專利名稱：使用雙鏈核酸復合物與耐熱聚合酶用于合成脫氧核糖核苷酸鏈的組合物和方法
使用雙鏈核酸復合物與耐熱聚合酶用于合成脫氧核糖核苷酸鏈的組合物和方法相關申請本申請要求由St印hen Picone等人在2009年11月6日提交的題為“使用雙鏈核酸復合物與耐熱聚合酶用于合成脫氧核糖核苷酸鏈的組合物和方法”的美國臨時申請號61/258,684的優先權。將上述申請的全部教導以引用方式并入本文。
背景技術：
DNA聚合酶為催化脫氧核糖核苷酸聚合為核酸鏈的酶。在多種DNA技術中使用聚合酶，包括PCR擴增，即復制或擴增DNA鏈的過程。一些PCR方法的重要問題是非特異性擴增產物的產生(例如，產生不想要的DNA鏈)。在許多情況下，這是由于非特異性寡核苷酸弓I發和副反應的非靶寡核苷酸的產生，如背景DNA的錯誤引發和/或在實際的熱循環過程自身之前引物的低聚化以及隨后的引物延伸事件。由于耐熱DNA聚合酶在環境溫度下具有適當的活性，這經常發生。為了使該問題減少至最低程度，可進行稱為“熱啟動”PCR的方法。在熱啟動PCR中，將擴增反應所需的一種成分從反應混合物中分離或使其保持非活性狀態，直到首次將反應混合物的溫度升高。由于聚合酶在這些條件下不能發揮作用，因此在引物能夠非特異性結合的時期引物延伸較少。為了達到該效果，已經采用了幾種方法DNA聚合酶的物理分離(例如，使用固體蠟屏障以將DNA聚合酶與反應混合物分離)，DNA聚合酶的化學修飾(例 如，使DNA聚合酶可逆地失活),聚合酶DNA抗體(polymerase DNA antibody)(例如,在室溫環境下結合并在擴增過程中在較高溫度下分離的抗體)，通過核酸添加物的DNA聚合酶抑制，適體(例如，可充當抗體的形成環、假結體、和復雜三級結構的核苷酸的單鏈形式)，阻斷引物等。這些方法中的多種不方便或運行不能達到使非特異性擴增最小化的所需效果。因此，需要存在獨特且可替換的組合物和方法用于擴增反應，其不僅在擴增過程自身之前，而且在熱循環過程期間可提供非特異性引發和引物延伸的抑制。更具體而言，需要存在可替換和改進的組合物及方法用于熱啟動PCR。
發明內容
本發明涉及用于核酸擴增的阻斷雙鏈核酸復合物(DSC)。在一個實施方式中，復合物包括分離的雙鏈核酸分子，所述分離的雙鏈核酸分子包括具有包括約9至約40個之間核酸堿基的第一序列的第一核酸鏈；以及具有包括與第一序列互補的約9至約40個之間核酸堿基的第二序列的第二核酸鏈(核酸第二鏈)，其中所述第一核酸鏈和第二核酸鏈各自具有3’端和5’端，并且其中雙鏈核酸分子具有在約50%至約70%之間范圍內的胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)的百分比。雙鏈核酸復合物也包括阻斷分子，其中所述阻斷分子共價結合于第一核酸鏈、第二核酸鏈、或兩者的3’端或5’端。在一個方面，雙鏈核酸分子(例如DNA或RNA)具有在約25° C至約90° C之間范圍內的解鏈溫度。在一個實施方式中，本發明的DSC進一步包括尿嘧啶堿基的引入。當使用來自古細菌種的DNA聚合酶時，向DSC中加入一個或多個尿嘧啶堿基可進一步降低室溫下的聚合酶活性。特別地，DSC的第一序列或第二序列進一步包括一個或多個尿嘧啶堿基。阻斷分子的實例包括脫氧胸苷、雙脫氧核苷酸、3’磷酸化(3’ phosphorylation)、己二醇、間隔分子、I’ 2’ -雙脫氧核糖、2’ -O-甲基RNA、和/或鎖核酸(LNA)。在一個實施
方式中，阻斷分子具有以下結構
權利要求
1. 一種用于核酸擴增的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述復合物包括 a.分離的雙鏈核酸分子，所述分離的雙鏈核酸分子包括 1.具有包括約9至約40個之間核酸堿基的第一序列的第一核酸鏈，和 i i 具有包括與所述第一序列互補的約9至約40個之間核酸堿基的第二序列的第二核酸鏈，其中所述第一核酸鏈和所述第二核酸鏈各自具有3’端和5’端， 其中，所述雙鏈核酸分子具有在約50%至約70%之間范圍內的胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)的百分比；以及 b.阻斷分子，其中，所述阻斷分子共價結合于所述第一核酸鏈、所述第二核酸鏈、或兩者的所述3’端或所述5’端。
