全封閉式無菌細胞培養方法

專利名稱：全封閉式無菌細胞培養方法
技術領域：
本發明屬于細胞培養領域，特別涉及大規模，不添加抗生素的細胞培 養方法。
技術背景人體細胞治療技術是一門連結基礎研究和商業應用的綜合性橋梁學 科。尤其是在人們對干細胞的認識不斷加深的情況下，通過干細胞的分離 和體外培養，定向誘導分化成胰島細胞、神經元細胞、心肌細胞等，將這 些細胞移植在發病部位，修復病人的組織或器官，從而使患者免受病魔的 煎熬。由于移植的細胞與患者的決定簇基因完全相同，不會產生通常器官 移植中的免疫排斥反應，修復的組織或器官將良好的履行職責，無需使用 免疫抑制劑。生物體細胞治療技術是建立在細胞生物學、分子生物學、有 機化學、遺傳學等學科基礎之上，使上述情況成為現實和可能，給我們人 類帶來一場新的醫學革命，將利用生物組織工程學的方法衍生出一項完全 嶄新的再生醫療產業。細胞生物治療做為一種新型的治療手段，可以在癌癥、自身免疫疾病 等疾病中起到治療作用，而且比傳統化療手段更為有效。生物治療中的重 要環節是細胞培養，而細胞培養技術中面臨的主要問題是污染，為了防止 污染，目前最常用的是在培養基中添加抗生素，但是隨著社會的發展，由 于抗生素使用產生耐藥性的影響已經越來越受到關注。事實上，在抗生素投入使用至今的僅僅60年間，很多細菌就對抗生素產生了嚴重的耐藥，有 的甚至產生了多重耐藥。耐藥菌的出現是人類不合理使用抗生素的直接后果，并且細菌產生耐藥性的速度遠遠快于人類新藥開發的速度，如不遏止， 人類將進入"后抗生素時代"，也即回到抗生素發現之前的人們面對細菌 性感染束手無策的黑暗時代。而且中國已成為世界上濫用抗生素最為嚴重的國家之一，WHO在國際范圍內的多中心調査顯示，住院患者抗菌藥物使用 約30%，而我國住院患者中使用抗生素的占80% 90%，其中使用廣譜抗生 素或聯合使用兩種以上抗生素的占58%，就連門診感冒患者都有75%應用抗 生素，大大超過了已經很不正常的國際平均水平。目前，細胞培養為了防 止污染多采用抗生素，這就導致細胞耐藥性的產生，而抗生素的濫用在我 國已經非常嚴重。為了使注入體內的細胞更為安全可靠，我們迫切需要建立高級凈化層 流無菌生產車間及生產工藝，在每一個環節上都嚴格要求，確保沒有細菌 污染，以徹底解決細胞體外培養使用抗生素的歷史。這一瓶頸問題的解決， 將確保我國人體細胞能大規模地進入體外培養階段，從而推動生物治療尤 其是腫瘤生物治療產業化的進程，造福于廣大患者。因此本領域迫切需要開發出高級凈化層流無菌生產工藝，在該工藝中 不添加抗生素，以此培養出的細胞更為安全可靠。 發明內容發明人致力于在人體細胞體外工業化培養中去除抗生素，同時保證人 體細胞在培養過程中不被污染，人體細胞培養質量不受影響。本發明的目的就是提供一種全封閉式無菌細胞培養方法。本發明提供了一種全封閉式無菌細胞培養方法，即對進入細胞培養區 域的人員、物體、空氣分別進行無菌化處理，本發明所述的細胞培養區域 為全封閉式。本發明方法可以用于培養各種細胞，包括人體細胞，如淋巴 細胞。在一實施例中，本發明細胞培養方法還包括獨立的細胞預處理步驟， 使進入細胞培養區域的細胞無污染。即在大規模細胞培養之前，先檢測細 胞是否被污染，檢測為陰性的細胞才送入細胞培養區域進行擴增培養。較佳的，上述人員無菌化處理步驟為操作人員進入細胞培養區域之 前依次進行體檢、沐浴、泡手滅菌，然后穿戴無菌工作服。較佳的，上述物體無菌化處理步驟為對物體進行消毒或滅菌。本領域 技術人員可以根據物體的不同性能，選擇合適的方式進行消毒或滅菌。如 對能承受高溫濕熱消毒滅菌的物體進行高溫濕熱消毒；對于不能承受高溫 濕熱滅菌的物體，采用化學滅菌或輻照滅菌。較佳的，上述空氣無菌化處理步驟為空氣新風補充量控制在30%±5%; 對于新風口防塵無紡布、中效空氣過濾器和高效空氣過濾器定期更換。較佳的，上述中效空氣過濾器每半年更換一次。較佳的，上述高效空氣過濾器每年更換一次。較佳的，上述新風口防塵無紡布每兩周更換一次。更佳的，上述空氣無菌化還包括細胞培養結束后，開啟負離子發生器，運行30—90分鐘。在實施例中，負離子發生器的運行時間設定為45分鐘。在實施例中，為了降低層流凈化區域的負離子濃度，避免造成對人員的傷害，在操作人員進入細胞培養區域之前，補充新風30分鐘。本領域技 術人員可以根據實際需要補充新風20 — 50分鐘。更佳的，上述空氣無菌化還包括對細胞培養區域進行沉降菌檢測。 該項檢測每天進行一次，從而保證細胞培養區域的無菌狀態。當然，也可 以根據需要，每天檢測二次。較佳的，C02培養箱連續使用超過30天后，進行24小時的清洗、換水、 消毒。在實施例中，上述細胞預處理區域的空氣壓強相對于周邊環境處于負 壓狀態。優選的，上述細胞預處理區域具有獨立的人流退出通道，物流退 出通道和空氣外排系統。較佳的，在本發明上述細胞預處理步驟中，對于檢測結果為陽性的細 胞進行原位消毒滅菌。檢測結果為陽性或細胞有污染是指細胞懸液混濁， 細胞碎片增多，檢測出外源因子，或細胞樣品的細菌培養為陽性。


