專利名稱：檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針及合成方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測及臨床醫學檢測技術領域，尤其涉及用于高選擇性檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針；同時還涉及該熒光探針的合成方法；另外，還涉及該熒光探針的用途。
背景技術：
谷胱甘肽是生物體細胞中含量最高的硫醇，在細胞內抗氧化系統中具有重要的作用(Rahman，I.；MacNee，W.Free Radic.Biol.Med.2000，28，1405-1420；Kamencic，H.；Lyon，A.；Paterson，P.G.；Juurlink，B.H.J.Anal.Biochem.2000，286，35-37.)，因此實時準確的檢測細胞中谷胱甘肽的含量具有重要意義。目前已報道的用于檢測谷胱甘肽的方法中(Radkowsky，A.E.；Kosower，E.M.J.Am.Chem.Soc.1986，108，4527-4531.；Maeda，H.；Matsuno，H.；Ushida，M.；Katayama，K.；Saeki，K.；Itoh，N.Angew.Chem.，Int.Ed.2005，44，2922-2925.)，熒光法與其他方法相比較在靈敏度、選擇性及可應用于活體甚至單個細胞的成像方面具有顯著優勢。有兩項研究已經成功用熒光探針進行了活體中硫醇或谷胱甘肽的檢測(Pullela，P.K.；Chiku，T.；Carvan，M.J.；Sem，D.S.Anal.Biochem.2006，352，265-273.；Ahn，Y.-H.；Lee，J.-S.；Chang，Y.-T.J.Am.Chem.Soc.2007，129，4510-4511)，但是它們方法的選擇性仍不盡人意。因此，具有高靈敏度、高選擇性且能靶向識別谷胱甘肽的新型熒光探針亟待開發。基于2-苯基-1，2-苯并異硒唑酮(Ebselen)類似谷胱甘肽過氧化物酶的催化活性，我們設計合成第一種以羅丹明為母體含有硒氮鍵的新型熒光探針并且成功實現了活體細胞中谷胱甘肽的實時檢測。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種快速響應、高選擇性、高靈敏度檢測谷胱甘肽的熒光探針，為探討谷胱甘肽在生物體細胞內抗氧化系統中的重要作用提供良好的輔助手段；目的之二是提供一種工藝簡單，性能穩定的合成方法；目的之三是提供該熒光探針的用途。
本發明的目的之一可通過如下技術措施來實現該熒光探針具有下列結構式 R(取代基) 本發明的探針分子合成 其中，R為取代基。
本發明的探針分子與谷胱甘肽的反應機理
其中，R為取代基。
本發明的目的之二可通過如下技術措施之一來實現該合成方法按如下步驟進行a.先將150-200毫克硒氫化鉀溶于10毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再于室溫和真空下加入200-250毫克溴代試劑，攪拌，惰性氣體保護下依次加入400-500毫克熒光染料、500-600微升三乙胺及150-190毫克碘化亞銅，反應結束后用乙酸乙酯稀釋，然后分別依次用去離子水、濃度為1摩爾/升的氫氧化鈉溶液洗滌；b.將a步驟的混合物進行分液，得到的有機相先用無水硫酸鎂干燥，再將經干燥后熒光探針的粗品用洗脫劑過柱，最后旋蒸除去溶劑，干燥得產品。
