專利名稱：一種對hbv拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法。
背景技術：
拉米夫定是目前普遍使用的治療慢性乙肝的核苷類似藥物，但用藥后易引起HBV基因組突變而使HBV產生耐藥性，降低治療的效果。目前多數臨床資料認為，乙型肝炎患者拉米夫定治療過程中HBV出現YMDD基因變異是HBV耐藥的主要原因，因此YMDD基因變異檢測是拉米夫定耐藥的主要指標。
實時熒光PCR擴增是近期國內應用較多的HBV耐藥檢測方法。檢測原理如下其對基因點突變的檢測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體的穩定性，從而降低其熔解溫度.這樣便可對基因的突變和多態性進行分析。
它的具體作法是首先對待分析的DNA片段進行PCR擴增，以增加待檢測目的片段的數量加入緩沖液，DNA引物，單核苷酸堿基，DNA聚合酶，去離子水，DNA模板，兩條熒光基團標記DNA探針探針，進行擴增反應。擴增過程為94℃變性60秒后進入一個循環過程，循環條件為94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸90秒，循環25次，擴增完成后，立即進入熔解溫度檢測步驟將擴增產物溫度從45℃以0.5℃每秒的幅度進行遞增，直至溫度達到94℃。在此過程中連續檢測擴增產物的熒光信號，結合相應軟件的分析，得到該檢測樣品的熔解溫度，從而分析該樣品的基因的突變和多態性。
現有技術存在的問題是1)檢測成本高昂檢測需要兩條熒光基團標記的探針才能實現，熒光探針制備費用相對較高；2)功能單一檢測結果只能對檢測位點是否發生突變進行檢測，但不能檢測出單個堿基的變化情況；3)檢測結果不夠準確由于檢測的目標是反應過程中熒光強度的變化，在一個反應體系中，由于兩條熒光探針的存在，不可避免的帶來了熒光背景的干擾，導致結果不準確。
發明內容
本發明要提供一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，以克服現有技術存在的檢測成本高昂、功能單一和檢測結果不夠準確的問題。
為克服現有技術存在的問題，本發明的解決方案是一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，依次包括下述步驟，首先是對待分析的DNA片段進行PCR擴增及摻入在反應管中加入緩沖液、DNA引物、單核苷酸、DNA聚合酶、去離子水、DNA模板和一條熒光基團標記DNA探針進行擴增反應；然后進行熒光偏振檢測及數據分析對完成上述步驟的產物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數值的讀取，判定檢測結果。
上述擴增步驟中還加入UNG酶。可降解其他PCR產物，防止非特異信號的產生，起到防污染的作用。
上述擴增反應中加入4.5～5份緩沖液，1～1.2份DNA引物(HBV特異性)，0.8～1份單核苷酸，1～1.2份DNA聚合酶，0.5～0.6份熒光基團標記DNA探針(HBV拉米夫定耐藥特異性)，26～27.5份去離子水，5±0.05份DNA模板。
上述擴增步驟中還加入1～1.2份UNG酶。
上述擴增反應的具體過程是94～95℃熱變性3～5分鐘后進入一個擴增循環，循環條件為94～95℃變性18～25秒，55～60℃退火35～40秒，70～72℃延伸28～35秒，循環32～35次，循環完成后15～18℃保持18～25分鐘使樣品冷卻。
與現有技術相比，本發明的優點是1、檢測所需試劑成本低廉本發明中除常規PCR所需要的試劑體系外，只需要一條熒光素標記的探針便可完成。
2、功能多利用本發明，不僅可根據探針的序列，對單核苷酸多態性(SingleNucleotide Polymorphism，SNP)及點突變進行分析檢測，檢測結果準確，靈敏。同時能夠判斷出模板檢測部分的基因序列。這是由于在反應體系中使用的是熒光基團標記的DNA探針，從而避免了引物以及單核苷酸對熒光染料與模板結合的競爭。進行反應時，當模板與熒光基團標記的DNA探針發生雜交時，熒光基團標記DNA探針分子量會發生改變，熒光偏振值也會相應改變，證明模板基因序列與探針序列互補；而當模板不能夠與熒光基團標記的DNA探針雜交時，熒光偏振值不發生改變。通過對熒光偏振值的讀取，就能夠判斷出模板檢測部分的基因序列。
3、檢測結果準確首先本發明排除了熒光背景干擾的可能，這是由于本發明在檢測中采用的是熒光偏振的檢測方法，熒光偏振的強度變化，它不受熒光素濃度改變而改變(在熒光素濃度達到檢測域值后)，而是根據試劑的反應的情況而發生改變，避免了熒光背景的干擾，就大大減少了影響檢測結果的因素。其次，新方法是直接檢測待測樣品的熒光偏振值，而現有技術中的方法是通過檢測待測樣品與探針的熔解溫度，從而間接的判斷出待測樣品突變性質。因此新方法更加直觀，影響因素更少，結果也更加準確。
4、對實驗操作條件要求降低因為避免了熒光強度背景干擾的可能，產生熒光污染的可能性也降低，因此對實驗操作條件要求降低，操作性得到提高。