圖1、細胞預處理步驟示意圖。檢測為陽性是指細胞懸液混濁，細胞碎片增多，檢測出外源因子，細 胞樣品的細菌培養為陽性。
具體實施方式
發明人經過長期細致的研究和大量試驗，發明了高級凈化層流無菌生 產工藝，即全封閉式無菌細胞培養方法。該生產工藝的優點在于通過各種 手段和標準流程保證細胞培養區域無菌，因此在細胞培養過程中不需添加 抗生素，使培養的細胞更加安全可靠。具體涉及以下優點1、 通過預處理工藝，阻斷原料(細胞)中外源因子進入細胞培養區域。2、 通過質控手段，將外源因子阻隔在細胞培養生產區之外。3、 通過功能區域的劃分，采用區域氣流單送外排的方法，將細胞培養 區域內的空氣進行滅活外排。4、 通過原位消毒滅菌法，將污染源控制在零距離內，進行滅活消毒處理。5、 進行動態分時段、分周期檢測滅菌效果，了解細胞培養區域內全部 空間和設備內外的染菌情況，尋找及消滅遺漏點。細胞培養區域內凡與流 動空氣接觸的任何物體的表面(含設備內腔體表面)均應清洗消毒，并進 行動態分時段，分周期檢測滅菌效果。本發明中人流是指人流通道工作人員必須按指定要求進行淋浴，泡手和無菌服的更換處理，按指定路徑，沿著一個方向進入無菌工作區域； 工作完畢后，按指定路徑從另一條人流通道退出無菌工作區域。此路徑每 天經負離子發生器45分鐘滅菌處理，為無菌環境。物流是指物流通道經滅菌處理過的無菌物品必須按指定的無菌要求， 從專用的無菌通道(此為物流專用通道，與人流分開)向各無菌工作區域 分流，物品使用完畢后，從專用的物流退出通道退出。此路徑每天經負離 子發生器45分鐘滅菌處理，為無菌環境。操作人員包括細胞培養的操作人員、質控人員等所有需要進入細胞培 養區域的工作人員和其他人員。原位消毒滅菌法是指被污染的細胞或物品一經發現，就應將被污染的細胞或物品迅速放入早己備好的相應的滅菌設備內進行滅活處理，不得 移至其它工作區域或者室外再處理。細胞培養區域是指培養細胞的工作區域，通常是無污染的。細胞培養生產區包括細胞預處理室，細胞培養區域，人流通道，物流 通道，消毒滅菌室，細胞質檢室，試劑配制室，物料暫存室等區域。本發明培養的細胞可以來自自體、也可以是異體的淋巴細胞。淋巴細 胞采集方法通過無菌操作規程抽取定量的靜脈外周血或胎兒臍帶血液， 立即放入含有定量肝素抗凝劑的無菌瓶中，按照常規方法分離，獲得所需 要的淋巴細胞，然后按照本發明方法進行大規模的細胞培養。大規模細胞培養中無添加抗生素工藝研究，采用最先進的全封閉式無 菌操作模式進行細胞培養。在不添加抗生素的情況下，以實現細胞培養過 程的無菌化。全封閉式無菌操作包括1. 人員無菌界面式進入細胞培養區域。所謂人流無菌操作界面是指暴露在細胞培養區域空間的工作人員的人 體表面必須處于無菌化狀態。2. 物體無菌化進入細胞培養區域的任何物體都必須經過無菌化處理。3. 空氣無菌化細胞培養區域的空氣必須經過空氣初效過濾器，中效過濾器，高效過 濾器以及負離子發生器處理，保證空氣氣流始終處于無菌狀態。4. 細胞預處理系統盡管人體細胞在提供培養前，供體無任何異常或癥狀，但不能排除該 細胞是否帶菌或攜帶病毒。因此建立細胞預處理系統，將經檢測確認為帶 菌式攜帶病毒者的細胞留在預處理系統內，進行高溫濕熱或化學滅活處理。 同時，細胞預處理系統在人流，物流，氣流都與細胞培養區不發生交叉。 建立獨立的人流，物流退出通道和空氣外排系統，只保證帶菌式或攜帶病 毒的細胞無法進入細胞培養區域。檢測結果為陽性是指細胞懸液混濁，細胞碎片增多，檢測出外源因子，及細胞樣品的細菌培養為陽性。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用 于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員 所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆 可應用于本發明中。