人類mgst1基因的單核苷酸多態性在診斷和治療乳癌方面之應用的制作方法

專利名稱：：人類mgst1基因的單核苷酸多態性在診斷和治療乳癌方面之應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及檢測人類微粒體谷胱甘肽巰基轉移酶(MGST1降因上的3個與乳癌(breastcancer)相關聯的單核苷酸多態性(SNP)位點，以及應用這些單核苷酸多態性位點預測乳癌的易患性。本發明也提供了一種有助于預防乳癌的方法，也可應用T篩選針對不同類型乳癌的適當療法。
背景技術：
：乳癌是婦女中很常見的惡性癌癥，每年全世界有一百多萬的新發病例并導致六十萬例死亡(見IARC，WHO.Breastcancer,inStewartB，KleihuesP(eds).WorldCancerReport.Lyon:IARCPress,2003;188—19)。孚L癌發病率在西方發達國家最高，如美國，澳大利亞和西歐等國。但近20年來，乳癌的發病率在亞洲國家也逐漸增高。已知的導致乳癌的風險因素有家族遺傳，飲食習慣，生育史，外源雌激素的使用，抽煙飲酒等等。遺傳因素大約占了25%(LichtensteinP,HolmNV，VerkasaloPKetal.Environmentalandheritablefactorsinthecausationofcancer—analysesofcohortsoftwinsfromSweden,Denmark,andFinland.NEnglJMed2000;343:78-85)，而高致病性基因如BRCA1和BRCA2的突變則只占不到10%(WelcshPL，OwensKN，KingMC.InsightsintothefunctionsofBRCA1andBRCA2,TrendsGenet2000;16:69-74)。因此，一直以來大家都認為存在著一些更普遍的低致病性的遺傳改變，而這些改變導致了相當一部份乳癌的發生(KammererS,RothRB，RenelandRetal.Large-scaleassociationstudyidentifiesICAMgeneregionasbreastandprostatecancersusceptibilitylocus.CancerRes2004;64:8906-10)。異源物質代謝酶(XMEs)異源物質是非人體固有的天然或人工合成的物質，包括藥物，工業產物，殺蟲劑，污染性物質，生物堿，及由細菌，真菌，植物和動物產生的毒素。許多異源物質本身或其經生物轉化后的形式具有致癌性。異源物質代謝酶(XMEs)能導致各種致癌物，致癌物前體，毒素和藥物的活性化，它們也能參與宿主對異源物質的防御反應。由于治療性藥物對人體而言也是異源物質，因此某些異源物質代謝酶也被稱為藥物代謝酶(DMEs)。參與異源物質的氧化反應和連接反應的酶分別被稱為I相和II相異源物質代謝酶。I相異源物質代謝酶，例如細胞色素P450s(CYPs)基因家族，催化多種內源性和外源性的異源物質(從類固醇到污染物)的氧化反應，在這些氧化過程中可能產生親電的和可致癌的中間產物。II相異源物質代謝酶通常以氧作為進一步代謝反應的位點，比如接上協同因子使物質變得更親水進而有利于該物質的排出。在腸壁，血腦屏障和胎盤里存在著大量的異源物質代謝酶，暗示這些酶能限制異源物質進入主要系統并在宿主的防御機制中發揮重要作用(JonkerJW，BuitelaarM,WagenaarE,etal.，2002.Thebreastcancerresistanceproteinprotectsagainstamajorchlorophyll-deriveddietaryphototoxinandprotoporphyria.ProcNatlAcadSciUSA.99:15649-54.)。雖然異源物質的解毒總是與肝臟的代謝聯系在一起，但是現在在乳癌組織中也發現這些基岡的表達有著顯著不同(HaasS，PierlC，HarthVetal.Expressionofxenobioticandsteroidhormonemetabolizingenzymesinhumanbreastcarcinomas.IntJCancer2006;119:1785-91)。微粒體谷胱甘肽巰基轉移酶l(MGSTl)是一種在微粒體中廣泛分布的n相異源物質代謝酶。它催化谷胱甘肽與許多異源化合物反應形成親水的谷胱甘肽結合物，使這些異源物質更加容易被排出體外。某些可溶性的谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)，如GSTM1，已被發現與乳癌的發生有關(SachseC.，SmithG.，WilkieM.J.V"etal"2002.Apharmacogeneticstudytoinvestigatetheroleofdietarycarcinogensintheetiologyofcolorectalcancer.Carcinogenesis23:1839-1849)。