過氧化物酶體增殖物激活物受體δ(PPARδ)以及植入前胚胎的發育的制作方法

專利名稱：：過氧化物酶體增殖物激活物受體δ(PPARδ)以及植入前胚胎的發育的制作方法
技術領域：
：本發明主要涉及用于體外培養哺乳動物胚胎和增強培養的胚胎在適合的哺乳動物宿主的子宮中植入后懷孕的成功率的組合物和方法。相關技術的描述過氧化物酶體增殖物激活物受體(PPAR)是一組配體激活的轉錄因子。它具有三禾中同禾中型PPARoc、PPARy禾口PPAR5(也稱為PPARp)。這三種PPARs屬于核受體超家族(Mangelsdorf等，1995)，該家族包括了甾體激素受體、甲狀腺激素受體、類視色素(retinoid)受體和數量不斷增加的孤兒受體。在與PPAR反應基因的啟動子中的PPAR反應元件結合之前，結合了PPAR的配體首先與RXR(它是類視色素受體亞家族的成員)形成異源二聚體。(Willson等，2000;Berger等，2002)。由于它們的組織特異性分布及其天然的配體，暗示了PPARoc和PPARy在能量動態平衡和炎癥反應中的功能(Hihi等，2002;Wahli2002)。PPARa主要存在于肝臟、褐色脂肪組織和骨骼肌中；PPARY主要存在于脂肪組織、巨噬細胞和結腸中。PPARoc和PPARy的天然配體包括多不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸和亞油酸)、白三烯B4(花生四烯酸通過脂氧化酶途徑的產物)、氧化型低密度脂蛋白、9-和13-羥基十八碳二烯酸、以及可能有15-前列腺素J2(Forman等，1997)。合成的PPARoc和PPARy配體被用于治療脂類和葡萄糖紊亂苯氧酸類(fibricacid)、PPARa配體，是一種降脂藥物；噻唑垸二酮、PPARy配體，是一種胰島素(Berger等，2002)。4盡管PPAR5的天然配體的身份還是一個謎(Braissant等，1998)，通過合成的PPARS配體和具有靶定的PPARS功能的小鼠模型，已經揭示了PPAR5的多種生物學功能(Peters等，2000;Barak等2002)。被報道的PPAR5的功能包括脂類動態平衡(Forman等，1997)、子宮內膜感受性(Lim等，2000;Ding等，2003)、炎癥(Lee等，2003)、創傷愈合(Michalik等，2001;Wahli2002)、腦的髓鞘形成(Peters等，2000)以及對脅迫的抗性(Hao等，2002)。此外，PPAR5還涉及到結腸癌(Gupta等，2000;Cutler等，2003)。環前列腺素(PGI2)是一種推測的PPARS的天然配體。在子宮的植入位點共表達高水平的PGl2和PPARS信息(message)(Lim等，1999)。PGl2類似物或合成的PPAR5配體在環加氧酶-2靶向的小鼠中恢復了失去的子宮內膜感受性(Lim等，1999;Lim等，2000)。在不表達PGl2受體的腎髓細胞中，伴隨著PPAR5反應元件的活性的增加而增加的PGI2的產生促進了它們在高滲環境壓力下的存活(Hao等，2002)。最后，PGl2是抑制PG合成的非甾類抗炎藥物和防止結腸癌之間的可能的聯系(Gupta等，2000;Cutler等，2003)。植入前胚胎的體內發育受到一種協調的程序的促進，所述程序涉及來自輸卵管和子宮的可溶性因子(Yeimg等，1992)。環前列腺素(PGI2)、由輸卵管和子宮通過環加氧酶-2(COX-2)途徑產生的一種因子，在胚胎發育和完成中發揮了關鍵性的作用(Huang等，2004a;Huang等，2004b;Huang等，2003;Lim等，1999)。與體內胚胎發育相比，培養的胚胎諸如體外受精(IYF)的胚胎的發育被延遲了，因為培養的胚胎被剝奪了輸卵管的保護性環境(Hardy,1997)。我們最近的工作顯示出在培養基中添加一種PGl2的穩定類似物伊洛前列素，在體外增強了小鼠胚泡的孵化(Huang等，2003)。此外，用伊洛前列素預先處理的胚胎在轉移到妊娠載體時顯示出增強的植入和活產能力(Huang等，2004b)。除了輸卵管和子宮之外，PGl2的一個來源是植入前胚胎。通過用選擇性COX-2抑制劑阻斷內源PGl2的產生，延遲5了胚胎的孵化(Huang等，2004c)。因此，PGI2對于胚胎的體外發育來說是關鍵的，它的穩定的類似物有效地促進培養的胚胎的孵化和植入。盡管植入前的胚胎表達PGl2受體并具有功能性蛋白激酶A，但PGl2類似物不增加它們的cAMP水平(Huang等，2003)。尚不清楚PGI2及其類似物是如何實現這些增強的。PGb通過與G蛋白偶聯的前列腺素受體(IP)和/或過氧化物酶體增殖物激活物受體5(PPAR3)的結合發揮其效應(Forman等，1997;Namba等，1994)。PGl2抑制血小板凝集和平滑肌細胞的松弛是由IP受體通過環AMP依賴性的激酶(PKA)途徑來介導的(Namba等，1994)。PPARS通過PGl2參與細胞的保護(Adderley和Fitzgerald,1999;Hao等，2002;Tan等，2001)。無IP小鼠有增加的血栓形成的傾向(Cheng等，2002);無PPARS小鼠表現出生殖缺陷(Barak等，2002;Cheng等，2002)。以前已經報道，在添加了PGl2類似物的培養基中培養的胚胎顯示出增強的孵化(Huang等，2003)、植入和活產(Huang等，2004;題目為"通過在培養基中添加前列腺素或前列腺素類似物增強體外胚胎發育的方法和組合物(MethodandCompositionforEnhancing/"EmbryoDevelopmentbySupplementingCulturemediumwithProstaglandinoraProstaglandinAnalog)"的國際專禾U申ifPCT/US2004/029167(Huang等)；以及題目為"增強哺乳動物的胚胎發育(EnhancementofMammalianEmbryoDevelopment)"的美國專禾U申請11/370,152(Huang等)，其公開的內容在此引為參考)。目前仍在繼續尋找其它通過改進植入前胚胎的體外發育來增加它們成功植入子宮內的潛力以及增加從這些胚胎的活產率來進一步增加IVF的成功的方法。
發明內容本申請公開了植入前胚胎表達PPAR5，并且除去PPAR5導致了降低的細胞增殖和不可逆的發育遲緩。用合成的配體活化PPAR5，被證實增加了胚胎細胞的增殖、增強了體外的胚胎孵化，并增強了培養的胚胎的植入。PPAR5代表了一種改進IVF結果的新型治療靶。這些發現預期將在例如體外受精這樣的醫學技術中特別有用。根據本發明的某些實施方案，提供了在植入前哺乳動物胚胎中激活過氧化物酶體增殖物激活物受體5(PPARS)的體外方法，其中包括在胚胎培養基中培養胚胎，胚胎細胞中的PPAR5的表達一旦開始或開始后，通過用PPARS配體結合表達的PPARS來激活PPAR5，以阻止培養的胚胎的細胞中的凋亡和或加強培養的胚胎的細胞的增殖。在某些實施方案中，PPAR5配體與表達的PPARS的結合增強了胚胎的孵化。在某些實施方案中，該方法還包括以有效促進胚胎的完全孵化的量在培養基中添加前列腺素或其類似物。在某些實施方案中，配體包括至少一種前列腺素或其類似物以外的天然的或合成的配體。在某些實施方案中，配體在桑椹胚期或在所述胚胎發育后期加入到培養基中。在某些實施方案中，配體包括L165,041，在某些實施方案中，配體包括GW501516。在某些實施方案中，所述方法產生了具有增加的體內植入潛能的胚胎。在某些實施方案中，所述方法產生了具有增強的建立可存活的妊娠的能力的胚胎。根據本發明，還提供了增加體外受精的哺乳動物胚胎的活產能力的方法，所述方法包括(a)按照上述的方法增強胚胎的發育，其中所述在培養基中添加合成的PPAR5配體產生了PPARS配體處理的胚胎；(b)將PPAR5配體處理的胚胎導入哺乳動物的子宮中；以及(c)允許導入的胚胎植入到所述子宮中，其中胚胎孵化和植入到宿主的子宮中的能力，與沒有在存在該合成的PPARS配體的情況下培養的胚胎的這些能力相比，被增強了。在某些實施方案中，步驟(b)包括了將胚泡期或前期的PPARS配體處理的胚胎轉移到子宮中。根據本發明，還提供了用于哺乳動物胚胎體外發育的改進的胚胎培養基，其中的改進包括培養基中過氧化物酶體增殖物激活物受體s(PPAR5)配體的量有效增加胚胎細胞的增殖，其中所述配體不是前列腺素或其類似物。在某些實施方案中，培養基中PPARS配體的量當胚胎在培養基中培養時有效促進胚胎的完全孵化。在某些實施方案中，培養基還含有當胚胎在培養基中培養時有效促進培養的胚胎完全孵化的量的前列腺素或其類似物。