專利名稱：鴿毛滴蟲的體外培養方法
技術領域：
本發明涉及一種培養方法，特別涉及一種鴿毛滴蟲的體外培養方法。
背景技術：
鴿毛滴蟲病是鴿場的常見病和多發病，全國各地包括江蘇、山東、貴州、 廣西、山西、安徽、上海、浙江、廣東的江門、中山、東莞、深圳、新會等地 都有病例報道，已對養鴿業造成了非常嚴重的經濟損失。體外培養鴿毛滴蟲， 對流行病學調查、科研、教學以及生產都有十分重要的意義。目前，國內外有 關陰道毛滴蟲體外培養的資料報道很多，而有關鴿毛滴蟲體外培養的資料國內 外很少。國外進行體外培養主要用肝浸湯進行培養，用肝浸湯培養，效果較差， 而且成本高。
發明內容
為了解決上述現有技術存在的不足之處，本發明的目的在于提供一種鴿毛 滴蟲的體外培養方法。
本發明的目的通過下述技術方案實現 一種鴿毛滴蟲(7V/c/^腳mw 的體外培養方法，包括如下步驟
將基礎營養液pH值調整至6.0 6.8，加熱到35.0 36.5°C，加入8 10 %的小牛血清(質量百分比)后，接種2.00萬個/ml鴿毛滴蟲，于35.0 36.5°C 的恒溫培養4 6天。
所述基礎營養液按下述方法配制而成(以1000ml為例)
胰蛋白胨18 22g、酵母浸出粉8 12g、抗壞血酸lg、麥芽糖5g、鹽酸 -L-半胱氨酸O.lg、氯化鉀lg、磷酸二氫鉀0.5g、碳酸氫鉀lg、硫酸亞鐵0.1g、 雙蒸水1000ml，充分溶解后，高壓滅菌，4"C保存備用。
所述基礎營養液中還可加入抗菌素青霉素25U/ml、鏈霉素25U/ml和慶大 霉素80ug/ml，能有效地抑制包括G+、 G-菌在內的細菌的生長。
所述基礎營養液還可加入里勞素20 u g/ml，能有效地抑制念珠菌的生長。
特別優選基礎營養液pH值調整至6.5左右，是培養鴿毛滴蟲的最適pH 值。
在營養液配方中，不同物質發揮著不同的作用胰蛋白胨可提供多種氨基 酸；酵母浸出粉可提供滴蟲生長所需的營養物質；麥芽糖、無水葡萄糖可供給 代謝的能量；半胱氨酸為含巰基的氨基酸，既是培養基中起抗氧化作用的還原 劑，又是滴蟲生長所需的營養物質；同時L-半胱氨酸和硫酸亞鐵作為還原性 物質使培養基氧化還原電位降低；抗壞血酸為抗氧化物質；磷酸二氫鉀、碳酸 氫鉀作為緩沖物質對維持培養基pH值的衡定起至關重要的作用，半胱氨酸屬 于兩性氨基酸，既可與酸性物質，也可與堿性物質結合成鹽，對維持pH值也 發揮其應有的作用；氯化鉀作為電解質，對維持離子平衡起一定作用；小牛血 清可提供足夠的泛酸，促進蟲體增殖。從培養結果看，鴿毛滴蟲的繁殖量可高 達258.50萬個/ml，說明該培養液非常適合鴿毛滴蟲的生長繁殖。
本發明在分別在pH5.5、 pH6.0、 pH6.5、 pH7.0四種酸堿度下培養鴿毛滴 蟲，發現在pH值6.5時鴿毛滴蟲的生長情況最好，pH5.5、 pH6.0時鴿毛滴蟲 的生長情況次之，pH7.0時鴿毛滴蟲的生長情況最差，pH值6.5左右是培養鴿 毛滴蟲的最適pH值。這與Diamond等在pH7.2的TYM培養基培養鴿毛滴蟲 有所不同，而與培養陰道毛滴蟲的最適酸堿度(pH6.6)相近。由于pH值6.5 為酸性條件，不利于多數細菌的生長。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明建立了一套高 質量的鵒毛滴蟲體外培養方法，該方法效果較好，而且成本低，使鴿毛滴蟲滅 活苗的生產成為可能，也是鴿毛滴蟲弱毒株擴增的重要途徑。
圖1為加入抗念珠菌藥物時生長曲線對比圖。
圖2為不同pH值下培養鴿毛滴蟲的生長曲線圖。
