專利名稱：靶向載體-磷脂綴合物的制作方法
相關申請本申請要求2006年7月25日申請的美國臨時申請號60/833,342和2005年12月9日申請的美國臨時申請號60/749,240的優先權和權益，所述每個臨時申請的內容都通過引用結合到本文中。
發明領域
本發明涉及靶向載體-磷脂綴合物(targeting vector-phospholipid conjugate)，尤其是靶向肽-磷脂綴合物，其可用于治療性和診斷性組合物；以及制備它們的方法。本發明包括靶向超聲造影劑，尤其是包含此靶向載體-磷脂綴合物的靶向微泡。
背景技術：
血管生成，即新血管的形成，不僅在胚胎發育以及正常組織生長和修復過程中發生，而且涉及雌性生殖周期、懷孕的建立和維持以及傷口和骨折的恢復。除了發生在正常個體中的血管生成之外，血管生成事件涉及許多病理過程，尤其是腫瘤生長和轉移，以及其中血管增殖增加的其它病癥，例如糖尿病性視網膜病、銀屑病和關節病。另外，血管生成對于將腫瘤由增生轉變為腫瘤生長很重要。因此，抑制血管生成已成為活躍的癌癥治療研究領域。
一般認為，腫瘤誘導的血管生成取決于腫瘤細胞產生促血管生成生長因子，該生長因子戰勝了趨向于保持現有血管靜止和穩定的其它力量。這些促血管生成物質或生長因子中最佳表征的是血管內皮生長因子(VEGF)(Cohen等，FASEB J.，139-22(1999))。VEGF由多種細胞類型響應于低氧和某些其它刺激天然產生。許多腫瘤也產生大量的VEGF，和/或誘導鄰近的基質細胞產生VEGF(Fukumura等，Cell，94715-725(1998))。VEGF也稱為VEGF-A，其作為121、145、165、189和206個氨基酸的5種不同剪接異構體(splice isoform)合成。VEGF121和VEGF165是產生的主要形式，尤其是在腫瘤中(參見Cohen等，1999，出處同上)。與VEGF165不同，VEGF121沒有由VEGF基因的外顯子6和7編碼的基礎結構域，且不結合發夾或胞外基質。在本段落中提及的每個參考文獻都整體在此引入作為參考。
VEGF家族成員主要通過結合受體酪氨酸激酶起作用。一般而言，受體酪氨酸激酶為糖蛋白，具有能夠結合一種或多種特異性生長因子的胞外結構域、跨膜結構域(通常為α螺旋)、近膜結構域(其中受體可通過例如磷酸化進行調節)、酪氨酸激酶結構域(受體的催化組分)以及在許多受體中涉及酪氨酸激酶底物的識別和結合的羧基末端尾。已知有3個結合VEGF的內皮細胞特異性受體酪氨酸激酶VEGFR-1(FIt-1)、VEGFR-2(KDR或FIk-1)和VEGFR-3(Flt4)。FIt-1和KDR(也稱為VEGFR-2或FIk-1，在本文可互換使用)已被鑒定為主要的高親和力VEGF受體。盡管FIt-1對VEGF具有較高親和力，但KDR表現出更豐富的內皮細胞表達(Bikfalvi等，J.Cell.Physiol.，14950-59(1991))。而且，一般認為KDR支配血管生成反應，并因此引起人們極大的治療和診斷興趣(參見Cohen等，1999，出處同上)。KDR表達在血管生成性血管中被高度上調，尤其是在誘導強血管生成反應的腫瘤中(Veikkola等，Cancer Res.，60203-212(2000))。在純合KDR敲除小鼠胚胎中完全沒有血管發育凸顯了KDR在血管生成中的關鍵性作用(Folkman等，Cancer Medicine，第5版(B.C.Decker Inc.；Ontario，Canada，2000)，第132-152頁)。
KDR(激酶結構域區)的成熟形式由1336個氨基酸組成。KDR的糖基化形式可在SDS-PAGE凝膠上遷移，其表觀分子量約為205kDa。KDR在其胞外結構域中含有7個免疫球蛋白樣結構域，其中前3個在VEGF結合中最重要(Cohen等，1999，出處同上)。VEGF自身為能夠同時結合2個KDR分子的同二聚體。結果為2個KDR分子在結合和自身磷酸化時被二聚化，變得活性增加很多。增加的激酶活性又啟動了介導VEGF的KDR特異性生物作用的信號轉導途徑。
因此，不僅是KDR的VEGF結合活性在體內對血管生成很關鍵，而且檢測內皮細胞上的KDR上調的能力或檢測VEGF/KDR結合復合物的能力對檢測或監測血管生成應當極為有益。
眾所周知，含氣超聲造影劑(gas filled ultrasoundcontrast agent)是用于回波描記術的特別有效的超聲反射體。這些超聲造影劑包括例如含氣微囊泡，例如含氣微泡和含氣微球。含氣微泡是特別優選的超聲造影劑。(在本文公開內容中，術語“微泡”具體地指由磷脂圍繞或穩定的氣泡)。例如，將載液中的含空氣或含氣微泡的混懸液注射到活體的血流中將大大地增強超聲回聲成像，因此有助于顯現內部解剖學結構。血管和內臟的成像可對醫學診斷(例如用于檢測腫瘤、心血管疾病和其它疾病)起到很大的幫助作用。
對于診斷和治療目的，將對期望靶表現出高親和力的靶向載體組合物(例如KDR或VEGF/KDR復合物)摻入含氣超聲造影劑中應當特別有益。例如，靶向載體-磷脂綴合物，尤其是靶向肽-磷脂綴合物，可用于制備靶向含氣超聲造影劑。另外，獲得用于大規模生產高度純化形式的這種靶向載體-磷脂綴合物的方法應特別有益。這些組合物和方法應使得可以生產出用于診斷或治療應用的組合物，例如將報告部分、抗腫瘤劑或血管生成抑制劑精確靶向靶點。
發明概述
本發明提供靶向載體-磷脂綴合物，尤其是靶向肽-磷脂綴合物，其可用于制備含氣超聲造影劑。在一個優選的實施方案中，靶向肽-磷脂綴合物包括表現出高KDR結合親和力的靶向肽，因此成為用于血管生成過程成像的造影劑的有用組分。
本發明還提供單體和二聚體肽磷脂綴合物(在本文也稱為脂肽)，其可用于制備含氣超聲造影劑，尤其可用于制備靶向KDR并可以用于血管生成過程成像的超聲造影劑。
本發明還提供用于大規模生產高度純化的單體和二聚體肽磷脂綴合物、尤其是具有高KDR結合親和力的單體和二聚體肽磷脂綴合物的方法和工藝。
本發明還提供用于大規模生產高度純化的、具有三氟乙酸(TFA)水平最低的二聚體肽磷脂綴合物的方法和工藝。
本發明還提供用于合成高純度的單體肽的方法以及由多個肽亞單位構建肽磷脂綴合物的方法。
本發明還提供以高親和力結合KDR或VEGF/KDR復合物的單體肽，以及合成和使用這些單體肽的方法。
本發明還提供由這些靶向載體-磷脂綴合物制備的靶向超聲造影劑。這些靶向超聲造影劑可用于使攜帶靶的組織成像。在一個優選的實施方案中，靶向超聲造影劑是靶向微泡，靶向載體-磷脂綴合物包括表現出高KDR結合親和力的靶向肽，因此成為用于使攜帶KDR的組織成像、尤其是用于腫瘤成像和血管生成過程成像的造影劑的有用組分。還提供制備和使用這些靶向超聲造影劑的方法。
附圖簡述
圖1圖示了一種用于由線性肽單體(2)生產單體肽磷脂綴合物(1)的方法。
圖2圖示了單體肽磷脂綴合物(1)，包括對KDR具有高結合親和力的肽。
圖3圖示了一種用于由肽單體生產前體二聚體肽(16)的方法。
圖4圖示了一種用于將圖1所示的前體二聚體肽與DSPE-PEG2000-NH2綴合以形成含有以高親和力結合KDR的肽的二聚體肽磷脂綴合物(11)的方法。
圖5圖示了二聚體肽-磷脂綴合物(11)，含有以高親和力結合KDR的肽。
圖6圖示了一種用于生產具有TFA水平最低的二聚體肽-磷脂綴合物(例如(21))的方法。
圖7圖示了另一種用于生產具有TFA水平最低的二聚體肽-磷脂綴合物(例如(21))的方法。
圖8圖示了另一種用于生產具有TFA水平最低的二聚體肽-磷脂綴合物的方法。
圖9圖示了另一種對KDR具有高結合親和力的代表性單體肽(32)。
圖10圖示了另一種包含示于圖9的單體肽的單體肽-磷脂綴合物(31)。
圖11A-C顯示了通過在造影劑中使用二聚體肽-磷脂綴合物(11)(示于圖52)在下列情況下所獲得的圖像1)基線(圖11A)；2)在25分鐘后(圖11B)；和3)在扣除基線和游離循環氣泡之后(圖11C)。
圖12A-C顯示了通過在造影劑中使用單體磷脂肽綴合物(1)(示于圖2)在下列情況下所獲得的圖像基線(圖12A)、在25分鐘后(圖12B)以及在扣除基線和游離循環氣泡之后(圖12C)。
發明詳述
申請人出乎意料地發現了可用于生產靶向超聲造影劑并具有優越的KDR結合效力的肽磷脂綴合物。這些化合物中有兩種為含有以高親和力結合KDR的線性肽單體的單體肽磷脂綴合物，而另一種為含有兩個不同的單體亞單位的二聚體肽磷脂綴合物，每個單體均結合KDR。另外，業已發現了用于大規模生產這些綴合物和前體物質的純化形式的高效方法。這些方法包括生產具有TFA水平最低的二聚體肽磷脂綴合物。
所述磷脂可選自磷脂酰乙醇胺和修飾磷脂酰乙醇胺。特別優選的磷脂包括通過將親水聚合物與其連接而修飾的磷脂酰乙醇胺。經修飾的磷脂酰乙醇胺的實例為用聚乙二醇(PEG)修飾的磷脂酰乙醇胺(PE)，簡稱為“PE-PEG”，即磷脂酰乙醇胺中的親水乙醇胺部分連接可變分子量(例如從300道爾頓到5000道爾頓)的PEG分子，例如DPPE-PEG、DSPE-PEG、DMPE-PEG或DAPE-PEG。優選DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3400、DPPE-PEG2000和DPPE-PEG3400，特別優選DSPE-PEG2000。值得注意的是，可以使用磷脂的鹽形式，例如三甲基銨鹽、四甲基銨鹽、三乙基銨鹽、鈉鹽等。
這些化合物可摻入到含氣超聲造影劑中，例如含氣微泡，以形成提供極佳的含靶組織成像的造影劑。在一個優選的實施方案中，將含有以高親和力結合KDR的靶向肽的靶向載體-磷脂綴合物摻入靶向微泡中。如本文所述，這些靶向微泡選擇性定位于具有KDR的組織，允許這些組織成像，尤其允許腫瘤成像和血管生成過程成像，包括允許那些與腫瘤發展相關的過程成像。
單體綴合物 一般描述
表1提供了對圖1、2、9和10中顯示的識別標記的描述。
表1
如圖1和圖2所示，單體肽磷脂綴合物(1)N-乙酰-L-精氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-色氨酰-L-天冬氨酰-L-異亮氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-組氨酰-L-丙氨酰-L1-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-{N6-[1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基羰基氧基-(PEG2000)-氨基戊二酰]}-L-賴氨酰胺，是一種磷脂綴合物。該綴合物也稱為Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.1)和Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2。它含有29個氨基酸的線性肽單體(2)N-乙酰-L-精氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-色氨酰-L-天冬氨酰-L-異亮氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L1-精氨酰-L-組氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰胺，也稱為Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.2)和Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。此新的肽單體以高親和力結合KDR。應當理解的是，單體肽磷脂綴合物(1)和線性肽單體(2)的類似物和衍生物也包括在本發明范圍之內。
圖10提供了另一單體肽磷脂綴合物(31)N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-異亮氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-組氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-{N6-[1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇氨基羰基氧基-(PEG2000)-氨基戊二酰]}-L-賴氨酸-酰胺即磷脂綴合物的結構。該綴合物也稱為Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.4)和Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2。如圖9所示，該綴合物含有28個氨基酸的線性肽單體(32)N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-異亮氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-組氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰胺，也稱為Ac-AQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ IDNO.5)和Ac-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。如同時待審的申請—2003年9月11日申請的美國申請號10/661,156中所述，該肽單體以高親和力結合KDR。應當理解的是，單體肽磷脂綴合物和線性肽單體的類似物和衍生物也包括在本發明范圍之內。
如本發明實施例所述，用單體肽磷脂綴合物(1)和(31)配制的超聲造影劑，例如含氣微泡，表現出高KDR結合，該結合使用兔VX2腫瘤的回聲檢查得以證實。
理論上，為利于單體肽磷脂綴合物(1)或(31)的生產，應大量制備線性肽單體(2)或(32)。然后，經接頭戊二酸二琥珀酰亞胺酯(DSG)綴合純化的線性肽單體(2)或(32)與磷脂(例如鹽形式的PEG化磷脂，例如DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(4))可用于提供單體肽磷脂綴合物(1)或(32)。
制備單體肽-磷脂綴合物的方法
在制備單體肽磷脂綴合物(1)和(31)時，本發明的方法至少提供以下優勢肽合成收率提高；外消旋程度降低；避免了先前在合成過程中觀察到的哌啶酰胺形成；有效純化肽單體(2)和(32)；開發以較大規模綴合肽單體(2)和(32)的程序；以及開發應使得可以容易地將單體肽磷脂綴合物(1)和(31)與原料DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(4)分離開來的純化方案。
可如下所述制備單體肽磷脂綴合物。應當認識到，在單體肽磷脂綴合物合成的此示例性描述中提到的數值為示例性的。
線性肽單體可通過SPPS制備。線性肽單體的序列可在Pal-Peg-PS-樹脂上作為C-末端甲酰胺構建(取代水平0.2mmol/g)。肽合成可在
肽合成儀上使用Fmoc化學完成。先前對此方法觀察到的問題一直是外消旋、不完全偶聯和哌啶酰胺形成，其中每個問題都導致未達到最優得率和純度。哌啶酰胺形成的急劇下降可通過使用含HOBt(0.1M)的25％哌啶的DMF溶液作為用于脫去Fmoc的試劑來實現。可使用DIC/HOBt作為大部分偶聯的活化劑、3小時偶聯時間、使用4倍過量的預活化Fmoc-氨基酸、用無水DMF(6次)間插洗滌顯著降低外消旋。Nα-Fmoc氨基酸可恰好在其偶聯轉變之前被溶解，用DIC/HOBt的DMF溶液預活化4分鐘，并轉移至反應容器。這可以在Sonata設備上如下實現將固體Fmoc-氨基酸加到該設備的氨基酸容器中，然后給該設備設定好程序，以在該溶液鼓泡的同時序貫加入DMF、HOBt/DMF和DIC/DMF。
為優化得率，可解決在較長肽的合成過程中樹脂的聚集問題，該問題即便在使用最佳偶聯試劑時也可為破壞性的。為減少肽組裝過程中的聚集，可使用的策略是采用假脯氨酸二肽摻入X-Thr或X-Ser作為二肽代替X和Thr或X和Ser的序貫偶聯。對于線性肽單體，Leu11-Ser12和Leu22-Ser23的序貫偶聯可被假脯氨酸二肽Fmoc-Leu-Ser(ψMe，Mepro)-OH的單次偶聯替代。其它優化可通過使用Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH代替Fmoc-Gly-OH的順序偶聯而減少偶聯次數來實現。-Gly-Gly-OH區段的活化可導致活化的酸性官能團和遠端的酰胺官能團環化，得到無活性的二酮哌嗪；這可以時間依賴性方式減少偶聯得率。該問題可通過向反應容器中加入Fmoc-Glyn-OH(n＝2、3)并順序加入HOBt和DIC予以避免；活化的Fmoc-Glyn-OH可被樹脂結合的氨基截獲，然后發生變為二酮哌嗪的明顯環化。采用這些改進，線性肽單體的合成可在Sonata肽合成儀上以10mmol的合成規模完成。