本發明的另一個實施方案提供了上面定義的在表達PPARS的體外培養的胚胎細胞中與PPARS結合的PPARS配體，在用于激活PPARS以阻止胚胎細胞中的凋亡和或加強胚胎細胞的增殖、增強體外受精的哺乳動物胚胎在引入哺乳動物的子宮后的活產能力的藥物生產中的應用。本發明的這些以及其它的實施方案、特征和優點，在參考了下面的描述和附圖后，將變得明顯。圖1.小鼠胚胎表達過氧化物酶體增殖物激活物受體S(PPAR5)。(a)來自20只小鼠的胚泡的總RNA被反轉錄，并使用基于小鼠PPAR5序列的的外顯子5和6的引物通過PCR進行了擴增。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳。擴增子的預期大小是334堿基對(第2道)。將~330堿基對的擴增子洗脫，用限制性內切酶SST7進行消化。未消化的和消化的DNA(分別為第4和第5道)在3%瓊脂糖凝膠上進行電泳。在第5道中的兩個片段具有預期的大小95和239堿基對。(第1道和第3道是100堿基對的序列梯)。(b)60個小鼠胚泡(第l道)和肝臟(第2道，30g)的全細胞裂解物在聚丙烯酰胺凝膠上進行分離，然后電轉移到硝酸纖維素膜上。膜用親和純化的、多克隆的針對基于小鼠PPARS序列的合成肽的兔抗體進行探測，通過化學熒光進行觀察。具有免疫反應性的蛋白遷移到具有預期分子量(58kDa)的位置。圖2.過氧化物酶體增殖物激活物受體5(PPAR5)蛋白被定位于胚胎細胞的核。使用Western印跡分析用的相同的抗體對遠交株胚胎(ICR)中的PPAR5進行免疫組織化學定位。檢驗了來自不同發育階段的胚胎和未受精的卵。在8細胞階段及其后檢測胚胎中的免疫染色。顯示了一個具有代表性的胚泡內細胞團和滋養外胚層(trophoectoderm)都顯示出了PPARS染色。PPARS染色具有顆粒狀的圖案，反映了DNA結合染料4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對核的染色。圖3.過氧化物酶體增殖物激活物受體S(PPARS)的特異性配體以濃度依賴性的方式增強了小鼠胚胎的孵化，(a)收獲雙細胞胚胎(C3B6F1)并在存在DMSO(介質，1:10,000)或lpM合成的PPAR酉己4本WY14,643(PPARoc)、L165，041(PPARS)禾口環格歹(j銅(PPARy)的情況下培養。96小時后，比較完全孵化的比率。PPAR5的特異性配體L165,041增強了完全胚胎孵化(在所有組中/<0.0001，X2=24.6;費歇爾精確檢驗L165，041與對照組相比的p=0.0097;相對風險=1.9;95%置信區間1.08-3.36)。括號中的數字表示在總的胚胎中完全孵化的胚胎的數量，(b)將雙細胞胚胎(C3B6F1)在添加了不同濃度的L165，041的培養基中培養96小時。計算出完全孵化的比率(詳見文本)。圖中顯示了基于3到6組各含有15-20個胚胎的獨立的實驗的完全孵化的平均值士SD(%)。估算的EDso是21nM。(使用lnM進行了6組實驗，0和3pM各進行了3組實驗，其它濃度各進行了4組實驗。)圖4.桑葚胚期及其后的胚胎對合成的過氧化物酶體增殖物激活物受體5(PPARS)具有反應性。將雙細胞胚胎(混合的C57BL6N和C3H背景)在指示的時期內在添加了lpML165,041的培養基中培養96小時。下面的表顯示了在這期間胚胎經歷的發育階段。與對照胚胎相比，在收獲后0-96、24-96和48-96小時期間暴露于L165，041的胚胎具有明顯高的完全孵化比率。這些結果表明，在收獲后48小時，當大部分胚胎變成桑葚胚時，胚胎變得對L165，041具有反應性。括號中的數字表示相對總的胚胎完全孵化的胚胎的數量，(在5個組中0.0006，X2=19.6;相對于對照*/<0.0001、**;=0.004,***;=0.002)。圖5.合成的過氧化物酶體增殖物激活物受體S(PPARS)配體降低了植入前胚胎的細胞凋亡并增強了細胞增殖。(圖5a)將雙細胞小鼠胚胎(C3B6F1)在添加了L165,041(O.lpM，合成的PPARS配體)或介質(DMSO，1:10,000)的培養基中培養72小時。所有達到胚泡期的胚胎(典型大約為90%)用多聚甲醛進行固定，進行TUNEL分析，使用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚對核進行負染色。在熒光顯微鏡下使用適合的濾光片確定總的和凋亡的細胞。顯示了17個對照和19個實驗胚胎的結果(平均值土SD)。這是來自三組實驗中的一組的結果。其它的兩組實驗使用了同樣數量的胚胎，獲得了類似的結果。(^=0.034)(圖5b)。收獲雙細胞胚胎(25%C57BL6/J和75%129Sl/SvImJ)，如上所述培養72小時。在與10M5-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU)溫育6分鐘后，將胚胎固定在含有甘氨酸的酸性乙醇中(詳見文本)。使用針對BrdU的特異性單克隆抗體通過免疫組織化學法檢測摻入的BrdU。增殖指數是胚胎中摻入BrdU的細胞的百分數。顯示了來自25個對照和31個實驗胚胎的結果(平均值土SD)。每個胚胎的平均細胞數在兩個組中都是63個。(*/=0.015)。圖6.消除過氧化物酶體增殖物激活物受體S(PPARS)在體外延遲了植入前胚胎的有序進程。在注射hCG后47小時收獲PPAR5-/-和野生型胚胎(WT)，并在體外觀察96小時。經過48小時的培養后發育的差異變得明顯。該圖是基于151個PPAR5-/-和84個WT胚胎。使用類似數量的胚胎重復實驗一次，結果類似。(*p=0.0261，雙邊費歇爾精確檢驗，相對風險=5.393，95%置信區間=1.113到26.138)。圖7.消除過氧化物酶體增殖物激活物受體S(PPARS)在體內延遲了植入前胚胎的有序進程。在注射hCG后70和96小時獲得了PPARS-Z-和野生型(WT)胚胎。基于倒置顯微鏡下的形態學確定胚胎的發育階段；每個胚胎中細胞的數量通過用結合DNA的熒光染料4'-6-二脒基-2-苯基吲哚染色核來確定。在注射hCG70小時后，(a)大部分的PPARS-/-和WT胚胎分別是四和八細胞胚胎，并且(b)正如預期，WT胚胎比10PPAR5-A胚胎具有明顯多的細胞(*/<0.0001)。在注射hCG96小時后，(c)與PPAR3-/-胚胎相比明顯多的WT胚胎處于胚泡期(*戶<0.0001，相對風險2.6，95%置信區間為1.8-3.6)，以及(d)WT胚胎比PPARS-Z-胚胎具有明顯多的細胞(*p=0.002)。(a)和(b)中的結果是基于76個PPAR5-/-胚胎和72個WT胚胎；(c)中的結果是基于PPARS-/-和WT胚胎各155個；(d)中的結果是基于9個PPAR5-/-胚胎和18個WT胚胎。圖8.消除過氧化物酶體增殖物激活物受體S(PPARS)與降低的胚胎細胞增殖有關。在注射hCG后70和96小時獲得PPARS-/-和WT胚胎，在含有5-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU，10pM)的培養基中溫育10分鐘。將胚胎固定在冰冷的甘氨酸(50mM)的70%乙醇(pH2.0)中，使用抗BrdU小鼠單克隆抗體和FITC偶聯的抗兔IgG抗體進行染色(詳見文本)。細胞的核用DNA結合染料4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，5g/ml)進行染色。處于S期因此摻入了BrdU的細胞在FITC濾光片下被識別。總細胞數量基于DAPI核染色在UV濾光片下確定。增殖指數(處于S期的細胞的百分數)通過用BrdU陽性細胞的數量除以總細胞數量然后乘以100%來確定。在注射hCG后(a)70小時和(b)96小時后，百丁胚胎與？？八515-/-胚胎相比具有明顯高的增殖指數。在(a)中使用了各12個胚胎；在(b)中使用了33個WT胚胎和30個PPAR5-/-胚胎。(*;<0.0001)。圖9.植入前胚胎表達PPARS。(a)通過RT-PCR分析PPAR5的轉錄本。從~個胚泡制備總RNA。第i道顯示了分子量標記，第道是334-bp的PPAR5帶，第3道是334-bp的PPAR5帶的證實，通過SST1消化產生兩條具有預期大小的片段，分別為95-和239-bp。(b)來自25個小鼠胚胎的細胞裂解物的Western印跡分析。測試樣品的總細胞裂解物(30pg)作為對照；使用了60kd的蛋白作為分子量標記(第l道)。(c)代表性的胚泡中PPARS的免疫組織化學染色。染色圖案表明PPARS是核定位的，與Hoechst33258(—種DNA結合染料)染色的結果相似。正如預期的那樣，PPARS-/-胚泡沒有顯示出PPAR5染色。圖10.伊洛前列素(iloprost)和L-165041對野生型(PPARS+/+)11和PPAR5-A胚胎的孵化的影響。