圖3為在35.5"、 pH6.5值條件下培養鴿毛滴蟲的生長曲線圖。
具體實施例方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一歩詳細的描述，但本發明的實施 方式不限于此。 實施例1
鴿毛滴蟲(7V/c/^momw gfl///"^)的體外培養方法，包括如下步驟基礎 營養液按下述方法配制而成(以1000 ml為例)胰蛋白胨20g、酵母浸出粉10g、抗壞血酸lg、麥芽糖5g、無水葡萄糖5g、鹽酸-L-半胱氨酸0.1g、氯化 鉀lg、磷酸二氫鉀lg、碳酸氫鉀lg、硫酸亞鐵lg、雙蒸水1000ml，充分溶 解后少量分裝，高壓滅菌，4。C冰箱保存備用。
將上述基礎營養液pH值調整至6.5，加熱到35.5。C左右，加入抗菌素青 霉素25U/ml、鏈霉素25U/ml和慶大霉素80ug/ml，加入10% (質量百分比) 的小牛血清后，接種2.00萬個/ml鴿毛滴蟲，于35.5。C的恒溫培養5天，達到 最高峰258.50萬個/ml。
實施例2
鴿毛滴蟲(rWc/io附omw 的體外培養方法，包括如下步驟基礎
營養液按下述方法配制而成(以1000 ml為例)胰蛋白胨22g、酵母浸出粉 12g、抗壞血酸lg、麥芽糖5g、無水葡萄糖5g、鹽酸-L-半胱氨酸0.1g、氯化 鉀lg、磷酸二氫鉀lg、碳酸氫鉀lg、硫酸亞鐵lg、雙蒸水1000ml，充分溶 解后少量分裝，高壓滅菌，4X:冰箱保存備用。
將上述基礎營養液pH值調整至6.8，加熱到35.(TC左右，加入抗菌素青 霉素25U/ml、鏈霉素25U/ml和慶大霉素80 u g/ml，里勞素20 u g/ml，加入8 % (質量百分比)的小牛血清后，接種2.00萬個/ml鴿毛滴蟲，于35.(TC的恒 溫培養5天，達到最高峰258.50萬個/ml。
實施例3
鴿毛滴蟲(7V/c/^卿mis 的體外培養方法，包括如下步驟基礎
營養液按下述方法配制而成(以1000 ml為例)胰蛋白胨18g、酵母浸出粉 8g、抗壞血酸lg、麥芽糖5g、無水葡萄糖5g、鹽酸-L-半胱氨酸0.1g、氯化鉀 lg、磷酸二氫鉀lg、碳酸氫鉀lg、硫酸亞鐵lg、雙蒸水1000ml，充分溶解后 少量分裝，高壓滅菌，《C冰箱保存備用。
將上述基礎營養液pH值調整至6.0，加熱到36.5。C左右，加入抗菌素青 霉素25U/ml、鏈霉素25U/ml和慶大霉素80ug/ml，里勞素20ug/ml，加入8 % (質量百分比)的小牛血清后，接種2.00萬個/ml鴿毛滴蟲，于35.(TC的恒 溫培養5天，達到最高峰258.50萬個/ml。
比較實施例
(1)在培養液中培養鴿毛滴蟲的生長情況 基礎營養液按下述方法配制而成(以1000ml為例)胰蛋白胨20g、酵母 浸出粉10g、抗壞血酸lg、麥芽糖5g、無水葡萄糖5g、鹽酸-L-半胱氨酸O.lg、
氯化鉀lg、磷酸二氫鉀lg、碳酸氫鉀lg、硫酸亞鐵lg、雙蒸水1000ml，充 分溶解后少量分裝，高壓滅菌，4t:冰箱保存備用。
將基礎營養液取出，加溫到35.5。C左右，加入抗菌素青霉素25U/ml、鏈 霉素25U/ml和慶大霉素80ug/ml，加入10%的小牛血清后(質量百分比)， 接種2.00萬個/ml鵒毛滴蟲，于35.5。C的恒溫培養。2h后可見活的鴿毛滴蟲， 數量有所增多，6h仍可見到活的鴿毛滴蟲，但數量已很少，12h后不見有鴿毛 滴蟲，而念珠菌大量繁殖。
(2) 加入抗念珠菌藥物培養鴿毛滴蟲情況
在每ml基礎培養液中分別加入0.25mg里勞素、0.25mg制霉菌素后，接 種鴿毛滴蟲，比較其培養效果。結果見圖l。
