專利名稱：一種轉基因大豆的定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種定量檢測方法，尤其涉及一種轉基因大豆的定量檢測方法。
背景技術：
隨著基因工程技術的迅速發展，全球轉基因作物的種植面積成倍增長，其中抗除草劑轉基因大豆占全球轉基因作物種植面積的66％，達到3600萬hm2。據國際農業生物技術應用購買組織(ZSAAA)預測，2005年基因工程作物的市場份額將達50億美元，顯著的經濟效益世人矚目，但轉基因作物潛在的生態風險，可能帶來的環境問題、倫理問題和國際貿易問題等，促使國際上許多國家如歐盟、日本、韓國等都制訂了相應的法規對轉基因食品實行標簽制度。中國加入世貿組織以后，國外的農產品必將以其優良的品質和低廉的價格大量涌入，大部分來自轉基因技術發達的美國、加拿大等國家，因此，建立準確的轉基因檢測方法保證消費者的知情權和選擇權非常必要。
國內外已有多篇關于轉基因食品含量檢測的文獻報道，但多為針對原料產品進行品系檢測，還沒有針對轉基因產品品系的鑒定檢測。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效、準確、簡便的檢測轉基因大豆中轉基因成分的方法。
本發明的目的是通過以下技術措施來實現的一種轉基因大豆的定量檢測方法，它包括以下步驟(1)提取大豆中的DNA；(2)將提取的DNA作為模板，用外源基因特異性引物對進行PCR擴增，并同時加入探針，進行雜交；設定熒光閾值，測定雜交所產生的可檢測信號達到熒光閾值的循環次數；(3)分析測定數據，從而定量地檢測出轉基因大豆中轉基因成分。
所述的步驟(2)中，測定的可檢測信號是探針和擴增產物雜交反應中產生的熒光信號。
所述的探針是5’-acgttccaaccacgtct--3’，是Taqman型熒光探針。這個探針與PCR兩個引物之間的靶序列互補配對，其5’端標記了一個熒光報告基團，3’端標記了一個熒光淬滅基團。兩者可構成能量傳遞結構，即5’端熒光基團所發出的熒光可被熒光抑制基團吸收或抑制。當二者距離較遠時，抑制作用消失。進行PCR反應時，Taq聚合酶利用其5’→3’外切酶活性從探針上切下熒光報告基團，熒光淬滅基團抑制作用消失，報告基團熒光信號增強。伴隨PCR產物的增加，熒光信號隨之增強。
所述的外源基因特異性引物對是5’-GAGGAGCATCGTGGAAAAAGAA--3’5’-GGATATCACATCAATCCACTTGCTT--3’所述的熒光閾值是以PCR反應的第3～15個循環的熒光值作為熒光本底信號，再以3～15個循環的熒光值增加量ΔRn的標準偏差的10倍來設定。
在步驟(2)中還包括將標準參照物作為模板，用外源基因特異性引物對進行PCR擴增，同時加入探針進行雜交，設定熒光閾值，測定雜交所產生的可檢測信號達到熒光閾值的循環次數，從而制得標準曲線。其中所述的標準參照物是轉基因大豆與非轉基因大豆的DNA混合物，其中在各種混合物中轉基因DNA的含量為0％、1.0％、2.0％或5.0％。
所述步驟(2)中是以熒光信號達到所設定的熒光閾值時的循環次數(Ct值)和PCR體系中起始DNA量的對數值之間建立線性關系得到標準曲線的。
在步驟(3)中將測定的數據與標準曲線進行比較，從而定量檢測轉基因大豆中轉基因成分。
所述外源基因是指特異性地擴增出轉入植物的外源基因或其片段的引物，應理解，外源基因特異性引物隨外源基因的不同而變化。本發明方法檢測的外源基因優選35S啟動子。
(1)本發明提供的轉基因大豆的定量檢測方法中，PCR擴增反應和與探針雜交反應一步完成，并以熒光信號達到該熒光閾值時的循環次數(Ct值)和PCR體系中起始DNA量的對數值之間建立線性關系，方法簡便，減少了定量檢測中探針的種類，降低檢測成本，可以較便捷對轉基因成分實施定量檢測。
(2)由于70％轉基因產品都是使用35S啟動子，因此該方法還可以應用到多組分的食品、飼料等加工產品，檢測轉基因成分的含量，并可作為轉基因食品常規PCR定性檢測方法。
圖1是轉基因大豆35S啟動子的定量擴增曲線；圖2是Ct值與不同轉基因大豆含量之間的Taq Man檢測標準曲線；圖3是1％轉基因大豆標準品作為未知樣的35S啟動子定量擴增曲線；圖4是2％轉基因大豆標準品作為未知樣的35S啟動子定量擴增曲線；圖5是5％轉基因大豆標準品作為未知樣的35S啟動子定量擴增曲線。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明的內容。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
實施例11材料方法1.1材料轉基因大豆(Roundup ready)抗除草劑大豆參照樣品從Fluka公司購買，其中轉基因成分含量分別占0％、1.0％、2.0％、5.0％四個樣品。
1.2儀器美國ABI公司生產的ABI PRISM 7000定量PCR儀；離心機德國Eppendorf5415D型；核酸蛋白分析儀美國LABCONCO公司產品。
1.3試劑Taq ManTMPCR檢測試劑盒購自美國ABI PRISM公司產品(ABI-Roche MolecularSystems Inc.，Branch-burg，NJ，USA)。
1.4 DNA提取大豆粉末DNA的提取采用CTAB法。
1.5引物及探針上游引物5’-GAGGAGCATCGTGGAAAAAGAA--3’；下游引物5’-GGATATCACATCAATCCACTTGCTT--3’；探針5’-acgttccaaccacgtct--3’5’端用熒光報告基團FAM標記，3’端用熒光淬滅基團TAMRA標記。