2.根據權利要求I所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述雙鏈核酸分子具有在約25° C至約90° C之間范圍內的解鏈溫度。
3.根據權利要求I所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述復合物包括DNA、或RNA。
4.根據權利要求I所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述阻斷分子選自由脫氧胸苷、雙脫氧核苷酸、3’磷酸化、己二醇、間隔分子、I’ 2’ -雙脫氧核糖、2’ -O-甲基RNA、和鎖核酸(LNA)組成的組。
5.根據權利要求I所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述阻斷分子包括
6.根據權利要求I所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述第一序列或所述第二序列進一步包括一個或多個尿嘧啶堿基。
7.一種用于核酸擴增的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述復合物包括 a.分離的雙鏈核酸分子，所述分離的雙鏈核酸分子包括 i.具有包括約9至約40個之間核酸堿基的第一序列的第一核酸鏈，和 ii.具有包括與所述第一序列互補的約9至約40個之間核酸堿基的第二序列的第二核酸鏈，其中所述第一核酸鏈和所述第二核酸鏈各自具有3’端和5’端， 其中，所述雙鏈核酸分子具有在約25。C至約90° C之間范圍內的解鏈溫度； b.阻斷分子，其中所述阻斷分子共價結合于所述第一核酸鏈、所述第二核酸鏈、或兩者的所述3’端或所述5’端。
8.根據權利要求7所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述阻斷分子選自由脫氧胸苷、雙脫氧核苷酸、3’磷酸化、己二醇、間隔分子、I’ 2’ -雙脫氧核糖、2’ -0-甲基RNAjP LNA組成的組。
9.一種用于核酸擴增的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述復合物包括a.分離的雙鏈核酸分子，所述分離的雙鏈核酸分子包括 i.第一核酸鏈，所述第一核酸鏈具有與下述序列有高于或等于約70%同一性的第一核酸序列，下述序列包括 a.SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16 或它們的組合， b.SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16 或它們的組合的互補物，或 c.與SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16 或它們的組合雜交的序列；以及 ii.具有包括與所述第一核酸序列互補的約9至約40個之間核酸堿基的第二序列的第二核酸鏈，其中所述第一核酸鏈和所述第二核酸鏈各自具有3’端和5’端， 其中，所述雙鏈核酸分子具有在約25。C至約90° C之間范圍內的解鏈溫度； b.阻斷分子，其中所述阻斷分子共價結合于所述第一核酸鏈、所述第二核酸鏈、或兩者的所述3’端或所述5’端。
10.根據權利要求9所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述第一和第二核酸鏈的所述3’端包括下述阻斷分子，其中當所述阻斷雙鏈核酸復合物與核酸聚合酶相互作用時，由此降低非特異性擴增產物。
11.根據權利要求9所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述復合物具有約48.9°C的解鏈溫度。
12.根據權利要求9所述的阻斷雙鏈核酸復合物，其中，所述第一序列或所述第二序列進一步包括一個或多個尿嘧啶堿基。
13.一種用于核酸擴增的組合物，所述組合物包括 a.緩沖劑； b.根據權利要求I所述的阻斷雙鏈核酸復合物；以及 c.耐熱聚合酶。
