專利名稱：防治溫室蔬菜根結線蟲病的生防菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種防治溫室蔬菜根結線蟲病生防菌株AR156，屬于農作物防病治病技術領域，專用于蔬菜根結線蟲病的無公害防治。
二、技術背景根結線蟲(Meloidogyne spp.)屬植物根系專性內寄生物，是世界性分布的威脅農業生產的主要病原物，也是世界各國的對外檢疫對象。它不僅使作物產量減少，品質降低，而且可與其他病原物一起造成復合侵染。迄今已記載的根結線蟲有約70種，其中南方根結線蟲(M.incognita)、爪哇根結線蟲(M.javanicica)和花生根結線蟲(M arenaria)因其廣分布性和多寄主性，是最重要的植物寄生線蟲種類。在中國，這三種根結線蟲在大多數省(區)均有發生，侵染農作物達百種以上，大田作物、蔬菜、果樹、花卉、藥用植物等幾乎每種作物均可受到侵染。蔬菜根結線蟲病(為害對象黃瓜、冬瓜、西瓜、絲瓜、番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、萵苣、菠菜、胡蘿卜、白菜、豆科蔬菜等幾乎所有蔬菜)是國內外最為嚴重的植物病害之一。由植物寄生線蟲侵襲寄生引起的植物病害，受害植物可因侵入線蟲吸收體內營養而影響正常的生長發育；線蟲代謝過程中的分泌物還會刺激寄主植物的細胞和組織，導致植株畸形，使農產品減產和質量下降；此外，還可以通過線蟲危害，加劇其它病害的發生，尤其是保護地蔬菜，致使寄主常年減產15-25％，有時達70％以上，嚴重地制約了大棚蔬菜、果樹、花卉等作物的生產和出口創匯，有的甚至到了無法種植的地步。據估計，我國農作物的生產每年因根結線蟲的為害而遭受的經濟損失達數億元以上。
由于根結線蟲病害屬于土傳病害，所以防治較為困難。目前，人們主要采取有機磷類化學殺線蟲劑、選種抗病作物品種、實施輪作、建立無病種苗基地和對進出口農作物進行嚴格的檢疫來控制根結線蟲病害的發生。化學殺線蟲劑雖防效顯著，但其選擇性差，破壞農作物的生態環境；不易降解，高殘留，對人畜極不安全；破壞土壤結構，造成土壤沙化；抗藥性問題日益突出。這些因素使得化學殺蟲劑的使用范圍已受到嚴格的限制。因此，非化學性防治措施目前已成為農作物根結線蟲病治理的核心，而生物防治則為其中最有前途的方法。現有技術中按照本實驗室的菌體保藏液專利(公開專利號CN1358838，
公開日2002年7月17日)方法，菌體可室溫保存2～3年。
發明內容
技術問題本發明的目的是針對現有技術中的對根結線蟲病害有較高防效的生防制劑主要集中在一些真菌制劑、使用成本過高的缺陷，提供開發一種防治蔬菜根結線蟲病害的單一生防菌菌株及其菌劑，該菌劑的防效可達50％以上，并且有增產功能。
技術方案一種防治溫室蔬菜根結線蟲病的生防菌株AR156，為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，2007年1月26日寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.1929。
生防菌株AR156用于制備生防菌劑的方法為1)將該菌株接種到PDA培養液中分別培養37℃180rpm，16～20小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；2)當培養至OD值在0.5～0.8之間時，將種子菌液以1∶100體積比加入PDA培養液中，37℃ 180rpm振蕩培養20～24小時，然后6000rpm離心10min，每1000ml培養液獲得13～16g濕菌，每克濕菌含4×1010～1015個菌體，取濕菌與菌體保藏液按1g∶40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012fu/ml。所用PDA培養液配制方法為用200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后至少煮20分鐘以上，接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值調至7.2～7.4，然后121℃滅菌20分鐘。
有益效果本發明的優點和積極效果表現在本發明是專門針對蔬菜根結線蟲病開發的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于蔬菜的無公害生產，農民可以不用或減少其他防治蔬菜根結線蟲病化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利于蔬菜的出口。同時，該菌劑還有增產功能，可為農民增加收入。