1.6 PCR反應使用美國ABI PRISM公司Taq ManTMPCR檢測試劑盒，50μl反應體系中含引物100nmol/L，探針200nmol/L，dNTP 0.25nmol/L，AmpliTaq Gold DNA聚合酶2.5U，UNG0.5U，MgCl23.25mmol/L，1×PCR緩沖液，4ng模板DNA，檢測外源基因的PCR反應小管中進行。循環條件50℃，2min；95℃，10min；95℃，30S，60℃，1min，50個循環。
1.7轉基因大豆的定量檢測標準曲線的制作使用Beckman紫外分光光度計精確測定DNA濃度，保證加入PCR反應管中模板量一致。對每個參照樣品的DNA作為模板，用35S啟動子設定的特異性引物對進行PCR擴增反應，同時與Taq Man探針進行雜交反應，測定雜交所產生的可檢測信號。可檢測信號達到熒光閾值時的循環次數(Ct值)和PCR體系中起始DNA量的對數值之間有嚴格的線性關系。根據所測得的轉基因作物陽性梯度標準品Ct值，制成標準曲線。
2結果用35S啟動子的引物和探針對參照樣品進行定量PCR測試的擴增曲線如圖1所示；各參照樣品外源基因35S啟動子的Ct值見表1。其中Roundup ReadyTM轉基因大豆含量分別為1％、2％和5％的標準品。
表1不同含量轉基因大豆樣品檢測的Ct值
而各PCR管中模板總量一致，PCR反應管內總DNA為2000個拷貝，由此1％、2％和5％的標準品的拷貝數分別為20、40和100，在此基礎上，繪制外源基因35S啟動子的Ct值與Roundup readyTM轉基因大豆量之間的標準曲線(見圖2)，該標準曲線的回歸方程為
Ct＝-3.053345logX+36.794895 R20.994245實施例2轉基因大豆的定量檢測運用以上建立起來的方法，對待測的轉基因大豆樣品進行檢測，分別將轉基因成分含量為1％、2％、5％的標準品作為未知樣品進行測試，定量擴增曲線見圖3、圖4、圖5。測試結果分析見表2。
表2轉基因大豆轉基因成分含量檢測分析結果
權利要求
1.一種轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于它包括以下步驟(1)提取大豆中的DNA；(2)將提取的DNA作為模板，用外源基因特異性引物對進行PCR擴增，與此同時加如探針，進行雜交，設定熒光閾值，測定雜交所產生的可檢測信號達到熒光閾值的循環次數；(3)分析測定數據，從而定量地檢測出轉基因大豆中轉基因成分。
2.根據權利要求1所述的轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中，測定的可檢測信號是探針和擴增產物雜交反應中產生的熒光信號。
3.根據權利要求1或2所述的轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于所述的探針是Taqman型熒光探針。
4.根據權利要求1或2所述的轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于所述的探針是5’-acgttccaaccacgtct--3’。
5.根據權利要求1或2所述的轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于所述的外源基因特異性引物對是5’-GAGGAGCATCGTGGAAAAAGAA--3’5’-GGATATCACATCAATCCACTTGCTT--3’。
6.根據權利要求1所述的轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于所述的步驟(2)中還包括將標準參照物作為模板，用外源基因特異性引物對進行PCR擴增，與此同時加入探針，進行雜交，設定熒光閾值，測定雜交所產生的可檢測信號達到熒光閾值的循環次數，從而制得標準曲線，其中所述的標準參照物是轉基因大豆與非轉基因大豆的DNA混合物，其中在各種混合物中轉基因DNA的含量為0％、1.0％、2.0％或5.0％。
7.根據權利要求6所述的轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中是以可測熒光信號達到所設定的熒光閾值時的循環次數(Ct值)和PCR體系中起始DNA量的對數值之間建立線性關系得到標準曲線的。
8.根據權利要求1所述的轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于所述的外源基因優選35S啟動子。
9.根據權利要求1所述的轉基因大豆的定量檢測方法，其特征在于在步驟(3)中將測定的數據與標準曲線進行比較，從而定量檢測轉基因大豆中轉基因成分。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因大豆的定量檢測方法，它包括以下步驟(1)提取大豆中的DNA；(2)將提取的DNA作為模板，用外源基因特異性引物對進行PCR擴增，與此同時加如探針，進行雜交，設定熒光閾值，測定雜交所產生的可檢測信號達到熒光閾值的循環次數；(3)分析測定數據，從而定量地檢測出轉基因大豆中轉基因成分。該方法高效、準確、簡便，減少了定量檢測中探針的種類，降低檢測成本，可以較便捷對轉基因成分實施定量檢測。
文檔編號C12N15/11GK101016566SQ20071002688
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月12日 優先權日2007年2月12日
發明者黃東東, 呂玲, 翁少萍, 何建國, 寇秀穎, 李春榮, 王三永 申請人:廣東省食品工業研究所, 中山大學