從雙細胞期開始，將胚胎在存在或不存在伊洛前列素(O.lpM)或L-165041(O.l)iM)的情況下培養。96小時后，比較每個組中完全孵化的胚胎的數量。伊洛前列素和L-165041單獨地以相似的程度增加了野生型胚胎的孵化。伊洛前列素和L-165041的組合沒有額外的效果。另一方面，PPAR5-A胚胎具有明顯低的完全孵化比率，對伊洛前列素或L-165041都沒有應答。括號中的數字表示完全孵化的胚胎的數量與總胚胎的數量的比較Z表示p0.05，"表示pO.Ol(與對照胚胎比較，卡方檢驗)。圖11.PPAR5的缺失降低了胚胎細胞的增殖。從雙細胞期開始，將野生型和PPAR5-A胚胎培養72小時。按照方法部分中的描述確定BrdU的攝取和細胞數量。正如每個胚胎中明顯更多的BrdU陽性細胞所表明的那樣，WT胚胎具有更多的細胞增殖(a)。結果，WT胚胎每個胚胎具有更多的細胞(13)。該圖顯示了使用22個野生型和20個？？八113-/-胚胎的一個代表性的實驗的結果；在使用類似數量的胚胎的其它兩組實驗中觀察到了同樣的結果。*表示p<0.01。圖12.L-165041增強胚胎的孵化，(a)L-165041濃度依賴性地刺激完全胚胎的孵化。從雙細胞期開始，將野生型胚胎培養在不同濃度的L-165041中。96小時后確定完全孵化的胚胎的比率。該圖是基于3到6組實驗，每組實驗使用15-20個胚胎；誤差條線顯示了平均值士SD。(b)PPARS酉己體(L-165041，lpM)、而不是PPARg(WY14643，lpM)或PPARY(環格列酮，lpM)配體、增強了完全胚胎孵化。圖中描述了1到2組各使用15-20個胚胎的獨立的實驗的組合結果。括號中的數字表示完全孵化的胚胎的數量與總胚胎的數量的比較，(c)L-165041(lpM)增加了雙細胞、八細胞和桑椹胚期胚胎的孵化、但是不增加胚泡期胚胎的孵化。圖中描述了2到4組各使用14-20個胚胎的獨立的實驗的組合結果。括號中的數字表示完全孵化的胚胎的數量與總胚胎的數量的比較，(d)L-165041增加了胚胎細胞的增殖。圖中描述了使用24個對照和31個L-165041處理的野生型胚胎的一組代表性實驗的結果。實驗被重復兩次；結果相似。*表示p<0.05，**表示pO.Ol。圖13.PPAR5的激活改進了培養的胚胎的植入。處于雙細胞期的1297個PPARS+/+，B54個PPARS-A胚胎被培養48小時。在記錄了它們的發育階段后將胚胎轉移到妊娠載體。72小時后確定妊娠囊的數量。明顯較少的PPAR5-/-胚胎發育到胚泡期(a)。當轉移到載體時，PPARS-A胚胎具有明顯較低的植入率(b)。從雙細胞期開始，56個和42個？？八115+/+胚胎分別接受DMSO和L165041,培養48小時。在記錄了發育階段之后，將胚胎轉移到受孕載體。72小時后確定妊娠囊的數量。在胚胎轉移時兩個組中胚胎發育的程度是類似的(c)。但是，L-165041處理的胚胎具有明顯較高的植入率(d)。括號中的數字表示妊娠囊的數量和被轉移的胚胎的數量。*表示p0.05，**表示？<0.01。優選實施方案的詳細描述I、增強胚胎的孵化和減少胚胎細胞的凋亡。輸卵管來源的前列環素最適化了植入前胚胎的發育，并增強了它們孵化、植入和活產的能力。前列環素在植入前胚胎中的信號傳導尚不清楚。為了探索過氧化物酶體增殖物激活物受體S(PPARS)可能在植入前胚胎中介導PGl2效應(例如PGl2的信號傳導)的可能性，研究了PPARS在植入前胚胎中的表達，并通過合成的PPARS配體將它激活。基于完全胚胎孵化和胚胎細胞的凋亡評估了植入前胚胎對合成的PPAR5的應答。為了揭示PPARS在植入前胚胎的發育中的作用，比較了PPARS敲除(PPAR5耙向的(PPARS-/-))和野生型胚胎的發育。發現，當通過RT-PCR和Western印跡分析測定時，植入前小鼠胚胎表達了PPARS，正如在后面詳細描述的那樣。合成的配體對它的活化增加了胚胎孵化并減少了凋亡。合成的PPARS配體以濃度依賴性的方式減少了凋亡、增強了增殖、并增加了胚胎孵化(ED5()=21nM)。通過基因耙向消除PPARS，在植入前胚胎中導致了降低的細胞增殖和不可逆的發育遲緩。因此，植入前胚胎表達PPAR5，而它對于正常的發育和胚胎細胞的增殖是關鍵的。合成的配體對PPARS的活化增強了體外的胚胎孵化。根據這些在小鼠模型中進行的代表性研究，推測哺乳動物、包括人類的胚胎表達PPAR5。PPARS的表達確保了植入前胚胎的13有序發育，它被合成的配體的活化增加了體外的胚胎孵化。材料與方法試淑來,浙教稱漲準。除非特別指明，所有的試劑都是從Sigma-AldrichCo.(St.Louis,MO，USA)購買的。研究方案得到休斯頓的德克薩斯大學衛生科學中心的動物福利委員會的批準。小鼠的護理和操作符合美國國立衛生研究院出版的實驗動物護理和使用指南(NIH出版號No.85-23，1996年修訂)。^嵐^"應游敬蕕浙潛泰。小鼠從下列來源獲得C3H、129Sl/SvImJ和C57BL6/J來自Jackson實驗室(BarHarbor,ME,USA);ICR和C57BL6/Nhd來自Harlan(Indianapolis,IN，USA);PPARS-A由R.Evans博士饋贈(theSalkInstitute,LaJolla,CA)。PPARS-A的野生型(WT)對應小鼠通過將129Sl/SvImJ與C57BL6/Jx129Sl/SvImJ的后代進行交配而育種。小鼠被保持在溫度和濕度被控制的環境中(07:00開始光照，19:00停止光照)，可以自由接近食物和水。小鼠胚胎按照以前描述的方法收獲和培養(Huang等，2003)。簡單來說，通過對3周齡的雌性小鼠進行腹膜內注射PMSG(5IU)、然后在42-46小時后注射hCG(5IU)，來使其超排卵。在注射hCG后(在15:00)，將每只雌性小鼠與一只被證明具有生殖能力的雄性小鼠同籠。除非特別指明，胚胎(在雙細胞期)在44-48小時后收獲，并于37匸在5%032條件下培養(每組17-20個)在含有600L無蛋白培養基的4孔板中(NalgeNuncInternational,Naperville,IL,USA)。在前48小時使用HTF培養基(SageBi叩harma,Bedminster,NJ，USA;在第二個48小時，使用含有Earle's鹽和2mM谷氨酰胺的aMEM(IrvineScientific)。經過96個小時的培養后，檢查每個胚胎中透明帶的存在。那些完全不具有透明帶的胚胎被記錄為已經完全孵化。完全孵化的比率通過用完全孵化的胚胎的數量除以總的胚胎的數量來計算。胚胎的完全孵化被用作終點，因為它是明確的終點，并與植入和活的妊娠的概率相關(Huang等，2003;Huang等，2004b)。介質(DSMO)的濃度少于1:10,000;對照的胚胎接受同樣濃度的DMSO。PiM及S-/-浙『7^*應沐力發#游^^。如下所述對PPAR3-/-禾口WT胚胎在體內的發育進行了比較。胚胎從注射了hCG后70和96小時的plugged小鼠獲得。這些時間點的選擇是因為在注射hCG后70小時時，大部分的WT胚胎發育成8細胞或桑椹胚期的胚胎，而在注射hCG后96小時，大部分的WT胚胎發展成胚泡。根據胚胎細胞的數量對注射hCG后70小時獲得的胚胎的發育階段進行了比較，因為緊密的8細胞胚胎和桑椹胚期的胚胎不能根據它們的形態在相差顯微鏡下可靠地區分。根據它們在相差顯微鏡下的形態確定了注射hCG后96小時獲得的胚胎的發育階段。基于用結合DNA的熒光染料4'-6-二脒基-2-苯基B引哚(DAPI)進行核染色，然后用免疫熒光顯微鏡在UV濾光片下(AxioPlan2,CarlZeiss,Germany)檢測來確定胚胎細胞的數量。5-湊-r-應奪尿夢Mn/[^游凝乂浙潛遭獵教。胚胎細胞的增殖根據它們摻入BrdU的能力來確定。分析使用商業化的試劑盒(BrdU標記與檢測試劑盒I,RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)按照制造商的方法作了某些最適化后進行。改變之一是溫育的時間。預實驗顯示在PPARS-A禾PWT胚胎之間區分S期細胞比例的最適溫育時間是10分鐘。為了比較對照和L165，041處理的胚胎，最適的時間是6分鐘。修改后的步驟如下。在收獲后，將胚胎立即在含有10MBrdU的100L預先平衡的HTF培養基中于37。C在5%C02條件下溫育10分鐘。在溫育后，將胚胎在冰冷的甘氨酸(50mM)的70%乙醇(pH2.0)中于-20。C下固定30分鐘。在含有1%BSA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中復水/封閉后，將胚胎在含有1%BSA的溫育緩沖液中與稀釋的抗BrdU小鼠單克隆抗體(1:2)的溫育，然后在含有1%BSA的PBS中與稀釋的FITC偶聯的抗兔IgG抗體(1:4)溫育。