本發明的目的之二可通過如下技術措施之二來實現該合成方法按如下步驟進行a.先向抽真空后通入惰性氣體的容器中加入0.1-0.5克鎂粉，然后緩慢加入2-3毫升溴代試劑和40-60毫升無水乙醚，通入惰性氣體并加入1.2-1.6克黑色硒粉，攪拌，緩慢加入80-100克碎冰，然后滴加10-30毫升濃鹽酸。反應混合物用去離子水洗滌后加入80-100毫升甲醇，氣體鼓泡反應18-24小時，蒸餾得二硒化物；b.取5-12毫摩爾a步驟的二硒化物溶于5-12毫升二氯甲烷中，在室溫、惰性氣體保護和攪拌下緩慢加入1-2毫升溶有1-1.5克磺酰氯的二氯甲烷溶液，經旋蒸除去溶劑，蒸餾得取代苯次硒酰氯；
c.先向通入惰性氣體的容器中加入0.2-0.6克熒光染料，然后緩慢加入30-50毫升四氯化碳，攪拌溶解，再加入0.1-0.6毫升三乙胺和b步驟的0.1-0.5克取代苯次硒酰氯，攪拌，反應結束后過濾，乙醇重結晶，得產品。
本發明的目的之二還可通過如下技術措施來實現所述的熒光染料選自羅丹明6G或羅丹明110；所述的溴代試劑選自鄰三氟甲基溴苯、間三氟甲基溴苯、對三氟甲基溴苯、2，4-雙三氟甲基溴苯、3，5-雙三氟甲基溴苯或2，4-二硝基溴苯；所述的洗脫劑為二氯甲烷∶四氫呋喃＝2-5∶1體積比。
該合成方法之一中將硒氫化鉀溶于N，N-二甲基甲酰胺中，再于室溫和真空條件下加入溴代試劑，攪拌一小時后，開大惰性氣體流量依次加入熒光染料、三乙胺和碘化亞銅，該反應溶液于室溫下攪拌24小時后，用乙酸乙酯稀釋，然后分別用去離子水、氫氧化鈉溶液洗滌。分液后有機相用無水硫酸鎂干燥，再將經干燥后的粗產品用洗脫劑過柱，最后將溶劑旋蒸除去溶劑，蒸餾得紫紅色產品。
該合成方法之二中a.合成二硒化物取圓底燒瓶(加入磁子)上接回流冷凝管，恒壓滴液漏斗，惰性氣體入口管。先抽真空后通惰性氣體，重復三次。向燒瓶中加入鎂粉，然后滴加溴代試劑，恒壓漏斗滴加無水乙醚。取下恒壓漏斗，開大惰性氣體流量，3分鐘內加入黑色硒粉。攪拌20分鐘后，先向燒瓶中緩慢加入碎冰，然后滴加10-30毫升濃鹽酸。應混合物用少量去離子水洗，得黃色溶液。再加入甲醇，氣體鼓泡反應18-24小時。蒸餾得產物為橙色液體，沸點121-123℃。
b.合成取代苯次硒酰氯取a步驟的二硒化物溶于二氯甲烷中，在室溫、惰性氣體保護下，然后于攪拌下15分鐘內緩慢加入溶有磺酰氯的二氯甲烷溶液。溶劑旋蒸除去，蒸餾得取代苯次硒酰氯，為深橙色液體，沸點54-55℃。
c.合成探針惰性氣體保護下，向50毫升圓底燒瓶中加入熒光染料，然后緩慢加入四氯化碳并攪拌溶解。向溶液中緩慢加入三乙胺，然后加入取代苯次硒酰氯。攪拌，反應后過濾，乙醇重結晶，得產物。
本發明的目的之三可通過如下技術措施來實現該熒光探針可用于化學體系、生物體系中谷胱甘肽的檢測，生物活細胞和活組織內的谷胱甘肽的熒光成像檢測，以及臨床醫學上病變組織中谷胱甘肽的檢測。
1.本發明熒光探針分子的設計基于以下原理所設計探針在水溶液中熒光微弱，加入谷胱甘肽后，谷胱甘肽中的巰基對探針結構中的硒氮鍵具有強親核作用從而將其打斷，同時恢復熒光染料強熒光結構并且生成相應的硒硫化物。相比生物體中的活性氧自由基及其它抗氧化劑，熒光探針分子對谷胱甘肽表現出良好的選擇性。
2.本發明熒光探針分子對谷胱甘肽的檢測范圍為3.0×10-9-1.2×10-7摩爾/升，檢測限達1.4納摩爾，能夠實現對谷胱甘肽的高效定量檢測。探針分子細胞滲透性好，對細胞本身沒有毒副作用，適于細胞內谷胱甘肽濃度變化的檢測。
本發明的高選擇性、高靈敏度檢測谷胱甘肽的熒光探針的具體特征如下1.探針合成方法一是以熒光染料、硒氫化鉀、溴代試劑為主要原料，以碘化亞銅作催化劑，同時在加入三乙胺條件下完成。探針合成方法二是先合成二硒化物，之后合成取代苯次硒酰氯，最后在惰性氣體保護下，四氯化碳作溶劑同時加入三乙胺的條件下熒光染料與取代苯次硒酰氯反應生成目標探針。pH＝7.4的反應條件下，探針通過捕獲體系內谷胱甘肽后生成熒光產物，具有較高的靈敏度。體內存在的的活性氧和其它抗氧化劑不對檢測造成干擾，說明該探針選擇性較好。該熒光探針分子捕獲谷胱甘肽的反應在30分鐘內完成，說明其實用性較好。激光共聚焦顯微鏡成像實驗證明探針能夠穿透細胞膜進入細胞內部捕獲谷胱甘肽，對細胞本身沒有毒副作用，并且能夠對微摩爾級的谷胱甘肽濃度的變化產生響應。