在鏈延伸后，可從N-末端脫去Fmoc。肽和游離氨基均可被乙酰化。然后，可從樹脂上切下肽序列，并使用“試劑B”(TFA:水:苯酚:三異丙基硅烷，88:5:5:2，體積/體積/重量/體積)脫保護4小時。在切割反應后，可通過蒸發揮發物、用乙醚研磨殘余物并使用同樣的溶劑洗滌由此獲得的固體來分離粗肽。在另一個變化中，可按下述步驟使該肽從反應混合物中沉淀出來向反應混合物中加入乙醚，收集由此形成的固體，再用同樣的溶劑洗滌。
可如下所述純化線性肽單體。再者，數值是代表性的。粗線性肽單體(0.5g)可溶解在CH3CN(40mL/g)中，可用水將該溶液稀釋至終體積為100mL，然后過濾溶液。可將濾過的溶液加到用10％CH3CN的水溶液(0.1％TFA)平衡的制備型HPLC柱(Waters，
Prep MS C18，10μ，
50×250mm)上。在上樣后，接著可在1分鐘內將洗脫液的組成階次升至20％CH3CN-水(0.1％ TFA)，可以0.6％/分鐘CH3CN(0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的速度啟動線性梯度，并跑柱50分鐘。可在分析型反相C18柱(Waters XTerra MS-C18，10μ，
4.6×50mm)上檢查洗脫流分的純度，可合并和凍干含產物流分(純度>95％)。對于每0.5g粗肽的純化，都始終可以分離出0.12g(24％)線性肽單體，并得到同樣得率和純度的肽。
可如下所述實施單體肽磷脂綴合物的合成。數值基準仍是示例性的。合成的最后一步可為磷脂(例如PEG化磷脂，例如DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽)與線性肽單體的綴合。DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(4)的PEG2000部分名義上由45個乙二醇單元組成。然而，應當理解的是，該物質為含PEG物質的分布，其質量中心為含有45個乙烯氧基單元的名義化合物。線性肽單體與DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽的綴合可如下完成制備線性肽單體的戊二酸單酰胺單NHS酯，并使其與磷脂銨鹽的游離氨基反應。因此，線性肽單體可在DIEA(5當量)存在下與DSG(4當量)的DMF溶液反應30分鐘。反應混合物可用乙酸乙酯稀釋，這可導致肽戊二酸單酰胺單NHS酯沉淀。可傾析出含有未反應的DSG的上清液，并用乙酸乙酯洗滌中間體肽單NHS酯幾次，以除去痕量DSG。質譜數據證實形成的肽單NHS酯為純凈產物。固體單NHS酯可溶解在DMF中，并在DIEA(4當量)存在下與DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(0.9當量)反應24小時。可過量使用線性肽單體戊二酸單酰胺單NHS酯，以使磷脂銨鹽的消耗最大化，因為游離的磷脂銨鹽可使高純度形式的單體肽磷脂綴合物的分離復雜化。
反應混合物可用水(0.1％ TFA)和CH3CN-CH3OH(1:1，體積/體積)(0.1％ TFA)的1:1混合物(約100mL)稀釋，再加到反相C2柱(
Prep C2，10μ，
50×250mm，流速100mL/分鐘)上，該柱可用水(0.1％ TFA)和CH3CN-CH3OH(1:1，體積/體積)(0.1％TFA)的3:1混合物洗脫，以除去親水雜質。然后，產物可使用CH3CN-CH3OH(1:1)(0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的梯度洗脫(細節參見實驗部分)。可使用ELS檢測器，通過反相HPLC對所收集的流分進行分析，ELS檢測器允許檢測需要的產物以及經常難以分離的DSPE-PEG2000-NH2磷脂，其UV吸光度非常小。這表明單體肽磷脂綴合物和DSPE-PEG2000-NH2磷脂完全分離。可收集含有純產物的流分，在旋轉蒸發器上濃縮(以減少甲醇含量)，凍干，得到單體肽磷脂綴合物(無色固體)。為了制備所需量的單體肽磷脂綴合物，可使用0.5g至1.0g的線性肽單體實施幾個輪次。在所有情況下，靶單體肽磷脂綴合物都可以以高得率和純度(例如得率57-60％和純度>99％)分離出來。
二聚體綴合物 一般描述
表2提供了示于圖3、4和5的識別標記的描述。
表2
如附圖所示，二聚體肽磷脂綴合物(11)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-蘇氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-蘇氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰[乙酰-L-纈氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-絲氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-纈氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰(二硬脂酰磷酸乙醇氨基羰基氧基-PEG2000-氨基-8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-戊二酰-L-賴氨酰)酰胺環(2-12)二硫化物]-酰胺環(6-13)二硫化物，由2個結合KDR的單體肽鏈組成21個氨基酸的環狀二硫化物肽單體(13)乙酰-L-纈氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-絲氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-纈氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰(8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基)酰胺環(2-12)二硫化物，以及22個氨基酸的環狀二硫化物肽單體(12)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-蘇氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-蘇氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰胺環狀6-13二硫化物，這兩條肽鏈通過戊二酰接頭束縛在一起。應當理解的是，二聚體肽磷脂綴合物(11)和環狀二硫化物肽單體(12)和(13)的類似物和衍生物也包括在本發明范圍之內。
用二聚體肽磷脂綴合物(11)配制的超聲造影劑(例如含氣微泡)表現出高KDR結合，該結合使用兔VX2腫瘤的回聲檢查得以證實。
制備二聚體-磷脂綴合物的方法
為實現二聚體肽磷脂綴合物(11)的合成，用于此目的的單體最好應當大量制備。然后，可使用戊二酸二琥珀酰亞胺酯作為接頭將單體彼此束縛在一起，以形成前體二聚體肽(16)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-蘇氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-蘇氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰[乙酰-L-纈氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-絲氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-纈氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰(8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-戊二酰-L-賴氨酰)酰胺環(2-12)二硫化物]-酰胺環(6-13)二硫化物。然后，可又經戊二酸二琥珀酰亞胺酯綴合純化的前體二聚體肽(16)和DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(18)，以便提供目標二聚體肽磷脂綴合物(11)。
在制備二聚體肽磷脂綴合物(11)時，本發明的方法至少提供以下優勢肽序列自動化鏈延伸的得率增加；在合成過程中遇到的外消旋程度降低；避免了先前在肽單體(13)合成過程中觀察到的哌啶酰胺形成；使用可經受多克級但仍允許有效和實用的樣品操作的程序環化(12)和(13)的線性含二半胱氨酸肽前體；有效純化單體肽(12)和(13)；前體二聚體肽(16)的得率和純度最大化；開發較大規模綴合前體二聚體肽(16)的程序；以及開發應使得可以容易地將目標二聚體肽磷脂綴合物(11)與磷脂銨鹽(18)分離開來的純化方案。
可通過自動化合成肽單體(12)Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2環(6-13)二硫化物和(13)Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2環(2-12)二硫化物，來制備二聚體肽磷脂綴合物(11)，它們使用戊二酸二琥珀酰亞胺酯(DSG)有效偶聯，得到ivDde保護的二聚體，其脫保護和后續與DSPE-PEG2000-NH2偶聯也經由戊二酰連接。采用本發明的程序，單體肽可以10mmol規模合成，不復雜，在HPLC純化后可以得率約20％的和純度>95％獲得。此方法允許二聚體形成反應和隨后與磷脂組分的綴合，提供了以克級實施的二聚體肽磷脂綴合物(11)形成。前體二聚體肽(16)可以常規得率約32％和純度>95％得自單體肽。二聚體肽磷脂綴合物(11)可以得率57-60％和純度>99％由前體二聚體肽(16)生產。
可如下所述制備二聚體肽磷脂綴合物。應當認識到，在二聚體肽磷脂綴合物合成的此代表性描述中提及的數值是代表性的。
下面描述的是用于肽單體(12)Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2環(6-13)二硫化物和肽單體(13)Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2環(2-12)二硫化物的固相合成和二硫化物環化的代表性方法。
所述肽可在Pal-Peg-PS-樹脂上作為其C-末端甲酰胺構建(取代水平0.2mmol/g)。可在
肽合成儀上，使用Fmoc化學并采用優化的脫保護和偶聯方案，以10mmol合成規模完成鏈延伸。通過研究肽雜質和方案中特定元素的變化對所獲得的肽總體得率和純度的影響，可開發出利用自動化SPSS來優化合成肽。
從非優化合成單體肽獲得的雜質分析表明，主要問題是外消旋、不完全偶聯和哌啶酰胺形成(假定經由中間體天冬氨酰亞胺或戊二酰亞胺中間體)，其中每個問題都導致未達到最優得率和純度。哌啶酰胺形成的急劇下降可通過使用含HOBt(0.1M)的25％哌啶的DMF溶液作為用于脫去Fmoc的試劑來實現。可使用DIC/HOBt作為大部分偶聯的活化劑、3小時偶聯時間、使用4倍過量的預活化Fmoc-氨基酸、用無水DMF(6次)間插洗滌顯著降低外消旋。Nα-Fmoc氨基酸可恰好在其偶聯轉變之前被溶解，用DIC/HOBt的DMF溶液預活化4分鐘，并轉移至反應容器。這可以在Sonata設備上如下實現將固體Fmoc-氨基酸加到該設備的氨基酸容器中，然后給該設備設定好程序，以序貫加入DMF、HOBt/DMF和DIC/DMF，并在每次加入后使溶液鼓泡。
為優化得率，可解決在較長肽的合成過程中樹脂的聚集問題，該問題即便在使用最佳偶聯試劑時也可能是破壞性的。為減少肽組裝過程中的聚集，可使用的策略是采用假脯氨酸二肽摻入X-Thr或X-Ser(X是指序列的n-1個氨基酸)作為二肽代替X和Thr或X和Ser的序貫偶聯。因此，對于單體(12)Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2環(6-13)二硫化物，適當保護的Thr和Gly(如上粗體字所示)的序貫偶聯可被假脯氨酸二肽Fmoc-Gly-Thr(ψMe.Mepro)-OH的單次偶聯替代。類似地，在單體(13)Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2環(2-12)二硫化物的合成中，假脯氨酸二肽Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψMe，Mepro)-OH可用于替代適當保護的Ser和Asp(如上粗體字所示)的序貫偶聯。進一步優化可通過使用Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH代替Fmoc-Gly-OH的順序偶聯而減少偶聯次數來實現。-Gly-Gly-OH區段的活化可導致活化的酸性官能團和遠端的酰胺官能團環化，得到無活性的二酮哌嗪；這可以時間依賴性方式減少偶聯得率。該問題可通過向反應容器中加入Fmoc-Glyn-OH(n＝2、3)并順序加入HOBt和DIC予以避免；活化的Fmoc-Glyn-OH可被樹脂結合的氨基截獲，然后發生變為二酮哌嗪的明顯環化。在完成鏈延伸后，可脫去每個肽中的N-端Fmoc保護基，而游離氨基可被乙酰化。
假正交保護的衍生物Fmoc-Lys(ivDde)-OH可用于使單體和二聚體肽的C-末端賴氨酸ε-胺選擇性無掩蔽，并使它們隨后官能化，這也可以被優化。可使用10％肼的DMF溶液，來脫去每個肽單體C-末端賴氨酸ε-胺上的ivDde基團。然后，可使用4當量的Fmoc氨基酸以及各4當量的DIC和HOBt的DMF溶液，使Fmoc-Adoa(用于單體(13))或Lys(ivDde)(用于單體(12))接在暴露的賴氨酸ε-氨基上，時間長達10小時。在完成合成后，可從樹脂上切下肽序列，并使用“試劑B”(TFA:水:苯酚:三異丙基硅烷，88:5:5:2，體積/體積/重量/體積)脫保護4小時。在完成切割反應后，可使肽沉淀出來，用乙醚洗滌，并干燥。
下面用于環化線性含二半胱氨酸肽的方法可用于提供最佳的單體肽放大。一般來說，線性二半胱氨酸肽的空氣氧化可以約0.5-5mg/mL(對于公開的肽單體，在肽中約為0.18-1.8mM，在半胱氨酸硫醇中約為0.36-3.6mM)進行。為了在顯著更高的濃度下起作用，DMSO輔助的二半胱氨酸肽環化允許在低至約50mL的溶液中以良好的得率環化約10g線性肽。因此，在室溫下，粗線性二半胱氨酸肽可在95％ DMSO-H2O(5mL/g)pH8.5中進行環化。環化進程可通過質譜和HPLC常規跟蹤。盡管環化可在約36小時內基本完成，但反應混合物一般可攪拌達48小時。環狀二硫化物肽可通過用CH3CN稀釋從反應混合物中沉淀出來，所得的灰白色粗固體肽可通過過濾收集。這是從粗環狀肽中除去DMSO的簡便方法。
單體肽(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2的純化和分離可如下所述完成。值得注意的是，本文使用的符號“C*”是指對二硫鍵作出貢獻的半胱氨酸殘基。將0.5g粗肽溶解在達300mL的30％ CH3CN的水(0.1％ TFA)溶液中的嘗試未獲成功。因此，作為替代，粗肽(0.5g)可溶解在DMSO(5mL/g)中，該溶液可用20％ CH3CN-水稀釋至終體積為100mL。該溶液可過濾。濾過的溶液可加到用10％ CH3CN(0.1％ TFA)的水(0.1％ TFA)溶液平衡的制備型HPLC柱(Waters，
Prep MS C18，10μ，
50×250mm)上，該柱可用10％ CH3CN(0.1％ TFA)的水(0.1％ TFA)溶液洗脫，以從柱子中洗滌出DMSO。然后，可在1分鐘內將洗脫液的組成階次升至35％ CH3CN-水(0.1％ TFA)，可以0.5％/分鐘CH3CN(0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的速度啟動線性梯度，并跑柱50分鐘。可在分析型反相C18柱(Waters XTerra MS-C18，10μ，
4.6×50mm)上檢查洗脫流分的純度，可合并純度>95％的含產物流分后凍干。對于每0.5g粗肽的純化，均可分離出0.1g(20％)的(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2。已發現重復純化始終得到同樣得率和純度的肽。