MGSTl基因定位在12號染色體的pl3.1-p13.2區上，全長17,268bp，有2個可被選擇的第一外顯子(外顯子lb和ld)及2個非功能性的第一外顯子(外顯子la和lc),還有3個能被翻譯成蛋白的外顯子(外顯子2，3，4)。進行RNA剪切時，其中一個帶有不被翻譯的mRNA區域的第一外顯子將與下游的其它外顯子連接。外顯子lb和ld是最主要的外顯子；帶有外顯子la和lc的mRNA還未被檢測到。緊接外顯子lb上游的啟動子區會作出氧化應激反應，而緊接外顯子ld的啟動子區則不會。單核苷酸多態性(SNP)人類基因組中DNA序列的差異導致了個體的不同特征，包括每個人接觸了異源物質(污染物，毒素和藥物)后不同的反應。基因組中的單個核苷酸(A，G，C或T)發生變化就產生了單核苷酸多態性(SNP)，在傳代的過程中單核苷酸多態性逐漸趨于穩定。大家越來越認識到大量已定位SNP的收集將為人類遺傳學的研究提供有力的工具。此外，SNP還能作為遺傳標記用于家系的連鎖分析，特定人群的連鎖不平衡分析以及疾病關聯性分析來尋找與疾病有關的基因。像乳癌這樣的多基因病，與疾病有顯著關聯的SNP就可以作為一種工具來辨別對疾病有較高易感性的個體。而對患乳癌的病人進行基因檢測則有可能揭示一些未知的遺傳病因并且優化疾病的管理和治療。當乳癌病人和健康對照組的SNP被發現和檢測后，需要分析有關數據來確定某個SNP與乳癌之間是否存在顯著的聯系。這是基于即使某個SNP"X"能直接影響乳癌的易感性，擁有這個SNP"X"也不是得乳癌的充分必要條件，但是這個SNP"X"在病人中的出現頻率一定高于正常人。同樣地，與此SNP"X"呈連鎖不平衡(linkagedisequilibrium,LD)的其它SNP也會出現這種情況。因此，對SNP與疾病的關聯性的研究可以在兩個方向上進行直接檢測一個有功能影響的SNP或者用這個SNP作為連鎖不平衡(LD)的標記物進行關聯性分析。
發明內容本發明的目的是提供微粒體谷胱甘肽巰基轉移酶l(MGSTl)基因的單核苷酸多態性位點，這些位點與乳癌易感性有關聯，它們可運用于開發一些新的方法在早期臨床階段對乳癌進行輔助診斷。本發明給出了一條獨立的多核苷酸片斷，它具有SEQEDNO:l的序列。該多核苷酸片斷為人類MGST1基因的一部分，包括了此基因的5'不轉錄區。外顯子la，lb和lc，及3個多態性位點rs4149187，rs2239675和rs2239676。本發明還給出了一套PCR引物可用于擴增出如同SEQIDNO:l的多核苷酸片斷。該套引物中的第一條引物的序列與SEQIDNO:2所示相同，或與SEQIDNO:2互補；第二條引物的序列與SEQIDNO:3所示相同，或與之互補。此發明的另一部分給出了一種可以預測一個個體是否更容易或者更不容易得乳癌的方法。此方法包括(a).檢測該個體的核酸序列；(b).選擇并確定以下3個SNP位點(rs4149187,rs2239675和rs2239676)中的一個或多個位點的核苷酸序列；或檢測與上述3個SNP中一個或多個位點處于相同的單倍型或連鎖不平衡(LD)的其它遺傳標記。此發明還給出了一種檢測乳癌病人基因型的方法，該方法可以為病人的藥物治療提供在藥學基因組學方面的指導，包括(a).檢測病人的核酸樣本的序列；(b).選擇并確定以下3個SNP位點rs4149187，rs2239675和rs2239676中的一個或多個位點的核苷酸序列，或檢測與上述3個SNP中一個或多個位點處于相同的單倍型或連鎖不平衡(LD)的其它遺傳標記。此發明也給出了一種篩選藥物的方法，可應用于鑒定治療或預防乳癌的藥物。此方法包括(a).轉染一個載體到真核細胞表達系統，該載體至少含有人類微粒體谷胱甘肽巰基轉移酶l(MGSTl)基因中的部份片段，而該片斷包含以下3個SNP位點中的一個或幾個(rs4149187，rs2239675和rs2239676)，或者包含與上述3個SNP中一個或多個位點處于相同的單倍型或連鎖不平衡(LD)的其它遺傳標記；(b).在細胞表達系統中表達該載體；(c).在這個細胞系統中加入被篩選的藥物；(d).分析異源物質代謝酶基因的表達來研究被篩選的藥物在該細胞系統中對基因表達的影響；(e).確定那些能夠改變異源物質代謝酶基因表達的藥物。以下這些圖表將令該項發明的特點在后面的詳細敘述中更加淺顯易懂。圖1是部分基因組MGST1基因的示意圖，顯示了SNP:rs4149187,rs2239675和rs2239676的位置和與其鄰近的外顯子的相對位置。具體實施方式術語的定義在本發明的說明書和權利要求書中使用了以下各種術語，它們的定義如下所述術語"等位基因"(allele)指一段核苷酸序列的不同變化形式。術語"互補的"(complementary)與"互補"(complement)指一段核苷酸序列可以通過堿基配對的原則與另一條多核苷酸序列在可以配對的區域配對。術語"基因型"(genotype)指生物體的遺傳物質組成。更確切地說，它是指個體中所含有的等位基因的類型。如某個體的兩條姐妹染色單體上的特定位置核苷酸序列均為A，則該個體在此特定位點的基因型為A/A。