兩次溫育都在37'C下進行，持續30分鐘；在每次溫育后將胚胎在200L含有1。/。BSA的PBS中清洗。在DAPI(5pg/ml)中在25。C下最后溫育90分鐘后，將胚胎固定在含有16.6%Elvanol②50-42(DuPontWilmington,DE,USA)15和2.5%1,4-二氮雜二環-(2.2.2)-辛烷的0.1MTrisHCl(pH8.5)中。處于S期從而摻入了BrdU的細胞在FITC濾光片下進行識別。總細胞數基于DAPI核染色在UV濾光片(AxioPlan2,CarlZeiss,Germany)下被確定。增殖指數(處于S期的細胞的百分數)通過用BrdU陽性細胞的數量除以總的細胞數量然后乘以100%來確定。末凝應裒拔芽廢存移蘑辦導游W7T敘/7末艚薪記(^T/A^D浙^^應i^教。使用了商業化的試劑盒(原位細胞死亡檢測試劑盒，RocheAppliedScience)并作了一些修改，對經歷了程序性細胞死亡的胚胎細胞通過TUNEL分析進行鑒定。在每個指示的時間點，在培養后收集胚胎或從小鼠收獲胚胎，并在含有4y。緩沖的多聚甲醛的PBS中于4"C固定30分鐘。在進行TUNEL之前，將胚胎與5%triton的PBS溶液在37t:溫育20分鐘。對制造商提供的方案進行了修改。將最多20個胚泡在20LTUNEL反應溶液(2pLTUNEL酶和18(iL1:4稀釋的標記溶液)中于37'C在加濕箱中溫育60分鐘。然后在安裝在16.6%Elvanol50-42(DuPont，Wilmington,DE，USA)的0.1MTrisHC1(pH8.5)中之前，將胚胎在DAPI(30pg/mL)中于37。C溫育5分鐘。使用熒光顯微鏡(AxioPlan2,CarlZeiss,Germany)分別用FITC和UV濾光片觀察凋亡的細胞和總細胞。使用DNA酶處理的胚胎作為陽性對照。死細胞指數(TUNEL陽性細胞的百分數)通過用TUNEL陽性細胞的數量除以總細胞的數量然后乘以100%來確定。iiVJ提攻、i77PC7莉凝劍性艨賴化分折。從20個胚泡中使用商業化的試劑盒(RNeasy,Qiagen,Chatsworth,CA,USA)提取總RNA，并用于RT/PCR。引物根據基因庫中小鼠的PPAR5序列(NM一011145)進行選擇。BLAST分析顯示出沒有已發表的小鼠序列與334bp的擴增子的序列具有同源性。使用基于外顯子6的核苷酸序列的引物(5'TTCTAGAGCCCGCAGAATGG),在42。C進行RT30分鐘。。上游(5，GCCAAGAACATCCCCAACTTC)禾卩下游(5'CCTGGATGGCTTCTACCTGG)引物分別來自外顯子5和6。PCR反應由94°C15秒、60°C1分鐘和72°C1分鐘共45個循環構成，最后在72'C延伸7分鐘。具有預期分子量(~330堿基對)的擴增子被洗脫(QIAEXII凝膠提取試劑盒)，用限制性酶(Invitrogen，Carlsbad,CA)進行消化。分別使用2%和3%的瓊脂糖凝膠分離PCR產物和消化的DNA(預計產生兩個片段95和239bp)，使用UV光觀察。『e^em伊^"分析。Western印跡分析按照以前的描述(Huang等，2002)來進行，作了一些修改。使用了親和純化的、針對基于小鼠的PPARS蛋白的合成肽(MEQPQEETPEAREE,AbeamInc.,Cambridge,MA，USA)的多克隆抗體。簡單來說，將細胞裂解物中的蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，然后轉移到硝酸纖維素膜上(Schleicher&Schuell,Inc.,Keene，NH,USA)。被抗體結合的PPARS蛋白使用增強的化學熒光(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USA)來觀察，其信號被STORM860激光掃描器(AmershamBiosciences)檢測。來自小鼠肝臟的總細胞裂解物被用作陽性對照。胚泡的細胞裂解物如下進行制備。將2L培養基中的60個小鼠胚泡轉移到1.5mlEppendorf管中，管中含有30|aL裂解緩沖液(150mMNaCl，l%NP-40，0.25%脫氧膽酸鈉，lmM原釩酸鈉，ImMEGTA和1mM氟化鈉)和蛋白酶抑制劑(1mM4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽，0.8^M抑蛋白酶肽，5(^M(3-抑制素，15pME-64，20pM亮抑酶肽半硫酸鹽，10(aM抑胃酶肽A，Calbiochem-NovabiochemCorp.,SanDiego:CA，USA)。將混合物渦旋振蕩5秒，離心10秒，在冰上搖動30分鐘。經過兩次每次1秒的超聲波沖擊(Sonifier250,BransonCo.Danbury,CTUSA)后，將裂解物與4X蛋白負載染料混合。將混合物的上清液用于Western印跡分析。扇iff蘊織眾學。使用與Western印跡分析中使用的同樣的抗體來定位胚胎中的PPAR5。免疫組織化學按照以前的描述進行(Huang等，2003)。簡單來說，將胚胎(ICR)在冰冷的含有4%緩沖的多聚甲醛17的PBS中固定30分鐘。在用"/。triton的PBS溶液通透化20分鐘之后，將胚胎在含有5%牛奶的PBS中和抗PPAR5抗體(32g/mL)在37r溫育30分鐘。然后將胚胎在偶聯了FITC的2.5pg/mL山羊抗兔IgG抗體(MolecularProbes,Portland,OR)中在37。C溫育30分鐘。在兩次溫育之間胚胎用PBS清洗4次，每次5分鐘。在與DAPI(30pg/mL)在37"最后溫育5分鐘后，如上所述(在TUNEL部分中)將胚胎固定，使用熒光顯微鏡(AxioPlan2，CarlZeiss,Germany)在FITC和UV濾光片下檢測。檢測了未受精的卵和來自不同發育階段的胚胎(從單細胞胚胎到胚泡期胚胎)。PPARS-/-胚泡被用作陰性對照。數據分析Prism3.0版(GraphPadSoftwareInc.SanDiego,CA)，將Hill斜率設定在1.0，被用于估算L-165041的ED5Q。在適當時使用卡平方和Student'sr檢驗(InStat3.05版，GraphPadSoftwareInc.)。;K0.05被認為是統計學顯著的。結果部分I澄乂肅V、腐^T靡表達i^4及S。首先對胚泡(C3B6F1)進行RT/PCR和Western印跡分析以確定PPAR5的表達。用于PCR的引物分別來自外顯子5和6;預期的擴增子大小是334bp。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物發現了兩個擴增子一個具有預期的分子量(約330bp)，另一個具有較低的分子量(約250bp)(圖la)。將大約330bp的擴增子從凝膠洗脫并用限制性酶(^SW7V)消化。通過瓊脂糖凝膠電泳對消化的產物進行分析，發現了兩個如根據PPARS的cDNA序列推測的具有預期大小的片段(約95和約240bp)(圖lb)。對胚泡的全細胞裂解物進行的Western印跡分析發現了單一的條帶，對應于來自肝臟的PPARS蛋白(圖lc)。戶/M朋歪A在潘應菊J!"后游,應^^^檢,游。使用與Western印跡分析中使用的相同的抗體在植入前胚胎中定位PPARS蛋白。對未受精的卵和來自不同發育階段的胚胎(ICR，遠系繁殖株系)進行了免疫組織化學分析。結果顯示PPAR5的染色位于胚胎細胞的核中。它具有顆粒的圖案，反映了DNA結合染料DAPI對核的染色。PPAR5首先在細胞胚胎中變得可以被檢測(未顯示)。在胚泡中，內細胞團和滋養外胚層都顯示出了PPAR5染色(圖2)。正如預期，PPARS陽/-胚泡沒有顯示出染色。合成游"^S衝沐遂雍絲潛蔬V、廚嚴應游辨眾。為了證實PPARS的生物學功能，確定了胚胎對三種同種型特異性的合成PPAR配體的反應。雙細胞胚胎(C3B6F1)在添加了每種配體的培養基中培養96小時，胚胎的完全孵化被用作終點。在三種合成的PPAR配體中，只有PPARS特異性相互作用的L165,041增加了胚胎的完全孵化(圖3a)。L165,041是4-[3-(4-乙酰基-3-羥基-2-丙基苯氧基)丙氧基]苯氧基-乙酸。L165,041的加入以濃度依賴性的方式增加胚胎的孵化；EDso被估計是21nM(圖3b)。這些結果表明植入前胚胎中的PPAR5是功能性的，它的激活增加了胚胎孵化。在澄乂薪嚴應護對會成游PiMi5衝體游及應;^犮f份虔資廯絲游。從基因組變得活化的雙細胞期開始，胚胎變得對外部刺激越來越有反應性。