肽單體(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2，可按對肽單體(12)的描述進行純化和分離，只是目標肽可溶解在20％ CH3CN(0.1％ TFA)的0.1％ TFA水溶液(0.5g肽/100mL)中，而不是含有DMSO的稀釋液。所得的粗肽溶液可加到用10％ CH3CN的水(0.1％ TFA)溶液平衡的制備型HPLC柱(Waters，
Prep MS C18，10μ，
50×250mm，流速100mL/分鐘)上。該柱可用10％ CH3CN(0.1％ TFA)/水(0.1％ TFA)以100mL/分鐘洗脫5分鐘。然后，可在1分鐘內將洗脫液的組成階次升至30％CH3CN(0.1％ TFA)/水(0.1％ TFA)，可啟動0.5％/分鐘CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％TFA)的線性梯度并保持，直至需要的肽從柱中完全洗脫出來。含有產物的流分可在Waters XTerra分析型反相C18柱(10μ，120
)上進行分析，可合并純度>95％的含產物流分后凍干，得到環狀二硫化物肽單體(13)(0.12g，得率24％，純度>95％)。以此方式可連續純化10g粗肽單體。
下面描述的是制備前體二聚體肽(16)Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2環(2-12)二硫化物]-NH2環(6-13)二硫化物的示例性方法。前體二聚體肽的制備可按兩步法通過束縛單體肽而完成。首先，可使Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK-[K(ivDdc)]-NH2(12)在DIEA(5當量)存在下與戊二酸二琥珀酰亞胺酯(DSG，5當量)的DMF溶液反應30分鐘。反應混合物可用乙酸乙酯稀釋，這可導致肽的戊二酸單酰胺單NHS酯沉淀。可傾析出含有未反應的DSG的上清液，并可用乙酸乙酯洗滌單NHS酯幾次，以除去痕量DSG。質譜數據證實形成的單NHS酯為純凈產物。該單NHS酯可再溶解在DMF中，并在DIEA(5當量)存在下與單體肽Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2(13)反應。HPLC和MS結果表明形成具有ivDde的二聚體，為單一主要產物。可將反應混合物與肼(10％)的DMF溶液攪拌20分鐘，脫去在二聚體Lys的ε-胺上的ivDde保護基。然后，溶液可用TFA酸化，用10％CH3CN(0.1％ TFA)-水(0.1％ TFA)稀釋，加到制備型反相C18 HPLC柱上，通過乙腈(0.1％ TFA)至0.1％ TFA水溶液的梯度洗脫進行純化。為了提供所需量的前體二聚體肽，可使用每種單體肽0.5g至多達1g進行反應。在每種情況下，所需要的前體二聚體肽都可以得率約32％和純度>95％分離得到，證實了該程序的再現性和規模化。
合成的最后一步可為DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(18)與前體二聚體肽的綴合。如前所述，DSPE-PEG2000-NH2的PEG2000部分名義上由45個乙二醇單元組成。然而，應當指出的是，該物質是含PEG物質的分布，其質量中心為含有45個乙烯氧基單元的名義化合物。
DSPE-PEG2000-NH2與前體二聚體肽的綴合可通過制備前體二聚體的戊二酸單酰胺單NHS酯并使其與磷脂銨鹽的游離氨基反應而完成。因此，具有ivDde的前體二聚體肽(16)可在DIEA(5當量)存在下與DSG(4當量)的DMF溶液反應30分鐘。和在制備前體二聚體肽時一樣，溶液可用乙酸乙酯稀釋，以將二聚體戊二酸單酰胺單NHS酯(17)沉淀出來成為固體。上清液可被傾析出去，以除去未反應的DSG。然后，可用乙酸乙酯洗滌固體二聚體肽的戊二酸單酰胺單NHS酯(17)幾次，以除去痕量DSG。質譜結果證實形成的肽二聚體戊二酸單酰胺單NHS酯為純凈產物。
二聚體戊二酸單酰胺單NHS酯(17)可溶解在DMF-CH2Cl2(8:2)中，并在DIEA(4當量)存在下與DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(0.9當量)反應24小時。可過量使用NHS酯(17)，以使磷脂銨鹽的消耗最大化，因為任何游離的磷脂都可使終產物的純化和分離復雜化。反應混合物可用水(0.1％ TFA)-CH3CN-CH3OH(1:1)(0.1％TFA)(約100mL)稀釋，加到反相C4柱(
Prep C4，10μ，
50×250mm，流速100mL/分鐘)上，該柱可用水(0.1％ TFA)-CH3CN-CH3OH(1:1)(0.1％ TFA)溶劑混合物洗脫，以除去親水雜質。然后，產物可用CH3CN-CH3OH(1:1)(0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的梯度洗脫。可使用ELS檢測器，通過反相HPLC對所收集的流分進行分析，ELS檢測器允許檢測需要的產物以及經常難以分離的DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽，其UV發色團不太強。這表明二聚體肽磷脂綴合物和DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽完全分開。可收集含有純產物的流分，在旋轉蒸發器上濃縮(以減少甲醇含量)，凍干，得到二聚體肽磷脂綴合物(無色固體)。
為了制備所需量的二聚體肽磷脂綴合物，可使用0.5g至1.0g的前體二聚體肽實施幾個輪次。在所有情況下，目標二聚體肽磷脂綴合物都可以以得率57-60％和純度>99％分離得到。得自上述連續輪次的大量二聚體肽磷脂綴合物可如下獲得將各個輪次的產物溶解在叔丁醇-乙腈-水(1:1:3)中，然后凍干。可對二聚體肽磷脂綴合物的大量樣品應用定量評價游離硫醇的Ellman方法；游離硫醇即便有也在檢出限以下。氨基酸組成分析得到的結果在可接受的限度內，支持確定的肽衍生物結構。MALDI-TOF質譜分析也支持假定的二聚體肽磷脂綴合物結構。
制備具有低水平或可忽略水平的TFA的二聚體-磷脂綴合物的方法
本發明還提供用于生產具有非常低水平的TFA的二聚體肽-磷脂綴合物的方法。盡管某些方法在克級上提供了這些綴合物的合成和純化，但已在5℃儲存凍干物質時或儲存綴合物的水溶液時觀察到有溶解形式(lyso-version)的綴合物形成。一般認為，溶解型化合物(lyso-compound)經由對二聚體肽-磷脂綴合物中的一種磷脂脂肪酸酯的TFA促進的酸水解而形成。
為獲得磷脂肽作為具有藥學上可接受的抗衡離子的穩定物質，發現了用于獲得二聚體肽-磷脂綴合物的高效方法，該方法將二聚體肽-磷脂綴合物的TFA鹽或其任何適宜的前體轉變為類似的藥用乙酸鹽。下面提供了這些方法的代表性實施方案。
表3提供了對圖6、7和8中顯示的識別標記的描述。
表3 其中m、n、x、y、z隨凍干條件的不同而變化。
現在參考圖6和7，在某些實施方案中，雜二聚體肽(27)的單體肽組分，即TFA鹽化合物(22)和(25)，使用階梯梯度的乙酸銨在大孔磺酸陽離子交換樹脂AG MP-50上進行離子交換層析，以將它們轉變為它們的乙酸鹽。然后，這兩個肽單體乙酸鹽(23)和(26)可通過戊二酰接頭束縛而形成為乙酸鹽的二聚體(27)。使用線性梯度法并采用各含10mM NH4OAc的CH3CN/H2O，通過C-18制備型HPLC純化(27)的粗二聚體乙酸鹽，得到純的二聚體乙酸鹽(27)。此二聚體與DSPE-PEG2000-NH2(29)綴合并通過C-3制備型HPLC使用CH3CN/H2O/NH4OAc最終純化粗混合物，得到為乙酸鹽的化合物(21)。
更具體地說，化合物(22)、(25)和(27)全都具有側鏈羧酸和氨基。可使用一種大孔陽離子交換樹脂AG MP-50，使得肽可以完全穿過樹脂，并利用其堿性(氨基和胍基)開發肽的固定化。肽的TFA鹽可吸附至AG MP-50柱(磺酸形式)，該柱可用水洗滌，然后根據肽的溶解度，用NH4OAc在0或30％ CH3CN/H2O中的階梯梯度進行洗脫。所述肽可以約600mM NH4OAc洗脫，然后，可獲得純形式的肽的乙酸鹽形式。IC氟分析和CE TFA抗衡離子分析都一致表明所述肽中的TFA含量非常低。
優選方法還包括將最終的肽重溶解/重凍干幾次，以除去殘余的NH4OAc。否則，所述肽中存在的殘余痕量NH4OAc可在DIEA存在下產生游離氨。這可以導致在隨后的由單體(23)和(26)制備(27)或者由(27)的乙酸鹽制備最終的磷脂-肽綴合物(21)中形成不需要的肽-Glut-酰胺作為主要產物。
現在參考圖7，另一個實施方案提供通過在大孔磺酸陽離子交換樹脂AG MP-50上進行離子交換層析，將二聚體(27)的TFA鹽轉變為其類似乙酸鹽。此二聚體乙酸鹽然后可與DSPE-PEG2000-NH2綴合，接著使用CH3CN/H2O/NH4OAC通過C-3制備型柱純化粗物質，得到為乙酸鹽的最終化合物(21)。
盡管上述方法以及圖6和7中的方法提供了極佳的結果，但是，第二種方法的優勢是需要較少的步驟。其它細節見下面的實施例部分。
轉到圖8，另一個實施方案利用磷脂-肽綴合物(21)和TFA離子之間的大小差異提供了用于生產TFA含量最少的二聚體綴合物的方法。在該實施方案中，在碳酸氫銨緩沖液存在下，21·nTFA加合物可從大小排阻柱上洗脫下來。起初，可在Zorbax C-3柱上，使用乙腈至水的線性梯度，通過制備型HPLC使粗21·nTFA不含溶解型化合物。兩相都可以用10mM乙酸銨緩沖。如分析型HPLC所示，這提供了溶解型化合物的分離。
為進一步減少TFA的量，可將所得材料加到SephadexG-25柱上，再用碳酸氫銨水溶液洗脫。洗脫液可通過HPLC監測。可合并含產物流分后凍干，得到基本上不含TFA但具有高回收率的所需物質(21)。其它細節見下面的實施例部分。
本文所述的單體和二聚體肽磷脂綴合物可摻入到超聲造影劑如含氣微囊泡中。所述含氣微囊泡包括例如含氣微泡、含氣微球、含氣微囊等。在一個優選實施方案中，肽磷脂綴合物可摻入到含有含氣微泡的超聲造影劑中。由磷脂和磷脂綴合物制備含氣微泡的方法是本領域技術人員已知的。例如，本發明的微泡可通過任一個以下專利中所述方法制備EP 554213、WO 04/069284、美國專利第5,413,774號、美國專利第5,578,292號、EP 744962、EP682530、美國專利第5,556,610號、美國專利第5,846,518號、美國專利第6,183,725號、EP 474833、美國專利第5,271,928號、美國專利第5,380,519號、美國專利第5,531,980號、美國專利第5,567,414號、美國專利第5,658,551號、美國專利第5,643,553號、美國專利第5,911,972號、美國專利第6,110,443號、美國專利第6,136,293號、EP 619743、美國專利第5,445,813號、美國專利第5,597,549號、美國專利第5,686,060號、美國專利第6,187,288號和美國專利第5,908,610號，這些專利整體在此引入作為參考。特別優選在WO04/069284中公開的方法。
適宜的磷脂包括甘油與一個或兩個分子的脂肪酸(相同的或不同的)和磷酸的酯，其中磷酸殘基又與親水基團鍵合，例如膽堿、絲氨酸、肌醇、甘油、乙醇胺等基團。磷脂中存在的脂肪酸一般為長鏈脂肪酸，通常含有12-24個碳原子，優選含有14-22個碳原子，可為飽和的，或者可含有一個或多個不飽和的。適宜的脂肪酸的實例為月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。磷脂的單酯在本領域已知為磷脂的“溶解”形式(“lyso”form)。
磷脂的其它實例為磷脂酸(即甘油-磷酸與脂肪酸的二酯)、鞘磷脂(即其中具有脂肪酸的甘油二酯的殘基被神經酰胺鏈置換的那些磷脂酰膽堿類似物)、心磷脂(即1，3-二磷脂酰甘油與脂肪酸的酯)、神經節苷脂、腦苷脂等。
本文使用的術語磷脂包括可單獨使用或作為混合物使用的天然、半合成或合成制備的產物。
天然磷脂的實例為天然卵磷脂(磷脂酰膽堿(PC)衍生物)，例如通常為大豆或蛋黃卵磷脂。半合成磷脂的實例為天然卵磷脂的部分或完全氫化衍生物。
合成磷脂的實例為例如二月桂酰-磷脂酰膽堿(“DLPC”)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(“DMPC”)、二棕櫚酰-磷脂酰膽堿(“DPPC”)、二花生四烯酰磷脂酰膽堿(“DAPC”)、二硬脂酰-磷脂酰膽堿(“DSPC”)、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿(“MPPC”)、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(“PMPC”)、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿(“PSPC”)、1-硬脂酰-2-棕櫚酰-磷脂酰膽堿(“SPPC”)、二油酰磷脂酰膽堿(“DOPC”)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿(乙基-DSPC)、二月桂酰-磷脂酰甘油(“DLPG”)及其堿金屬鹽、二花生四烯酰磷脂酰甘油(“DAPG”)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)及其堿金屬鹽、二棕櫚酰-磷脂酰甘油(“DPPG”)及其堿金屬鹽、二硬脂酰磷脂酰甘油(“DSPG”)及其堿金屬鹽、二油酰磷脂酰甘油(“DOPG”)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻酰磷脂酸(“DMPA”)及其堿金屬鹽、二棕櫚酰磷脂酸(“DPPA”)及其堿金屬鹽、二硬脂酰磷脂酸(“DSPA”)、二花生四烯酰磷脂酸(“DAPA”)及其堿金屬鹽、二肉豆蔻酰磷脂酰-乙醇胺(“DMPE”)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(“DSPE”)、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸(“DMPS”)、二花生四烯酰磷脂酰絲氨酸(“DAPS”)、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸(“DPPS”)、二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(“DSPS”)、二油酰磷脂酰絲氨酸(“DOPS”)、二棕櫚酰鞘磷脂(“DPSP”)和二硬脂酰鞘磷脂(“DSSP”)。
適宜的磷脂還包括通過使親水聚合物與其連接而修飾的磷脂。經修飾的磷脂的實例為用聚乙二醇(PEG)修飾的磷脂酰乙醇胺(PE)，簡稱“PE-PEG”，即磷脂酰乙醇胺中的親水乙醇胺部分連接可變分子量(例如從300道爾頓到5000道爾頓)的PEG分子，例如DPPE-PEG、DSPE-PEG、DMPE-PEG或DAPE-PEG(其中DAPE為1，2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)，其組成中還可以包含其它的兩親化合物，包括例如脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸、花生四烯酸或油酸；甾醇，例如膽固醇，或甾醇與脂肪酸或與糖酸的酯；甘油或甘油酯，包括甘油三棕櫚酸酯、甘油二硬脂酸酯、甘油三硬脂酸酯、甘油二肉豆蔻酸酯、甘油三肉豆蔻酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油三月桂酸酯、甘油二棕櫚酸酯；叔或季烷基銨鹽，例如1，2-二硬脂酰-3-三甲基銨-丙烷(DSTAP)、1，2-二棕櫚酰-3-三甲基銨-丙烷(DPTAP)及其混合物和組合。
優選地，所述制劑含有至少一種帶有總凈電荷的組分，例如磷脂酸、PE-PEG、棕櫚酸、硬脂酸、乙基-DSPC或DSTAP，優選摩爾量低于約50％。特別優選的制劑可包括兩種或更多種以下組分的混合物DSPC、DPPG、DPPA、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、棕櫚酸和硬脂酸。某些優選的磷脂和制劑在實施例中有描述。可使用本文公開的或本領域技術人員已知的任何氣體；但優選惰性氣體，例如SF6或全氟化碳，如CF4、C3F8和C4F10，，其任選地與空氣、氮氣、氧氣或二氧化碳等其它氣體混合。
