一種菌株耐藥性的快速測定方法

專利名稱：一種菌株耐藥性的快速測定方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種菌株耐藥性的快速測定方法，特別是涉及一
種采用掃描獲得的菌株生長曲線而快速測定菌株對抗生素敏感性的方法。
背景技術：
目前世界衛生組織認為，隨著抗生素的濫用，所有主要的傳染病病原都會逐漸對 藥物產生抗性。耐藥菌產生之快、傳播之迅速、耐藥率之高已經引起了世界性關注。菌株的 耐藥性不僅使藥物療效減弱，還會使藥物失去療效，導致病人死亡率升高。菌株耐藥性的研 究已成為當今的一個世界性熱點。快速、簡便地測定菌株耐藥性是控制耐藥菌的關鍵所在， 可及早發現耐藥菌、阻斷耐藥菌傳播、盡量縮小耐藥菌危害，具有非常重要的意義。
目前耐藥菌的檢測方法有紙片擴散法、肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法、自動化藥敏儀、 Etest法和耐藥基因檢測。其中普遍采用的紙片擴散法，通過測量抑菌環直徑并比照美國臨 床實驗室標準化委員會的標準進行判定是否耐藥。該方法價格便宜、操作簡便，是世界衛生 組織推薦的標準方法，但是該方法花費時間長，無法測定生長緩慢的微生物，還可能存在感 染危險。肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法是將抗生素倍比稀釋在肉湯或瓊脂中，定量測定最低抑 菌濃度的方法。該方法可準確定量最低抑菌濃度，但是該方法耗時、費力，尤其對于大批量 菌的耐藥性測定，工作量太大。自動化藥敏儀，通過檢測濁度或熒光指示劑的熒光強度或底 物水解反應來判定結果。該方法快速，適合大量檢測，但是需要昂貴的藥敏儀，無法在基層 廣泛普及。Etest法，原理是在一條塑料條背面吸附有濃度連續變化的抗生素，其表面是相 應的抗生素濃度刻度；當Etest條放在已接種了一定濃度細菌的特定藥敏培養基上后，抗 生素立即釋放至瓊脂中，呈單一方向擴散；經一定時間孵育后產生一橢圓形的抑菌環，抑菌 環與Etest條交界處的刻度即為該菌株的最低抑菌濃度。該方法操作簡易、結果準確、不需 昂貴儀器，但是Etest條價格相當昂貴，也不適合大批量檢測。耐藥基因檢測原理是根據耐 藥基因設計相應的特異引物，采用PCR方法直接檢測耐藥基因，確定被檢菌是否具有耐藥 性。目前已經有幾種菌的耐藥基因研究得比較多，開發出了耐藥基因檢測方法，但是對于大 多數菌來說，還無法采用該方法。 因此，本領域需要一種快速、方便并可大批量檢測菌株耐藥性的方法。

發明內容
本發明的目的在于提供一種快速檢測菌株耐藥性的方法，應用這種方法，可快速、 簡便地檢測菌種的耐藥性，確定該菌種的抗生素譜，為臨床上確定采用何種藥物治療提供參考。 為實現上述目的，本發明提供了一種菌株耐藥性的快速測定方法，其包括如下步 驟 A.制備含有噻唑藍的培養液；
B.制備菌懸液；
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C.制備抗生素溶液； D.將上述含有噻唑藍的培養液、抗生素溶液、菌懸液加入到培養板的孔中，系列稀 釋抗生素溶液； E.實時掃描測定，根據掃描結果測定菌株對抗生素的耐藥性。 由于只要有活菌存在，經過培養就能使噻唑藍產生藍色物質，因此可根據吸收峰， 確定抗生素敏感性和最低抑制濃度。例如，以測定時間為X軸，以吸收值為Y軸，作每孔的 時間-吸收曲線。如有相應軟件，可直接采用軟件，制作生長曲線。 在上述培養板上，可設置一個陰性對照，即不加菌懸液；還可再設置一個陽性對 照，即不加入抗生素。 本發明所述的菌株耐藥性的快速測定方法將噻唑藍顯色用于測定菌株在含有抗 生素的培養液中的生長情況。該方法與濁度法相比，具有更好的特異性；與熒光法相比無需 特殊儀器。工藝步驟E優選使用酶標儀掃描以測定菌株在培養液中的生長情況，其與傳統 方法相比，操作更簡便，使用的試劑更少、更經濟。 本發明提供的菌株耐藥性的快速測定方法是通過菌株在培養液中的生長情況，判 定其對抗生素的敏感性和最低抑制濃度。 