專利名稱：從粘質沙雷氏菌分離的s-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶基因序列及表達重組菌株的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和酶工程領域，更具體地，本發明涉及一種粘質沙雷
氏菌(&rr"ia歷arce"e/^) S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶(Pf s)及其編碼基因， 以及表達Pfs酶的重組菌株。
背景技術：
群體感應(Quorum sensing)這個術語，是由Fuqua等1994年首先提出的。 其定義是當細菌的數量達到一定的密度(quorum)時才能發生的感應現象 (sensing)。當一個特定的環境中細菌的數量急劇增加時，由細菌所分泌的信 息分子的濃度也會相應的升高。通過擴散性信號小分子(又稱為自誘導物)與轉 錄活化蛋白的相互作用而打開與細胞群體密度有關的基因表達。這些信號分子 從細菌細胞擴散到環境中， 一旦達到一個臨界濃度(或者說達到某一特定的群 體密度)，這些信號分子就可誘導調節一系列目標基因的轉錄，從而在菌群范 圍內控制其行為。群體感應在細菌中廣泛存在，胞間交流可發生在細菌種內和 種間，細菌和其真核宿主間。在革蘭氏陰性菌中，自誘導物通常是i酰基高絲 氨酸內酯(AHLs)，它可調節的功能包括抗生素合成、毒性因子產生、胞外多 糖合成、細菌叢集、質粒結合轉移、生物膜形成、接合、孢子形成、生物發光 和穩定期進入等。
粘質沙雷氏菌能產生多種具工業應用潛力的物質，如殼質酶、蛋白酶、脂 酶、核酸酶、抗生素、表面活性劑等；并可發酵產生大量內消旋2，3-丁二醇， 靈菌紅素；可利用碳源廣，如單糖、蔗糖、甘油、纖維二糖等；是丙酮酸、琥 珀酸等有潛力的高產菌種；是兼性厭氧菌，在厭氧條件下，作為發酵工業菌株 具有節能優勢。Rob Van Houdt等人利用粘質沙雷氏菌MGl QS突變株，通過檢 測2，3-丁二醇的前體-乙偶姻，論證了 QS在2，3-丁二醇代謝合成中的生理作 用。結果表明，在s/^I突變株中，2，3-丁二醇以及前體聯乙醯和乙偶姻產量 都會大大降低。當添加C4-HSL和3-0X0-C6-HSL時，突變株中三種化合物的產
4量水平能夠恢復到與野生型菌株一樣。突變株的發酵結果和突變株
比較一致。QS系統的失活導致了在指數生長末期和穩定期酸性化合物的不斷產 生，并且在利用糖發酵時，會引起早期生長停滯。Rice等人建立的在基本培養 基中添加葡萄糖和酪素考察生物膜變化的模型也說明了 QS系統對沙雷氏菌的 代謝調節功能。盡管QS系統調控2,3-丁二醇合成的精確機制還不清楚，但是 QS系統方面的工作對于研究細菌代謝將會有很重要的意義。
群體感應系統對粘質沙雷氏菌的次級代謝也具有重要的調控作用。很多沙 雷氏菌菌株產生靈菌紅素，靈菌紅素是一種次級代謝的紅色抗生素，它的生物 合成是由一個涉及高絲氨酸內酯群體感應系統和/^>基因簇的復雜網絡調控， 同時，這個調控網絡至少有兩個單獨的雙組分信號轉導系統和大量的其它調節 因子。Sarah等人將5)^274的p&基因簇導入不產色素的粘質沙雷氏菌12 (5"歷3 12)中，結果S歷s 12產生了紅色素，并且是受自身aHSL-QS和7w^S系統的調 節。反過來將aHSL-QS調節基因座從5)ra 12導入5"/ra 274發現，S/ra 274表現 出由aHSL控制的一系列生理行為，包括紅色素的產生。QS調控系統、復合調 節網絡以及環境信號對靈菌紅素合成的影響被廣泛的研究。
在沙雷氏菌S 39006中，靈菌紅素和碳(雜)青霉烯是由以朋L和HHL為信 號分子的^/al/R型的QS系統調控的，在沙雷氏菌SS-l中，靈菌紅素的合成、 核酸酶的分泌以及游動性是由5>/jIR型的QS系統調節的。在不產生色素的MG1 菌株中，游動性、蛋白酶的分泌和生物膜的形成受aHSL-QS控制。5^aluxS突 變株表現出了靈菌紅素產量減少、溶血和致病性降低，這都是由代謝缺陷引起 的，由此說明Zi/;fS在激活甲基循環中具有代謝功能。在5>a 12 5"歷al突變體 中，甲殼酶的分泌、細菌素的生成以及溶血活性都是由QS控制的。在5^3 12 的調控體系中，5歷aR的作用有待進一步確認。 一些學者認為，5)y/aR結合所有 它調節的基因的啟動子； 一些人則認為5feaR依賴阻抑和aHSL型脫阻抑有關的 保守調節子發揮作用。這種調節蛋白具有保守的啟動子元件，在aHSL存在時， S/^R能結合它，阻止轉錄。還有一些理論認為在QS系統控制下的多效調節子 調控靈菌紅素和碳(雜)青霉烯的合成，例如在菌株S 39006中，Rap受QS控制， 從而影響代謝。
盡管目前本領域對于粘質沙雷氏菌在工業上的用途有所了解，然而還需要
進一步清楚地研究其生理或代謝功能，找到一些對于調節生理或代謝有用的基 因。
發明內容
本發明的目的在于提供一種來自于粘質沙雷氏菌的s-腺苷高半胱氨酸核
苷酸酶(Pfs)及其編碼基因，含有所述編碼基因的載體以及含有所述載體的重 組菌株。
本發明的目的還在于提供一種從粘質沙雷氏菌的基因組中分離s-腺苷高 半胱氨酸核苷酸酶編碼基因的方法。
在本發明的第一方面，提供一種分離的S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶多肽， 該多肽選自下組
(a) 具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b) 將SEQ ID N0:2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或 添加而形成的，且具有水解S-腺苷高半胱氨酸功能的多肽。
在另一優選例中，所述的S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶的分子量為22500道 爾頓。
在另一優選例中，所述的s-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶來源于粘質沙雷氏菌。
在另一優選例中，該多肽是具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列， 該核苷酸序列選自下組
(a) 編碼所述多肽的多核苷酸；
(b) 與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
在另一優選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。
在另一優選例中，該多核苷酸具有SEQ ID NO: l所示的序列。 在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。 在本發明的第四方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體。在本發明的第五方面，提供所述的多肽的制備方法，該方法包含
(a) 在適合表達的條件下，培養所述的宿主細胞；
(b) 從培養物中分離出s-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶多肽。 在本發明的第六方面，提供一種從粘質沙雷氏菌基因組中分離s-腺苷高半
胱氨酸核苷酸酶的編碼基因的方法，所述的方法包括
(1) 用限制性內切酶HindIII消化粘質沙雷氏菌基因組DNA，從消化產物中 分離3-5kb的DNA片段，并使這些DNA片段自身環化連接，形成自身環化分子；
(2) 以步驟(1)獲得的自身環化分子為模板，以SEQIDN0: 5和SEQIDN0: 6所示序列的引物進行PCR擴增，收集分子量約702土50bp的擴增產物；
(2)對步驟(2)獲得的擴增產物進行測序驗證，獲得含有完整閱讀框的 基因，即為S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶的編碼基因。
在另一優選例中，在步驟(1)中，自身環化連接的溫度是12'C。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。
圖l顯示了利用簡并引物擴增的pfs基因的部分片段，泳道M為標準DNA 分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。
圖2顯示了 p/^基因的反向PCR擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳，其中泳道CK 為陰性對照；泳道M為標準DNA分子量，自上向下的條帶分別為6， 5， 4， 3， 2， lkb。
圖3顯示了 p/s基因的Southern Blot鑒定結果。
圖4顯示了 p&結構基因擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳；泳道M為標準DNA 分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。 圖5顯示了重組質粒pET/pA的圖譜。