2.本發明涉及的熒光探針分子具有極其重要的應用價值。特別是該探針對谷胱甘肽響應迅速，測定靈敏度高，選擇性好，對細胞的滲透性好，毒副作用小，使得這類探針作為測定生物體內谷胱甘肽的試劑有很好的實際應用價值。另外該系列探針分子結構簡單，合成工藝簡單且效率高，而且性能穩定，使得極易規模化生產。
3.本發明適用于生物體內谷胱甘肽檢測成像的新型探針分子，為生物樣品中低含量的谷胱甘肽檢測探討谷胱甘肽在生物體細胞內抗氧化系統中的重要作用提供良好的輔助手段。
圖1是本發明的探針分子與谷胱甘肽結合后產物的熒光發射譜圖，橫坐標為波長(納米)，縱坐標為相對熒光強度；圖2是本發明的熒光探針分子與谷胱甘肽結合后產物的相對熒光強度與pH變化關系圖，橫坐標為pH值，縱坐標為相對熒光強度；圖3是本發明的熒光探針分子與谷胱甘肽結合后產物的熒光強度與探針濃度的關系圖，橫坐標為探針濃度，縱坐標為相對熒光強度；圖4是本發明的熒光探針分子與谷胱甘肽結合后產物的熒光強度與谷胱甘肽濃度的關系圖，橫坐標為谷胱甘肽濃度，縱坐標為相對熒光強度；圖5是本發明的熒光探針分子對谷胱甘肽具有良好的選擇性的示意圖，橫坐標為待測物，縱坐標為相對熒光強度；圖6是本發明的熒光探針分子與谷胱甘肽濃度的線性關系圖；圖7是本發明的熒光探針分子研究人正常肝細胞和肝癌細胞內谷胱甘肽濃度變化的激光共聚焦顯微成像。
緩沖溶液的pH值的影響在實驗中，反應溶液的pH值對熒光強度有很大的影響。如圖4示，緩沖pH值從6.0到7.4變化時探針對谷胱甘肽熒光響應逐漸增大，且至7.4達平臺。因此該實驗中在pH7.4-8.0的范圍內檢測谷胱甘肽最佳。為了獲得低試劑空白、高信噪比，分析實驗中選擇加入2毫升模擬生理條件的PBS緩沖(0.1摩爾/升，pH＝7.4)。
熒光探針濃度的影響探針的濃度直接決定了谷胱甘肽能否完全被捕獲，從而影響該分析方法的準確度和靈敏度。圖5表明在探針濃度小于0.4微摩爾/升的范圍內，相對熒光強度隨探針濃度增大而增強；在0.4-0.6微摩爾/升的范圍內，相對熒光強度最大而且穩定；在大于0.6微摩爾/升的范圍內，隨著探針濃度的增大而降低。因此，本文實驗中選擇探針的濃度為0.5微摩爾/升。
谷胱甘肽濃度的影響實驗中我們檢測了谷胱甘肽濃度的影響，隨著谷胱甘肽的濃度從0.003微摩爾/升增至0.12微摩爾/升，探針的熒光響應逐漸增大并且達平臺(圖6)。因此，實驗中選擇最佳谷胱甘肽的濃度為0.12微摩爾/升。
生物體內活性氧及其它抗氧化物質的干擾為了評價該方法的選擇性，我們選擇探針的濃度為0.5微摩爾/升，谷胱甘肽的濃度為0.12微摩爾/升測定了生物體內活性氧及其它抗氧化物質次氯酸鈉(1000倍，0.12毫摩爾/升)；過氧化氫(500倍，60微摩爾/升)；過氧化叔丁醇，羥自由基，單線態氧，抗壞血酸(300倍，36微摩爾/升)；超氧陰離子(50倍，6微摩爾/升)； 半胱氨酸(5倍，0.6微摩爾/升)。超氧陰離子是由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(36微摩爾/升/10毫U)在25℃下反應5分鐘產生。羥自由基和單線態氧則分別是由過氧化氫與鈷離子，過氧化氫與次氯酸鈉反應產生。結果如圖7所示，干擾實驗證明大多數生物樣品中的共存物質無干擾，說明本方法選擇性好，可用于有機及生物體系中谷胱甘肽的測定。