可使用已知方法，例如冷凍干燥或噴霧干燥粗磷脂在適宜溶劑中的溶液，或使用以下文獻中所述的方法，由磷脂制備本發明的優選微泡混懸液EP 554213、WO 04/069284、美國專利第5,413,774號、美國專利第5,578,292號、EP 744962、EP 682530、美國專利第5,556,610號、美國專利第5,846,518號、美國專利第6,183,725號、EP 474833、美國專利第5,271,928號、美國專利第5,380,519號、美國專利第5,531,980號、美國專利第5,567,414號、美國專利第5,658,551號、美國專利第5,643,553號、美國專利第5,911,972號、美國專利第6,110,443號、美國專利第6,136,293號、EP 619743、美國專利第5,445,813號、美國專利第5,597,549號、美國專利第5,686,060號、美國專利第6,187,288號和美國專利第5,908,610號，所述專利整體在此引入作為參考。優選地，如國際專利申請WO 04/069284中所公開的，可制備包含磷脂(例如DSPC和/或DSPA)的微乳狀液，所述磷脂與凍干保護劑(例如糖、糖醇、聚二元醇及其混合物，如后文詳述所示)和任選的其它兩親物質(例如硬脂酸)混合，分散在水乳狀液和水不混溶有機溶劑的乳狀液中。優選的有機溶劑在水中的溶解度為1.0g/L以下，優選低于約0.01g/L，包括例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、1-戊烯、2-戊烯、1-辛烯、環戊烷、環己烷、環辛烷、1-甲基-環己烷、苯、甲苯、乙苯、1，2-二甲苯、1，3-二甲苯、二丁醚和二異丙酮、氯仿、四氯化碳、2-氯-1-(二氟甲氧基)-1，1，2-三氟乙烷(恩氟烷)、2-氯-2-(二氟甲氧基)-1，1，1-三氟乙烷(異氟烷)、四氯-1，1-二氟乙烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟壬烷、全氟苯、全氟萘烷、甲基全氟丁醚、甲基全氟異丁醚、乙基全氟丁醚、乙基全氟異丁醚及其混合物。本發明的肽-磷脂綴合物可與磷脂一起混合在微乳狀液中，形成微囊泡包囊。優選地，首先制備肽-磷脂綴合物和PE-PEG(例如DSPE-PEG2000)的水性混懸液，然后將其與含有磷脂和凍干保護劑的水性混懸液-有機乳狀液混合在一起。優選在加熱(例如約40℃至80℃)時進行混合。
在通過分散在水性載體中形成微泡混懸液之前，使凍干或噴霧干燥的磷脂粉末與空氣或其它氣體接觸。當與水性載體接觸時，其結構已被破壞的粉末狀磷脂將形成片狀化或層狀化部分，這些部分將使分散在其中的氣體的微泡穩定。該方法允許生產即便在長期儲存時也穩定的微泡混懸液，僅僅將無水的層狀化磷脂(其已在所需氣體下儲存)溶解就可獲得，無需振搖或任何其它劇烈攪拌。
或者，可如例如WO 97/29783中所公開的，通過以高速攪拌將氣體懸浮在水性溶液中制備微泡。微泡的其它制備方法公開于WO 2004/069284，該文獻在此引入作為參考，其包括在磷脂存在下在水性介質中制備有機溶劑的乳狀液，隨后在任選的洗滌和/或過濾步驟之后將所述乳狀液凍干。在實施例中公開了某些優選的制備方法。
用于制備含氣微泡的制劑最好還可以含有凍干添加劑，例如具有冷凍保護作用和/或凍干保護作用的物質，和/或填充劑，例如氨基酸，如甘氨酸；碳水化合物，例如糖，如蔗糖、甘露醇、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖或環糊精，或多糖，例如葡聚糖；或聚二元醇，例如聚乙二醇(例如PEG-4000)。
任何這些超聲組合物都還應盡可能地與血液等滲。因此，在注射前，可向任何上述超聲造影劑混懸液中加入少量等滲劑。等滲劑是醫學上常用的生理溶液，它們包括鹽水溶液(0.9％NaCl)、2.6％甘油溶液、5％葡萄糖溶液等。另外，超聲組合物可以包括藥學上可接受的標準添加劑，包括例如乳化劑、粘度調節劑、冷凍保護劑、凍干保護劑、填充劑等。
任何生物相容性氣體都可以用于本發明的超聲造影劑。本文使用的術語“氣體”包括在正常人體溫度下基本上呈氣體形式的任何物質(包括混合物)。所述氣體因此可以包括例如空氣、氮氣、氧氣、CO2、氬氣、氙氣或氪氣、氟化氣體(包括例如全氟化碳、SF6、SeF6)；低分子量的烴(例如含有1-7個碳原子)，例如烷烴，例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷，環烷烴，例如環丙烷、環丁烷或環戊烷，烯烴，例如乙烯、丙烯、丙二烯或丁烯，或者炔烴，例如乙炔或丙炔，和/或它們的混合物。然而，優選氟化氣體。氟化氣體包括含有至少一個氟原子的物質，例如SF6、氟利昂(含有一個或多個碳原子和氟原子的有機化合物，即CF4、C2F6、C3F8、C4F8、C4F10、CBrF3、CCl2F2、C2ClF5和CBrClF2)和全氟化碳。術語全氟化碳是指只含有碳和氟原子的化合物，尤其包括飽和的、不飽和的和環狀全氟化碳。通常優選的飽和全氟化碳具有式CnFn+2，其中n為1-12，優選2-10，最優選3-8，甚至更優選3-6。適宜的全氟化碳包括例如CF4、C2F6、C3F8C4F8、C4F10、C5F12、C6F2、C7F14、C8F18和C9F20。最優選地，所述氣體或混合氣體包括SF6或選自以下的全氟化碳C3F8C4F8、C4F10、C5F2、C6F12、C7F14、C8F18，特別優選C4F10。另參見WO 97/29783、WO 98/53857、WO 98/18498、WO98/18495、WO 98/18496、WO 98/18497、WO 98/18501、WO98/05364、WO 98/17324。在一個優選實施方案中，所述氣體包括C4F10或SF6，其任選地與空氣、氮氣、氧氣或二氧化碳混合。
在某些情況下，可能需要包括氣體物質的前體(例如能夠在體內轉變為氣體的物質，通常稱為“氣體前體”)。優選地，氣體前體和其產生的氣體是生理上可接受的。氣體前體可為pH活化的、光活化的、溫度活化的，等等。例如，某些全氟化碳可用作溫度活化的氣體前體。這些全氟化碳，例如全氟戊烷，具有在室溫(或生產和/或儲存該物質的溫度)以上但在體溫以下的液相/氣相轉變溫度；因此它們經歷相移，并在人體內轉變為氣體。
如上所述，氣體可以包括混合氣體。以下組合是特別優選的混合氣體氣體(A)和(B)的混合物，其中氣體(B)(以0.5-41％(體積)的量存在，分子量大于80道爾頓，并為氟化氣體)和(A)中的至少一種選自空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳及其混合物，混合物的余量為氣體A。
除非其包含已知需要特定儲存條件的超極化氣體，否則凍干產品可儲存和運輸，而不需要對其環境進行溫度控制，具體地說，其可以提供給醫院和醫師，用于現場配制為即用的給藥混懸液，無需這些用戶具有特定的儲存設備。優選地，在這種情況下，其可以雙組分藥盒的形式提供，該藥盒可裝有兩個獨立的容器或雙室容器。在前一種情況下，優選地，該容器為常規的隔膜密封小瓶，其中裝有步驟b)的凍干殘余物的小瓶用隔膜密封，可使用任選的預灌裝注射器通過該隔膜注射載液。在此情況下，然后還使用用作第二種組分的容器的注射器注射造影劑。在后一種情況下，優選地，雙室容器為雙室注射器，一旦凍干物被重配，則適宜地混合或輕輕地振蕩，該容器可直接用于注射造影劑。在這兩種情況下，均提供用于將足夠的氣泡形成能量引入或允許應用于容器內容物的方法。然而，如上所述，在本發明的穩定造影劑中，氣體微泡的尺寸基本上與施加到重配干燥產品的攪拌能量無關。因此，一般只需要輕輕用手搖動就可產生微泡尺寸均一的可再制產品。
本領域一般技術人員會意識到，其它能夠以無菌方式混合干粉和水溶液的兩室重配系統也在本發明的范圍之內。在這類系統中，如果水相可介于水不溶性氣體和環境之間，則特別有利于延長產品的保存期。在形成造影劑所需的物質(例如在重配過程中連接至磷脂的靶向配體)在容器中已經不存在時，可與藥盒的其它組分一起包裝，優選為適于與藥盒的其它組分簡便組合的形式或容器。
不需要特定的容器、小瓶或連接系統；本發明可使用常規容器、小瓶和適配器。唯一的要求是塞子和容器之間的良好密封。因此，密封質量成為首要考量的問題；密封完整性的任何減低都可能使不需要的物質進入小瓶。除了確保無菌之外，真空保留度對于環境壓力或減壓下封塞的產品是必需的，以確保安全和正確的重配。塞子可為化合物或基于合成橡膠的多組分配方，例如聚(異丁烯)橡膠或丁基橡膠。
在超聲應用中，例如可給予由磷脂穩定的微泡制成的造影劑，給予劑量使得注射磷脂的量在0.1-200μg/kg體重的范圍內，優選約0.1-30μg/kg。
可用于本發明的超聲成像技術包括已知技術，例如彩色多普勒、能量多普勒、多普勒幅度、刺激性聲成像以及二維或三維成像技術。成像可以諧波(共振頻率)或基諧模式進行，優選第二諧波。
本發明的超聲造影劑還可以用于多種治療性成像方法。術語治療性成像在其含義中包括用于治療患者的疾病的任何方法，其包括使用造影成像劑(例如用于將治療劑遞送到選定的受體或組織)，并在體外和/或體內能夠發揮或負責發揮生物學作用。治療性成像最好可與含氣微囊泡的受控的局部破壞相關聯，例如利用高聲壓(通常高于一般用于非破壞性診斷成像方法的聲壓)超聲爆裂。此受控的破壞例如可用于治療血凝塊(一種也稱為超聲溶栓的技術)，任選地與適宜治療劑的局部釋放組合。或者，所述治療性成像可包括由于在細胞水平由微囊泡的局部爆裂誘導的瞬時膜穿透而將治療劑遞送到細胞中。該技術可用于例如將遺傳物質有效遞送到細胞中；任選地，藥物可與遺傳物質組合局部遞送，由此允許對患者進行聯合藥物/遺傳治療(例如對癌癥治療而言)。
術語“治療劑”在其含義中包括可用于任何治療用途(例如用于治療患者的疾病的方法)的任何物質、組合物或顆粒，以及在體外和/或體內能夠發揮或負責發揮生物學作用的任何物質。治療劑因此包括能夠用于治療(包括診斷、預防、緩解、疼痛減輕或治愈)患者的任何病理狀況(包括疾病、不適、病灶或損傷)的任何化合物或物質。治療劑的實例為藥物、藥劑、生物活性劑、細胞毒性劑、化療劑、放療劑、蛋白質、天然或合成肽(包括寡肽和多肽)、維生素、類固醇和遺傳物質，包括核苷、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和質粒。
材料與分析方法
用于反應、層析純化和HPLC分析的溶劑為來自VWRCorporation(West Chester，PA)的E.Merck Omni級溶劑。N-甲基吡咯烷酮(NMP)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)得自Pharmco Products Inc.(Brookfield，CT)，為肽合成級或低水/無胺的生物技術級質量。哌啶(測序級，重蒸餾99+％)和三氟乙酸(TFA)(分光光度級或測序級)得自Sigma-Aldrich Corporation(Milwaukee，WI)或得自Fluka ChemicalDivision of Sigma-Alrich Corporation。N，N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)、苯酚(99％)、N，N-二異丙基乙胺(DIEA)和三異丙基硅烷(TIS)購自Sigma-Aldrich Corporation。Fmoc-保護的氨基酸、假脯氨酸二肽、Fmoc-Asp(O-tBu)-Ser(ψMe，Mepro)-OH和Fmoc-Gly-Thr(ψMe，Mepro)-OH以及N-羥基苯并三唑(HOBt)得自Novabiochem(San Diego，CA)。Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(Adoa)得自NeoMPS Corp(San Diego，CA)或Suven Life Sciences(Hyderabad，India)。戊二酸二琥珀酰亞胺酯(DSG)和1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)2000]銨鹽、[DSPE-PEG2000-NH2]分別得自Pierce Chemical Co.(Rockford，TL.)和
Polar Lipids(Alabaster，AL)。通過與Fmoc-OSu反應由相應的三甘氨酸或二甘氨酸自行制備Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH。AG MP-50離子交換樹脂得自Bio-Rad(Hercules，CA)。
一般使用Shimadzu LC-10AT VP雙泵梯度系統，采用Waters XTerra MS-C184.6×50mm柱(粒徑5μ；孔徑
)和梯度或等度洗脫系統，使用水(0.1％ TFA)作為洗脫劑A以及CH3CN(0.1％ TFA)或CH3CN-CH3OH(1:1，體積/體積)(0.1％ TFA)作為洗脫劑B，獲得分析型HPLC數據。化合物的檢測使用UV于220nm和254nm完成。磷脂-PEG-肽衍生物的純度在YMC C-4(5μM，
4.6×250mm)柱上或在Zorbax 300 SB-C3(3.5μM；
3×150mm)柱上使用SEDEX 55光散射檢測器(LSD)和UV檢測器進行測定。
制備型HPLC在裝備配有制備流動池的SPD-10AV UV檢測器的Shimadzu LC-8A雙泵梯度系統上進行。一般來說，根據化合物特征將含有粗肽的溶液加到反相C18、C4或C3柱上，所述柱使用第三個泵連接至制備型Shimadzu LC-8A雙泵梯度系統。在將粗產物混合物的溶液加到制備型HPLC柱后，反應溶劑和用作稀釋劑的溶劑，例如DMF或DMSO，以低有機相組成由該柱洗脫下來。然后，使用洗脫液B至洗脫液A的梯度洗脫液洗脫所需產物。基于根據分析型HPLC和質譜分析確定的它們的純度，合并含有產物的流分。凍干合并的流分，得到所需產物。
在Yale University，New Haven，CT的Keck生物技術資源實驗室進行氨基酸組成分析。質譜數據得自MScan Inc.(606Brandywine Parkway，West Chester，PA 19380)，或用Agilent LC-MSD1100質譜儀自行獲得。為了選擇產物流分和表征目的，質譜值通常使用API-ES以負離子模式獲得。一般而言，目標肽的分子量約為3000；質譜通常表現出雙重或三重負電荷離子質譜值，而不是[M-H]-。這些一般用于在HPLC純化過程中選擇收集并合并的流分，得到純肽。在某些情況下，流分在質譜中表現出歸屬于[M-2H]/2+57或[M-2H]/2+114的主峰。這些峰源于形成每分子肽一分子或兩分子三氟乙酸的加合物。在通過比較MS結果和HPLC純度以及凍干過程小心收集流分后，將少量分離的蓬松固體溶解在水中(0.5mg/mL)，并用一滴N-甲基-D-葡糖胺水溶液(約0.5M)處理。通過HPLC和MS分析該溶液的純化肽的最終純度結果。在N-甲基-D-葡糖胺存在下，肽溶液在質譜中未表現出[M-2H]/2+57或[M-2H]/2+114的質量值峰，相反觀察到預期的[M-2H]/2或[M-3H]/3峰。
下面的非限制性實施例提供了有關用于獲得大量高度純化形式的單體和二聚體肽磷脂綴合物的有效方法的其他細節。這些非限制性實施例還描述了包含這些單體和二聚體肽磷脂綴合物的代表性靶向微泡的制備方法。這些實施例還描述了這些靶向微泡在靜態結合測試中對KDR轉染細胞的用途以及在動態結合測試中對rhVEGF-R2/Fc嵌合蛋白的用途。這些實施例還描述了在兔VX2腫瘤模型中評價含有KDR結合脂肽的超聲造影劑。
實施例
下面的實施例1-2涉及示于圖2的單體肽磷脂綴合物。此化合物的合成方法見圖1。盡管這些實施例更具體地涉及合成示于圖2的化合物的方法，但可使用類似方法制備示于圖10的單體肽磷脂綴合物和示于圖9的線性肽單體(32)以及其它單體肽-磷脂綴合物。另外，同時待審的美國申請第10/661,156號(2003年9月11日申請)記載了肽單體的制備方法，該申請整體在此引入作為參考。
實施例1 線性肽單體(2)Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.2)Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2；N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-異亮氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-組氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰胺的固相合成(SPPS)和純化
