專利名稱：人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產品的制作方法
技術領域：
人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產品，屬于長效重組融合蛋白藥物技術領域。
背景技術：
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血漿中的主要蛋白成分，在血漿中的濃度為40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 2616747-6757)，它除了具有維持血漿滲透壓功能外，還能結合內源性和/或外源性配體，包括激素、有毒代謝產物、藥物等。通過結合這些配體，HSA可以調節激素活性、內源性和/或外源性物質的毒性和藥物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et BiophysicaActa，20031640119-128)。David S.Park等構建的HalfHSA(截取HSA的前297個氨基酸殘基)具有野生型HSA相應區類似的二級結構，同時保留了野生型HSA結合甲狀腺素和甲狀腺素類似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，199948169-174)，細胞中剛翻譯出來的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein結構，包括18個氨基酸殘基的信號肽和6個氨基酸殘基前肽的原肽。信號肽和前肽在轉運和分泌的過程中被切除，成熟的HSA由585個氨基酸殘基組成，含有17對二硫鍵，分子量約為66.5KDa。通常情況下，HSA為非糖基化蛋白，然而有的突變體中也存在N-連接糖基化(見Uniprot中的protein ALBU HUMAN)。Peters的觀點認為進化出大分子蛋白的優點是減小其在內循環時經腎排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37161-245)。HSA的分子量相對較大，在正常情況下，不易被腎小球濾過，其血漿半衰期在20天左右。
人甲狀旁腺激素(human parathyroid hormone，PTH)通過與受體結合后激活腺苷酸環化酶和蛋白激酶C的活性，改變骨吸收和骨合成的速率，影響骨代謝。如果PTH的活性片段在較低或中等劑量的濃度下長時間作用于骨，則會刺激骨的形成，并且通過誘導骨中的合成作用而有效地治療骨質疏松癥。由于PTH分子量較小，易被腎小球濾過，因而在體內的半衰期較短，皮下給藥或肌肉注射的半衰期一般在12h左右。為了達到治療效果，一般需要頻繁大劑量用藥，為了克服上述缺點，人們通過對甲狀旁腺激素加以修飾，以延長其半衰期。本發明將把PTH和HSA進行融合表達，通過研發人PTH的長效化技術，改善PTH體內藥代動力學性狀，研發出一種具有自主知識產權的長效新藥。
發明內容
本發明的目的是提供一種人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法及產品。本發明的融合蛋白在保持了人甲狀旁腺激素的生理特性的基礎上延長其在體內的半衰期，改善其溶解度，在藥學領域有良好的應用前景。
本發明的技術方案從新鮮人甲狀旁腺組織中分離單核細胞，刺激培養，提取RNA，通過RT-PCR反轉錄得到PTH cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA；利用重疊PCR技術，連接HSA cDNA和PTH cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的PTH-HAS cDNA融合基因插入到克隆載體中保存；PTH-HAS cDNA融合基因在宿主系統進行表達，PTH-HSAcDNA融合基因被整合到宿主的染色體中。
PTH cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，HSA cDNA和PTH cDNA融合基因的克隆，融合蛋白PTH-HSA的重組酵母構建和融合蛋白PTH-HSA的表達的步驟詳見實施例。
用上述方法制備的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區和與人甲狀旁腺激素至少85％序列同源的第二區；所述與人血清白蛋白同源的第一區位于融合蛋白的C末端，所述與人甲狀旁腺激素同源的第二區位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽；或所述與人甲狀旁腺激素同源的第二區位于融合蛋白的C末端，所述與人血清白蛋白同源的第一區位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽。
優選的是所述融合蛋白包括與人血清白蛋白至少95％序列同源的第一區和與人甲狀旁腺激素至少95％序列同源的第二區。
所述融合蛋白的第一區可以由人血清白蛋白部分結構域組成、或經結構域重排后的人血清白蛋白組成，包括所有HSA天然存在的多態型外，還包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名為HSA(1-n)，n為369-419。
所述融合蛋白包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區和與人甲狀旁腺激素氨基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
本發明的另一內容是提供表達融合蛋白編碼區的宿主。宿主系統是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞等。優選的宿主系統是酵母。優選的酵母是畢赤酵母。優選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
由于PTH基因含有內含子，從新鮮人甲狀旁腺組織中分離單核細胞，刺激培養，提取RNA，通過RT-PCR反轉錄得到PTH cDNA。HAS cDNA可以通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得。獲得的PTH cDNA和HSA cDNA分別插入到克隆載體中，測序。利用重疊PCR技術，連接PTH cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩定性和免疫原性方面的問題，得到的PTH cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆載體中保存。
PTH cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多個宿主系統中表達，如細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞，及生物體(如脊椎動物、昆蟲)等。在這些表達系統中目的基因被整合到宿主的染色體中或插入到質粒中。本發明優選的是酵母表達系統，更優選的是畢氏酵母表達系統。