HepG2人肝癌細胞和HL-7002人正常肝細胞的培養和染色HepG2人肝癌細胞和HL-7002人正常肝細胞用常規DMEM培養液(含10％胎牛血清，NaHCO3(2克/L)，青霉素100U/毫升，鏈霉素100微克/毫升)調整細胞密度為1×106個細胞/毫升，置于放有無菌蓋玻片的培養皿中，37℃，5％CO2培養箱中放置4小時。用無血清的DMEM清洗2～3次，除去未貼壁的細胞，獲取貼壁的HepG2和HL-7002細胞供實驗用。貼壁細胞用探針溶液(5微摩爾/升，150微升，PBS緩沖，pH＝7.4)分別孵育15、30分鐘。用激光共聚焦顯微鏡(Leica SPE，Germany)拍攝上述細胞的熒光顯微照片。熒光成像前，用PBS(0.10摩爾/升，pH7.4)的緩沖溶液沖洗蓋玻片三次。
激光共聚焦成像將本發明的熒光探針用來檢測人正常肝細胞(HL-7702)和肝癌細胞(HepG2)中谷胱甘肽的濃度變化。結果發現，在37℃下用0.5微摩爾/升探針孵育15分鐘后，兩種細胞均沒有熒光(圖9a，d)。當孵育30分鐘后人正常肝細胞發出強烈的熒光(圖9b)，而肝癌細胞有微弱的熒光(圖9e)。(c)(f)分別代表(b)(e)圖像的明場。細胞孵育在37℃含5％二氧化碳的培養箱中進行。圖中標尺為20微米。由此表明，本發明的熒光探針可以用來反映人正常肝細胞和肝癌細胞中谷胱甘肽的濃度變化。
具有實施方式實施例1a.先將150毫克硒氫化鉀溶于10毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再于室溫和真空下加入250毫克鄰三氟甲基溴苯，攪拌一小時后，通入氬氣并依次加入400毫克羅丹明6G、600微升三乙胺及150毫克碘化亞銅，該反應溶液于室溫下攪拌24小時后用10毫升乙酸乙酯稀釋，然后分別依次用20毫升去離子水、5毫升濃度為1摩爾/升的氫氧化鈉溶液洗滌；b.用分液漏斗將混合物分液，得到的有機相先用無水硫酸鎂干燥，取二氯甲烷∶四氫呋喃＝2∶1體積比制成洗脫劑，再將經干燥后的熒光探針粗品用洗脫劑過柱，35℃旋蒸除去溶劑，真空干燥得紫紅色產品。
實施例2a.先將200毫克硒氫化鉀溶于10毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再于室溫和真空下加入200毫克鄰三氟甲基溴苯，攪拌一小時后，通入氮氣并依次加入500毫克羅丹明6G、500微升三乙胺及190毫克碘化亞銅，該反應溶液于室溫下攪拌24小時后用30毫升乙酸乙酯稀釋，然后分別依次用5毫升去離子水、20毫升濃度為1摩爾/升的氫氧化鈉溶液洗滌；b.用分液漏斗將混合物分液，得到的有機相先用無水硫酸鎂干燥，取二氯甲烷∶四氫呋喃＝5∶1體積比制成洗脫劑，再將經干燥后的熒光探針粗產品用洗脫劑過柱，45℃旋蒸除去溶劑，蒸餾得紫紅色產品。
實施例3a.先將170毫克硒氫化鉀溶于10毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再于室溫和真空下加入220毫克鄰三氟甲基溴苯，攪拌一小時后，通入氦氣并依次加入450毫克羅丹明6G、550微升三乙胺及170毫克碘化亞銅，該反應溶液于室溫下攪拌24小時后用20毫升乙酸乙酯稀釋，然后分別依次用10毫升去離子水、10毫升濃度為1摩爾/升的氫氧化鈉溶液洗滌；b.用分液漏斗將混合物分液，得到的有機相先用無水硫酸鎂干燥，取甲醇∶乙酸乙酯＝1∶20體積比制成洗脫劑，再將經干燥后的熒光探針粗品用洗脫劑過柱，40℃旋蒸除去溶劑，真空干燥得紫紅色產品。
實施例4a.合成二硒化物取圓底燒瓶(加入磁子)上接回流冷凝管，恒壓滴液漏斗，氮氣入口管。先抽真空后通入氮氣，重復三次。向燒瓶中加入0.1克鎂粉，然后緩慢加入3毫升鄰三氟甲基溴苯和40毫升無水乙醚，取下恒壓漏斗，開大氮氣流量，3分鐘內加入1.6克黑色硒粉。攪拌20分鐘后，先向燒瓶中緩慢加入80克碎冰，然后加入10毫升濃鹽酸。反應混合物用少量去離子水洗滌，得黃色溶液。再加入100毫升甲醇，氣體鼓泡反應24小時。蒸餾得產物為橙色液體，沸點121-123℃。