如下合成線性肽單體(2)采用已建立的自動化方案，在
肽合成儀上，使用Fmoc-Pal-Peg-PS樹脂(0.2mmol/g)、Fmoc-保護的氨基酸和DIC介導的在DMF中的HOBt酯活化。通過SPPS法，在Fmoc-Pal-Peg-PS樹脂上，以分步方式合成肽序列，通常為10mmol規模。氨基酸偶聯用4倍過量的每種氨基酸以及DIC-HOBt試劑對的DMF溶液進行。
在典型的氨基酸偶聯中，每克樹脂使用5mL無水DMF。基于使用的樹脂計算的DMF總體積在用于溶液制備的氨基酸、HOBt和DIC之間分配。例如，對于包含50g(10mmol規模)樹脂的合成，計算的250mL DMF體積在氨基酸(150mL)、HOBt(50mL)和DIC(50mL)之間分配。在
Pilot合成儀上的氨基酸容器中裝入固體無水氨基酸(相對于樹脂4倍過量)。在偶聯步驟開始時，使用設備的軟件連續地傳遞選定體積的DMF(用于稀釋氨基酸)和HOBt(4當量)的DMF溶液以及DIC(4當量)的DMF溶液，通過通入氮氣啟動混合，進行4分鐘。這用于預活化氨基酸，并確保混合物的所有組分完全溶解。在活化后，軟件介導活化的Fmoc-氨基酸溶液向裝有樹脂的反應容器轉移。在轉移完成后，攪拌容器3小時，同時周期性通入氮氣。在3小時偶聯時間后，用DMF(5mL/g，6次)徹底洗滌樹脂，用含有HOBt(0.1M)的25％哌啶的DMF(5mL/g)溶液進行Fmoc基團的切割(2×10分鐘)。用DMF(5mL/g，6次)徹底洗滌樹脂，以確保在制備中從樹脂中完全除去哌啶，用以保證氨基酸偶聯。就Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH而言，在氨基酸瓶中不進行預活化，以便在如本文論述的活化時間當中使二酮哌嗪的形成減至最低。因此，在這兩種情況下，將氨基酸、HOBt和DIC的溶液序貫加入反應容器，并以“原位”活化實施偶聯方法。
在完成鏈延伸之后，按標準方式脫去N-末端氨基酸的Fmoc基團，接著用DMF進行標準洗滌(參見上文)。然后，通過用新鮮制備的乙酰化混合物(0.5M乙酸酐、0.125M DIEA和0.015MHOBt的DMF溶液，6mL/g樹脂)處理2×20分鐘給N-末端氨基酸加帽。在完成肽合成后，用切割混合物‘試劑B’(TFA:水:苯酚:三異丙基硅烷，88:5:5:2，體積/體積/重量/體積)(10mL/g樹脂)處理樹脂4小時。除去揮發物，由此獲得的膏狀物用乙醚研磨，得到固體，再用乙醚洗滌(3次)，間插離心(以壓緊懸浮固體，以便允許上清液傾析)，然后真空干燥，得到所需要的肽，為灰白色固體。10mmol規模的線性肽單體(2)合成得到33.82g(理論值的103％)粗肽。超過理論收率最有可能是源于潮濕和殘余的溶劑。
線性肽單體(2)Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK-NH2(SEQ ID NO.2)；Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2；N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-異亮氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-組氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰胺的純化
將約0.5g部分的粗線性肽單體(2)溶解在最少量CH3CN(約20mL)中。用水將溶液體積調整至約100mL，使用第三個泵將溶液加到反相C18制備型柱(Waters，
Prep MS C18，10μ，
50×250mm，流速100mL/分鐘)上，該柱已用10％ CH3CN的水溶液(0.1％ TFA)預平衡。該柱在樣品溶液上樣的過程中不用平衡洗脫液洗脫。在樣品溶液加到該柱后，在1分鐘內將洗脫液的組成階次升至20％ CH3CN-水(0.1％ TFA)，以0.6％/分鐘CH3CN(0.1％TFA)至水(0.1％ TFA)的速率開始線性梯度，并保持50分鐘。使用220nm的UV作為產物洗脫液的指示器手動收集流分(15mL)。所收集的流分在Waters XTerra分析型反相C-18柱(5μ顆粒，孔徑
)上進行分析，合并純度>95％的含產物流分后凍干，得到相應的純線性肽單體(2)。通常，0.5g粗產物(2)的純化得到0.12g(得率24％)所需產物(純度>95％)。
實施例2 單體肽磷脂綴合物(1)Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.1)；Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2；N-乙酰-L-精氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-色氨酰-L-天冬氨酰-L-異亮氨酰-L-谷氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-L-甲硫氨酰-L-丙氨酰-L-天冬氨酰-L-谷氨酰胺酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-組氨酰-L-丙氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰-L-絲氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰胺的制備
通過將肽單體(2)的戊二酸單酰胺單NHS酯(3)與DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(4)綴合來制備單體肽磷脂綴合物(1)Ac-RAQDWYYDEILSMADQLRHAFLSGGGGGK(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-NH2(SEQ ID NO.1)。
邊攪拌邊將無水二甲基甲酰胺(7.5mL)、戊二酸二琥珀酰亞胺酯(DSG，0.25g，0.75mmol)和二異丙基乙胺(0.10g，0.78mmol)序貫裝入配有磁力攪拌棒和隔膜帽的圓底燒瓶。在2分鐘時間段內將固體線性肽單體(2)(0.5g，0.152mmol)分批加入上述溶液中；然后于室溫攪拌該溶液30分鐘。用無水乙酸乙酯將反應混合物稀釋至約50mL；這導致中間體單NHS酯(3)—肽單體(2)的戊二酸單酰胺單NHS酯沉淀。離心溶液，以使單NHS酯(3)沉淀出來，為無色固體。將含有過量DSG的上清液從壓緊的固體單NHS酯(3)中傾出，再將該酯分散在乙酸乙酯中，離心后再多清洗2次，以除去剩余的痕量DSG。將由此獲得的固體中間體單NHS酯(3)溶解在無水DMF(10.0mL)中；加入二異丙基乙胺(0.10g，0.78mmol)；攪拌混合物。
此時，將DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(4)(0.38g，0.14mmol，0.9當量)懸浮在單獨燒瓶中的無水二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(2滴)，以使磷酸二酯氧質子化，這促進磷脂銨鹽在二氯甲烷中的溶解。然后，在旋轉蒸發器上蒸發澄清溶液以除去揮發物，進一步真空干燥。
將固體磷脂銨鹽(4)溶解在DMF(5mL)中，并轉移至單NHS酯(3)的攪拌溶液中，于室溫攪拌所得混合物24小時。用CH3OH和CH3CN-水(1:1，體積/體積)的1:1混合物將反應混合物稀釋至100mL，過濾不溶物。將一半濾過溶液加到反相C2制備型柱(
Prep C2，10μ，
50×250mm)上，該柱已用水(0.1％TFA)和CH3OH-CH3CN(1:1，體積/體積，0.1％TFA)的3:1(體積/體積)混合物以100mL/分鐘流速預平衡。值得注意的是，該柱在樣品上樣過程中不用平衡洗脫液洗脫。在加載樣品溶液后，用平衡洗脫液洗柱子，直至洗脫出DMF塞流。在9分鐘內將洗脫液的組成階次升至70％CH3OH-CH3CN(1:1，0.1％ TFA)，開始0.75％/分鐘CH3OH-CH3CN(1:1，0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的線性梯度，并跑柱40分鐘。使用UV(220nm)作為產物洗脫液的指示器收集流分(15mL)。使用220nm的UV和蒸發光散射檢測器(ELSD)，在分析型HPLC系統(柱YMC C-4，5μ，
4.6×250mm)上檢查流分的純度。使用后一檢測器(ELSD)來檢測DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(4)，其在220nm的UV吸光度非常低。合并純度>98％且沒有DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(4)的含產物流分，在旋轉蒸發器上濃縮，以減少CH3OH含量。然后，用10％ CH3CN的水溶液稀釋濃縮溶液，直至形成微弱的絮狀沉淀。凍干所得溶液，得到為無色固體的單體肽磷脂綴合物(1)。如上所述純化第二部分的粗單體肽磷脂綴合物(1)。目標單體肽磷脂綴合物(1)的合并產量為0.40g(得率47％)。
下面的實施例3-5涉及示于圖5的二聚體肽磷脂綴合物。二聚體綴合物的示例性合成方法見圖3、4、6、7和8。
實施例3 單體肽(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2和(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2的固相合成(SPPS)、環化和純化
通過已建立的自動化方案，在
肽合成儀上，使用Fmoc-Pal-Peg-PS樹脂(0.2mmol/g)、Fmoc-保護的氨基酸和DCI介導的在DMF中的HOBt酯活化，合成線性肽。通過SPPS方法，在Fmoc-Pal-Peg-PS樹脂上，以分步方式合成肽序列，通常為10mmol規模。用4倍過量的每種氨基酸以及DIC-HOBt試劑的DMF溶液進行氨基酸偶聯。
在典型的順序氨基酸偶聯中，每克樹脂使用5mL無水DMF。基于使用的樹脂計算的DMF總體積在用于溶液制備的氨基酸、HOBt和DIC之間分配。例如，對于包含50g樹脂的合成，計算的250mL DMF體積在氨基酸(150mL)、HOBt(50mL)和DIC(50mL)之間分配。在
Pilot肽合成儀上的氨基酸容器中裝入固體無水氨基酸(相對于樹脂4倍過量)。在偶聯步驟開始時，連續地傳遞選定體積的DMF和HOBt(4當量)的DMF溶液以及DIC(4當量)的DMF溶液，在每次傳遞后通過通入氮氣進行混合。在最后一次試劑傳遞后，通過通入氮氣啟動混合，進行4分鐘。這用于預活化氨基酸，并確保混合物的所有組分完全溶解。
在活化后，將活化的Fmoc-氨基酸溶液轉移至裝有樹脂的反應容器。在轉移完成后，攪拌容器3小時，同時周期性通入氮氣。在3小時偶聯時間后，用DMF(5mL/g，6次)徹底洗滌樹脂，用含有HOBt(0.1M)的25％哌啶的DMF溶液(5mL/g)進行Fmoc基團的切割(2×10分鐘)。用DMF(5mL/g，6次)徹底洗滌樹脂，以確保在制備中從樹脂中完全除去哌啶，用以保證氨基酸偶聯。就Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH和Fmoc-Gly-Gly-OH而言，在氨基酸瓶中不進行預活化，以便在如本文論述的活化時間當中使二酮哌嗪的形成減至最低。因此，在這兩種情況下，將氨基酸、HOBt和DIC的溶液序貫加入反應容器，并以“原位”活化實施偶聯方法。在完成鏈延伸之后，按標準方式脫去N-末端氨基酸的Fmoc基團，接著用DMF進行標準洗滌(參見上文)。然后，通過用新鮮制備的乙酰化混合物(0.5M乙酸酐、0.125M DIEA和0.015M HOBt的DMF溶液，6mL/g樹脂)處理2×20分鐘給N-末端氨基酸加帽。
首先用新鮮制備的10％肼的DMF溶液(5mL/g樹脂-2×10分鐘)脫去ε-氨基上的ivDde基團，而完成單體肽(根據需要具有Fmoc-Adoa或Fmoc-Lys(ivDde))的C-末端賴氨酸部分ε-氨基的官能化。為添加Fmoc-Adoa或Fmoc-Lys(ivDde)，把偶聯時間增加至10小時。在完成肽合成后，用切割混合物‘試劑B’(TFA:水:苯酚:三異丙基硅烷，88:5:5:2，體積/體積/重量/體積)(10mL/g樹脂)處理樹脂4小時。真空蒸發揮發物之后，用乙醚研磨膏狀物，得到固體，通過過濾收集，再用乙醚洗滌，干燥。10mmol規模的(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2合成得到30g(理論值的103％)粗肽。就(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2而言，10mmol規模的合成得到28g(理論值的107％)粗肽。超過理論得率最有可能是源于潮濕和殘余的溶劑。
線性二半胱氨酸肽環化為環狀二硫化物肽
通過DMSO輔助的氧化，使用DMSO/水(95/5，體積/體積)，由相應的線性二半胱氨酸肽制備環狀二硫化物肽。將粗線性肽溶解在廣口燒杯中的溶劑混合物(5mL/g)中，通過分批加入固體N-甲基-D-葡糖胺將溶液的pH調節至8.5。所得的混合物于室溫攪拌36小時。然后，用乙腈(50mL/g)稀釋該溶液，混合物攪拌2分鐘。固體環狀二硫化物肽通過過濾收集，用乙醚洗滌，并干燥。
單體肽的純化 肽單體(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2；Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys[Lys(ivDde)]-NH2環(6-13)二硫化物
將約0.5g部分的粗環狀二硫化物肽單體(12)溶解在最少量DMSO(約3mL)中。用20％ CH3CN-水將溶液體積調整至約100mL，使用第三個泵將溶液加到反相C18制備型柱(Waters，
Prep MS C18，10μ，
50×250mm，流速100mL/分鐘)上，該柱已用10％ CH3CN的水溶液(0.1％TFA)預平衡。在樣品溶液上樣的過程中，停止制備型HPLC系統中的平衡洗脫液流動。在樣品溶液上柱后，再啟動梯度HPLC系統中的平衡洗脫液流動，用10％ CH3CN-水(0.1％ TFA)洗脫該柱，直至洗脫出DMSO。然后，在1分鐘內將洗脫液的組成階次升至35％ CH3CN-水(0.1％ TFA)，此后，啟動0.5％/分鐘速率的CH3CN(0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的線性梯度，并保持50分鐘。使用220nm的UV作為產物洗脫的指示器手動收集流分(15mL)。所收集的流分在Waters XTerra分析型反相C-18柱(5μ顆粒，孔徑120
)上進行分析，合并純度>95％的含產物流分后凍干，得到相應的環狀二硫化物肽單體(12)。通常，0.5g粗肽單體(12)的純化得到0.1g(得率20％)所需產物(純度>95％)。
肽單體(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2；Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2環(2-12)二硫化物
按照用于肽單體(2)的HPLC純化的方法，將溶解在20％ CH3CN-水混合物(100mL)中的粗環狀二硫化物肽單體(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2(0.5g)加到反相C18制備型柱(Waters，
Prep MS C18，50×250mm，10μ顆粒，孔徑
流速100mL/分鐘)上，該柱已用10％ CH3CN(0.1％ TFA)的水(0.1％ TFA)溶液預平衡。在樣品溶液上柱的過程中，停止制備型HPLC系統中的平衡洗脫液流動。在樣品溶液上柱后，再啟動梯度HPLC系統中的平衡洗脫液流動，用10％ CH3CN-水(0.1％ TFA)洗脫該柱5分鐘。然后，在1分鐘內將洗脫液的組成階次升至30％CH3CN(0.1％ TFA)-水(0.1％ TFA)，啟動0.5％/分鐘速率的CH3CN(0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的線性梯度洗脫，并保持50分鐘。使用220nm的UV作為產物洗脫的指示器手動收集流分(15mL)。所述流分在Waters XTerra分析型反相C-18柱(4.6mm內徑×50mm，5μ顆粒，孔徑