畢氏酵母表達系統分泌型表達載體主要有pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα，pYAM75P6；胞內型表達載體主要有pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZα(invitrogen)等，優選的是畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有His缺陷型的選擇性標記基因HIS4、AOX1啟動子、MFα分泌信號肽和G418抗性基因(可作為篩選重組子的標記)等元件。AOX1啟動子是一個強啟動子，可以高效的啟動目的基因的表達。在畢氏酵母里共編碼兩種乙醇氧化酶AOX1和AOX2，細胞中絕大多數乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇為唯一碳源培養的細胞中，該酶可占細胞總蛋白的30％以上。AOX2與AOX1的同源性雖然高達97％，但酶活很低。當AOX1基因缺失，只存在AOX2時，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，細胞利用甲醇能力降低，細胞在甲醇為唯一碳源的培養基上生長很慢。
帶有融合cDNA的表達載體可以通過轉化鋰鹽法、PEG法、原生質體法或電穿孔法轉化宿主系統。成功轉化的細胞，即帶有本發明構建的DNA的細胞，可以通過本領域熟知的方法加以鑒定，如收集細胞，裂解后提取DNA，然后進行Southern雜交和PCR鑒定，也可在誘導表達后用HSA抗體和/或G-CSF抗體檢測培養液上清。
本發明的有益效果利用重疊PCR技術，連接HSA cDNA和PTH cDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩定性(避免針對連接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的問題。
優選的酵母表達系統除了具備原核表達系統的易操作、生長迅速、營養要求簡單、易工業放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白后修飾系統，有利于大量生產高質量的重組蛋白。更優選的是畢赤酵母表達系統，和釀酒酵母表達系統相比，畢赤酵母表達系統在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優勢。畢赤酵母自身分泌的蛋白少，十分有利于純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
可以通過培養帶有本發明構建的DNA的宿主系統，來生產本發明的融合蛋白。宿主系統培養優選在生物反應器上進行，培養分兩個階段，第一階段主要用于宿主系統生長，第二階段主要用于產物合成。可以用各種蛋白分離的方法自含有本發明DNA構建體的細胞培養物中分離、純化融合蛋白。如鹽析、沉淀、超濾、層析、制備電泳等技術及這些技術的組合。
圖1.質粒pPIC9K-PTH-HSA圖2.質粒pPIC9K-PTH-HSA的酶切驗證 Lane1DNA分子量標準；Lane2pPIC9K-PTH-HSA NcoI酶切；Lane3pPIC9K-PTH-HSA Sal I酶切。
圖3.融合蛋白的SDS-PAGE分析 Lane1KM71/pPIC9K；Lane2蛋白分子量標準；Lane3～6KM71/PTH-HSA圖4.融合蛋白的HSA抗體檢測 Lane1蛋白質分子量標準；Lane2PTH-HAS。
具體實施方法實施例1PTH cDNA的克隆以RT-PCR反轉錄得到的PTH cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出PTHcDNA，所用的引物如下p15’CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’p25’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，PTHcDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，66℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環35次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.27kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經EcoR I和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；隨機挑取5個菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoR I和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒EcoR I和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pBlue-PTH，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-PTH。
實施例2HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為PH15’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒SalI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HAS。
實施例3HSA cDNA和PTH cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下P15’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’P25’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次。
PTHcDNA的PCR擴增，所用引物如下P35’CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’P45’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-PTH 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次。
利用重疊PCR融合PTH cDNA和HSA cDNA將PTH的PCR擴增產物和HSA的PCR擴增產物分別稀釋10倍，再以4∶6體積比例混合后作為模板，于50μl的反應體系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2kb的目標條帶，純化好的目標片段和載體pUC19分別經EcoRI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，取雙酶切后純化好的PTH-HSA片段5μl，pBluescript II KS(+)5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜；用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌XL-1Blue感受態細胞，轉化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；隨機挑取5個單菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR和EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒EcoRI和HindIII酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pBlue-PTH-HAS，陽性重組子命名為XL-1/pBlue-HSA-PTH。