圖6顯示了重組質粒pET/ /^雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳；泳道M為標 準DNA分子量，自上向下的條帶分別為(kb): 2， 1， 0.75， 0.5， 0.25， 0.1。 圖7顯示了 ￡ coh' BL21(DE3)/pET/ /s誘導表達后的全菌體SDS-PAGE電泳圖。泳道M為標準蛋白分子量，自上向下的條帶分別為(kDa): 94.0, 66.2， 45.0， 35.0， 24.0， 20.0， 14.4。
具體實施例方式
本發明人經過長期的研究和反復的試驗，首次從粘質沙雷氏菌中分離獲得 一種S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶(Pfs)基因，經鑒定Pfs是粘質沙雷氏菌QS系 統關鍵酶。該Pfs酶的獲得通過設計特殊的引物，通過對粘質沙雷氏菌基因組 DNA進行特殊的處理，以及通過常規PCR和反向PCR相結合的方法而克隆獲得。 在此基礎上完成了本發明。
更具體的，本發明的提供了一種從粘質沙雷氏菌中分離的Pfs酶及其結構 基因、重組質粒和轉化重組菌體。同時本發明提供了一種方法，即通過分子生 物學手段，將本發明涉及的酶基因克隆到其他受體菌，由其他菌株或在其他培 養條件下產生本發明涉及的Pfs酶。
本發明的s-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶的編碼基因是從粘質沙雷氏菌中分
離獲得的，分離方法如下
(1) 用限制性內切酶HindIII消化粘質沙雷氏菌基因組DNA，從消化產物中 分離3-5kb的DNA片段，并使這些DNA片段自身環化連接，形成自身環化分子；
(2) 以步驟(1)獲得的自身環化分子為模板，以SEQIDN0: 5和SEQIDN0: 6所示序列的引物進行PCR擴增，收集分子量約702士50bp的擴增產物；
(2)對步驟(2)獲得的擴增產物進行測序驗證，獲得含有完整閱讀框的 基因，即為S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶的編碼基因。
在上述方法中，限制性內切酶的選擇是重要的，本發明人發現，選擇 HindIII酶以外的其它限制性內切酶消化粘質沙雷氏菌基因組DNA無法獲得量 較多的3-5kb的DNA片段，獲得從酶切產物中無法良好地擴增獲得S-腺苷高半 胱氨酸核苷酸酶。
并且，在酶切后，將自身環化連接的溫度設置為12°C，該溫度可獲得連接 較好的自身環化分子，用于后續作為PCR擴增的模板。而采用常規的連接溫度 如16'C，自身環化連接的效果不夠理想。
上述方法中，釆用SEQIDNO: 5和SEQ ID NO: 6所示序列的引物進行PCR擴增，該PCR擴增為反向PCR擴增。
在本發明的實施例中，本發明人利用PCR技術(反向PCR和普通PCR)和分 子雜交相結合的方法成功克隆了粘質沙雷氏菌QS系統關鍵酶基因p/s，同時利 用pET28a")表達載體，表達分析了這一個基因，蛋白分子量的大小與預測的分 子量基本一致。尸/^關鍵酶基因的克隆為深入研究QS調控系統遺傳特點以及研 究QS系統在代謝中的功能奠定了基礎。
如本文所用，"分離的"是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然 的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸 和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在 的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，"分離的S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶蛋白或多肽"是指S-腺 苷高半胱氨酸核苷酸酶多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類 或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化S-腺苷高半胱 氨酸核苷酸酶蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的 主帶。S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本 發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從 原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。 根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖 基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
在本發明中，"S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶保守性變異多肽"指與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列相比，有至多8個，較佳地至多5個，更佳地至多2個氨基酸 被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的多肽。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組 DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編 碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO: l所示的編碼區序列相同 或者是簡并的變異體。如本文所用，"簡并的變異體"在本發明中是指編碼具 有SEQ ID NO: 2的蛋白質，但與SEQ ID NO: l所示的編碼區序列有差別的核酸 序列。編碼SEQ ID NO: 2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序 列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選 的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以 是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發 生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、 缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替 換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改 變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至 少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本 發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，"嚴格條件"是指(1) 在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O. 2XSSC， 0. 1%SDS， 6CTC;或 (2)雜交時加有變性劑，如50。/。(v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll， 42 。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90°/。以上，更好是95%以上時才發 生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0:2所示的成熟多肽 有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段" 的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸， 最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定 和/或分離編碼S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的s-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶核苷酸全長序列或其片段通常可以