為了確定何時胚胎變得對合成的PPARS配體具有反應性，進行了下面的實驗。將雙細胞胚胎(C3H和C57BL6Nhd混合的遺傳背景)隨機分配到三個組中的一個組中，其中L165，041在開始培養后24、48和72小時添加。在這些時間點，它們大部分分別發育成8細胞期、桑葚胚期和胚泡期胚胎。在培養96小時后比較各組的完全孵化比率。給出的結果顯示在24-96小時和48-96小時期間(分別對應于8細胞期以后和桑葚胚期以后)接受Ll65,041的組與在0-96小時期間接受L165，041的組具有相同的完全孵化比率(圖4)。盡管在72-96小時期間(對應于胚泡期以后)接受L165,041的胚胎顯示出比對照胚胎較高的完全孵化比率，其差異不是統計學顯著的(p=0.08)(圖4)。這些結果表明在培養48小時后，胚胎變得對L165，041具有反應性。根據19該時間點胚胎的發育階段，可以推論胚胎在桑葚期及以后變得對L165，045具有反應性。這與基于免疫組織化學研究的PPARS的發育階段依賴性表達相符合。合成游piM及s配沐在植入肅巡游^減少7W亡并谫勿:r瓶游^遭。以前的研究表明胚胎在體外的成功孵化依賴于足夠高的細胞數量(Montag等，2000)。起初的研究顯示出胚胎中總的細胞數量可以在培養72小時后可靠地測量，但是在96小時后就不能了。因此，在隨后的研究中，在培養72小時后比較胚胎中凋亡和增殖的比率。凋亡的細胞和處于S期的細胞分別使用TUNEL分析和BrdU摻入來確定；DNA結合染料DAPI被用于確定總的胚胎細胞。結果顯示，在培養72小時后，在對照和實驗胚胎中細胞的數量是可比的(大約每個胚胎60個)，但是L165，041處理的胚胎在S期具有較少的死細胞和更多的細胞(圖5)。這些結果說明，假設再過24小時，當評估胚胎的完全孵化時，L165，041處理的胚胎可能具有更多的活細胞。在沐力浙沐^對于澄乂薪^^游,序發展;^關楚脫為了調查PPAR5在植入前胚胎的發育中的作用，比較了PPARS-/-禾卩WT胚胎在體外和體內的發育。對于前者來說，雙細胞胚胎被培養和觀察了96小時；對于后者來說，胚胎在注射hCG后70和96小時被收回(原理參見材料/方法部分)。結果顯示PPARS的缺乏阻礙了胚胎的發育。在培養小時后，發育的差別變得明顯了，這時57%的WT胚胎變成胚泡或孵化的胚泡，而只有10%的PPAR5-A胚胎發展成胚泡。這種差異保持到96小時的末期2P/。的WT胚胎和4。/。的PPARS-A胚胎完全孵化(圖6)。值得注意的是即使在培養時期延長到120小時后，PPAR5-A胚胎也不能"趕上"WT胚胎在96-120小時期間，一些胚胎保持不變，而其它的則變得退化(數據未顯示)。PPAR5V-和WT胚胎在體外發育中的反差也表現在注射hCG后70和96小時收獲的胚胎中。在注射hCG后70小時，大部分的WT胚胎變成8細胞胚胎，而大部分的PPAR5-A胚胎是雙或四細胞胚胎(圖7a)。類似地，在注射hCG后96小時，56%的WT胚胎和22%的PPARS-/-胚胎發展成胚泡(圖7c)。正如預期，WT胚胎比PPARS-A胚胎具有顯著多的細胞(圖7b和7d)。這些結果表明PPAR5對于植入前胚胎的有序發展是關鍵的。激餘P/M朋與減少游嚴應智蘑潛遭存關但不與譜勿游銜亡,關。為了確定細胞增殖的不同速度對PPARS-A和WT胚胎中發育的差異的貢獻到何種程度，對注射hCG后70和96小時收獲的胚胎進行BrdU標記。結果顯示WT胚胎比PPAR5-A胚胎摻入了更多的BrdU，并且WT胚胎具有更高的增殖指數。在注射hCG后70小時，92。/。的WT胚胎和4%的？？八115-/-胚胎摻入了BrdU。WT和PPARS-Z-胚胎的增殖指數分別為45%和1%(圖8a)。類似地，在注射hCG后96小時，100%的WT胚胎慘入了BrdU，與此相比PPARS-A胚胎只有57%。WT和八115-/-胚胎的增殖指數分別為40%和18%(圖8b)。為了確定在八115-/-胚胎中凋亡導致的發育遲緩的程度，在注射hCG后96小時獲得胚胎，進行TUNEL分析，然后比較死細胞指數。結果顯示，被檢測的61個PPARS-A胚胎中的28個(54%)和58個WT胚胎中的1個(2%)發育停止了；它們每個胚胎含有15個或更少的細胞。這些胚胎中的三個TUNEL染色陽性在兩個胚胎中各有一個TUNEL陽性細胞，在第三個胚胎中有兩個TUNEL陽性細胞。比較了含有16個或更多細胞的胚胎中的死細胞指數2.2±3.5%對比2.9±3.9%(33個PPARS-A胚胎和58個WT胚胎的平均值士SD，戶=0.33)。這些結果表明在植入前胚胎中PPARS的消除與減少的細胞增殖有關，但是不與增加的凋亡有關。討論-部分I在這里第一次顯示了植入前小鼠胚胎表達PPARS。它被合成的PPAR5配體的激活增加了胚胎的孵化并減少了凋亡；通過遺傳靶向將它消除由于細胞增殖的減少導致了胚胎發育不可逆的延遲。本發現進一步證實了關于PPARS的表達和推測的生物學功能的早期報道。在E8.5天的大鼠胚胎中(到目前為止檢測到的最早的發育階段)，通過原位雜交發現了普遍存在的PPARS信息(但不是PPARoc或PPARy信息)(Braissant等，1998)。基于這些發現，提出了PPARS可能參與了更基本的細胞功能例如膜脂類的更新或細胞周期進程。但是，本結果超出了早期的報道，顯示出在植入前胚胎中缺少PPARS的表達與減少的胚胎細胞增殖和不可逆的發育延遲有關。盡管PPAR5已被暗示參與細胞的增殖，它的確切功能還有爭論。然而，在培養的血管平滑肌細胞中PPARS的過量表達促進了鋪滿后(post-confluent)細胞的增殖(Julan等，2005)，PPARS+A突變株小鼠比野生型小鼠對增殖刺激反應更深刻(Michalik等，2001;Tan等，2001)。已經提出了周期蛋白A和Cdk2的增加以及p57kip2(—種Cdk2抑制蛋白)的減少是前者的機制；但還不清楚什么影響了后者。在植入前小鼠胚胎中，PPARS的消除與細胞增殖的顯著減少有關，PPARS的激活與細胞增殖的顯著增加有關。PPARS的激活可能能夠使胚胎細胞克服Gl限制點，促進它們進入S期。該顯示出合成的PPAR5配體在WT胚胎中增加了細胞增殖的實驗結果與以前報道中的PPARS的生長促進性質相符合。以前關于PPARS激活和降低凋亡的研究更一致。已經提出PPAR5的抗凋亡性質促進了皮膚的創傷愈合(Michalik等，2001;Wahli2002)，并在腎臟細胞中增加了對高滲脅迫的抗性(Hao等，2002)。它可能在結腸直腸癌的腫瘤發生中也扮演了中心的角色(Gupta等，2000;Cutler等，2003)。該顯示了合成的PPAR5配體在WT胚胎中減少凋亡的實驗結果與以前關于PPARS的抗凋亡性質的報道相符合。在L165，041處理的胚胎中與增加細胞增殖和減少凋亡有關的分子機制仍需被確定。不希望受到具體的理論的限制，建議該機制可能包括配體依賴性的轉錄激活和輔阻遏物BCL-6介導的轉錄抑制。據報道，結合了配體的PPARS上調了14-3-3的表達，它又轉過來上調Bcl2家族的抗凋亡成員的表達(Liou等，2004)。最近的證據表明脫輔基PPAR5(apo-PPARS)螯合(s叫uester)了輔阻遏物BCL-6，并且一旦與PPAR5配體結合后，脫輔基PPARS釋放出BCL-6，這時它可以自由抑制其它基因的轉錄(Shi等，2002)。已知被BCL-6抑制的基因包括細胞周期抑制劑諸如p27kipl(Shaffer等，2000;Kusam等，2004)。該轉錄激活/抑制耦合可能也包含了其它的細胞周期調節物。例如據報道，增加的周期蛋白A和Cdk2以及降低的p57kip2(—種Cdk2抑制蛋白)的表達導致了過量表達PPARS的鋪滿后細胞的增殖(Julan等，2005)。與在PPARS配體處理的WT胚胎中觀察到的(即減少了凋亡但具有可比的總細胞數量)相比，PPARS-/-胚胎不比WT胚胎具有更多的凋亡。PPAR5-/-胚胎具有明顯減少的細胞增殖，但是沒有可察覺的凋亡的增加。這種現象可以有幾種可能的原因。首先，在注射hCG后96小時，540/。的PPAR5-/-胚胎(相比而言WT胚胎是2。/。)具有少于16個細胞，這是在注射hCG后72小時就應該達到的細胞數量。所有這些嚴重延遲的胚胎中只有3個顯示出TUNEL染色。不希望受到任何具體的理論的限制，建議可能這些嚴重延遲的胚胎更早地經歷了凋亡，并且DNA的損傷可能非常嚴重，使得它們不再被TUNEL分析染色為陽性。第二，來自輸卵管的可溶性因子可能補償了PPARS的缺乏，并在體內胚胎中維持了正常的凋亡比率。與人類輸卵管細胞共培養的胚胎已知具有顯著低的凋亡(Xu等，2000)。第三，有可能、盡管不是非常可能，合成的PPARS配體諸如L165,041的功能可能與天然的PPARS配體的功能有所不同。這些發現為？？