離體試驗表明，按AR156生防菌劑1×109cfu/ml，該濃度對根結線蟲二齡幼蟲活性和對卵的孵化都有很好的抑制作用(表1、表2)。溫室實驗表明該菌制劑能顯著降低根結線蟲的侵入，并兼有促進番茄生長的作用。溫室大棚實驗表明使用該菌劑對蔬菜根結線蟲病害的防治效果可達58-75％以上，增產可達30-50％以上(表3~4)該菌劑用濕菌與本實驗室的菌體保藏液(屬本實驗室已授權專利，專利號ZL02112559.7，公開專利號CN1358838，
公開日2002年7月17日)按1∶40(g/ml)配成菌劑，可室溫保存2～3年。
該菌劑可以在溫室移栽前倒入有機肥中制成堆肥，然后隨肥料在整地過程中埋到土里，也可以在栽苗時灌根使用。
四
具體實施例方式
本發明涉及一種防治溫室蔬菜根結線蟲病生防菌株AR156，為芽孢桿菌(Bacillussp)。2007年1月26日寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.1929。
生防菌株AR156用于制備生防菌劑的方法為常規細菌培養法1)將該菌株接種到PDA培養液中分別培養37℃180rpm，16～20小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；2)當培養至OD值在0.5～0.8之間時，將種子菌液以1∶100體積比加入PDA培養液中，37℃180rpm振蕩培養20～24小時，然后6000rpm離心10min，每1000ml培養液獲得13～16g濕菌，每克濕菌含4×1010～1015個菌體，取濕菌與菌體保藏液(屬本實驗室已授權專利，專利號ZL02112559.7，公開專利號CN1358838，
公開日2002年7月17日)按1g∶40ml配成AR156生防菌劑，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012fu/ml。所用PDA培養液配制方法為用200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后至少煮20分鐘以上，接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值調至7.2～7.4，然后121℃滅菌20分鐘。
(一)室內離體測定1根結線蟲二齡幼蟲懸浮液的制備從番茄根部挑取新鮮卵塊，置于貝曼漏斗中孵化，24h后開始收集幼蟲，每天收集一次，共收集一周。線蟲液稀釋為100條J2/ml，4℃保存待使用。
2卵懸浮液的制備根據MeClure等的方法(MeClure，M.A.，Kruk，T.H.& Misaghi，I.1973.A method for obtaining quantities of clean Meloidogyne eggs.Journal ofNematology，5230)，將有根結的番茄根剪碎后放入三角瓶中，加0.5％NaCl0液100ml，用力搖1-2min后，快速倒入200-500目篩組中并用自來水沖洗10min，收集500目篩網中的卵，稀釋成濃度為3000粒/ml的卵懸浮液。
3AR156生防菌劑對南方根結線蟲二齡幼蟲的作用平均室溫在20℃±時，將菌懸液吸取2ml，加入直徑為7.5cm的滅菌培養皿中，再加入2ml二齡幼蟲的懸浮液，以清水作對照，各處理重復3次。分別在12h、24h和36h后觀察線蟲的活力。
4AR156生防菌劑對南方根結線蟲卵孵化的作用平均室溫在20℃±時，吸取菌懸液2ml，加入直徑為7.5cm的滅菌培養皿中，再加入2ml卵懸浮液，以清水作對照，各處理重復3次。分別在4d、6d、8d和10d后觀察幼蟲的孵化情況。
(二)溫室盆缽試驗1番茄幼苗培育番茄種子進行表面消毒處理用75％的酒精處理15sec后無菌水水洗三次，5％的次氯酸鈉溶液處理15min后無菌水水洗三次。表面消毒的種子播種于滅菌土中培育待用。
2滅菌土制備將森林土、細砂、有機質按2∶2∶1體積混勻后，高壓滅菌鍋內121℃滅菌20mins。滅菌后分裝到直徑25cm的盆缽中待用。
3灌根接種供試菌株菌懸浮液(109CFU·mL-1)40ml，2天后每缽接種南方根結線蟲100條J2/ml二齡幼蟲懸浮液10ml。
4接種后的盆缽隨機排列于溫室的平臺上。25～28℃培養8周后緩慢取出接種植株。用水輕洗根系，分別稱根長、莖長和干物質重量，在解剖鏡下記錄根結數。
