，酚酞的顏色由無色變為粉色。一度道爾尼克表示每升奶中有100mg的乳酸。奶培養基是由120g脫脂奶粉(Milex240,AriaFoodIngredients)+930ml去離子水+lgN3肽(VitalArmor950,ArmorProteins)構成。混合該混合物直至完全均勻。然后在環境溫度下，使培養基再水化30分鐘，然后在95。C下進行巴氏消毒10分鐘。丄g.5.蘑嫌存薪存活測試是在含蔗糖的M17瓊脂培養基中進行的。通過螺旋菌落接種儀(自AES的WASP)進行表面分離。在37。C、112(302下進行溫育。溫育72小時后讀數。純菌株酸化曲線都繪制兩次。2』.6.>^弊與說敏圖2和圖3的結果示出1-3213突變株比親本株的酸化曲線更慢，尿素作用(ureaeffect)更顯著，最大酸化比率更低。但，兩種菌株在6個小時內都達到4.50的pH值。2.C-監測-1-3213突變株和1-2967親本株的后酸化比較圖4示出了比較1-3213突變株和1-2967親本株進行發酵獲得的產品，在貯存期間道爾尼克酸度的監測結果。發酵停止后立刻測量的pH值和在10°C下貯存28天后測量的pH值的結果示于表l中。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表l所有結果確定了突變株的后酸化性低于其親本菌株。2.D-監測小3213突變株和1-2967親本株存活的比較表2示出10°C下忙存28天后的lml產品的細菌菌落數<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2上述結果顯示在ie存28天后突變株的菌株存活與親本株一樣好。2.E-監測-用1-3213突變株和1-2967親本株發酵獲得的產品的品質比較對一次性生產的產品的品質進行檢測。所有檢測都進行三次(每次檢在D+7下對產品進行品質檢測的三個方法-用質構儀TAXT2(10。C)進行穿透力(Penetrometry)檢測-手動攪拌后，用流變儀Rheomat260(4。C)進行流動檢測-用離心機MCR300(20。C)離心后對乳清進行粘度檢測以下將對上述各檢測品質的技術進行詳細描述。歷-產^離微度纖浙該方法的優點在于通過對所選產品(setproducts)的乳清進行分析以確定菌株發酵乳的流變特性。該分析方法首先需從產品中收集乳清。將約50g的產品在環境溫度下在631g下離心IO分鐘，從而收集菌株發酵乳的膠體內存在的乳清。然后取出乳清，并進行同樣的離心以去除大部分產品殘余物。剩余顆粒沉積形成易碎的小塊。然后在20。C，于固定的切變梯度(sheargradient)100s"下測量乳清的粘度達一分鐘。還可在相同條件下，對由相同菌株在相同條件下發酵的三罐發酵乳進行上述三次測量。用于該分析的儀器為裝有具兩個空腔的同軸幾何形DG26.7/TEZ150p-c型的AntonPaarPhysicaMCR300流變儀，以及珀爾帖效應(Peltier-effect)溫控系統。該旋轉系統可在一個恒定的切變速度下評價乳清的粘度，每秒獲得一個點。通常，最初測量的兩個數值是不一致的，由于旋轉系統的初始化而失真。因此，乳清的粘度[Vs]是由這兩個數值以外的儀器獲得的其余數值的平均值而確定的。用于本測量的儀器是熱流變TAXT2穿透力測量儀(ThermoRheoTAXT2penetrometer(AntonPaarPhysica,奧地禾U))。在恒定速度下，將直徑約為1cm的圓柱勻速插入膠體中(溫度為10°C)，插入深度為15mm。當柱體沉入產品中時，膠體產生抵抗力，并在破裂(break)之前發生變形，測量由此產生的力。所涉及參數如下所示Fgd-膠體強度(g)，相當于膠體破裂時柱體施加的力,其值為曲線的第一個峰值。M^在此膠體強度時的距離(mm)，相當于在膠體破裂時柱體穿入的深度。m=15mm時的力(g)，相當于柱體在其路程末端時測得的力。蘑動綠-魔動教度本方法包括手動攪拌以及在4°C下溫育30分鐘后測定產品的粘度。在4。C下，對相同條件下用相同菌株發酵的三罐發酵乳進行三次測量。用于該分析的儀器為裝有具同軸系統的DIN145型的MettlerRM260冷凍粘度儀。該旋轉系統用于觀察產品變性，其為線性切變梯度(即給定梯度下的應力(stress))的函數。所獲得結果的形式為連續的流動曲線，上升和下降斜率為020s"。該產品經受020s"的漸增切變梯度達1分鐘，其相當于上升斜率。然后經受經受200s—1的漸減切變梯度達1分鐘，其相當于下降斜率。然后根據卡森模式(Cassonmodel)將各下降曲線模式化t:應力(Pa)To:產品的流動閾值(flowthreshold)(Pa)[閾值4]r|:產品粘度(Pa.s)[V4]D:切變梯度(s—"卡森模式化之后，對曲線的下降部分進行線性回歸處理，以選出重要參數產品粘度ri，其相當于回歸線的斜率。圖5示出了根據該模式計算粘度的方法。翁f用各測量技術獲得的結果示于表3中。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表3對品質測量的結果進行差異分析(PO.05)(通過student檢驗比較每種參數的數值)-參數膠體強度、膠體強度的距離和15mm時的力都顯示出這兩種菌株沒有顯著差異。-流動測量得到的粘度參數也顯示著兩種菌株沒有顯著差異。-可重復的乳清粘度顯示兩種菌株具有顯著差異，突變株的粘度高于1-2967株，證明產品品質沒有任何損失。2衛5-說欲與鄉對突變株和親本株發酵的產品品質進行檢測，可以說明突變沒有導致產品品質的任何損失。2.F-結論通過雙重組獲得其中乳糖透性酶不能磷酸化的1-2967的突變株。該突變株(1-3213)具有-酸化曲線不同于其親本菌株(酸化比率變緩)，-在D28時后酸化減小，-產品品質與親本菌株發酵相似，以及-在D28存活性良好。參考文獻Biswas,L,Gruss，A.,Ehrlich,S.D.andMaguin，E.(1993)High-efficiencygeneinactivationandreplacementSystemforgram-positivebacteria.JBacteriol,175,3628-3635.D腿,K.,Liu,C.Q.,Liu，Y.J.,Ren,J.andDunn，N.W.(1999)NucleotidesequenceandthermostabilityofpND324,a3.6-kbplasmidfromLactococcuslactis.ApplMicrobiolBiotechnol，53,36-42.Frere,J.,Benachour,A.，Giard,J.C.,Laplace,J.M.，Flahaut,S.andAuffray,Y.(1998)Anewtheta-typethermosensitiverepliconfromLactococcuslactisasanintegrationvectorforEnterococcusfaecalis.FEMSMicrobiolLett,161,107-114.Gun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