八115-/-小鼠的生殖表現型提供了新的見解。盡管PPARS的消除通常是致命的，那些存活的PPAR5-Z-小鼠一般是健康的和有生殖力的(Barak等，2002)。一種PPARS-Z-小鼠的生殖表現型是小的一次產子數(與R.Evans博士的私人聯絡)。這已經被歸因于不正常的胎盤蛻膜接觸導致的孕中期死亡(Barak等，2002)，即植入后事件。本現象表明？八115-/-胚胎在植入前期間的高度損耗可能是另一個原因。PPAR5-A和WT雌性對PMSG的超排卵反應一樣好(從11個PPARS-A和7個WT小鼠收集的卵的數量分別為26.0±17.2和33.1±22.7，平均值土SD);PPARS-A和WT雄性使雌性受孕具有可比的效率(上述卵的受精率分別為93%和95%)。但是在排卵被hCG啟動后70小時，在PPARS-A胚胎中的不可逆發育遲緩變得明顯。因此，在植入前期間胚胎的失去是？？八115-/-小鼠少的一次產子數的另一個原因。合成的PPAR5配體在人類IVF中可能具有潛在的應用。以前已經報道了一種PGl2類似物伊洛前列素增加胚胎的孵化(Huang等，2003)，并且當轉移到妊娠載體中時，伊洛前列素處理的胚胎比對照胚胎產生了多28%的活產(Huang等，2004b);PCT/US2004/029167(Huang等)，其公開的內容在此引為參考。因為L165，(H1(—種合成的PPARS配體)增加胚胎的孵化，可能添加了合成的PPARS配體的培養基也增加胚胎的活產能力并增加IVF的成功。可能PPARS和PGl2可以對胚胎發揮附加的甚至協同的影響。因此，用PGl2類似物和合成的PPAR5配體添加IVF培養基可能可以比單獨使用配體或單獨使用PGl2類似物提供更好的IVF成功率。使用上述的小鼠模型觀察到的結果，據信至少在某種程度上是使用其它的哺乳動物包括人類的胚胎將獲得的可以預料的結果。當然，在人類IVF中使用PPARS配體在進行治療性應用之前還需要進一步的安全性研究。據信所有的PPARS配體、包括合成的化合物GW501516(2-甲基-4-((4-甲基-2-(4-三氟甲基苯基)-l，3-噻唑-5-基)-甲基磺酰基)苯氧基-乙酸(Calbiochem,U.S.A.))，至少在某種程度上具有活性，就像用代表性的配體L165，041所證實的那樣。II.增加胚胎孵化和植入進行了一系列進一步的研究以調査通過PPAR5途徑增加胚胎孵化和植入。除了下面指明的之外，使用的材料和方法與前面描述的相同。Western印跡分析(II)24Western印跡分析按照以前的描述(Huang等，2004c)來進行，使用親和純化的、針對小鼠的PPAR5肽(MEQPQEETPEAREE)的多克隆抗體(AbeamInc.,Cambridge,MA)。將2L培養基中的25個小鼠胚泡轉移到1.5mlEppendorf管中，管中含有30pL裂解緩沖液(150mMNaCl，1%NP-40,0.25%脫氧膽酸鈉，lmM原釩酸鈉，lmMEGTA和lmM氟化鈉)和蛋白酶抑制劑(lmM4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽，0.8pM抑蛋白酶肽，5C^M卩-抑制素，15nME-64，20(aM亮抑酶肽半硫酸鹽，10jaM抑胃酶肽A，Calbiochem-NovabiochemCorp.,SanDiego，CA，USA)。將混合物渦旋振蕩5秒，離心10秒，在冰上搖動30分鐘，然后進行兩次每次1秒的超聲波沖擊(BransonCo.Danbury,CT:USA)。與4X蛋白載樣染料混合后，將上清液用于Western印跡分析。將裂解液在12%梯度聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，并轉移到硝酸纖維素膜上(Schleicher&Schuell，Inc.,Keene，NH)。被抗體結合的PPAR5蛋白使用增強的化學熒光(GEHealthcareBio-SciencesCorp.,Piscataway,NJ)來觀察，其信號被STORM860激光掃描器(GEHealthcareBio-SciencesCorp)檢測。來自小鼠睪丸的總細胞裂解物被用作陽性對照。胚泡的細胞裂解物如下進行制備。免疫組織化學分析(II)免疫組織化學分析按照以前的描述進行(Huang等，2004c)。簡單來說，將胚胎在冰冷的含有4%緩沖的多聚甲酸的PBS中固定30分鐘。在用ly。tritonX-100的PBS溶液通透化20分鐘之后，將胚胎在含有5%牛奶的PBS中和抗PPAR5抗體(32g/mL)在37。C溫育30分鐘。然后將胚胎在偶聯了FITC的山羊抗兔IgG抗體(2.5pg/mL，Invitrogen)中在37。C溫育30分鐘。在兩次溫育之間胚胎用PBS清洗4次，每次5分鐘。在Hoechst33258(30|^g/mL)中于室溫最后溫育5分鐘后，將胚胎固定，在FITC和UV濾光片下檢測。檢測了未受精的卵和來自不同發育階段的胚胎(從單細胞胚胎到胚泡期胚胎)。5-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU)的攝入(II)。胚胎細胞的增殖根據它們摻入BrdU的能力來確定。分析使用BrdU標記與檢測試劑盒I(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)按照制造商的方法作了修改后進行。簡單來說，將細胞在含有10MBrdU的100L預先平衡的HTF培養基中于37"C在5%(302條件下溫育6分鐘，再在冰冷甘氨酸(50mM)的70%乙醇溶液(pH2.0)中于-20"C下固定30分鐘，然后與含有1%BSA的稀釋的抗BrdU小鼠單克隆抗體(1:2)的緩沖液溫育30分鐘。將胚胎在200L含有1。/。BSA的PBS中清洗，在含有1%BSA的的PBS中與稀釋的FITC偶聯的抗兔IgG抗體(l:4)溫育30分鐘。清洗后，將胚胎用Hoechst33258(30|ag/ml)在25。C處理5分鐘，固定在含有16.6%elvanol50-42(DuPontWilmington,DE)和2.5%1，4-二氮雜二環-(2.2.2)-辛烷的0.1MTrisHC1(pH8.5)中。摻入了BrdU的細胞在FITC濾光片(AxioPlan2，Zeiss,Oberkochen,Germany)下被鑒定。總細胞數量基于Hoechst33258核染色在UV濾光片下被確定。胚胎轉移和植入率的確定胚胎轉移按照以前的描述進行(Huang等2004b)。簡單來說，在解剖顯微鏡(OlympusSZ-PT,Shinjuku-ku，Tokyo,Japan)下，在假孕的2.5天，將胚胎轉移到妊娠載體(ICR雌性小鼠)。麻醉后，通過1.5cm的側翼切口評估每個子宮角。通過用一對鉗子夾住近端輸卵管，用30號針頭在子宮角的遠端與腸系膜相對的一側產生一個開口。開口允i午內徑為135m的轉移吸管(MidAtlanticDiagnostics,Inc.,MountLaurel,NJ)進入。向每個角轉移1.5^L轉移培養基(含有25mMHEPES和1。/。BSA的MEM)，其中含有最多7個胚胎。每次轉移后，在解剖顯微鏡下檢查吸管的內含物以鑒定保留的胚胎。為了避免由于胚胎互換造成的胚月臺的混合(Dr.AndreasZimmer，UniversityofBonn,Germany:MGI18List,theJacksonLaboratory)，每個妊娠載體只接受一種胚胎。為了維持轉移技術的一致性，胚胎轉移按照相同的步驟由同一個人(J-cH)操作。胚胎轉移72小時后，根據以前描述的方法進行一些修改后(Paria等，1993)確定植入率。簡單來說，在安樂死前3分鐘，通過妊娠載體的尾部靜脈注射O.lml芝加哥藍(1%)。在載體被處死后，打開子宮角，對妊娠囊計數。植入率被表示為妊娠囊對總轉移胚胎的百分率。97個野生型和54個PPAR5-/-胚胎被分別轉移到7個和4個妊娠載體中。結果-部分IIPPAR5在植入前胚胎體外發育中的基本功能正如分別用RT-PCR和Western印跡分析所確定的那樣，胚泡期的胚胎表達PPAR5mRNAs和蛋白(圖9a和9b)。PPAR5可以在細胞期及以后的野生型胚胎中檢測到，但是不能在PPAR5-/-胚胎中檢測到(圖9c上圖和下圖)。為了評估PPAR5在胚胎發育中的功能，我們比較了PPAR5+Af和PPARS-A胚胎之間的胚泡孵化。從PPARSWT和裸小鼠(nullmice)制備的雙細胞期胚胎在體外培養96小時。計數完全孵化的胚胎。30%(20/67)的PPARS+Z+胚胎在96小時時已經完全孵化，相比而言只有3%(4/144)的PPARS-A胚胎完全孵化(圖10)。伊洛前列素(O.lpM)在WT中增加了完全孵化的胚胎的數量到50%(37/74)，但是對PPAR5-A胚胎沒有作用(3/144)。