實施例l人員無菌界面操作步驟及參考1. 工作人員進入細胞培養室之前(1) 體檢口腔扁桃體無紅腫化膿；手及手臂皮膚完好無破損； 全身無化膿感染創口，無呼吸道感染癥狀。嚴禁佩戴首飾和使用化妝品。(2) 淋浴采用常水(醫藥行業的專業術語，指自來水)沖淋全身， 使用清潔劑進行皮膚清洗，沖淋時間不得少于7分鐘。2. 工作人員進入細胞培養室準備階段(1) 泡手滅菌進入第一更衣室，將手及手臂至肘部浸入1%)新潔而 滅溶液(也可以使用75%酒精)，不得短于5分鐘，浸泡完畢用無菌毛巾擦 干。(2) 進入第二更衣室，穿戴無菌工作服，穿戴過程中手不能觸摸自體 任何體表部位。佩戴無菌口罩時，手不能接觸鼻，口腔，面頰等部位。3. 工作人員進入細胞培養室，手不能觸碰與細胞培養材料無關的任何物體。4. 工作人員從人流退出通道退出細胞培養室后，如再次進入細胞培養區域必須從上述第二條的要求重新做一遍。5. 工作人員在細胞培養區域，不準在萬級層流凈化室區域和十萬級 層流凈化區域之間來回走動。工作人員一旦進入十萬級層流凈化區域后， 如需再進入萬級層流凈化區域，則必須按上述第二條要求重新泡手，更衣 后進入。實施例2物體無菌操作步驟及參數1. 物理滅菌。能承受高溫濕熱(12rC/30分鐘)消毒滅菌的物體。 如玻璃器皿、無菌工作服、金屬器械、細胞洗液、生理鹽水等。(1) 上述物體在消毒之前必須清洗干凈，玻璃器件瓶壁內必須做到無 水珠掛壁現象；(2) 無菌工作服每用一次，必須用專用洗衣機清洗，清洗后按無菌操 作更衣辦法的要求進行折疊；(3) 所有經高溫濕熱滅菌的物品都必須加外包裹處理，以避免搬運過 程中暴露在空氣中。2. 化學滅菌。不能承受高溫濕熱滅菌的物體，均采用化學滅菌或輻 照滅菌，主要用于塑料制品。(1) 將塑料制品浸泡于1%。新潔而滅溶液，浸泡時必須將有腔體的容 器內空氣全部派出，浸泡時間不得少于30分鐘。本領域技術人員也可以將 塑料制品浸泡于75%的酒精內，其余操作同上。(2) 微波輻照滅菌3分鐘。 實施例3空氣無菌化操作步驟及參考1. 空氣新風補充量控制在30%±5%;2. 新風口防塵無紡布每兩周更換一次；3. 中效空氣過濾器每半年更換一次；4. 高效空氣過濾器每年更換一次；5. 每天下班時，人員全部退出層流凈化生產區域后，開啟負離子發生器，運行時間設定為45分鐘；6. 每天上班前，開啟空調機組，補充新風30分鐘，以降低層流凈 化區域的負離子濃度，避免造成對人員的傷害。7. 每天新風補充完畢后，質控人員進入層流凈化區域，在每張凈化 工作臺面放置l一2只(根據凈化工作臺面積大小不同)培養皿，打開蓋板， 空氣中暴露30分鐘。合蓋后送入培養箱培養，設陽性對照，進行沉降菌檢沉降菌檢測標準為0。沉降菌檢測結果存在24小時滯后性，如果發現陽性菌出現，則根 據培養皿編號及凈化工作臺放置位置，復査前一天在此工作臺進行換液 的細胞懸液，并取樣送檢，細胞懸液推遲一天出廠，等待檢測結果合格 后放行。實施例4細胞預處理操作步驟及參數1. 淋巴細胞(購自上海市血液中心)，在進入細胞預處理區域后，用以下方法進行處理(1) 細胞容器外壁采用75%酒精棉球進行擦洗兩遍。(2) 每瓶細胞懸液所直接接觸的耗材，如移液尖，吸管，離心管等均 設為一次性使用，用完后隨即放入1%。新潔而滅溶液中。(3) 為每位患者準備治療用的細胞放入C02培養箱時必須分層分格集 中存放。(4) 每瓶(107l0ml)細胞懸液中取出5Xl()e(0.5ml)細胞送菌檢培養。2. 外源性陽性因子細胞懸液處理程序及參數(1) 發現外源因子細胞懸液時，首先仔細核對細胞培養瓶編號，以免 發生錯誤。(2) 細胞懸液倒入不銹鋼容器內，放入手提式高壓滅菌鍋，121°C/30分鐘滅活。(3)塑料細胞培養瓶放入1%。新潔而滅溶液中浸泡。 3. 預處理系統內人員，物體，空氣等特殊要求及操作規程。(1) 人員進入預處理系統的工作人員嚴禁從原人流通道退出，必須 從專用人流退出通道退出。嚴禁進入其它區域。(2) 物體進入預處理系統的物品，必須從專用退出通道退出。a. 與外源性陽性因子接觸過的物品，經滅活后，方能移出預處理區域。b. 預處理系統內人員工作服應與其它工作崗位的工作服有顯著的顏 色或花紋區別。c. 預處理系統的工作服必須由專用的洗衣機進行第一程序的清洗，并添加復合有機絡合氯一片，洗滌時間大于30分鐘。(3) 預處理系統空氣全部外排，空氣壓強相對于周邊環境處于負壓狀態。實施例5細胞換液操作標準1. 當細胞培養瓶口處于開放狀態時，手，移液尖，吸管均不要觸碰 瓶口。2. 任何物體進出細胞培養瓶瓶口時，均應將細胞培養瓶瓶口在酒精 燈火焰上方2. 5cm-3cm處往復移動灼燒，時間控制在0. 7-1. 5秒之間。3. 操作過程中，因操作不當，某無菌物體脫落后，應棄之不用，待 細胞換液工作全部結束后，進入衛生清潔階段時再揀拾。C02培養箱連續使用超過30天后，進行24小時的清洗、換水、消毒，消 毒溫度9(TC，消毒時間23.5小時。