)上進行分析，合并純度>95％的含產物流分后凍干，得到相應的環狀二硫化物肽單體(13)。通常，0.5g粗肽單體(3)的純化得到0.12g(得率24％)所需產物(純度>95％)。
實施例4 前體二聚體肽(16)Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2環(2-12)二硫化物]-NH2環(6-13)二硫化物；Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys[Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(-Adoa-Adoa-Glut-Lys)]-NH2環(2-12)二硫化物]-NH2環(6-13)二硫化物的制備和純化
如圖3所示，將戊二酸二琥珀酰亞胺酯(DSG，0.28g，0.86mmol)溶解在攪拌的無水二甲基甲酰胺(2.0mL)中，一次性加入二異丙基乙胺(0.11g，0.85mmol)。然后，在2分鐘的時間段內將固體肽單體(12)Ac-AGPTWC*EDDWYYC*WLFGTGGGK-[K(ivDde)]-NH2(0.50g，0.17mmol)分批加入攪拌的DSG溶液中。在室溫攪拌30分鐘后，用無水乙酸乙酯將該溶液稀釋至約50mL，(其用于沉淀中間體單NHS酯(14))。離心整個混合物，傾析上清液，留下為無色固體的中間體單NHS酯(14)。用乙酸乙酯重懸浮固體；離心含有懸浮的固體單NHS酯(14)的溶液，以分離固體，再傾析上清液。重復此清洗方法2次，以完全除去過量的DSG。
將固體單NHS酯(14)溶解在攪拌的無水二甲基甲酰胺(2.0mL)中，加入二異丙基乙胺(0.11g，0.85mmol)。然后，在3分鐘時間段內，向攪拌的溶液中分批加入固體肽單體(13)Ac-VC*WEDSWGGEVC*FRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2(0.50g，0.19mmol，1.12當量)，對所得混合物攪拌18小時。通過質譜監測反應；在證實完全消耗了肽單體戊二酸單酰胺單NHS酯(14)之后，加入純凈肼(0.1mL)，以脫去具有ivDde的二聚體(15)的ivDde保護基，并于室溫攪拌混合物20分鐘。
然后，通過滴加TFA酸化溶液，并用10％ CH3CN(0.1％ TFA)的水(0.1％ TFA)溶液稀釋混合物至100mL。過濾溶液，以除去顆粒，將一半的澄清溶液加到反相C18制備型柱(Waters，
Prep MS C18，10μ，50×250mm，流速100mL/分鐘)上，該柱已用10％ CH3CN的水(0.1％ TFA)溶液預平衡。在樣品溶液上柱的過程中，停止制備型HPLC系統中的平衡洗脫液流動。在樣品溶液上柱后，再啟動梯度HPLC系統中的平衡洗脫液流動，用10％ CH3CN-水(0.1％ TFA)洗脫該柱，以便將DMF從柱中沖出來。在完成DMF塞流洗脫后，在1分鐘內將洗脫液組成增加至20％ CH3CN，用0.6％/分鐘速率的CH3CN(0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的線性梯度繼續洗脫。使用220nm的UV作為產物洗脫的指示器收集流分(15mL)。流分在反相C18柱(Waters MS C18，4.6mm內徑×50mm，5μ顆粒，孔徑
)上進行分析，合并純度>95％的含產物流分后凍干，得到為無色蓬松固體的前體二聚體肽(16)。以相同方式純化剩余的粗前體二聚體肽(16)。由0.5g的每種單體肽(12)和(13)獲得320mg(總得率33％)的所需二聚體(16)(純度>95％)。
實施例5 結合KDR的二聚體肽磷脂綴合物(11)乙酰-L-丙氨酰-甘氨酰-L-脯氨酰-L-蘇氨酰-L-色氨酰-L-半胱氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-天冬氨酰-L-色氨酰-L-酪氨酰-L-酪氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-1-亮氨酰-L-苯丙氨酰-甘氨酰-L-蘇氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰[乙酰-L-纈氨酰-L-半胱氨酰-L-色氨酰-L-谷氨酰-L-天冬氨酰-L-絲氨酰-L-色氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-谷氨酰-L-纈氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-L-精氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-賴氨酰(二硬脂酰磷酸乙醇胺羰基氧基-PEG2000-氨基-8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-8-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-戊二酰-L-賴氨酰)酰胺環(2-12)二硫化物]-酰胺環(6-13)二硫化物；Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2環(2-12)二硫化物}-NH2環(6-13)二硫化物；Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys{Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys[-Adoa-Adoa-Glut-Lys(DSPE-PEG2000-NH-Glut)-]-NH2環(2-12)二硫化物}-NH2環(6-13)二硫化物的制備
如圖4所示，可通過將前體二聚體肽(16)Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)[-NH2環(2-12)二硫化物]-NH2環(6-13)二硫化物和DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(18)綴合來制備結合KDR的二聚體(11)。
在3分鐘的時間段內，邊攪拌邊向戊二酸二琥珀酰亞胺酯(DSG，0.15g，0.46mmol)和二異丙基乙胺(0.06g，0.47mmol)的無水DMF(3.0mL)溶液中分批加入固體前體二聚體肽(16)(0.5g，0.092mmol)。然后，于室溫攪拌該溶液30分鐘。用無水乙酸乙酯稀釋反應混合物至約50mL；這導致前體二聚體肽(16)的戊二酸單酰胺單NHS酯—二聚體戊二酸單酰胺單NHS酯(17)沉淀。離心該溶液，得到為無色固體的沉淀6(m/z，負離子，1887.3(M-3H)/3，1415.1(M-4H)/4，1131.9(M-5H)/5)。含有過量DSG的上清液乙酸乙酯層從壓緊的固體二聚體戊二酸單酰胺單NHS酯(17)傾析出去，該固體再重懸浮在乙酸乙酯中，離心，再多洗滌2次，以除去余下的痕量DSG。將由此獲得的固體中間體戊二酸單酰胺單NHS酯二聚體衍生物(17)溶解在無水DMF/CH2Cl2(8:2，體積/體積)(3.0mL)中；加入二異丙基乙胺(0.06g，0.47mmol)，并攪拌溶液。
此時，將DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(18)(0.235g，0.084mmol，0.9當量)懸浮在單獨燒瓶的無水二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(2滴)，以使磷酸二酯氧質子化，促進磷脂銨鹽(18)在二氯甲烷中的溶解。濃縮澄清溶液以除去揮發物，進一步真空干燥。
將固體磷脂銨鹽(18)溶解在DMF(2mL)中，并轉移至戊二酸單酰胺單NHS酯二聚體衍生物(17)的攪拌溶液中，將所得混合物于室溫攪拌24小時。用50％ CH3OH、25％ CH3CN和25％水(1:1)的溶液稀釋反應混合物至約100mL，過濾不溶物。將一半濾過溶液加到反相C4制備型柱(
Prep C4，10μ，
50×250mm)上，該柱已用CH3OH和CH3CN(1:1，0.1％ TFA)和水(0.1％ TFA)的1:1混合物以100mL/分鐘流速預平衡。在樣品溶液上柱的過程中，停止制備型HPLC系統中的平衡洗脫液流動。在樣品溶液上樣后，再啟動平衡洗脫液的流動，洗滌該柱，直至洗脫出DMF塞流。
然后在1分鐘內將洗脫液的組成階次升至70％ CH3OH-CH3CN(1:1，0.1％ TFA)-水(0.1％ TFA)，啟動0.75％/分鐘CH3OH-CH3CN(1:1，0.1％ TFA)至水(0.1％ TFA)的線性梯度。在達到100％ B后繼續洗脫，以便實現從柱中完整洗脫下產物。使用UV(220nm)作為產物洗脫指示器收集流分(15ml)，在洗脫出主要產物后，繼續收集流分達幾分鐘，以便確保痕量的原料磷脂銨鹽(18)的洗脫。使用220nm的UV和蒸發光散射檢測器(ELSD)，在分析型HPLC系統(柱YMC C4，5μM，
4.6×250mm)上檢查流分的純度。使用后一檢測器檢測DSPE-PEG2000-NH2，其于220nm具有弱發色團。合并純度>98％且沒有DSPE-PEG2000-NH2磷脂銨鹽(8)的含產物流分，并濃縮，以減少CH3OH含量。然后，用10％ CH3CN的水溶液稀釋該溶液，直至形成微弱的絮狀沉淀。凍干所得溶液，得到為無色固體的二聚體肽磷脂綴合物(11)。如上所述純化第二部分的粗二聚體肽磷脂綴合物(11)。目標二聚體肽磷脂綴合物(11)的合并產量為0.39g(得率57％)。將由不同樣品純化輪次制備的二聚體肽磷脂綴合物(11)樣品合并在一起，溶解在叔丁醇-乙腈-水混合物中再次凍干，得到為無色蓬松固體的二聚體肽磷脂綴合物(11)，進一步真空干燥。
下面的實施例6-8涉及示于圖5的二聚體肽-磷脂綴合物的制備，其中二聚體綴合物含有非常低水平的TFA。圖6-8圖解了以下實施例中描述的方法。
實施例6 經使用戊二酰接頭制備具有低TFA水平的二聚體綴合物 通過AG MP-50離子交換樹脂將(22)、(25)和二聚體肽27·nTFA鹽轉變為乙酸鹽制備(23)、(26)和二聚體肽(27)乙酸鹽
對于化合物(23)，將AG MP-50離子交換樹脂(1.5meq/mL樹脂床)懸浮在20％ CH3CN/H2O中。將懸浮液裝入3×30cm玻璃柱中，最終體積為150mL。將該柱連接至泵和電導表，以17mL/分鐘的流速用20％ CH3CN/H2O洗滌，直至電導率低于1μs/cm。將化合物(22)(210mg)溶解在20％ CH3CN/H2O(80mL)中，將所得溶液上柱。該柱再用同樣的洗脫液洗滌，直至其電導率低于1μs/cm。以200mM、400mM、600mM和800mM各250mL施加NH4OAc在20％ CH3CN/H2O中的梯度。化合物出現在600mM NH4OAc中。通過HPLC分析各流分，合并含有所述化合物的流分后凍干幾次，直至物質重量恒定。獲得176mg為白色蓬松固體的純物質(23)。得率為83.8％。
其它的參數和結果如下HPLC保留時間5.6分鐘；測定>98％(面積％)；柱子Waters XTerra MS-C18，4.6×50mm，5μ顆粒，孔徑
；洗脫液AH2O(0.1％ TFA)，BCH3CN(0.1％ TFA)；洗脫初始條件15％ B，在8分鐘內線性梯度15-50％ B；流速3mL/分鐘；檢測220nm的UV；質譜API-ES；模式負離子；1441.7[M-2H]/2，960.9[M-3H]/3；CE分析(抗衡離子％重量/重量)TFA估計為0.3％；乙酸鹽1.1％。
對于化合物(26)，按照用于化合物(23)的相同方法，將300mg肽TFA鹽(25)在80mL水中的溶液以17mL/分鐘加到150mL AG MP-50柱上，用H2O洗該柱子至電導率為1μs/cm。然后，在上樣后再用H2O洗該柱，施加與化合物(23)的離子交換所用一樣的NH4OAc水溶液至H2O的相同階梯梯度。凍干合并流分至恒重，得到200mg為白色蓬松固體的乙酸鹽(26)。得率為66.7％。
其它的參數和結果如下HPLC保留時間5.6分鐘；測定97.0％(面積％)；柱子Waters XTerra MS-C18，4.6×50mm，5μ顆粒，孔徑
；洗脫液AH2O(0.1％ TFA)，BCH3CN(0.1％ TFA)；洗脫初始條件15％ B，在8分鐘內線性梯度15-50％ B；流速3mL/分鐘；檢測220nm的UV；質譜API-ES；模式負離子；1336.9[M-2H]/2，890.8[M-3H]/3；CE分析(抗衡離子％重量/重量)TFA估計為0.4％；乙酸鹽4.2％；IC分析(F％)0.26。
對于二聚體肽(27)乙酸鹽，和用于化合物(23)的方法類似，用30％ CH3CN/H2O洗滌AG MP-50柱(100mL濕體積)，直至電導率低于1μs/cm。將化合物(27)的TFA鹽(120mg，在80mL的30％ CH3CN/H2O中)加到該柱上，用同樣的洗脫液洗滌該柱，直至電導率穩定在1μs/cm。和對化合物(23)一樣實施NH4OAc 30％CH3CN/H2O至30％ CH3CN/H2O的階梯梯度，以約600mM NH4OAc洗脫化合物。凍干合并的流分，然后再凍干幾次，直至物質呈現恒重，得到104mg為乙酸鹽的純物質(27)。得率為86.7％。
其它的參數和結果如下HPLC保留時間5.2分鐘；測定>99％(面積％)；柱子Waters XTerra MS-C18，4.6×50mm，5μ顆粒，孔徑
；洗脫液AH2O(0.1％ TFA)，BCH3CN(0.1％ TFA)；洗脫初始條件20％ B，在8分鐘內20-60％ B的線性梯度；流速3mL/分鐘；檢測220nm的UV；質譜API-ES；模式負離子；1816.3[M-3H]/3，1362.0[M-4H]/4，1089.2[M-5H]/5；CE分析(抗衡離子％重量/重量)TFA估計為0.2％；乙酸鹽0.15％。
由化合物(23)和化合物(26)制備和純化二聚體肽(27)乙酸鹽
向戊二酸二琥珀酰亞胺酯(18mg，0.055mmol)的無水DMF(0.1mL)溶液中加入化合物(23)(0.1mg，0.021mmol)在0.2mL無水DMF液滴(pH8，用DIEA中和)中的溶液。于室溫攪拌澄清溶液0.5小時。HPLC和MS顯示反應完成。真空除去溶劑，加入EtOAc(8mL)，以沉淀中間體(24)。離心混合物，傾析，以除去過量戊二酸酯。再重復此EtOAc洗滌多3次，所得的固體使用干燥的氮氣流干燥，然后將其溶解在0.3mL無水DMF中。加入化合物(26)(56mg，0.021mmol)，通過加入DIEA將溶液的pH調節至8。于室溫攪拌溶液16小時，此后通過HPLC和MS分析判斷反應完成情況。加入30μL等份的NH2NH2，攪拌混合物5分鐘，以切下ivDde基團。反應混合物通過HPLC和MS分析，這表明脫去了所有的ivDde基團。
在純化二聚體肽(27)乙酸鹽之前，要注意小心地用無TFA的洗脫液、CH3CN/H2O/10mM NH4OAc洗滌整個制備型HPLC系統，包括柱子。然后，將粗反應混合物加到反相C-18制備型柱(Atlantis C-18，5μm顆粒，孔徑
30×150mm，流速30mL/分鐘)上，用15％ B(A10mM NH4OAc在H2O中的溶液；B10mMNH4OAc在CH3CN/H2O中的溶液，9/1，體積/體積)預平衡。用同樣的洗脫液洗柱子，直至洗脫出DMF塞流。在2分鐘內將洗脫液組成增加至25％ B，然后在40分鐘內階次升至65％ B。流分在分析型反向C-18柱(Waters MS C-18，4.6×50mm，5μm顆粒，孔徑
流速3mL/分鐘)上進行分析，合并純度>95％的含產物流分后凍干，得到25mg為其乙酸鹽的二聚體肽(27)，為白色蓬松固體。得率為21.8％。
其它的參數和結果如下HPLC保留時間5.2分鐘；測定>99％(面積％)；柱子Waters XTerra MS-C18，4.6×50mm，5μ顆粒，孔徑
；洗脫液AH2O(0.1％ TFA)，BCH3CN(0.1％ TFA)；洗脫初始條件20％ B，在8分鐘內20-60％ B的線性梯度；流速3mL/分鐘；檢測220nm的UV；質譜API-ES；模式負離子；[M-3H]/3，1362.0[M-4HJ/4，1089.2[M-5H]/5；CE分析(抗衡離子％重量/重量)TFA估計低于0.2％；乙酸鹽1.1％。