(三)溫室大棚試驗田間試驗共設三個處理A、生防菌劑AR156；B、阿維菌素；C、空白對照。每個小區12m2，小區間設三行隔離區，各處理按完全隨機區組排列，重復4次，全試驗共12個小區。試驗前先將試驗地整平耙勻，按上述設計方案分好小區，開好隔離溝和種植穴。在移栽前15天，施用生防菌劑AR156，每畝使用1500毫升109CFU/ml的AR156制劑，稀釋1000倍后用滅菌的噴霧器均勻噴霧，蓋上地膜；1.8％阿維菌素乳油移栽時每畝用500毫升，按1∶1000的比例稀釋，潑澆灌根。
5.3.2藥效和產量調查于120天調查根結線蟲的危害程度，計算防效，以及黃瓜產量的增產率。病情指數(％)＝(各級植物株數×級值)/(調查總株數×最高級值)×100％。
實驗結果(一)離體實驗表明(表1、表2)，按AR156生防菌劑1×109cfu/ml，該濃度對根結線蟲Meloidogyne incognita二齡幼蟲活性和對卵的孵化都有很好的抑制作用，48小時后對根結線蟲二齡幼蟲活性抑制作用可達到91.4％，10天根結線蟲卵的孵化僅達到9.8％。
表1 AR156生防菌劑對根結線蟲二齡幼蟲活力的影響
注AR156菌液濃度109cfu/ml；CK清水對照；表2AR156對南方根結線蟲Meloidogyne incognita孵化率的影響
注AR156菌液濃度109cfu/ml CK清水對照；(二)溫室盆缽試驗(表3)試驗結果表明，AR156生防菌劑能顯著降低根結線蟲的侵入，對番茄南方根結線蟲病害的防效達64％，并兼有促進番茄生長的作用。
表3AR156菌劑對番茄南方根結線蟲病害的防效
注AR156菌液濃度109cfu/ml，CK清水對照；(三)溫室大棚試驗(表4)施用AR156生防菌劑處理120天后(用量為1500ml/畝)，生防菌劑AR156對黃瓜根結線蟲的平均防效為64.4％，最高防效75％，要好于阿維菌素(40.1％)。此外，生防菌劑AR156有明顯的促進生長能力，提高黃瓜、絲瓜、番茄等作物的產量，增產率平均為39.8％，最高達200％。
表4AR156生防菌制劑施用后120天對黃瓜根結線蟲的防治效果*
權利要求
1.一種防治溫室蔬菜根結線蟲病的生防菌株AR156，為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，2007年1月26日寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.1929。
2.權利要求1所述生防菌株AR156制備的生防菌劑。
3.權利要求2所述生防菌劑在防治溫室蔬菜根結線蟲方面的應用。
4.權利要求1所述生防菌株AR156用于制備生防菌劑的方法，其特征在于1)將該菌株接種到PDA培養液中分別培養37℃180rpm，16～20小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；2)當培養至OD值在0.5～0.8之間時，將種子菌液以1∶100體積比加入PDA培養液中，37℃180rpm振蕩培養20～24小時，然后6000rpm離心10min，每1000ml培養液獲得13～16g濕菌，每克濕菌含4×1010～1016個菌體，取濕菌與菌體保藏液按1g∶40ml配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012cfu/ml。
5.根據權利要求4所述的生防菌株AR156用于制備生防菌劑的方法，其特征在于，所用PDA培養液配制方法為用200克土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后至少煮20分鐘以上，接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值調至7.2～7.4，然后121℃滅菌20分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種防治溫室蔬菜根結線蟲病生防菌株AR156，屬于植物保護技術領域。該菌是芽孢桿菌(Bacillus sp.)，將該菌在PDA培養液37℃180rpm振蕩培養20～24小時，然后6000rpm離心10min，取濕菌與本實驗室的菌體保藏液按1∶40(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×10
文檔編號C12R1/07GK101054565SQ20071002137
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月10日 優先權日2007年4月10日
發明者郭堅華, 魏利輝, 李師默 申請人:南京農業大學