對一個個體或一份DNA樣本進行基因型檢測"(Getiotyping)"是指在核苷酸的水平上來確定一個個體在特定多態性位點的等位基因序列。術語"多態性"(polymorphism)指某個基因或基因的某個部分在人群中存在多于一種的形式。"多態的，多態性的"(polymorphic)指在某一人群中可找到有兩種以上的基因序列變異。"多態性位點"(polymorphicsite)指核苷酸序列發生變異的基因座。術語"寡核苷酸"(oligonucleotide)禾卩"多核苷酸"(polynucleotide)在這里指的是在長度上多過一個核苷酸的RNA、DNA或者RNA/DNA雜交的序列。這些序列可以單鏈或雙鏈的形式存在。通常將小于50個核苷酸殘基組成的核酸稱為寡核苷酸，大于50個核苷酸殘基稱為多核苷酸。術語"聚合酶鏈式反應"(PCR)是一種擴增DNA序列的方法，它通過熱穩定的聚合酶和一對引物，其中一條引物與正鏈的一端互補結合，另一條與負鏈的另一端互補結合，來進行DNA擴增。新合成的DNA片斷可以作為模板，與同樣的引物結合，經過退火，延伸和解鏈三個步驟的循環迅速而特異地擴增出目的序列。術語"引物"(primer)指的是短的單鏈寡核苷酸。它可與DNA樣本中的互補序列配對結合。弓l物是依賴模板的DNA合成的起始點。DNA聚合酶可在一條引物的末端位置添加脫氧核糖核酸。"一對引物"(primerpair)或"一套引物"(primerset)指的是兩條引物中包含有可雜交于被擴增序列5'端位置的某條鏈的一條引物，和可雜交于被擴增片斷3'端位置的另一條鏈的引物。術語"外顯子"(exon)指的是基因中編碼蛋白質的DNA序列。術語"內含子"(mtron)指的是那些打斷基因中編碼蛋白質的DNA序列的序列。內含子序列可以被轉錄為RNA,但是在RNA翻譯為蛋白質之前會被切除。本發明特別關系到與乳癌有聯系的單核苷酸多態性(SNP)。已經發現如果個體編碼微粒體谷胱甘肽巰基轉移酶l(MGSTl)基因或與其互補的序列含有特定的多態性位點，則該個體可能具有相對高的乳癌易感性。本發明給出了一些與乳癌有聯系的特定的SNP位點MGST1基因的rs4149187，rs2239675和rs2239676。以上這些SNP位點雖然之前已經被發現并報道過，但是從未將它們與乳癌相聯系。此發明現給出有關上述3個SNP位點的詳細描述。SEQIDNO:l的序列為人類基因組MGST1基因序列的一部分，包括了此基因的外顯子la，lb，lc及其側翼序列。外顯子la起始于序列的第321堿基的位置，結束于第363堿基的位置。外顯子lb起始于序列的第824堿基的位置，結束于第889堿基的位置。外顯子lc起始于序列的第957堿基的位置，結束于第1077堿基的位置。對于SNPrs4149187，它的參考等位基因是如SEQIDNO:l所示，核苷酸變化是發生在第316堿基處，由胞嘧啶(C)取代參考堿基鳥嘌呤(G)。對于SNPrs2239675，它的參考等位基因是如SEQIDNO:l所示，核苷酸變化是發生在第510堿基處，由腺嘌呤(A)取代參考堿基鳥嘌呤(G)。對于SNPrs2239676，它的參考等位基因是如SEQIDNO:l所示，核苷酸變化是發生在第693堿基處，由胞嘧啶(C)取代參考堿基鳥嘌呤(G)。以下部分將給出確認這些與乳癌相關聯的單核苷酸多態性位點的方法。本發明所分析的所有健康人和乳癌病人均為中國漢族人。乳癌病人均經由組織病理學檢査確認。健康對照組在性別與年齡上與病人組相匹配。挑選健康組與病人組的另一些條件包括無家族癌癥病史，從未接受過對未知病因的放化治療。每一位經挑選的參與者貢獻5ml外周血。我們使用國際通用的GFXM血液基因組DNA純化試劑盒(AmershamBiosciences,NJ,USA)提取樣本血液基因組DNA。用常規DNA測序的辦法檢測堿基突變。我們使用應用生物系統公司(AppliedBiosystems,CA，USA)的熱啟動AmpliTaqGoldDNA擴增試劑盒和Eppendorf公司的Mastercycler⑧梯度擴增儀擴增基因組DNA。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳確認并純化后，使用應用生物系統公司(AppliedBiosystems,CA,USA)的BigDyeTerminatorv3.1測序試劑盒在ABIPRISM3100遺傳分析儀(AppliedBiosystems，CA,USA)上測序。我們使用標準的卡方分析查找乳癌與多態性位點的關聯性。計算優勢比(oddsratios,OR)與95%置信區間(95%CI)時我們使用了對年齡參數作校正的邏輯回歸分析。所有統計學分析均使用SPSS12.0統計軟件包(SPSSInc.,Chicago,IL)。表1顯示了上述SNP與乳癌相關性的分析及乳癌患者在基因型頻率上的關系。統計結果顯示SNP位點rs4149187，rs2239675和rs2239676與乳癌的發生顯著相關。