實施例7-圖7 經離子交換樹脂制備具有低TFA水平的二聚體肽-磷脂綴合物由二聚體肽(27)乙酸鹽制備和純化為其乙酸鹽的磷脂肽綴合物(21)
向戊二酸二琥珀酰亞胺酯-DSG(3.7mg，11.3μmol)的無水DMF(0.1mL)溶液中滴加已中和的二聚體肽(27)乙酸鹽(15mg，2.75μmol)的無水DMF(0.2mL)溶液。反應溶液于室溫攪拌0.5小時。采用Waters XTerra C-18柱的HPLC分析和MS表明反應完成。蒸發溶劑，加入EtOAc(8mL)，以沉淀中間體(28)。離心裝有沉淀的中間體(28)的容器，傾析液體層。重復該方法3次，以除去過量的DSG。固體用干燥的氮氣流干燥，然后溶解在0.3mL無水DMF中。加入固體形式的DSPE-PEG 2000-NH2銨鹽(29)(6.5mg，2.33μmol)，將混合物的pH調節至(28)。反應混合物于室溫攪拌16小時。通過MS和采用Zorbax 300 SB-C3柱的HPLC分析混合物，表明反應完成。
為使TFA對產物的潛在污染最小化，通過配備使用新的Zorbax 300 SB-C3柱(21.2×150mm，5μ顆粒)的制備型HPLC純化粗反應混合物，該柱從未接觸過TFA。利用CH3CN/H2O/NH4OAC徹底地預清洗HPLC系統，以除去痕量TFA。將反應混合物加到該柱上，該柱用20％B(A10mM NH4OAc在H2O中的溶液；B10mMNH4OAc在CH3CN/H2O中的溶液，9/1體積/體積)以30mL/分鐘的流速預平衡。該柱用同樣的洗脫液以30mL/分鐘洗脫，直至洗脫出DMF塞流。然后，在3分鐘內將洗脫液組成增加至40％ B，然后在50分鐘內階次升至90％ B。所收集的流分在分析型反相C-3柱(Zorbax 300SB-C3，3×150mm，3.5μm顆粒，孔徑
流速0.5mL/分鐘)上進行分析，其中檢測使用220nm的UV和蒸發光散射檢測器(ELSD)完成。合并含有純產物的流分后凍干。獲得6.5mg部分的終產物(21)乙酸鹽。得率為33.0％。
其它的參數和結果如下HPLC保留時間13.3分鐘；測定>99％(面積％)；柱子Zorbax 300SB-C3，3×150mm，3.5μm，孔徑
洗脫液AH2O(0.1％ TFA)，BCH3CN/MeOH(0.1％ TFA)；洗脫初始條件60％ B，3分鐘內60-90％ B的線性梯度；流速0.5mL/分鐘；檢測220nm的UV和ELSD；CE分析(抗衡離子％重量/重量)％重量TFA0.3％；％重量乙酸鹽0.4％。
實施例8-圖8 使用Zorbax C-3 RP制備型HPLC和Sephadex G-25凝膠滲透層析經序貫純化制備具有低TFA水平的二聚體綴合物
使用的材料和用于分析型HPLC系統的條件包括柱子Zorbax 300SB C-3；3mm內徑×150mm；3.5μm顆粒；洗脫液AH2O(HPLC級，以體積計含有0.1％ TFA)；洗脫液BCH3CN(以體積計0.1％ TFA)。洗脫初始條件50％ B，然后在3分鐘內50-90％ B的線性梯度，于90％ B保持11分鐘；流速0.5mL/分鐘；檢測220nm的UV。保留時間(化合物(21))6.77分鐘，保留時間(溶解型的)4.06分鐘。
使用制備型Zorbax C-3柱的制備型HPLC從(21)中除去溶解型化合物
以30％洗脫液B的濃度加載粗化合物。使用的材料和條件包括條件柱子Waters Zorbax 300SB C-3；21.2mm內徑×150mm；3.5μm顆粒；洗脫液洗脫液AH2O(HPLC級，含10mM NH4OAc)；洗脫液BCH3CN/H2O，9/1(最終NH4OAc濃度10mM)。
然后在2分鐘內改變洗脫液的組成至45％ B，然后在40分鐘內用45-100％ B的線性梯度洗脫該柱；流速30mL/分鐘；檢測于220nm的UV。
將粗化合物(100mg)溶解在25mL 30％ B溶液中。制備型HPLC系統以30％ B平衡。將化合物加到Zorbax C-3柱上。移動相組成在2分鐘內階次升至45％ B。使用在40分鐘內45-100％ B的線性梯度洗脫(21)。洗脫的產物介于26.5-33分鐘之間。
合并含有(21)的流分后凍干，得到白色蓬松固體，將其溶解在水-乙腈中，然后再凍干。這得到70mg沒有溶解型化合物的產物。回收率約為70％。在層析完成后，用95％ B以30mL/分鐘流速洗滌系統15分鐘。然后，用CH3CN/H2O(50/50，沒有TFA或緩沖劑)以15mL/分鐘流速洗滌該柱30分鐘。然后，將該柱儲存于室溫，以備后用。分析型HPLC證實在分離的物質中沒有溶解型化合物。進一步分析證實，在室溫5分鐘后沒有形成溶解型化合物。所述物質仍包含顯著量(4.2重量％)的TFA。
在Sephadex G-25上通過凝膠滲透層析從(21)中除去TFA
用4L 50mM碳酸氫銨平衡Sephadex G-25柱(100g樹脂，珠子大小20-80μm，總凝膠體積約500mL，柱高27cm)。然后，將(21)(70mg)溶解在30mL(終體積)的60mM碳酸氫銨的10％乙腈水溶液中。過濾溶液，然后加到Sephadex G-25柱上。該柱用50mM碳酸氫銨緩沖液洗脫，收集流分10mL。所收集的流分通過分析型HPLC(于220nm進行UV檢測)進行監測。結果見下表4。
表4
合并流分20-28后凍干。所得的凍干物質再溶解在少量水中，溶液冷凍后再凍干，以除去剩余量的碳酸氫銨。所需物質的最終重量為58mg。回收率為83％。
為確定TFA被有效除去，對樣品的TFA和乙酸根離子進行CE分析。按照前述測定，TFA明顯存在于原材料(4.2％)中，但在凝膠滲透步驟后幾乎檢測不到(0.2％)。未檢測到乙酸根離子。通過串聯的Zorbax C-3制備型HPLC和Sephadex G-25凝膠滲透層析獲得的(21)的分析數據
用于收集分析數據的材料和條件包括氟分析(通過QTI的IC)751ppm(0.15％ TFA重量/重量)；質譜方法MALDI-TOF；模式正離子；檢測的平均分子量為8461，觀察到典型的PEG2000質量分布曲線。HPLC系統A柱子Zorbax300SB C-3；3mm內徑×150mm；3.5μm顆粒；洗脫液A水(HPLC級，以體積計含有0.1％ TFA)；洗脫液B乙腈(以體積計含0.1％TFA)。初始條件50％ B；洗脫在3分鐘內50-90％ B的線性梯度，于90％ B保持11分鐘；流速0.5mL/分鐘；檢測于220nm的UV。保留時間6.77分鐘；面積％99.6％。系統B柱子Zorbax 300SB C-3；3mm內徑×150mm；3.5μm顆粒；洗脫液A水(HPLC級，以體積計含0.1％ TFA)；洗脫液B乙腈(以體積計含0.1％ TFA)。初始條件50％ B；洗脫在3分鐘內50-90％ B的線性梯度，然后在12分鐘內階次升至100％ B。流速0.5mL/分鐘；檢測LSD；保留時間13.98分鐘。面積％99.3％。
下表5提供了在實施例9-12中所用縮寫詞的定義以及所涉及材料的來源。
表5 *酸性形式，即硬脂酸，可以以本文的任一種微泡制劑使用。
實施例9 用DSPC/DPPG包囊制備靶向微泡 實施例9A
在60℃水浴中，將383mg DSPC/DPPG/和示于圖5的二聚體肽磷脂綴合物(11)的混合物(摩爾比49.75/49.75/0.5，三種組分分別相當于187.1mg、176.4mg和19.8mg)和PEG-4000(22.6g)溶解在120g叔丁醇中。將溶液裝入小瓶中，每瓶0.8ml溶液。樣品在-45℃冷凍，再凍干。頂部空間的空氣用C4F10/氮氣(50/50)混合氣體置換，小瓶加蓋卷邊。每瓶凍干的樣品用5mL H2O重配。
實施例9B
重復實施例9A，只是使用DSPC/DPPG/和示于圖10的單體肽磷脂綴合物(31)(摩爾比49.5/49.5/1，三種組分分別相當于182.8mg、172.3mg和28.2mg)的混合物。
實施例10 用DPPE/DPPG包囊制備靶向微泡 實施例10A
于60℃，用500μl蒸餾水制備DSPE-PEG1000(0.43mg-0.24μmol)和示于圖10的單體肽磷脂綴合物(31)(3.0mg-0.5μmol)的水性混懸液，得到膠束混懸液。
于70℃，單獨地將DPPE(15.8mg-22.8μmol)和DPPG(4.2mg-5.7μmol)分散在10％甘露醇的蒸餾水(20mL)溶液中達20分鐘。然后，將分散液冷卻至室溫。使用高速勻漿器(PolytronPT3000，軸直徑3cm)，將全氟庚烷(1.6mL)在水相中以10500rpm乳化1分鐘，得到乳狀液。
將膠束混懸液加入到乳狀液中，邊攪拌邊將所得混合物于60℃加熱1小時。在冷卻至室溫后(1小時)，將所得乳狀液分為在50mL圓底燒瓶中的4mL部分。將乳狀液于-45℃冷凍5分鐘，以0.2mBar凍干24小時(凍干機Christ Beta 1-8K)。
在重分配前，使凍干物接觸含C4F10/氮氣(以體積計50/50)的氣體。然后，輕輕用手搖動將凍干的產物分散在2倍初始體積的水中。
實施例10B
于60℃，用500μl蒸餾水制備DSPE-PEG1000(0.5mg-0.27μmol)和示于圖5的二聚體肽磷脂綴合物(11)(5.3mg-0.63μmol)的水性混懸液，得到膠束混懸液。
于70℃，單獨地將DPPE(15.8mg-22.8μmol)和DPPG(4.2mg-5.7μmol)分散在10％ PEG4000的蒸餾水(20mL)溶液中達20分鐘。然后，將分散液冷卻至室溫。使用高速勻漿器(Polytron PT3000，軸直徑3cm)，將全氟庚烷(1.6mL)在水相中以10000rpm乳化1分鐘，得到乳狀液。
將膠束混懸液加入到乳狀液中，邊攪拌邊將所得混合物于80℃加熱1小時。在冷卻至室溫后(1小時)，通過離心(200g/10分鐘，Sigma離心機3K10)將所得乳狀液洗滌1次，以除去過量磷脂。回收分離的沉淀(含有乳化的溶劑微滴)，并用初始體積的10％PEG4000水溶液重懸浮。
取所得乳狀液加到DIN8R小瓶(1mL/小瓶)中。然后，冷卻小瓶至-50℃(Christ Epsilon 2-12DS凍干機)，并于-25℃和0.2mBar凍干12小時，最后的干燥步驟為30℃和0.1mBar達7小時。小瓶暴露于含有C4F10/氮氣(以體積計35/65)的氣體并密封。輕輕用手搖動將凍干產物再分散在2倍初始體積的水中。
實施例11 用DSPC/DSPA包囊制備靶向微泡 實施例11A
于60℃，用1mL蒸餾水制備DSPE-PEG1000(2.5mg-1.4μmol)和示于圖5的二聚體肽綴合物(11)(7.0mg-0.84μmol)的水性混懸液，得到膠束混懸液。
于80℃，單獨地將DSPC(16.3mg-20.6μmol)和DSPA(3.7mg-5.15μmol)溶解在環辛烷(1.6mL)中。向該有機相中加入10％ PEG4000的水溶液(20mL)，使用高速勻漿器(Polytron PT3000，軸直徑3cm)以8000rpm乳化1分鐘，得到乳狀液。
將膠束混懸液與乳狀液混合，邊攪拌邊將所得混合物于80℃加熱1小時。在冷卻至室溫后(1小時)，通過離心(1500g/10分鐘，Sigma離心機3K10)將所得乳狀液洗滌1次，以除去過量磷脂。回收分離的上清液(含有乳化的溶劑微滴)，并分兩次重懸浮在初始體積的10％ PEG4000水溶液中。
取所得混懸液加到DIN8R小瓶(1mL/小瓶)中。然后，冷卻小瓶至-50℃(Christ Epsilon 2-12DS凍干機)，并于-25℃和0.2mBar凍干12小時，最后的干燥步驟為30℃和0.1mBar達7小時。小瓶暴露于含有C4F10/氮氣(以體積計35/65)的氣體并密封。輕輕用手搖動將凍干產物分散在2倍初始體積的水中。
實施例11B
重復實施例11A，只是使用0.7mg DSPE-PEG2000(0.26μmol)和示于圖2的1.6mg單體肽-磷脂綴合物(1)(0.26μmol)來制備膠束混懸液。
實施例11C
于80℃，將DSPC(16.3mg-20.6μmol)、DSPA(3.7mg-5.15μmol)和示于圖1的單體肽磷脂綴合物(1)(1.6mg-0.26μmol)溶解在環辛烷(1.6mL)中。使用高速勻漿器(Polytron PT3000，軸直徑3cm)，將該有機相在10％ PEG4000水相(20mL)中以8000rpm乳化1分鐘，得到乳狀液。
邊攪拌邊將所得乳狀液于80℃加熱1小時。在冷卻至室溫后(1小時)，用20ml的10％ PEG4000水溶液稀釋所得乳狀液。
取乳狀液加到DIN8R小瓶(1mL/小瓶)中。然后，冷卻小瓶至-50℃(Christ Epsilon 2-12DS凍干機)，并于-25℃和0.2mBar凍干12小時，最后的干燥步驟為30℃和0.1mBar達7小時。小瓶暴露于含有C4F10/氮氣(以體積計35/65)的氣體并密封。輕輕用手搖動將凍干產物分散在2倍初始體積的水中。
實施例12 用DSPC/硬脂酸鹽包囊制備靶向微泡 實施例12A
于60℃，用660μL蒸餾水制備DSPE-PEG1000(2.5mg-0.9μmol)和示于圖5的二聚體磷脂綴合物(11)(2.5mg-0.3μmol)的水性混懸液，得到膠束混懸液。
于80℃，單獨地將DSPC(18.2mg-23.1μmol)和硬脂酸鹽(1.8mg-5.8μmol)溶解在環辛烷(1.6mL)中。向該有機相中加入10％ PEG4000的水溶液(20mL)，使用高速勻漿器(Polytron T3000，軸直徑3cm)以9000rpm乳化1分鐘，得到乳狀液。
將膠束溶液與乳狀液混合，邊攪拌邊將所得混合物于80℃加熱1小時。在冷卻至室溫后(1小時)，通過離心(1500g/10分鐘，Sigma離心機3K10)將所得乳狀液洗滌1次，以除去過量磷脂。回收分離的上清液(含有乳化的溶劑微滴)，并分兩次重懸浮在初始體積的10％ PEG4000水溶液中。
取所得混懸液加到DIN8R小瓶(1mL/小瓶)中。然后，冷卻小瓶至-50℃(Christ Epsilon 2-12DS凍干機)，并于-25℃和0.2mBar凍干12小時，最后的干燥步驟為30℃和0.1mBar達7小時。小瓶暴露于含有C4F10/氮氣(以體積計35/65)的氣體并密封。輕輕用手搖動將凍干產物分散在2倍初始體積的水中。
實施例12B
重復實施例12A，只是用相同相對摩爾量的示于圖2的單體肽磷脂綴合物(1)替代示于圖5的二聚體肽磷脂綴合物(11)。
實施例12C
重復實施例11C，只是用DSPC(18.2mg-23.1μmol)、硬脂酸鈉(1.8mg-5.8μmol)和示于圖5的二聚體肽磷脂綴合物(11)(2.2mg-0.26μmol)。用于乳化的攪拌速度固定在9000rpm。在冷卻至室溫后(1小時)，通過離心(1500g/10分鐘，Sigma離心機3K10)將所得乳狀液洗滌1次，以除去過量磷脂。回收分離的上清液(含有乳化的溶劑微滴)，并分兩次重懸浮在初始體積的10％ PEG4000水溶液中。
實施例13 對KDR轉染細胞的靜態結合測試 質粒生產和純化
將全長KDR克隆到pcDNA6載體中，讓質粒在感受態DH5α大腸桿菌中擴增。使用大腸桿菌JM109和來自Quiagen的試劑盒進行質粒擴增和純化。
在
蓋玻片上轉染293H細胞
細胞在24孔板中的涂覆聚-D-賴氨酸的
環形蓋玻片上生長。按照脂轉染胺(lipofectamine)2000方案(Invitrogen，目錄號11668-019)的推薦，使用1μgDNA(pc-DNA6-fKDR)/每蓋玻片(1.3cm2)以0.1mL進行轉染。轉染在無血清培養基中進行，在2小時后從細胞中去除轉染試劑混合物，更換為常規含血清培養基。某些被覆細胞的蓋玻片進行模擬轉染(沒有DNA)。第二天，通過免疫細胞化學評價KDR受體的表達，并進行結合測定。
氣泡結合測定
將轉染的細胞與重懸浮在50％人血漿的PBS溶液中的KDR靶向微泡溫育。為與轉染細胞溫育，使小塑料帽充滿含有1.3×108個氣泡的混懸液，用倒置的
蓋玻片加蓋，以便使轉染細胞接觸靶向微泡。室溫下溫育30分鐘后，用鑷子夾起蓋玻片，用PBS漂洗3次，然后放在顯微鏡下檢查，以評價靶向微泡的結合。
測定微泡覆蓋的表面百分率
用數碼相機DC300F(Leica)獲得圖像，使用軟件QWin3.1版(Leica Microsystem AG，Basel，Switzerland)確定在成像區域中結合微泡覆蓋的表面百分率。獲取每個
蓋玻片的圖片。對于實施例9和10中的每個制備物，都重復結合測定至少2次，由此獲得所覆蓋表面的平均值。在下表6和7中記錄了按照以上的實施例9和10制備的微泡的結合活性。
如這些表所示，同一種肽在(作為脂肽)納入不同的磷脂制劑中時可顯示出不同的結合活性，形成微泡的穩定包囊。含有本發明的KDR結合脂肽的微泡特異性結合表達KDR的細胞，同時它們不顯著結合模擬轉染的細胞。
實施例14 對rh VEGF-R2/Fc嵌合蛋白的動態結合測試 涂覆Fc-VEGF-R2的蓋玻片的制備