權利要求
1.一種全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于，對進入細胞培養區域的人員、物體、空氣分別進行無菌化處理，所述的細胞培養區域為全封閉式。
2. 根據權利要求1所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于， 所述細胞培養方法還包括獨立的細胞預處理步驟，使進入細胞培養區域的細 胞無污染。
3. 根據權利要求1所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于，所述的人員無菌化處理步驟為操作人員進入細胞培養區域之前依次進行體 檢、沐浴、泡手滅菌，然后穿戴無菌工作服。
4. 根據權利要求1所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于，所述的物體無菌化處理步驟為對物體進行消毒或滅菌。
5. 根據權利要求1所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于， 所述的空氣無菌化處理步驟為空氣新風補充量控制在30%±5%;對于新風口 防塵無紡布、中效空氣過濾器和高效空氣過濾器定期更換。
6. 根據權利要求5所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于，所述的中效空氣過濾器每半年更換一次。
7. 根據權利要求5所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于，所述的高效空氣過濾器每年更換一次。
8. 根據權利要求5所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于，所述的新風口防塵無紡布每兩周更換一次。
9. 根據權利要求5所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于， 所述的空氣無菌化還包括細胞培養結束后，開啟負離子發生器，運行30— 90分鐘。
10. 根據權利要求5或9所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征 在于，所述的空氣無菌化還包括對細胞培養區域進行沉降菌檢測。
11. 根據權利要求2所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征在于， 所述的細胞預處理區域的空氣壓強相對于周邊環境處于負壓狀態。
12. 根據權利要求2或11所述的全封閉式無菌細胞培養方法，其特征 在于，在所述的細胞預處理步驟中，對于有污染的細胞進行原位消毒滅菌。
全文摘要
本發明提供了一種全封閉式無菌細胞培養方法，即對進入細胞培養區域的人員、物體、空氣分別進行無菌化處理，所述的細胞培養區域為全封閉式。所述的人員無菌化步驟為操作人員進入細胞培養區域之前依次進行體檢、沐浴、泡手滅菌，然后穿戴無菌工作服；所述的物體無菌化步驟為對物體進行高溫濕熱消毒、化學滅菌或輻照滅菌；所述的空氣無菌化步驟為空氣新風補充量控制在30％±5％；對于新風口防塵無紡布、中效空氣過濾器和高效空氣過濾器定期更換。本發明優點在于通過各種手段和標準流程保證細胞培養區域無菌，不需添加抗生素，使培養的細胞更加安全可靠。
文檔編號C12N1/20GK101323839SQ20071004187
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月12日 優先權日2007年6月12日
發明者張露億, 朱學東 申請人:上海果喜生物技術發展有限公司