實施例4PTH-HSA重組酵母表達系統構建及融合蛋白的表達融合蛋白PTH-HSA的重組酵母構建取一支凍存的XL-1/pBlue-HSA-PTH，接種到20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒，提取的質粒pBlue-PTH-HAS和酵母表達載體pPIC9K，經EcoRI單酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收。取酶切后純化好的pBlue-PTH-HSA片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取若干個長出的菌落，接種于20ml氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒；通過PCR，及Nco I酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pPIC9K-PTH-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pPIC9K-PTH-HAS；提取DH5α/pPIC9K-PTH-HSA中的質粒，經SalI酶切后，電擊轉化畢赤酵母KM71，轉化物涂布于含有1mol/L山梨醇的MD平板上，于30℃，培養6天。每塊平板上用2ml水洗滌，收集洗滌液。取部分收集到的洗滌液，分別涂布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，于30℃，培養3～6天。挑取在最高濃度G418的YPD平板上的長出菌落，接種于20ml MD培養基中，30℃培養24小時，用常規方法提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性重組子命名為KM71/pPIC9K-PTH-HAS。
PTH-HSA融合蛋白的表達將KM71/pPIC9K-PTH-HSA接種至裝有100mlBMGY(100mM磷酸鉀，pH6.0、1.34％無氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至A600nm值為2～6，離心收集菌體。將收集到的菌體接種至裝有20ml BMMY(100mM磷酸鉀，pH 6.0、1.34％無氨基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％(V/V)，誘導3天。離心收集上清，過濾除菌，進行SDS-PAGE驗證，Western雜交鑒定融合蛋白PTH-HSA分子的PTH的免疫源性。
用酶標法測定上清中的融合蛋白PTH-HSA活性。UMR2106細胞于含10％小牛血清的DMEM2F12(美國GIBCO2BRL公司產品)培養液(pH7.2)，在37℃、5％CO2的條件下培養。活性測定時，取對數生長期的細胞，經0.02％胰蛋白酶消化后用培養液稀釋至1.5×105個細胞/ml。于96孔細胞培養板中，每孔加入100μl細胞稀釋液，培養5h，然后換成每孔100μl的DMEM2F12溶液(不含牛血清)，繼續培養過夜。取甲狀旁腺激素國際標準品及供試品各1支，分別溶解于DMEM2F12培養液中，預稀釋后，再按1∶2的體積比例進行系列倍比稀釋。稀釋用溶液為DMEM2F12溶液(不含牛血清)。將細胞棄培養液后，每孔加入170μl DMEM2F12培養液，及10μl/孔IBMX(異丁基黃嘌呤，Sigma公司產品)，然后分別依次加入上述系列稀釋好的甲狀旁腺激素國際標準品及供試品，每孔20μl，每個稀釋度作3個復孔。每塊板上都帶有PTH國際標準品，及cAMP標準，同時設總活性對照(TA)、非特異性結合對照(NSB)、最大結合(B0)、底物空白對照(SB)孔，置于37℃培養。45min后進行cAMP抽提。抽提方法去培養基，每孔加200μl 0.1mol/L HCl，37℃溫育30min后，裂解細胞，取上清用于測定cAMP。cAMP測定用cAMP(low p H)試劑盒測定。用微量滴定板酶標儀檢測各孔在405nm處的光吸收值。活性分析結果證明產物具有PTH的免疫學活性。Western雜交表明產物具有PTH和HSA的免疫源性。
權利要求
1.人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白的制備方法，其特征是從新鮮人甲狀旁腺組織中分離單核甲狀旁腺細胞，刺激培養，提取RNA；通過RT-PCR反轉錄得到PTH cDNA；通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得HSA cDNA；利用重疊PCR技術，連接HSA cDNA和PTH cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的PTH-HAS cDNA融合基因插入到克隆載體，PTH-HAS cDNA融合基因在宿主系統中進行表達，PTH-HAS cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中；(1)PTH cDNA的克隆以RT-PCR反轉錄得到的PTH cDNA第一鏈為模板，通過PCR擴增出PTHcDNA，所用的引物如下p15’CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’p25’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，PTHcDNA第一鏈1μg，加雙蒸水補齊50μl，PCR條件為95℃變性10分鐘，94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環35次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.27kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經EcoRI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；隨機挑取5個單菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒EcoRI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pBlue-PTH，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-PTH；(2)HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為PH15’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH25’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段，純化好的目標片段和載體pBluescriptII KS(+)分別經SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒SalI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HAS；(3)PTH cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下P15’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’P25’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次；PTHcDNA的PCR擴增，所用引物如下P35’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’P45’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-PTH 