如圖1所示，加入里勞素對毛滴蟲生長影響較小，蟲體數量接近直線上升， 而且能夠很好地抑制念珠菌的生長；而制霉菌素雖能夠很好地抑制念珠菌，但 也抑制鴿毛滴蟲的生長，蟲體數目明顯減少。兩者差異極顯著(P<0.01)。
(3) 不同pH值條件下鴿毛滴蟲的生長情況 調整培養液的pH值，分別在pH5.5、 6.0、 6.5、 7.0下培養鴿毛滴蟲，結
果見圖2。
如圖2所示，在pH值5.5、 6.0、 6.5時鴿毛滴蟲都有明顯的生長波峰，而 pH值7.0時其繁殖受到影響；pH值6.5時鴿毛滴蟲的生長峰值最高，在第5d 達到最高峰258.50萬個/ml，隨后逐漸下降。因此pH值6.5是鵒毛滴蟲體外培 養的最適pH值。
(4) 最佳培養時間的研究 在基礎營養液里加入抗菌素青霉素25U/ml、鏈霉素25U/ml和慶大霉素
80ug/ml，里勞素20ug/ml，和10%的小牛血清，調整培養基的pH值為最佳 pH值6.5后，于35.5'C的恒溫培養，每隔一段時間觀察一次鴿毛滴蟲的生長 情況，繪出生長曲線。其消長情況見圖3。
如圖3所示，鴿毛滴蟲在人工培養條件下，前5天活蟲數呈持續上升，在 第5天(120h)達到258.50萬個/mh隨后活蟲數迅速減少，到12天(290h) 以后不見活蟲。因此最佳培養時間為第5天。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實 施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、 替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1、一種鴿毛滴蟲的體外培養方法，包括如下步驟將基礎營養液pH值調整至6.0～6.8，加熱到35.0～36.5℃，加入按質量百分比計8～10％的小牛血清后，接種2.00萬個/ml鴿毛滴蟲，于35.0～36.5℃的恒溫培養鴿毛滴蟲4～6天。
2、 根據權利要求1所述的一種鴿毛滴蟲的體外培養方法，其特征在于所 述基礎營養液按下述方法配制而成將胰蛋白胨18 22g、酵母浸出粉8 12g、抗壞血酸lg、麥芽糖5g、鹽酸 -L-半胱氨酸O.lg、氯化鉀lg、磷酸二氫鉀0.5g、碳酸氫鉀lg、硫酸亞鐵O.lg 和雙蒸水1000ml，充分溶解后，高壓滅菌，4℃保存備用。
3、 根據權利要求2所述的一種鴿毛滴蟲的體外培養方法，其特征在于所 述基礎營養液中加入青霉素25U/ml、鏈霉素25U/ml和慶大霉素80 n g/ml。
4、 根據權利要求2所述的一種鴿毛滴蟲的體外培養方法，其特征在于所 述基礎營養液中加入里勞素20 u g/ml。
5、 根據權利要求1所述的一種鴿毛滴蟲的體外培養方法，其特征在于所 述基礎營養液pH值調整至6.5。
全文摘要
本發明公開了一種鴿毛滴蟲的體外培養方法，該方法如下將基礎營養液pH值調整至6.0～6.8，加熱到35.0～36.5℃，加入按質量百分比計8～10％的小牛血清后，接種2.00萬個/ml鴿毛滴蟲，于35.0～36.5℃的恒溫培養。本發明建立了一套高質量的鴿毛滴蟲體外培養方法，使鴿毛滴蟲滅活苗的生產成為可能，也是鴿毛滴蟲弱毒株擴增的重要途徑。
文檔編號C12N1/10GK101173212SQ200710030659
公開日2008年5月7日 申請日期2007年9月29日 優先權日2007年9月29日
發明者張健騑, 鋒 羅, 翁亞彪 申請人:華南農業大學;廣東省農業科學院獸醫研究所