b.合成取代苯次硒酰氯取12毫摩爾a步驟的二硒化物溶于5毫升二氯甲烷中，在室溫、氮氣保護下，攪拌10分鐘，然后緩慢加入2毫升溶有1克磺酰氯的二氯甲烷溶液。35℃旋蒸除去溶劑，蒸餾得產物為深橙色液體，沸點54-55℃。
c.合成探針在氮氣下向50毫升的容器中加入0.2克羅丹明6G，再緩慢加入50毫升四氯化碳并攪拌溶解，然后向溶液中緩慢加入0.1毫升三乙胺和b步驟的0.5克取代苯次硒酰氯，攪拌，反應2小時后過濾，乙醇重結晶，得產品。
實施例5a.合成二硒化物取圓底燒瓶(加入磁子)上接回流冷凝管，恒壓滴液漏斗，氦氣入口管。先抽真空后通氦氣，重復三次。向燒瓶中加入0.5克鎂粉，然后緩慢加入2毫升鄰三氟甲基溴苯和60毫升無水乙醚，取下恒壓漏斗，開大氦氣流量，3分鐘內加入1.2克黑色硒粉。攪拌20分鐘后，先向燒瓶中緩慢加入100克碎冰，然后加入30毫升濃鹽酸。反應混合物用少量去離子水洗滌，得黃色溶液。再加入80毫升甲醇，氣體鼓泡反應18小時。蒸餾得產物為橙色液體，沸點121-123℃。
b.合成取代苯次硒酰氯取5毫摩爾a步驟的二硒化物溶于12毫升二氯甲烷中，在室溫、氦氣保護下，攪拌20分鐘，然后緩慢加入1毫升溶有1.5克磺酰氯的二氯甲烷溶液。45℃旋蒸除去溶劑，蒸餾得產物為深橙色液體，沸點54-55℃。
c.合成探針在氦氣保護下向50毫升的容器中加入0.6克羅丹明6G，再緩慢加入30毫升四氯化碳并攪拌溶解，然后向溶液中緩慢加入0.6毫升三乙胺和b步驟的0.1克取代苯次硒酰氯，攪拌，反應2小時后過濾，乙醇重結晶，得產品。
實施例6a.合成二硒化物取圓底燒瓶(加入磁子)上接回流冷凝管，恒壓滴液漏斗，氬氣入口管。先抽真空后通入氬氣，重復三次。向燒瓶中加入0.3克鎂粉，然后緩慢加入2.5毫升鄰三氟甲基溴苯和50毫升無水乙醚，取下恒壓漏斗，開大氬氣流量，3分鐘內加入1.4克黑色硒粉。攪拌20分鐘后，先向燒瓶中緩慢加入90克碎冰，然后加入20毫升濃鹽酸。反應混合物用少量去離子水洗滌，得黃色溶液。再加入90毫升甲醇，氣體鼓泡反應20小時。蒸餾得產物為橙色液體，沸點121-123℃。
b.合成取代苯次硒酰氯取8毫摩爾a步驟的二硒化物溶于8毫升二氯甲烷中，在室溫、氬氣保護下，攪拌15分鐘，然后緩慢加入1.5毫升溶有1.4克磺酰氯的二氯甲烷溶液。85℃旋蒸除去溶劑，蒸餾得產物為深橙色液體，沸點54-55℃。
c.合成探針在氬氣下向50毫升的容器中加入0.4克羅丹明6G，再緩慢加入40毫升四氯化碳并攪拌溶解，然后向溶液中緩慢加入0.3毫升三乙胺和b步驟的0.3克取代苯次硒酰氯，攪拌，反應2小時后過濾，乙醇重結晶，得產品。
實施例7用羅丹明110替代羅丹明6G，其他分別同實施例1-6。
實施例8用間三氟甲基溴苯替代鄰三氟甲基溴苯，其他分別同實施例1-7。
實施例9用對三氟甲基溴苯替代鄰三氟甲基溴苯，其他分別同實施例1-7。
實施例10用2，4-雙三氟甲基溴苯替代鄰三氟甲基溴苯，其他分別同實施例1-7。
實施例11用3，5-雙三氟甲基溴苯替代鄰三氟甲基溴苯，其他分別同實施例1-7。
實施例12用2，4-二硝基溴苯替代鄰三氟甲基溴苯，其他分別同實施例1-7。
權利要求
1.檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針，其特征在于該熒光探針具有如下結構式 式中R＝