對于MGST1基因的rs4149187位點，g/c基因型攜帶者比g/g或c/c基因型攜帶者的患乳癌風險要高出1.681倍(p=0.002，95%CI:1.213-2.331)。對于MGST1基因的rs2239675位點，g/a基閑型攜帶者比g/g或a/a基因型攜帶者的患乳癌風險要高出1.44倍(p=0.028，95%CI:1.039-1.995)。對于MGST1基因的rs2239676位點，g/c基因型攜帶者比g/g或c/c基因型攜帶者的患乳癌風險要高出1.416倍(p=0.037，95%CI:1.020-1.964)。表l:MGST1基因的SNP位點與乳癌的相關性(P《0.05為顯著相關)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>相應地，本發明也給出了檢測以下SNP的方法來對乳癌的易感性作出診斷，這些SNP為MGSTl基因的rs4149187，rs2239675和rs2239676。同時也給出了對乳癌病人進行基因型檢測的方法，以將MGSTl基因作為有用的潛在目標來制造防治乳癌的藥物。圖1展示了人類MGST1基因的基因組核酸序列上外顯子的排布情況。在本發明中，那些可用于判斷個體乳癌易感性的SNP的位置也同時在以上附圖中標明了。為了檢測SNPrs4149187，rs2239675和rs2239676，要使用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物來擴增一段與SEQIDNO:l相同的基因組DNA片段。然后用SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示引物對擴增片段進行測序。上述圖表和基因型檢測方法對與乳癌相關的SNP位點都作了描述。另一方面，此發明也給出了一種測定和診斷乳癌病人的基因型的方法。這種方法通過分析MGST1基因的部分序列來確定rs4149187，rs2239675和rs2239676這些SNP位點中的一個或兒個位點的等位基因和(或)基因型。應用該方法首先要取得足夠的人類DNA來進行序列和(或)基因型的分析才能夠確定以上SNP位點中的某一個或幾個的序列。此方法包括一些目前普遍使用的技術，如PCR，就象后面的范例中所描述的，用與范例相同的引物在相同的條件下檢測與乳癌相關的單核苷酸多態性。也可以對這3個SNP位點使用不同于本發明中所述的引物進行檢測，這些引物可以由具有相關經驗的人勿須經過太多實驗而設計。其它對單核苷酸多態性位點的基因型檢測分析有幫助的方法都可以用于檢測上述3個SNP位點和與這3個SNP位點處于連鎖不平衡的其它位點。本發明的范例還提供了篩選和(或)診斷乳癌的方法。概括地說，此發明顯示，在中國漢族女性人群中，MGSTl基因rs4149187位點如為g/c基因型，該個體的患乳癌風險將顯著增加1.681倍(95呢CI:1.213-2.331，p=0.002);MGST1基因rs2239675位點如為g/a基因型，該個體的患乳癌風險將顯著增加1.44倍(95呢CI:1.039-1.995,p=0.028);MGST1基因rs2239676位點如為g/c基因型，該個體的患乳癌風險將顯著增加1.416倍(95免CI:1.020-1。964，p=0.037)。以上所述的SNP位點可以用于鑒別那些接觸異源物質時更容易得乳癌的個體。某些遺傳多態性不僅影響乳癌的發生也影響乳癌的發展，為此本發明提供了乳癌的與易感基因遺傳多態性之間的聯系。這些檢測可以使用一些已知的技術，包括基因芯片的方法(比如Affymetrix公司的GenFlex，Tag，Pamgene，Inc.公司的PamChip等)，把DNA固定在基質上(比如MarligenBioscience公司的SIGNETY-SNPIdentificationSystem),ABI公司的SNPaPshotMultiplex系統(AppliedBiosystemsInc.),分子信標技術(SanyaTyagi,PublicHealthResearchInstitute,NewYork,USA)禾口Pyrosequencing技術(PyrosequencingAB)。檢測也可以使用以下方法來完成用等位基因特異性引物，等位基因特異性探針直接對目標區域進行測序，單鏈構象多態性(SSCP)和變性梯度膠電泳(DGGE)。綜上所述，本發明給出了一個檢測有患乳癌趨勢的人的方法，它是通過對MGST1基因的rs4149187,rs2239675和rs2239676這些SNP位點進行檢測來實現的。作為本發明的另一部分，人工合成的或重組的DNA分子都可以用于檢測。這些DNA分子序列包含以下3個SNP位點的任意組合MGST1基因的rs4149187，rs2239675和rs2239676。序列可以是它們的任意一種等位基因形式和其側翼序列，也可以是和這些SNP位點連鎖不平衡的基因座。這些DNA分子序列可以是這個異源物質代謝酶基因的一條或兩條DNA鏈。此外，本發明還提供了一種對治療乳癌所用藥物進行評價的方法，該方法是基于上述SNP位點與乳癌的相關性。