本發明適宜于菌株耐藥性的快速測定，測定的菌株的耐藥性為確定該菌種的抗生 素譜、確定采用何種藥物治療提供參考。 在本發明方法中，可針對待測菌株的類別，設計抗生素。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽 性菌有兩套不同的抗生素設計。 使用本發明的菌株耐藥性的快速測定方法能夠簡單、快速、高效地大量測定菌株 的耐藥性，篩選出耐藥菌，確定菌株的抗生素譜。 本方法測定的原理是，在培養板的每孔中，加入含有噻唑藍(MTT)的培養液和各 種不同濃度的抗生素，并將菌懸液接種到各孔中后，進行培養。抗生素對菌株不產生抑制 時，隨著培養時間加長，孔中活菌數量增加，MTT被細菌的琥珀酸脫氫酶利用后產生藍色 Fomazan顆粒，擴散到培養液中，隨著細菌數量的增加，培養液的藍色逐漸加深，該過程用酶 標儀進行實時掃描，測定各孔的吸收值，做時間_吸收曲線，曲線中吸收峰的產生與細菌是 否生長直接相關。針對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，可選用不同的抗生素。該方法操作 簡便，快速，經濟，且可以使用酶標儀進行掃描，無需特殊儀器。 本發明所述的菌株耐藥性的快速測定方法是將噻唑藍顯色用于測定菌株在含有 抗生素的培養液中的生長狀況。該方法與濁度法相比，具有更好的特異性；與熒光法相比無 需特殊儀器。上述步驟A中的培養液優選為腦心浸液培養液；步驟D中的系列稀釋的稀釋 梯度為IO倍梯度；步驟E優選使用酶標儀進行掃描，以測定菌株在培養液中的生長情況。掃 描后可將測定時間作為X軸，以吸收值為Y軸，作每孔的時間-吸收曲線。如有相應軟件， 可直接利用軟件，制作生長曲線。本發明的測定方法與傳統方法相比，操作更簡便，使用的 試劑更少、更經濟。


圖1為金黃色葡萄球菌在含不同濃度的阿莫西林培養液中的生長曲線圖譜。
圖2為阪崎腸桿菌在含不同抗生素的培養液中的生長曲線圖譜。
具體實施方法 根據本發明的菌株耐藥性的快速測定方法的一個實施方案，該測定方法包括如下 步驟 A.將噻唑藍用PBS配置成5±0. 5%的儲備液，滅菌，約4。C冰箱保存。將噻唑藍儲 備液加入腦心浸液培養液，使其終濃度達到0. 1±0. 05%，滅菌，約4t:冰箱保存備用；
B.制備l-10CFU/ml的菌懸液；
C.制備抗生素溶液； D.將178士20ia含有噻唑藍的腦心浸液加入到培養板的每一孔中，并加入菌懸 液20 ± 5 ，然后加入抗生素2 ± 1 ，系列稀釋抗生素溶液，抗生素溶液的最終濃度為系 列濃度，如O. 1U、10禾口 lOOii g/ml系列濃度，10—5、10—4、10—3、10—2、10—丄、1、10禾口 100 ii g/ml系 列濃度等； E.用酶標儀采用動力學測定模式進行掃描測定，測定波長為520nm ;根據掃描結 果確定菌株對抗生素的耐藥性。 在分析掃描結果時，可采用分析菌株生長曲線的方式來確定菌株對抗生素的耐藥
性，如以測定時間為X軸，以吸收值為Y軸，作每孔的時間-吸收曲線，然后分析。 利用本發明的測定方法可以快速檢測一種菌株對多種抗生素的敏感性，例如一個
96孔板， 一次可以檢測一種菌株對23種抗生素的敏感性，當菌株為革蘭氏陽性菌(如金
黃色葡萄球菌)時，所述抗生素可以為阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林、呋喃妥因、復方新諾
明、紅霉素、環丙沙星、克拉霉素、克林霉素、利福平、諾氟沙星、青霉素、慶大霉素、四環素、
頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢唑林、萬古霉素、亞胺培南、氯霉素、阿米卡星、復方磺胺甲惡唑或
替考拉寧；當菌株為革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)時，所述抗生素可以為氨芐西林、哌拉西