1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，66.5℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次；利用重疊PCR融合PTH cDNA和HSA cDNA將PTH的PCR擴增產物和HSA的PCR擴增產物分別稀釋10倍，再以4∶6體積比混合后作為模板，于50μl的反應體系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfuBuffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出2kb的目標條帶，純化好的目標片段和載體pBluescript IIKS(+)經EcoRI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，取雙酶切后純化好的PTH-HSA片段5μl，pBluescript IIKS(+)5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜；連接產物轉化大腸桿菌XL-1Blue感受態細胞，轉化物涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；隨機挑取5個單菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，并對重組質粒EcoRI和HindIII雙酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；融合基因命名為PTH-HSA，重組質粒命名為pBlue-PTH-HAS，含重組質粒的重組大腸桿菌命名為XL-1/pBlue-HSA-PTH；(4)融合蛋白HSA-PTH的重組酵母構建取一支凍存的XL-1/pBlue-HSA-PTH，接種到20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒，提取的質粒pBlue-PTH-HSA和酵母表達載體pPIC9K，分別經EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切后純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取長出菌落，接種于20ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆，陽性重組子保存在含有15％甘油的LB中，凍存于-80℃；重組質粒命名為pPIC9K-PTH-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pPIC9K-PTH-HAS；提取DH5α/pPIC9K-PTH-HSA中的質粒，經SalI酶切后，電擊轉化畢赤酵母KM71，提取重組畢赤酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性重組子命名為KM71/pPIC9K-PTH-HSA；(5)融合蛋白PTH-HSA的表達將KM71/pPIC9K-PTH-HSA接種至裝有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至A600nm為2～6，離心收集菌體，將收集到的菌體接種至裝有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％，誘導3天，離心收集上清，用酶標法測定上清液中的融合蛋白PTH-HAS的含量，進行SDS-PAGE驗證，Western雜交鑒定融合蛋白PTH-HSA分子的PTH免疫源性。
2.用權利要求1所述方法制備的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征是包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區和與人甲狀旁腺激素至少85％序列同源的第二區；所述與人血清白蛋白同源的第一區位于融合蛋白的C末端，所述與人甲狀旁腺激素同源的第二區位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽；或所述與人甲狀旁腺激素同源的第二區位于融合蛋白的C末端，所述與人血清白蛋白同源的第一區位于融合蛋白的N末端，中間不加任何連接肽。
3.根據權利要求2所述的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與人血清白蛋白至少95％序列同源的第一區和與人甲狀旁腺激素至少95％序列同源的第二區。
4.根據權利要求2所述的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的第一區由人血清白蛋白部分結構域組成或經結構域重排后的人血清白蛋白組成。
5.根據權利要求2所述的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包括與人血清白蛋白氨基酸殘基序列相同的第一區和與人甲狀旁腺激素氨基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
6.根據權利要求5所述的人甲狀旁腺激素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是宿主系統是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞或植物細胞表達系統。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征是優選的宿主系統是酵母。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征是優選的酵母是畢赤酵母。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征是優選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
全文摘要
人甲狀旁腺激素(PTH)與人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制備方法及產品，屬于長效重組融合蛋白藥物技術領域。本發明利用重疊PCR技術，將HAS cDNA和PTH cDNA進行拼接，中間不加入任何連接肽，得到的PTH－HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中，在宿主系統中進行表達。本發明的融合蛋白包括與人血清白蛋白至少85％序列同源的第一區和與人甲狀旁腺激素至少85％序列同源的第二區。該融合蛋白可以在不改變融合蛋白特性的前提下，進行個別氨基酸殘基的取代、缺失或加入。本發明的融合蛋白在保持了人甲狀旁腺激素生理特性的基礎上，延長其在體內的半衰期，改善其溶解度，在藥學領域有良好的應用前景。
文檔編號C12N15/62GK101063125SQ20071002089
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月17日 優先權日2007年4月17日
發明者沈微, 金堅, 諸葛健, 王俊, 張蓮芬 申請人:江南大學