因為有些位點處于基閑的啟動子區或外顯子和內含子的交界區，它們可以影響這些基因mRNA的調控，合成和剪接。為了檢測這種影響，可以將這些SNP的不同等位基因形式依不同組合方式組成一條新序列，再將序列克隆到合適的表達載體上，并在一些乳癌細胞系中表達，這些細胞系包括BT-20,BT-474,Hs578T等等。轉染的方法可用目前普遍使用的轉染試劑盒如CellPhect轉染試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech,Inc.,USA)禾卩ProFection⑧哺乳動物轉染系統(PromegaCoporation)。轉染效率可用一些已知的試劑如磷酸鈣(LifeTechnologiesInc.)等來提高。如果以上一個或幾個SNP位點與乳癌相關的等位基因形式會改變基因表達和(或)同族基因的結構特征，則以上提到過的細胞系也可用來篩選一些能夠使基因表達恢復正常的化合物。這樣的化合物在治療和預防乳癌方面可作為非常有潛力的候選藥物。本發明進一步提供了檢測與乳癌有關的SNP位點的檢測試劑盒；也提供了明確無誤的DNA測試方法以應用于乳癌遺傳易感性的檢測。用DNA測序或其它基因型檢測方法檢測感興趣的SNP位點，首先需要用PCR擴增含有以下一個或者多個SNP位點的DNA片段。這些SNP位點包括MGST1基因的rs4149187，rs2239675和rs2239676。所獲得的PCR產物可用于之后的DNA測序或別的基因型檢測方法來檢測多態性位點的不同等位基因形式，如連接依賴性的多探針擴增(multiplexligationdependentprobeamplification),單堿基延伸(singlebase-baseextension),或基因芯片上的序歹U特異性探針雜交(microarray-basedsequence-specificoligonucleotideprobehybridization),單鏈構象多態性(singlestrandconformationpolymorphism),寡核苷酸芯片上的固相PCR(solidphasePCRonoligonucleotidemicroarrays)，直接在寡核苷酸芯片上的復合PCR(directmultiplexPCRonoligonucleotidemicroarrays)等。檢測結果可以用軟件包，比如POLYPHARD禾BCONCED頂等合適的軟件進行分析。一個能夠用于以上檢測的試劑盒可能包括下列組分中的一個或幾個PCR引物，等位基因特異性探針，DNA聚合酶，PCR反應緩沖液，氯化鎂，PCR反應或引物延伸所需的4種脫氧核糖核酸。如果需要測序的話，該試劑盒還可能需要含有測序引物，DNA聚合酶，4種標記的雙脫氧核糖核酸和4種未標記的脫氧核糖核酸。當基因型檢測方法中不需要對DNA進行擴增時，被檢測的DNA可直接用于檢測上述3個SNP或檢測與任何一個SNP相關的單倍型。此方法給出了一個篩選藥物的辦法，其步驟包括(a)將一載體轉入一個真核細胞表達系統，該載體必須含有人類MGST1基因的一部分或全部，可以是單獨的某一基因也可以是幾個基因在一起。(b).在細胞表達系統中表達該載體；(c).在這個細胞系統中加入被篩選的藥物；(d).分析基因的表達情況，此基因可以是MGST1基因的SNP位點上的所有等位基因的可能組合方式。同時也分析該細胞系統中相同家族的異源物質代謝酶基因的表達與活性。(e).確定那些被篩選的化合物在該細胞體系中對同族的異源物質代謝酶基因表達和活性的影響。依照以上方法，得到的化合物或制備的細胞表達體系可作為治療和預防乳癌的潛在的候選藥物。更進一步，不僅如范例1中所述的PCR與DNA測序方法可以用于檢測被測DNA樣本的如下單核苷酸多態性位點MGST1基因的rs41491S7,rs2239675和rs2239676，還有其它一些類似的測序方法也可以用作這一用途。比如說多重連接依賴的探針擴增(multiplexligationdependentprobeamplification,MLPA)，pyrosequencing觀!j序(PyrosequencingAB)，單鏈構象多態性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP),或者變性梯度膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)。另有一些方法可達到此目的，這些方法包括使用DNA芯片的方法(比如Affymetrix公司的GenFlexTag，Pamgene,Inc.公司的PamChip等);把DNA固定在基質上的方法(比如MarligenBioscience,Inc.公司的SIGNETY-SNPIdentificationSystem);ABI公司的PrismSNPaPshotTMMultiplexSystem(AppliedBiosystemsInc.);或者是分子信標技術(SanyaTyagi，PublicHealthResearchInstitute,美國紐約)。以下將舉例說明本發明。但正如一些熟知此