5、減輕工作人員的勞動強度現有技術的檢測發生在擴增過程中，在此過程中需要連續檢測，而本發明的檢測是在產物擴增完成后進行，因此減輕了勞動強度。
具體實施例方式下面將結合具體實施例對本發明做詳細的說明。
實施例1一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，依次包括下述步驟1)擴增及摻入該步驟對從標本中提取的DNA片段進行PCR擴增，擴增的同時，熒光標記的探針摻入到HBV目的基因中。
具體方法是加入5份緩沖液，1份DNA引物(HBV特異性)，1份單核苷酸，1份DNA聚合酶，0.5份熒光基團標記DNA探針(HBV拉米夫定耐藥特異性)，27.5份去離子水，5份DNA模板，1份UNG酶，進行擴增反應。
反應過程為94℃熱變性4分鐘后進入一個擴增循環，循環條件為94℃變性20秒，57℃退火40秒，72℃延伸30秒，循環35次；循環完成后15℃保持20分鐘使樣品冷卻。
2)熒光偏振檢測及數據分析對完成步驟1的產物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數值的讀取，判定檢測結果，確定HBV拉米夫定耐藥特異性。
實施例2一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，依次包括下述步驟1)擴增及摻入該步驟對從標本中提取的DNA片段進行PCR擴增，擴增的同時，熒光標記的探針摻入到HBV目的基因中。
具體方法是加入4.5份緩沖液，1.2份DNA引物(HBV特異性)，0.8份單核苷酸，1.2份DNA聚合酶，0.6份熒光基團標記DNA探針(HBV拉米夫定耐藥特異性)，26份去離子水，5.05份DNA模板，1.2份UNG酶，進行擴增反應。
反應過程為95℃熱變性5分鐘后進入一個擴增循環，循環條件為95℃變性25秒，55℃退火40秒，70℃延伸35秒，循環32次，循環完成后18℃保持25分鐘使樣品冷卻。
2)熒光偏振檢測及數據分析對完成步驟1的產物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數值的讀取，判定檢測結果，確定HBV拉米夫定耐藥特異性。
權利要求
1.一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于依次包括下述步驟首先是對待分析的DNA片段進行PCR擴增及摻入反應管中加入緩沖液、DNA引物、單核苷酸、DNA聚合酶、去離子水、DNA模板和一條熒光基團標記DNA探針，進行擴增反應；然后進行熒光偏振檢測及數據分析對完成上述步驟的產物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數值的讀取，判定檢測結果。
2.如權利要求1所述的一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于所述擴增步驟中還加入UNG酶。
3.如權利要求1或2所述的一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于所述擴增反應中加入4.5～5份緩沖液、1～1.2份DNA引物(HBV特異性)、0.8～1份單核苷酸、1～1.2份DNA聚合酶、26～27.5份去離子水、5±0.05份DNA模板和0.5～0.6份熒光基團標記DNA探針(HBV拉米夫定耐藥特異性)。
4.如權利要求3所述的一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于所述擴增步驟中還加入1～1.2份UNG酶。
5.如權利要求1或2所述的一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，其特征在于所述擴增反應的具體過程是94～95℃熱變性3～5分鐘后進入一個擴增循環，循環條件為94～95℃變性18～25秒，55～60℃退火35～40秒，70～72℃延伸28～35秒，循環32～35次，循環完成后15～18℃保持18～25分鐘使樣品冷卻。
全文摘要
本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法。現有技術檢測成本高昂、功能單一、檢測結果不夠準確。本發明提供一種對HBV拉米夫定耐藥性進行分析檢測的方法，包括下述步驟首先是對待分析的DNA片段進行PCR擴增及摻入反應管中加入緩沖液、DNA引物、單核苷酸、DNA聚合酶、去離子水、DNA模板和一條熒光基團標記DNA探針，進行擴增反應；然后進行熒光偏振檢測及數據分析對完成上述步驟的產物進行熒光偏振檢測，通過對熒光偏振數值的讀取，判定檢測結果。優點是檢測所需試劑成本低廉、功能多、檢測結果準確、對實驗操作條件要求降低、減輕工作人員的勞動強度。
文檔編號C12Q1/68GK101024855SQ20071001758
公開日2007年8月29日 申請日期2007年3月29日 優先權日2007年3月29日
發明者崔崇軍, 雷紅文, 張菊 申請人:陜西陽光生物工程股份有限公司