林、優立新、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢三嗪、頭孢他啶、頭孢噻肟鈉、慶大霉素、奈
替米星、妥布霉素、阿米卡星、環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、呋喃妥因、四環素、復
方新諾明、泰能、氨曲南或舒普深。 下面，結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明，這些實施例只用于舉例說明
本發明，并非用于對本發明的限定。
實施例1 以金黃色葡萄球菌作為革蘭氏陽性菌的例子。將噻唑藍用PBS配置成5%的儲備 液，滅菌，4t:冰箱保存。將噻唑藍儲備液加入腦心浸液培養液，使其終濃度達到O. 1%，滅 菌，4t:冰箱保存備用。將178 iU含有噻唑藍的腦心浸液加入到96孔培養板的每一孔中。 配制金黃色葡萄球菌(菌株IQCC22004)菌懸液，使其濃度達到10CFU/ml數量級，將20 yl 菌懸液加到微孔中。其中，A、B、C三行為三個重復，A1、B1、C1為空白對照，加入2iU無菌 水；A2、 B2、 C2為加入了 2iU濃度為100mg/ml的阿莫西林溶液，使其終濃度為lmg/ml ;依 次類推A3、 B3、 C3 All、 B 11、 Cll為阿莫西林濃度100 ii g/ml 10—V g/ml ;A12、 B12、 C12為未加入阿莫西林的陰性對照。蓋上微孔板蓋子，將微孔板放入酶標儀中，培養溫度設 定為36°C ，測定波長為520nm，使用動力學測定模式(Thermo公司multiskan speetrum酶 標儀Skanltso軟件)，每隔30分鐘測定1次，連續測定8小時。以測定時間為X軸，以吸收 值為Y軸，作每孔的時間-吸收曲線。由于只要該菌株對抗生素敏感，經過培養，該菌株無 法生長，不能產生藍色，儀器測定無吸收峰；如果該菌株對抗生素不敏感，經過培養，則該菌株能使噻唑藍產生藍色物質，儀器測定產生吸收峰。因此可根據出現吸收峰的孔的情況，確 定阿莫西林對該菌株的最低抑制濃度。 從圖1可見，A1、B1、C1 A6、B6、C6不出現吸收峰，A7、B7、C7開始出現吸收峰， A8、B8、C8 A11、B11、C11和陰性對照出現吸收峰。由此可見，金黃色葡萄球菌對阿莫西林 敏感，其最低抑制濃度為0. 01 ii g/ml。
實施例2 以阪崎腸桿菌作為革蘭氏陽性菌的例子。將178 iU含有噻唑藍的腦心浸液加入 到96孔培養板的每一孔中。配制阪崎腸桿菌(菌株IQCC 10424)菌懸液，使其濃度達到 10CFU/ml數量級，將20iU菌懸液加到微孔中。兩個孔重復試驗。A1、A2為陰性對照，加入 20iU無菌水代替菌懸液；A3、A4為空白對照，加入2iU無菌水代替抗生素。A5、A6，A7、A8 為0. 1 ii g/m1、0. 05 ii g/ml萬古霉素，以下依次類推，A9、 A10 Hll、 H12為苯唑西林、頭孢 唑林、頭孢泊肟、頭孢噻吩、青霉素G、頭孢西丁、阿莫西林、氨芐西林、亞胺培南、培氟沙星、 慶大霉素、羧芐西林、奈替米星、頭孢噻肟、頭孢尼西、呋南妥因、復方新諾明、環丙沙星、頭 孢他啶、諾氟沙星、四環素、妥布霉素溶液。其余步驟同實施例1。 從圖2可見，除了 B9 B 12、E9 E 12、G9 G12對應的抗生素處理青霉素G、 頭孢噻肟、頭孢他啶，其余抗生素處理的孔中生長曲線的吸收峰相對于空白對照均出現了 不同程度的減弱，可見，該菌株對青霉素G、頭孢噻肟、頭孢他啶具有抗性，而其余抗生素則 對該菌株具有不同程度的抑制。例如A5 A8對應的萬古霉素，濃度高的A5、A6處理，吸收 峰相對于空白對照出現了明顯降低，濃度低的A7、 A8處理則與空白對照吸收峰相似，可見 萬古霉素對阪崎腸桿菌菌株(ATCC29544)有一定的抑制作用，但其濃度需達到0. 05 y g/ml 以上。 與現有技術相比，本發明具有的優點為可簡單、快速、經濟、高效地測定菌株耐藥性。
權利要求