2.檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針的合成方法，其特征在于該合成方法按如下步驟進行a.先將150-200毫克硒氫化鉀溶于10毫升N，N-二甲基甲酰胺中，再于室溫和真空下加入200-250毫克溴代試劑，攪拌，惰性氣體保護下依次加入400-500毫克熒光染料、500-600微升三乙胺及150-190毫克碘化亞銅，反應結束后用乙酸乙酯稀釋，然后分別依次用去離子水、濃度為1摩爾/升的氫氧化鈉溶液洗滌；b.將a步驟的混合物進行分液，得到的有機相先用無水硫酸鎂干燥，再將經干燥后熒光探針的粗品用洗脫劑過柱，最后旋蒸除去溶劑，干燥得產品。
3.檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針的合成方法，其特征在于該合成方法按如下步驟進行a.先向抽真空后通入惰性氣體的容器中加入0.1-0.5克鎂粉，然后緩慢加入2-3毫升溴代試劑和40-60毫升無水乙醚，通入惰性氣體并加入1.2-1.6克黑色硒粉，攪拌，緩慢加入80-100克碎冰，然后滴加10-30毫升濃鹽酸。反應混合物用去離子水洗滌后加入80-100毫升甲醇，氣體鼓泡反應18-24小時，蒸餾得二硒化物；b.取5-12毫摩爾a步驟的二硒化物溶于5-12毫升二氯甲烷中，在室溫、惰性氣體保護和攪拌下緩慢加入1-2毫升溶有1-1.5克磺酰氯的二氯甲烷溶液，經旋蒸除去溶劑，蒸餾得取代苯次硒酰氯；c.先向通入惰性氣體的容器中加入0.2-0.6克熒光染料，然后緩慢加入30-50毫升四氯化碳，攪拌溶解，再加入0.1-0.6毫升三乙胺和b步驟的0.1-0.5克取代苯次硒酰氯，攪拌，反應結束后過濾，乙醇重結晶，得產品。
4.根據權利要求2或3所述的檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針的合成方法，其特征在于所述的熒光染料選自羅丹明6G或羅丹明110。
5.根據權利要求2或3所述的檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針的合成方法，其特征在于所述的溴代試劑選自鄰三氟甲基溴苯、間三氟甲基溴苯、對三氟甲基溴苯、2，4-雙三氟甲基溴苯、3，5-雙三氟甲基溴苯或2，4-二硝基溴苯。
6.根據權利要求2所述的檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針的合成方法，其特征在于所述的洗脫劑為二氯甲烷∶四氫呋喃＝2-5∶1或甲醇∶乙酸乙酯＝1∶18-22體積比。
7.根據權利要求2所述的檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針的合成方法，其特征在于所述的旋蒸溫度為35-45℃。
8.權利要求1所述的檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針用于化學體系和生物體系中谷胱甘肽的檢測，生物活細胞和活組織內的谷胱甘肽的熒光成像檢測，以及臨床醫學上病變組織中谷胱甘肽的檢測。
全文摘要
本發明提供了一種用于選擇性檢測細胞內谷胱甘肽的熒光探針及合成方法和用途。所述的方法是a.先將150－200毫克硒氫化鉀溶于10毫升N，N－二甲基甲酰胺中，再于室溫和真空下加入200－250毫克溴代試劑，攪拌，惰性氣體保護下依次加入400－500毫克熒光染料、500－600微升三乙胺及150－190毫克碘化亞銅，反應結束后用乙酸乙酯稀釋，然后分別依次用去離子水、濃度為1摩爾/升的氫氧化鈉溶液洗滌；b.將a步驟的混合物進行分液，得到的有機相先用無水硫酸鎂干燥，再將經干燥后熒光探針的粗品用洗脫劑過柱，最后旋蒸除去溶劑，干燥得產品。
文檔編號C12Q1/00GK101093222SQ20071001640
公開日2007年12月26日 申請日期2007年7月24日 優先權日2007年7月24日
發明者唐波, 邢艷瓏, 李平, 段霞, 卜令海 申請人:山東師范大學