L-165041、一種特異性PPARS配體、將完全孵化的胚胎的百分率增加到54%，與此相比在未處理的WT胚胎中是30%。伊洛前列素和L-165041都不影響PPARS-A胚胎的孵化。伊洛前列素和L-165041組合在一起處理將孵化的胚胎增加到52%,這與單獨使用任何一種配體相比沒有明顯的增加。這些結果表明伊洛前列素和L-165041通過PPAR5起作用。然后進行了實驗以確定PPARS在胚胎發育中的功能。來自WT和PPAR5-A小鼠的雙細胞期胚胎在不含PPARS配體的培養基中培養96小時。在48、72和96小時，對胚泡、桑葚胚和較早期胚胎(表示為<桑葚胚)進行計數。在每個時間點，PPAR5-A胚胎明顯比WT胚胎發育緩慢。在96小時時，29%的PPAR5-Z-胚胎仍處于比桑葚胚更早的階段，28%正在孵化或已經孵化，而所有的WT胚胎都已經達到了胚泡期，85%經歷了孵化或己經完全孵化(表I)。值得一提的是，預備實驗顯示出將培養延長到120小時，在兩個組中都沒有改變完全孵化的胚胎的百分率(數據未顯示)。這些數據綜合起來表明PPARS對于體外胚胎發育和孵化是基本的。胚胎的孵化受胚泡細胞的數量的影響(Montag等，2000)，它引起透明帶變薄從而便于孵化。我們假設PPARS-A胚胎受損的孵化是細胞增殖減少的結果。為了驗證這個假設，我們比較了WT和PPAR5-A胚胎的BrdU攝入。BrdU陽性細胞的數量在PPAR5-Z-胚胎中極大地減少了(圖lla)。在PPARS-Z-胚胎中每個胚胎的細胞數量也明顯減少了(圖lib)。PPAR5配體對胚胎孵化的刺激伊洛前列素和L-165041都以類似的程度增加WT胚胎的孵化(圖10)。它們的刺激效應由PPARS缺失所消除(~i)。L-165041以濃度依賴性的方式增加了孵化的胚胎的百分數，ED50值為21nM(圖12a)。PPARoc配體Wyl4,643和PPARy拮抗劑環格列酮都不剌激胚胎的孵化(圖12b)。L-165041當在雙細胞、八細胞或桑葚胚期加入到胚胎中時，有效刺激胚胎的孵化(圖12c)。一旦大部分胚胎達到胚泡期時，在培養基中加入L-165041不再有效刺激孵化(圖12c)。已經提出當胚泡中的細胞達到臨界數時，胚胎的孵化發生(Montag等，2000)。因此，我們確定了L-165041增加胚胎細胞增殖的程度。與未處理的對照相比，L-165041(10(aM)增加了BrdU陽性細胞的百分率(圖12d)。這些結果綜合起來表明外源的PPARS配體例如L-165041和伊洛前列素通過刺激胚胎中的細胞增殖來加速孵化。通過PPARS調節胚胎的植入為了確定PPARS參與植入的程度，將從WT和PPAR5-/-小鼠獲得的雙細胞胚胎培養48小時，計數，然后轉移到妊娠載體的接受子宮中。72小時后計數妊娠囊。從雙細胞期？？八&5-/-胚胎發育的早期和晚期胚泡的數量明顯低于從WT胚胎發育的數量(圖13a)。PPARS-/-胚胎的植入率也明顯低于WT胚胎的植入率(28%對44%，/K0.05)(圖13b)。接下來我們確定了用L-165041預處理雙細胞胚胎對植入率影響的程度。來自WT小鼠的雙細胞胚胎用L-165041處理48小時。28對胚胎計數，然后轉移到妊娠載體中。72小時后評估植入率。盡管L-165041沒有明顯增加胚泡的形成(圖13c)，它極大地增加了植入率(64%對41%，/K0.05)(圖13d)。這些結果表明胚胎的PPARS在植入中發揮了重要作用。外源的PPARS配體促進了植入而不改變胚泡的形成。討論-部分II我們的研究表明胚胎的發育和孵化需要PPARS。來自PPAR-A小鼠的雙細胞胚胎能夠發育成胚泡，但是胚泡形成的速度與WT胚胎相比滯后。PPAR5對于胚泡的孵化是特別重要的。與WT胚胎相比，在培養96小時后，有大量的雙細胞？？八115-/-胚胎不能孵化。值得注意的是，將培養時間延長到120小時也不改變結果，因為大部分的胚泡在此期間變得衰弱。已經提出胚胎的孵化由兩個主要因素介導(1)胚胎中決定性的細胞數量的增加(Montag等，2000)，這導致了透明帶的變薄；以及(2)透明帶被蛋白水解酶消化(Sawada等，1990)。我們的結果表明PPAR5介導了胚胎細胞的增殖，從而增加了胚胎細胞的數量。與WT胚胎相比，？？八115-/-胚胎表現出非常低的BrdU摻入。在培養72小時后，PPAR5-A胚胎的細胞數量僅為WT胚胎的細胞數量的大約30%。PPAR5是一種核受體，其夠與許多內源和合成的配體結合(Forman等，1997)。我們以前的研究表明，胚胎中的COX-2衍生的PGI2可能是一種內源的PPARS配體。配體激活的PPARS與結合反應元件的類視色素X受體(RXR)形成了異源二聚體，并激活基因轉錄(Kliewer等，1994)。已經報道了許多PPAR5介導的基因，這些基因中的兩個，14-3-3e和磷酸肌醇依賴性激酶-l(PDK-I)、參與了保護細胞免于凋亡(Di-Poi等，2002;Liou等，2006)。但是PPARS促進胚胎細胞增殖的機理尚不了解。據報道，在血管平滑肌細胞中過量表達PPAR5，通過增加了周期蛋白A和CDK2以及減少了p57kip2而增加了鋪滿后細胞的增殖(Zhang等，2002)。可能PPARS介導的14-3-3的上調參與了細胞的增殖，因為14-3-3蛋白被認為是大量蛋白、包括信號傳導分子和受體的支架(Fu等，2000;Tzivion和Avruch，2002)。解決這種可能性的工作正在進行中。在通過14-3-3e(Liou等，2006)禾口PDK-I(Di-Poi等，2002)保護胚胎細胞免于凋亡中，PPARS可倉g也發揮了重要的作用。已經報道，培養的胚泡的內細胞團(ICM)易受氧化凋亡的傷害(Brison禾QSchultz，1997;Schratt等，2004)。PGI2激活的PPARS可能通過上調14-3-3e從而保護了ICM免于凋亡，所述14-3-3e螯合了通過PDK-l和Akt途徑磷酸化的Bad(Datta等1997;Zha等，1996)。PPARS的抗凋亡功能可能對胚泡中細胞數量的增加和孵化的增加有貢獻。已經報道子宮中COX-2衍生的PGI2參與了胚胎的植入，并且PPARS被顯示可能與PGl2的作用有關(Lim等，1999)。胚胎PPARS在植入中的作用還沒有被報道。本研究的結果為胚胎PPAR5在植入中的決定性的作用提供了直接的證據。為了模擬IVF過程，我們在體外將WT和？？八115-/-雙細胞胚胎培養了48小時。對處于不同發育階段的胚胎進行計數，并轉移到接受妊娠的載體中。72小時后計數子宮中的妊娠囊。來自PPAR5-Z-胚胎的妊娠囊的數量明顯少于來自WT胚胎的妊娠囊數量。PPAR5-Z-胚胎的植入的減少與PPAR5-Z-胚胎延遲的胚胎發育和胚泡的形成有關。這些結果著重說明了PPARS介導的增加的細胞增殖在促進植入前胚胎的生長、成熟(孵化)和植入中的重要性。我們的研究的主要目標是改進IVF。我們以前已經報道了一種穩定的PGI2的類似物伊洛前列素增加胚胎的植入和活產的能力(Huang等，2004b)。在本研究中，我們證實了以前的數據，并對外源伊洛前列素增加胚胎的孵化和植入的機制進行了闡明。我們的結果顯示，在植入前胚胎中PPAR5是PGl2的靶。在PPAR5-Z-胚胎中伊洛前列素對胚泡孵化的增加被完全消除了。合成的PPAR5配體L-165041發揮與伊洛前列素類似的效應，但是將伊洛前列素與L-165041組合沒有附加的效果。這些結果進一步表明在培養的胚胎中內源的PGl2的生產是有限的，并且外源的PGl2類似物或合成的PPARS配體可以進一步活化PPAR5。合成的配體或PGl2類似物(伊洛前列素)對PPARS的激活進一步促進了細胞增殖，產生較高的孵化比率。值得注意的是L-165041的效應不限于雙細胞期的胚胎。L-165041即使是在桑葚胚期的胚胎中也對增加胚胎孵化相當有效。但是，L-165041對于胚泡期的胚胎不顯示出效果。上面提到的結果可能是因為某些胚泡發育更完善從而易于孵化。這種觀察對于選擇在培養基中添加伊洛前列素或PPARS配體的時機具有實踐上的重要性。自然，在人類IVF中施用PPARS配體需要對其安全性狀況進行全面的研究。L-165041顯示出通過不依賴于它對胚泡形成的影響的機制增加胚胎的植入，因為在胚胎轉移時，對照和實驗胚胎的發育階段是類似的，而被轉移的實驗胚胎仍產生了更多妊娠囊。延遲作用的分子基礎尚不清楚。我們推測，L-165041通過PPARS誘導了持續性的信號傳導活化以增加植入。在子宮和胚胎的PPAR5的轉錄信號傳導之間可能存在互相干擾。胚胎發育和子宮內膜蛻膜化之間的協調確保了成功的植入。分子機制的闡明將對我們對胚胎植入和提高IVF的成功的能力的理解具有重大的影響。