一種菌株耐藥性的快速測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟A.制備含有噻唑藍的培養液；B.制備菌懸液；C.制備抗生素溶液；D.將上述含有噻唑藍的培養液、抗生素溶液、菌懸液加入到培養板的孔中，系列稀釋抗生素溶液；E.實時掃描測定，根據掃描結果測定菌株對抗生素的耐藥性。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A中的培養液為腦心浸液培養液。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟E中使用酶標儀進行掃描。
5. 根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟E中的掃描結果以菌株的生長曲 線表示，其中測定時間為X軸，吸收值為Y軸。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟D中的系列稀釋的稀釋梯度為 IO倍梯度。
7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟A. 將噻唑藍用PBS配置成5±0. 5%的儲備液，滅菌，約4t:冰箱保存；將噻唑藍儲備液 加入腦心浸液培養液，使其終濃度達到0. 1±0. 05%，滅菌，約4。C冰箱保存備用；B. 制備l-10CFU/ml的菌懸液；C. 制備抗生素溶液；D. 將178士20ia含有噻唑藍的腦心浸液加入到培養板的每一孔中，并加入菌懸液 20 ± 5 ，然后加入抗生素2 ± 1 ，系列稀釋抗生素溶液，抗生素溶液的最終濃度為0. 1 、 1、10禾P lOOii g/ml系列濃度，或10—5、10—4、10—3、10—2、10—、1、10禾P 100 y g/ml系列濃度等；E. 用酶標儀采用動力學測定模式進行掃描測定，測定波長為520nm ;根據掃描結果確 定菌株對抗生素的耐藥性。
8. 根據權利要求1 7中任意一項所述的方法，其特征在于，所述菌株為革蘭氏陽性 菌時，所述抗生素為阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林、呋喃妥因、復方新諾明、紅霉素、環丙沙 星、克拉霉素、克林霉素、利福平、諾氟沙星、青霉素、慶大霉素、四環素、頭孢噻吩、頭孢噻 肟、頭孢唑林、萬古霉素、亞胺培南、氯霉素、阿米卡星、復方磺胺甲惡唑或替考拉寧；或者， 所述菌株為革蘭氏陰性菌時，所述抗生素為氨芐西林、哌拉西林、優立新、頭孢唑啉、頭孢呋 辛、頭孢哌酮、頭孢三嗪、頭孢他啶、頭孢噻肟鈉、慶大霉素、奈替米星、妥布霉素、阿米卡星、 環丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、呋喃妥因、四環素、復方新諾明、泰能、氨曲南或舒 普深。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌。
10. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。
全文摘要
本發明公開了一種菌株耐藥性快速測定的方法，其包括以下步驟A.制備含有噻唑藍的培養液；B.制備菌懸液；C.制備抗生素溶液；D.將上述含有噻唑藍的培養液、抗生素溶液、菌懸液加入到培養板的孔中，系列稀釋抗生素溶液；E.實時掃描測定，根據掃描結果測定菌株對抗生素的耐藥性。與現有技術相比，本發明具有的優點是可簡單、快速、經濟、高效地測定菌株的耐藥性。
文檔編號C12Q1/02GK101760502SQ20101010551
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月28日 優先權日2010年1月28日
發明者張菲菲, 徐寶梁, 楊海榮, 袁飛, 趙勇勝, 趙貴明, 陳穎 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院;袁飛