14.根據權利要求13所述的用于核酸擴增的組合物，其中，所述聚合酶為由下述組成的組中的DNA聚合酶Taq DNA聚合酶；BST DNA聚合酶；PFU DNA聚合酶；Klenow DNA聚合酶；T7DNA聚合酶；T4DNA聚合酶；Phi29DNA聚合酶；以及RB69DNA聚合酶。
15.根據權利要求13所述的用于核酸擴增的組合物，其中，濃度范圍在每5，000U/mL聚合酶為約2 ii M核酸復合物至每5，000U/mL聚合酶為2mM核酸復合物之間。
16.根據權利要求13所述的用于核酸擴增的組合物，其中，所述緩沖劑包括TRIS緩沖劑、MOPS、或HEPES緩沖劑。
17.—種擴增靶核酸分子的方法，所述方法包括 將所述靶核酸分子與DNA聚合酶和根據權利要求I所述的雙鏈核酸復合物接觸，其中所述雙鏈核酸復合物在約25° C至約90° C范圍的溫度下結合于所述DNA聚合酶； 其中，獲得擴增的靶核酸分子，并且與未與所述雙鏈核酸復合物接觸相比，減少了一種或多種非特異性擴增產物或次級產物的產生。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，與未與所述雙鏈核酸復合物接觸的靶核酸分子的聚合酶活性相比，降低了在約20° C至25° C之間溫度下的聚合酶活性。
19.根據權利要求18所述的方法，其中，在約20°C至25° C之間溫度下的聚合酶活性降低在約50%至約90%之間的范圍內。
20.根據權利要求17所述的方法，其中，與未與所述雙鏈核酸復合物接觸時獲得的靶核酸分子的量相比，擴增的祀核酸分子的量增加。
21.根據權利要求20所述的方法，其中，獲得的擴增靶核酸的量增加在約2X至約20X之間的范圍內。
22.—種擴增靶核酸分子的方法，所述方法包括 將所述靶核酸分子與來自古細菌種的DNA聚合酶和根據權利要求6所述的雙鏈核酸復合物接觸，其中，所述雙鏈核酸復合物在約25° C至約90° C范圍的溫度下結合于所述DNA聚合酶； 其中，獲得擴增的靶核酸分子，并且與未與所述雙鏈核酸復合物接觸相比，減少了一種或多種非特異性擴增產物或次級產物的產生。
23.根據權利要求22所述的方法，其中，與未與所述雙鏈核酸復合物接觸的靶核酸分子的聚合酶活性相比，降低了在約20° C至25° C之間溫度下的聚合酶活性。
24.根據權利要求23所述的方法，其中，在約20°C至25° C之間溫度下的聚合酶活性降低在約50%至約90%之間的范圍內。
25.—種擴增靶核酸分子的方法，所述方法包括 a.將緩沖劑，所述靶核酸分子，一種或多種引物，DNA聚合酶，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的供應物，以及根據權利要求I所述的雙鏈核酸復合物混合； b.通過在一個或多個循環中升高溫度使得所述靶核酸分子擴增，其中溫度范圍在約25° C至約90° C之間， 其中，獲得擴增的靶核酸分子，并且與未與所述雙鏈核酸復合物接觸相比，減少了一種或多種非特異性擴增產物或次級產物的產生。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，與未與所述雙鏈核酸復合物接觸的靶核酸分子的聚合酶活性相比，降低了在約20° C至25° C之間溫度下的聚合酶活性。
27.根據權利要求25所述的方法，其中，與未與所述雙鏈核酸復合物接觸的靶核酸分子相比，增加了擴增的靶核酸分子的量。
28.一種用于核酸擴增的試劑盒；所述試劑盒包括 a.根據權利要求I所述的阻斷雙鏈核酸復合物；以及 b.聚合酶。
29.根據權利要求28所述的試劑盒，其中，所述聚合酶為由下述組成的組中的DNA聚合酶Taq DNA聚合酶；BST DNA聚合酶；PFU DNA聚合酶；Klenow DNA聚合酶；T7DNA聚合酶；T4DNA聚合酶； Phi29DNA聚合酶；以及RB69DNA聚合酶。
全文摘要
本發明涉及分子生物學領域，更具體而言，涉及用于擴增過程的核酸構建。更確切地，本發明通過借助雙鏈寡核苷酸來提高核酸擴增的特異性，其中使用具有防止雙鏈核酸延長的能力的分子對所述雙鏈寡核苷酸進行修飾。
文檔編號C12Q1/68GK102791877SQ201080050355
公開日2012年11月21日 申請日期2010年11月5日 優先權日2009年11月6日
發明者克里斯托弗·伯努瓦, 斯蒂芬·皮科內, 比利亞納·科萊瓦 申請人:酶學有限公司