按照以下方法用重組人VEGF-R2/Fc嵌合蛋白(R&DSystems)涂覆玻璃蓋玻片(直徑40mm，Bioptechs Inc.，Butler，PA，USA)。
使用特定標記(Dako Pen)，在玻璃蓋玻片上劃分14×25mm尺寸的表面，將在PBS中為4μg/mL的400μL Fc-VEGF-R2溶液沉積在該表面上。于4℃過夜溫育后，吸出溶液，更換為0.5mL1％重量/體積BSA的PBS-0.05％吐溫(Tween)80溶液(pH7.4)，并于室溫溫育3小時。然后，用5ml PBS-0.05％吐溫(Tween)80洗滌蓋玻片3次。
結合測定
使用平行平板流動室(FCS2，Bioptech Inc.，Butler，PA，USA)進行靶向氣泡的結合研究，所述室的室墊圈厚0.25mm，帶有定制的用于上下室倒置的轉接器。將涂覆的蓋玻片作為流動室的平板插入。使用帶有60mL注射器(Terumo)的可調節輸注泵(Auto
AS50輸注泵，Baxter，Deerfield，IL，USA)通過流動室汲出微泡(5×106個氣泡/mL，在50％人血漿的PBS溶液中)。將泵流速調節至1mL/分鐘，得到需要的剪切流速約為114s-1。在10分鐘后，停止流動，使用40倍物鏡和連接至倒置Olympus IX 50顯微鏡的CCD單色照相機(F-View II，Soft Imaging Systems，Germany)在蓋玻片上的不同位置(約0.025mm2的面積上)隨機獲取圖片。
測定每張圖片上的微泡數目，對圖片總數求平均值，然后將得出的值除以10(得出“斜率”，即每分鐘的結合微泡的平均數)。
對于實施例11和12的每種制備物，重復4次結合測定，由此獲得斜率平均值。
斜率代表目標基質上的氣泡結合速率。例如，斜率值8表示在10分鐘內平均有80個微泡結合在涂覆的蓋玻片上。較高的斜率表示在流動條件下氣泡結合靶標的能力更好。
在下表8和9中，描述了按照以上實施例11和12制備的微泡的結合活性。
由這些表可以推斷，同一種肽在(作為肽-磷脂綴合物或脂肽)納入不同的磷脂制劑中時可顯示出不同的結合活性，形成微泡的穩定包囊。
表6 表7 表8 表9 實施例15 靶向KDR的超聲造影劑的體內評價
使用已知的血管生成模型兔VX2腫瘤模型，在體內評價含有本發明的KDR結合脂肽的超聲造影劑結合表達KDR的組織的能力。
使用已知的血管生成組織模型檢查靶向KDR的超聲微泡定位于血管生成組織并提供血管生成組織的圖像的能力。將VX2兔癌癥順次移植入重2.5/3kg的新西蘭兔(Charles River Laboratories，France)的背肌中。
腫瘤勻漿物的制備
用手術方法切取腫瘤，放入含有10％胎牛血清、抗生素、1.5mM Glutamax 1的McCoy氏培養基中，切成小塊，進行漂洗，以去除血液和碎片。然后，將腫瘤塊(3-5cm3)放入裝有5mL完全培養基的50ml Falcon管中。搗碎腫瘤組織(Polytron)，直至不再觀察到固體塊。以300g離心渾濁液體5分鐘，棄去上清液。每5mL沉淀加入7mL新鮮培養基。
腫瘤移植
兔子首先接受0.3mL Vetranquil(Acepromazine，Sanofi，肌內注射)，然后用肌內注射
5/噻拉嗪(VeterinariaAG/Sigma)混合物(50/10mg/mL，0.7mL/kg)麻醉。肌內注射100μl的VX2腫瘤勻漿物。在移植VX2腫瘤后15天，再用相同混合物麻醉動物，外加皮下注射50％烏拉坦(2mL/kg，皮下)(Sigma)，供成像試驗用。
體內超聲成像
VX2腫瘤成像使用配有L7-4線陣探頭的超聲成像系統ATL HDI 5000裝置進行。以高聲功率(MI＝0.9)使用B-模式脈沖倒置評價在新血管內皮上表達的KDR受體上的靶向微泡累積。線陣探頭固定在直接覆蓋移植腫瘤的皮膚上。
在使用實施例16或實施例17的制備物進行氣泡注射(0.1μL/kg氣體)后，停止聲波作用，以允許氣泡累積25分鐘。然后，再以高聲功率(MI0.9)啟動聲波作用，破壞腫瘤中存在的所有氣泡。然后，通過記錄無聲波作用下的20秒累積后獲得的信號，評測游離的循環氣泡的量。VX2腫瘤成像試驗的視頻幀用video-capture捕獲，并用Image-Pro Plus 2.0軟件分析。代表游離循環氣泡的圖像由在25分鐘時獲得的圖像中扣除，得到代表結合氣泡的圖像。
參考圖11(其顯示了采用實施例16的制備物的結果)和圖12(其顯示了采用實施例17的制備物的結果)，圖11A和12A顯示了氣泡注射前的圖像(基線)，圖11B和12B顯示了注射后25分鐘腫瘤中的氣泡造影滯留；圖11C和12C顯示了在扣除基線和游離循環氣泡后獲得的結果，代表本發明的含有KDR脂肽的結合微泡。實施例15-17以及圖11和12證實，具有此KDR結合部分的超聲造影劑在動物模型中定位于表達KDR(并因此導致血管生成)的組織。
實施例16
重復實施例12A，只是用DSPE-PEG1000(2.7mg，1.54μmol)替換DSPE-PEG2000，并使用2.5mg(0.31μmol)示于圖5的二聚體肽磷脂綴合物(11)。
實施例17
重復實施例16，只是用相同摩爾量的示于圖2的單體磷脂綴合物(1)替換二聚體肽磷脂綴合物。
權利要求
1.一種肽-磷脂綴合物，所述肽-磷脂綴合物選自
和
2.一種超聲造影劑組合物，所述組合物包含權利要求1的綴合物。
3.權利要求2的組合物，其中所述造影劑包含含氣微囊泡。
4.權利要求3的組合物，其中所述含氣微囊泡包含磷脂。
5.權利要求3的組合物，其中所述含氣微囊泡還含有兩種或更多種選自以下的組分DSPC、DPPG、DPPA、DSPA、DPPE、DPPG、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、棕櫚酸和硬脂酸。
6.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2環(2-12)二硫化物}-NH2環(6-13)二硫化物，而所述造影劑還含有DSPC和DPPG。
7.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有SEQ ID NO.4，而所述造影劑還含有DSPC和DPPG。
8.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有SEQ ID NO.4，而所述造影劑還含有DSPE-PEG1000、DPPE和DPPG。
9.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2環(2-12)二硫化物}-NH2環(6-13)二硫化物，而所述造影劑還含有DSPE-PEG1000、DPPE和DPPG。
10.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2環(2-12)二硫化物}-NH2環(6-13)二硫化物，而所述造影劑還含有DSPE-PEG1000、DSPC和DSPA。
11.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有SEQ ID NO.1，而所述造影劑還含有DSPE-PEG2000、DSPC和DSPA。
12.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有SEQ ID NO.1，而所述造影劑還含有DSPC和DSPA。
13.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2環(2-12)二硫化物}-NH2環(6-13)二硫化物，而所述造影劑還含有DSPE-PEG2000、DSPC和硬脂酸鹽。
14.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有SEQ ID NO.1，而所述造影劑還含有DSPE-PEG2000、DSPC和硬脂酸鹽。
15.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2環(2-12)二硫化物}-NH2環(6-13)二硫化物，而所述造影劑還含有DSPC和硬脂酸鹽。
16.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K(DSPE-PEG2000-NH-Glut)]-NH2環(2-12)二硫化物}-NH2環(6-13)二硫化物，而所述造影劑還含有DSPE-PEG1000、DSPC和硬脂酸鹽。
17.權利要求5的組合物，其中所述綴合物含有SEQ ID NO.1，而所述造影劑還含有DSPE-PEG1000、DSPC和硬脂酸鹽。
18.權利要求5的組合物，所述組合物還含有選自以下的組分糖、多糖和多元醇。
19.權利要求18的組合物，其中所述組分選自甘露醇、葡聚糖和聚乙二醇。
20.權利要求18的組合物，其中所述氣體包括氟化氣體。
21.權利要求3或7-18中任一項的組合物，其中所述氣體包括C3F8、C4F10或SF6，其任選地與空氣、氮氣、氧氣或二氧化碳混合。
22.一種用于哺乳動物中含KDR組織成像的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的權利要求3的組合物并使哺乳動物成像。
23.一種用于檢測哺乳動物中的血管生成過程或使其成像的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的權利要求3的組合物并使哺乳動物成像。
24.一種用于檢測哺乳動物中含KDR的腫瘤組織或或使其成像的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的權利要求3的組合物并使哺乳動物成像。
25.一種肽單體，所述肽單體含有Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。
26.一種超聲造影劑組合物，所述組合物含有一種或多種選自以下的單體Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2；Ac-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2；Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(ivDde)-NH2環(6-13)二硫化物；和Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys(Adoa-Adoa)-NH2環(2-12)二硫化物。
27.權利要求26的組合物，其中所述造影劑含有含氣微囊泡。
28.權利要求27的組合物，其中所述氣體包括氟化氣體。
29.權利要求28的組合物，所述組合物還含有磷脂。
30.權利要求29的組合物，所述組合物還含有兩種或更多種選自以下的組分DSPC、DPPG、DPPA、DSPA、DPPE、DPPG、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG2000、棕櫚酸和硬脂酸。
31.權利要求30的組合物，其中所述氣體包括C3F8、C4F10或SF6，其任選地與空氣、氮氣、氧氣或二氧化碳混合。
32.一種肽-磷脂綴合物，所述綴合物含有一種或多種權利要求25的肽單體。
33.權利要求32的肽-磷脂綴合物，其中所述磷脂選自磷脂酰乙醇胺和修飾磷脂酰乙醇胺。
34.權利要求33的肽-磷脂綴合物，其中所述磷脂是DSPE-PEG2000。
35.一種用于哺乳動物中含KDR組織成像的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的權利要求26的組合物并使哺乳動物成像。
36.一種用于檢測哺乳動物中的血管生成過程或使其成像的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的權利要求26的組合物并使哺乳動物成像。
37.一種用于檢測哺乳動物中含KDR的腫瘤組織或使其成像的方法，所述方法包括給予哺乳動物有效量的權利要求26的組合物并使哺乳動物成像。
38.一種用于制備包含磷脂的含氣微囊泡的方法，所述方法包括以下步驟
a.制備水性有機乳狀液，所述乳狀液包含i)含有水的水性介質，ii)基本上和水不混溶的有機溶劑，iii)磷脂，iv)權利要求1的肽-磷脂綴合物和v)凍干保護劑；
b.將所述乳狀液凍干，得到含有所述磷脂的凍干基質；
c.使所述凍干基質與生物相容性氣體接觸；
d.通過將所述凍干基質溶解在生理上可接受的水性載液中而重配所述凍干基質，得到所述含氣微囊泡的混懸液。
39.權利要求38的方法，其中步驟a包括以下步驟
a.制備含有PEG化磷脂和權利要求1的綴合物的水性混懸液；
b.制備含有水性介質、有機溶劑、磷脂和凍干保護劑的水性有機乳狀液；和
c.將步驟a1的所述水性混懸液和步驟a2的乳狀液混合。
40.一種制備肽磷脂綴合物的方法，所述方法包括使選自以下的肽與磷脂綴合SEQ ID NO.2、Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2環(6-13)二硫化物、Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2環(2-12)二硫化物、SEQ ID NO.5和Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2環(2-12)二硫化物]-NH2環(6-13)二硫化物。
41.權利要求40的方法，其中所述磷脂是PEG化的。
42.權利要求41的方法，其中所述PEG化磷脂是DSPE-PEG2000-NH2。
43.權利要求42的方法，其中所述綴合包括使肽的單NHS酯與磷脂鹽的游離氨基反應。
44.一種制備具有低水平的TFA的肽磷脂綴合物的方法，所述方法包括以下步驟
將肽二聚體的TFA鹽經陰離子交換轉變為乙酸鹽；和
使肽二聚體與磷脂綴合。
45.權利要求44的方法，其中所述肽包括肽二聚體。
46.權利要求45的方法，其中所述肽二聚體包括Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2環(2-12)二硫化物]-NH2環(6-13)二硫化物。
47.權利要求44的方法，其中所述陰離子交換層析包括乙酸銨階梯梯度。
48.權利要求44的方法，其中所述磷脂是PEG化的。
49.權利要求48的方法，其中所述PEG化磷脂是DSPE-PEG2000-NH2。
50.一種制備具有低水平的TFA的肽-磷脂綴合物的方法，所述方法包括洗脫出大小排阻柱中的肽磷脂綴合物和TFA離子。
51.權利要求50的方法，其中所述洗脫在碳酸氫銨存在下進行。
52.權利要求50的方法，其中所述肽磷脂綴合物包含PEG化磷脂。
53.權利要求52的方法，其中所述PEG化磷脂是DSPE-PEG2000-NH2。
54.權利要求50的方法，其中所述肽-磷脂綴合物包含肽二聚體。
55.權利要求54的方法，其中所述肽二聚體包含Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(-Adoa-Adoa-Glut-K)-NH2環(2-12)二硫化物]-NH2環(6-13)二硫化物。
56.權利要求50的方法，其中所述肽-磷脂綴合物包含肽單體。
57.權利要求56的方法，其中所述單體選自SEQ ID NO.2、Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[K(ivDde)]-NH2環(6-13)二硫化物、Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK(Adoa-Adoa)-NH2環(2-12)二硫化物和SEQ ID NO.5。
全文摘要
本發明提供具有高KLDR結合親和力的肽載體和制備此載體的方法。肽載體可與磷脂綴合，并包含在超聲造影劑組合物中。此超聲造影劑尤其可用于治療和診斷方法，例如使含KDR組織成像以及評價和治療與腫瘤病癥相關的血管生成過程。本發明也提供用于大規模生產高純度二聚體和單體肽磷脂綴合物以及用于形成綴合物的前體物質的方法。本發明還提供用于大規模生產含有非常低水平的TFA的高純度肽磷脂綴合物的方法。
文檔編號C12P21/04GK101374955SQ200680052279
公開日2009年2月25日 申請日期2006年12月8日 優先權日2005年12月9日
發明者P·比薩, S·沙爾卡維, H·范, B·拉米, P·南加潘, R·K·皮萊, S·波雄, B·宋, R·E·斯溫森 申請人:布拉科國際有限公司