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的人所顯而易見的那樣，這并不意味著將本發明局限于以下示例。實施例1:檢測本發明中的單核苷酸多態性位點rs4149187,rs2239675和rs2239676。本發明涉及到MGST1基因的rs4149187，rs2239675和rs2239676單核苷酸多態性位點。檢測位點的方法介紹如下可用軟件Pnmer3(http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3)設計一些特異性弓l物用于查找相關區域的多態性位點。用BLAST程序(NationalCenterforBiotechnologyInformation-http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)檢測所設計的引物相對于人類基因組序列的特異性。不論是正向還是反向引物，只有當它們在BLAST程序的特定條件下所找到的相似性序列少于5條時才會被認為是特異性的并被采納。用AmpliTaqGold聚合酶試劑盒(AppliedBiosystems,CA，美國)和MastercyclerGradient熱循環儀(Eppendorf,Hamburg,德國)進行聚合酶鏈式反應(PCR)。聚合酶鏈式反應總體積為20微升，包括1.5mM鎂離子,200pM四種堿基，每條引物各0.3pM，模板基因組DNA10ng，和0.5U的聚合酶。首先用呈梯度溫度變化的聚合酶鏈式反應來為每一對引物尋找最合適的退火溫度。表2列出了一對引物序列的例子及其退火溫度。聚合酶鏈式反應程序為95度10分鐘(l個循環)，接著進行45個循環的94度30秒，60度30秒和72度30秒。最后為72度延伸2分鐘。產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色進行分析確認為所需長度，然后將擴增產物用MultiScreen頂PCR96純化試劑盒(MilliporeCorporation,Bedford,美國)純化除去剩余的反應物。表2:檢測單核苷酸多態性位點rs4149187，rs2239675和rs2239676基因型的引物與其最佳退火溫度。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>SEQIDNO:3GCACGGGGACAGAAATACAA我們采用對PCR產物的雙鏈分別測序的方法來査找感興趣區域的單核苷酸多態性位點。采用的試劑盒為BigDyeTerminatorv3.0CycleS叫uencingKit(AppliedBiosystems,CA,USA)。采用的測序儀器為ABIPRISM3100GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,CA,USA).每一個樣本至少測序兩次。將測序結果輸入到BioEdit軟件中作序列比對與分析，以此確定單核苷酸多態性位點。實施例2:檢測人類MGSTl基因上與乳癌相關的單核苷酸多態性位點此范例描述了一個用于檢測并確定上文所述的一個或幾個單核苷酸多態性位點的方法。人類的MGSTl基因的部分目標區域將用作模板來合成PCR產物。表3列出了特異性引物，每對可分別用于擴增特定目標區域。表3:用于MGSTl基因的PCR和DNA測序的引物單核苷酸多態性位點名稱正向引物反向引物測序引物最佳退火溫度rs4149187AGGAAGTAGACCTTGCAACACG(SEQIDNO:2)GCACGGGGACAGAAATACAA(SEQIDNO:3)SEQIDNO:260oCrs2239675AGGAAGTAGACCTTGCAACACG(SEQIDNO:2)GCACGGGGACAGAAATACAA(SEQIDNO:3)SEQIDNO:260oCrs2239676AGGAAGTAGACCTTGCAACACG(SEQIDNO:2)GCACGGGGACAGAAATACAA(SEQIDNO:3)SEQIDNO:360oC含有單核苷酸多態性位點片段的PCR擴增與擴增產物的測序以下試劑用于PCR擴增感興趣的片段1.5mM鎂離子，200j^M四種堿基，每條引物各0.3^M,模板基丙組DNA10ng，和0.5U的聚合酶，聚合酶鏈式反應總體積為20微升。聚合酶鏈式反應使用MastercyclerGradient熱循環儀(Eppendorf,Hamburg,德國)按以下步驟進行95度10分鐘(l個循環)，接著進行45個循環的94度30秒，55到60度30秒和72度30秒。最后為72度延伸2分鐘。PCR擴增產物用MultiScreen頂PCR96純化試劑盒(MilliporeCorporation,Bedford,美國)純化后直接用BigDyeTerminatorv3.0CycleS叫uencingKit(AppliedBiosystems,CA,USA)試劑盒測序。