總的來說，植入前胚胎表達PPAR5，它在胚胎的發育、胚泡的形成、胚胎的孵化和植入中發揮重要的作用。胚胎PPAR5的激活是改進IVF結果的一種新型治療策略。31表I在96小時的培養過程中PPARS+Z+和PPAR5-A胚胎的發育階段<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>括號中的數字表示百分率。§<桑葚胚期是指雙細胞、四細胞和8細胞期胚胎。孵化中是指正在孵化的胚泡。已孵化是指完全孵化的胚泡。*表示相對于PPAR5-Z-胚胎；0.05，**表示/<0.01。參考文獻Adderley，S.R.，andFitzgerald,D.J.(1999)Oxidativedamageofcardiomyocytesislimitedbyextracellularregulatedkinases1/2-mediatedinductionofcyclooxygenase-2(心肌細胞的氧化損傷受到細胞外調控的激酶1/2-介導的環加氧酶-2的誘導的限制)JWo/C/zem.274,5038-46.Barak，Y.，Liao,D.,He,W.,Ong，E.S"Nelson,M.C.,Olefsky,J旦，Boland,R.andEvans,R.M.(2002)Effectsofperoxisomeproliferator-activatedreceptordeltaonplacentation,adiposity,andcolorectalcancer.(過氧化物酶體增殖物激活的受體S對胎盤形成、肥胖癥和結腸直腸癌的影響)/VocAAa"^cad&fC/&4，99,303-308.Berger,J.andMoller，D.E.(2002)ThemechanismsofactionofPPARs.(PPARs的作用機制)^畫ievMec/，53，409-435.Braissant,0.andWahli,W.(1998)DifferentialExpressionofPeroxisomeProliferator-ActivatedReceptor-{alpha},-{beta},and-{gamma}duringRatEmbryonicDevelopment.(大鼠胚月臺發育過禾呈中過氧化物酶體增殖物激活的受體-(oc、-p和-Y的差異表達)E油cnWogy,139，2748-2754.Brison，D.R.，andSchultz，R.M.(1997)Apoptosisduringmouseblastocystformation:evidenceforaroleforsurvivalfactorsincludingtransforminggrowthfactoralpha.(小鼠胚泡形成過程中的凋亡存活因子包括轉化生長因子oc的功能的證據)Ao/i印roA56，1088-96.Cheng,Y.,Austin,S.C，Rocca,B.，Koller，B.H.,Coffman，T.M.,Grosser,T.，Lawson,J.A.，andFitzGerald,G.A.(2002)RoleofprostacyclininthecardiovascularresponsetothromboxaneA2.(前列環素在心血管對凝血烷A2的反應中的作用)&/e"ce.296，539-41.Cutler，N.S.，Graves-Deal,R.，LaFleur,B丄，Gao，Z.，Boman，B.M.,Whitehead,R.H.,Terry，E.,Morrow,J.D.andGoffey，RJ.(2003)Stromalproductionofprostacyclinconfersanantiapoptoticeffecttocolonicepithelialcells.(前列環素的基質生產造成了對結腸上皮細胞的抗凋亡效應)OmceriM，63，1748-1751.Datta,S.R.，Dudek,H.，Tao,X.,Masters,S.，Fu,H.,Gotoh,Y.，andGreenberg，M.E.(1997)AktphosphorylationofBADcouplessurvivalsignalstothecell-intrinsicdeathmachinery.(BAD的Akt磷酸化將生存信號與細胞內在的死亡機制相偶聯)Ce〃.，91,231-41.Di-Poi，N.，Tan，N.S.,Michalik，L.,Wahli，W.，andDesvergne,B.(2002)AntiapoptoticroleofPPARbetainkeratinocytesviatranscriptionalcontroloftheAktlsignalingpathway.(角質細胞中PPAR卩的抗凋亡功能是通過對Aktl信號傳導途徑的轉錄控制來進行的)Mo/Ce//.10,721-33.Ding,N.Z.,Teng，C.B.,Ma,H.,Ni,H.，Ma，X.H.,Xu，L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的技術人員可以使用本文的描述，最大程度地利用本發明。上述的實施方案應該被視為說明性的，而不是以無論任何方式對本公開的范圍進行限制。盡管已經顯示并描述了本發明的優選實施方案，本領域的技術人員可以對其作出修改而不背離本發明的精神和教導。本文描述的實施方案僅僅是示例性的，并不是限制性的。本文公開的發明的許多變化和修改是可能的，也屬于本發明的范圍之內。所有本文中引用的專利、專利申請和出版物的公開內容，在它們為本文提出的材料提供程序上的或其它詳細的補充材料的程度上，在此引為參考。權利要求1.在植入前哺乳動物胚胎中激活過氧化物酶體增殖物激活物受體δ(PPARδ)的體外方法，包括在胚胎培養基中培養胚胎，以及在胚胎細胞中PPARδ的表達開始發生時或發生后，通過將PPARδ配體與表達的PPARδ結合來激活PPARδ，從而在培養的胚胎細胞中阻止凋亡和/或促進培養的胚胎細胞的增殖。2.權利要求1中的方法，其中PPAR5配體與所述PPARS的結合增加了胚胎的孵化。3.權利要求2中的方法，還包括以有效促進胚胎的完全孵化的量在培養基中添加前列腺素或其類似物。4.權利要求l中的方法，其中所述配體包括至少一種除了前列腺素或其類似物之外的天然的或合成的配體。5.權利要求1中的方法，其中所述配體在所述胚胎發育的桑葚胚期或之后加入到所述培養基中。6.權利要求l中的方法，其中所述配體包括L165，041。7.權利要求l中的方法，其中所述配體包括GW501516。8.權利要求l中的方法，其中所述方法產生了具有增加的體內植入能力的胚胎。9.權利要求l中的方法，其中所述方法產生了具有增加的建立可存活的妊娠的能力的胚胎。10.增加體外受精的哺乳動物胚胎的活產能力的方法，包括進行權利要求l-9任一項的方法以獲得PPAR5配體處理的體外培養的胚胎；將所述PPARS配體處理的胚胎導入哺乳動物的子宮中；以及允許導入的胚胎植入到所述子宮中，其中胚胎孵化和植入到宿主的子宮中的能力與沒有在存在所述合成的PPAR5配體的情況下培養的胚胎的這些能力相比增強了。11.權利要求10中的方法，其中所述導入的步驟包括將胚泡期或較早期的PPARS配體處理的胚胎轉移到子宮中。12.用于哺乳動物胚胎的體外發育的改進的胚胎培養基，其中的改進包括培養基中過氧化物酶體增殖物激活物受體5(PPAR5)配體的量有效地增加胚胎細胞的增殖，其中所述配體是除了前列腺素及其類似物之外的配體。13.權利要求12中的培養基，其中所述PPAR5配體的量有效促進在培養基中培養的胚胎的完全孵化。14.權利要求12中的培養基，還含有有效促進在培養基中培養的胚胎的完全孵化的量的前列腺素或其類似物。15.權利要求6或7中限定的在表達PPAR5的體外培養的胚胎細胞中與PPAR5結合的PPAR5配體在制備用于激活PPARS以阻止胚胎細胞中的凋亡和或加強胚胎細胞的增殖來增強體外受精的哺乳動物胚胎在引入哺乳動物的子宮后的活產能力的藥物中的應用。全文摘要本申請公開了用于增強植入前哺乳動物胚胎的發育以及增強體外受精的哺乳動物胚胎的活產潛能的方法和組合物。在植入前哺乳動物胚胎中激活過氧化物酶體增殖物激活物受體δ(PPARδ)的體外方法包括將胚胎培養在胚胎培養基中，胚胎細胞中的PPARδ的表達一旦開始或開始后，通過向所述培養基中加入有效結合PPARδ的量的PPARδ配體來激活PPARδ，以阻止培養的胚胎的細胞中的凋亡和或加強培養的胚胎的細胞的增殖。文檔編號C12N5/00GK101495618SQ200680045801公開日2009年7月29日申請日期2006年10月12日優先權日2005年10月12日發明者珍妮弗·戈爾茲比,肯尼斯·K·吳,艾爾弗雷德·W-S·溫,黃鄒琛申請人:德克薩斯系統大學董事會