測序反應條件為96度1分鐘(l個循環)，接著進行25個循環的96度10秒，50度5秒和60度4分鐘。測序產物用含有DNA純級別SephadexG-50的AutoSeq%Plates平板(AmershamPharmaciaBiotech,Inc,USA)純化。純化產物經加入5|iilHi-DiFormamide(AppliedBiosystems,CA,USA)95攝氏度變性。變性的測序產物用ABI公司提供的方法在ABIPRISM3100GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,CA,USA)測序儀上分析。將測序結果輸入到BioEdit軟件中作序列比對與分析。表4列出了用此方法的測序統計結果。表格分別列出了在基因型水平上正常人與乳癌病人在多個單核苷酸多態性位點上的序列情況。表4:在MGST1基因中與乳癌相關的單核苷酸多態性的表格<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>雖然以上只介紹了一種檢測與乳癌有關聯的多態性位點的方法，任何熟知此方面工作的人都知道可以使用其它方法達到此目的。比方說，設計等位基因特異性探針，等位基因特異性引物延伸反應，或者使用單堿基延伸反應來檢測。實施例3:檢測MGST1基因單核苷酸多態性位點rs4149187，rs2239675和rs2239676的試劑盒此范例描述了一個試劑盒，該試劑盒用于檢測并確定上文所述的一個或幾個單核苷酸多態性位點的序列，從而得到被測個體的基因型。檢測結果可運用于對該個體對乳癌的易感性作出預測。該試劑盒包含以下引物SEQIDNO:l，SEQIDNO:2禾卩SEDIDNO:3。該試劑盒還包含以下試劑用于PCR擴增MGST1基因的片段1.5mM鎂離子,200四種堿基，陽性對照人類模板基因組DNA，和聚合酶。運用試劑盒時，聚合酶鏈式反應總體積為20微升，聚合酶鏈式反應使用熱循環儀按以下步驟進行95度10分鐘(l個循環)，接著進行45個循環的94度30秒，55到60度30秒和72度30秒。最后為72度延伸2分鐘。PCR擴增產物可用測序等方法來確定單核苷酸多態性位點rs4149187，rs2239675和rs2239676的序列。核酸序列的清單<110>廖凌虹，張浩<120>人類MGST1基因的單核苷酸多態性在診斷和治療乳癌方面之應用<160>3<210>1<211>1080<212>DNA<213>Homosapiens<220><221>misc_feature<222>(316)<223>單核苷酸多態性位點rs4149187，n=g或c<220><221>misc_feature<222>(510)<223>單核苷酸多態性位點rs2239675，n=g或a<220><221>misc—feature<222>(693)<223>單核苷酸多態性位點rs2239676,n=g或c<400>1aggaagtagaccttgcaacaggtggtgagtgtctgagatatagcactaggagagaaataa60ccttsaacstttctcatataagatagatcc120tgggga_cta_tggggsctsgggtatccctaatctagatagt180gatggtaggctaa_sta_tctacggcttccgtaaacgttcctCt333CCtCC240cacactaagctgattgtgtaatgagctgstccagtacaattgcctccaatttcattctgg300sccctgaacaggaggngscagcaaattgtctggtatcatgaatttggaac360sccgtssgtgatctttactgagggttacattctgtcattgtcagcctttt420tgccaccagcgcsggggaggtgaagtctast3ttgtcsstgcctgctaat糊tsgttctsccctggagattttaactttctncgaagttttttcc3aa3ctc540tgctgatcctgaaatgttcggttcctagacastggctactgtcccccttc600ccsctgattaggggsgttggcatttcaggaaccagagtttctaagggcgc660ggctc333ggga_atcagcaggcgatggttactntgggcgg720gsggggtttggcgsggttggggtcgggcttta_a_3cgtgggagggctaatt780ggggcggtgcctgcgtccggcccgcgcggccacagtccctgcattgcgcg謂cgacccggcggcgggscsggcttgctgcttcctcctcctcggcctcaccgtgcgtactgg900ggggaccgcstgcasagggtggcsggcagggsgggccagggtgggtggca960gstggsa^gscttgggggggtctctgccagctggaagtgcttggctccacttagcagct331020acttagcttttcaatcgatcgcttttgaaaggg33ttgt3tttctgtccccgtgcgggta1080<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用來檢測人類MGSTl基因等位基因的變化類型的人工合成DNA序歹U。<400>2aggaagtagaccttgcaacaeg22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用來檢測人類MGSTl基因等位基因的變化類型的人工合成DNA序列。<400>3gcacggggacagaaatacaa20權利要求1.用如下三個單核苷酸多態性位點制造診斷乳腺癌的試劑盒的用途，所述三個SNP分別是MGST1基因的位點rs4149187，即，SEQIDNO1序列第316堿基位核苷酸由G變成C；位點rs2239675，即，SEQIDNO1序列第510堿基位核苷酸由G變成A；位點rs2239676，即，SEQIDNO1序列第693堿基位核苷酸由G變成C基于SEQIDNO1的MGST1基因的rs4149187，rs2239675和rs2239676。2.如權利要求l所述的用途，其中，根據基于包含這三個SNP中任何一種或多種的SEQIDNO:1來設計引物，所述試劑盒包含所述引物。3.—種對乳癌病人進行基因型分析以判斷其在臨床和藥學基因組學分類地位的方法，其特征在于，該方法為檢測如下3個單核苷酸多態性位點中的一個或幾個位點的序列，這些位點為MGSTl基因的rs4149187，rs2239676和rs2239676。4.一種用于篩選治療乳癌藥物的方法，其特征在于，該方法為a)將一載體轉入一個真核細胞表達系統，該載體必須含有人類MGSTl基因的一部分或全部，可以是單獨的某一基因也可以是幾個基因在一起，這些基因片段必須包括以下SNP位點中的一個或多個MGSTl基因的rs4149187,rs2239675禾Brs2238676;b)在細胞表達系統中表達該載體；C)在這個細胞系統中加入被篩選的藥物；d)分析該細胞系統中的那些異源物質代謝酶的表達情況與活性；e)確定那些可以改變異源物質代謝酶基因表達和活性的藥物。這些異源物質代謝酶基因可能因為以下這3個單核苷酸多態性位點的存在而表現為不同的等位基因形式，也可能因為一些與這3個單核苷酸多態性位點呈相同單倍型或處于連鎖不平衡的其它遺傳標志的存在而表現為不同的等位基因形式，這3個單核苷酸多態性位點指的是位于MGSTl基因的rs4149187，rs2239675和rs2238676。5.—種可以用來檢測以下3個單核苷酸多態性位點序列的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括檢測以下3個單核苷酸多態性位點所需的一切合適的試劑，所述三個SNP分別是MGSTl基因的位點rs4149187,即，SEQIDNO:1序列第316堿基位核苷酸由G變成C;位點rs2239675，SP，SEQIDNO:1序列第510堿基位核苷酸由G變成A;位點rs2239676，即，SEQIDNO:1序列第693堿基位核苷酸由G變成C。6.—種預測個體對乳癌的易感性的方法，其特征在于，它應用權利要求5中的檢測3個SNP序列的診斷試劑盒，來診斷一個人的基因型。該方法為檢測此個體的單套或兩套染色體組上的一個或多個單核苷酸多態性位點的核酸序列，這些位點包括MGST1基因的rs4149187，rs2239675和rs2239676;該方法檢測位于SEQIDNO:1序列第316堿基位單核苷酸多態性位點rs4149187，基因型為g/g或c/c的女性個體較不易患乳癌,，基因型為g/c的女性個體較易患乳癌；該方法檢測位于SEQIDNO:1序列第510堿基位單核苷酸多態性位點rs2239675，基因型為g/g或a/a的女性個體較不易患乳癌,，基因型為g/a的女性個體較易患乳癌；該方法檢測位于SEQIDNO:1序列第693堿基位單核苷酸多態性位點rs223%76，基因型為g/g或c/c的女性個體較不易患乳癌，基因型為g/c的女性個體較易患乳癌。7.—種用于診斷一個乳癌病人的基因型的方法，其特征在于，它應用權利要求5中的檢測3個SNP序列的試劑盒。全文摘要本發明涉及檢測在人類微粒體谷胱甘肽巰基轉移酶(MGST1)基因上的3個與乳癌(breastcancer)相關聯的單核苷酸多態性(SNP)位點，以及應用這些單核苷酸多態性位點預測乳癌的易患性及篩選治療乳癌的藥物。乳癌在許多國家是很主要的癌癥致死因素，本發明所提供的信息有助于預防乳癌及開發有效的新療法。文檔編號C12Q1/68GK101230387SQ200710008910公開日2008年7月30日申請日期2007年4月28日優先權日2007年4月28日發明者吳汪黔生,廖凌虹,浩張申請人:廖凌虹;張浩