用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明 所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的 cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而 得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各 次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通 常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中 分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。 通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，己經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或 其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA 分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序 列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki， et al. Science 1985;230: 1350-1354)被優選用于獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的 cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根
據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常 規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或S-腺 苷高半胱氨酸核苷酸酶編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術 產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science, 1984; 224: 1431)，可利用本發明的 多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶。 一般來 說有以下步驟
(1) .用本發明的編碼S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶的多核苷酸，或用含有該 多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
(2) .在合適的培養基中培養的宿主細胞；
(3) .從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，s-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶多核苷酸序列可插入到重組表達載
體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、 植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發 明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg, et al. Gene， 1987， 56: 125);在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans, J Bio Chem. 263: 3521， 1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿 狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯 控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含s-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶
編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組 DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook， et al. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory. New York, 1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導m脂A 合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；A噬菌體Pl
啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚 期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核 細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點 和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇 轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗 性，或用于大腸桿菌的四環素或氨節青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于 轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞； 或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。原核細胞的代表性例子如大腸桿菌。
作為本發明的最優選方式，提供了一種轉化重組大腸桿菌BL21/pETpfs, 該重組大腸桿菌含重組質粒pETpfs，插入的該質粒DNA片段的大小為6. 0kb， 該質粒pETpfs中含有序列表中SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。利用該重組大
腸桿菌可良好地表達s-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶。
重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主 為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲， 用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如 果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA 轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝 等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根 據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的 方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細 胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離 和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包 括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透
破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、 高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從粘質沙雷氏菌中分離出 的。其序列如SEQ ID NO: 1所示，它包含的多核苷酸序列全長為702個堿基， 編碼全長為233個氨基酸的S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶(SEQ ID N0: 2)，該重 組酶的分子量為22500道爾頓。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于 本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1粘質沙雷氏菌基因組DNA的提取
按照生產商提供的使用說明書，用Genomic DNA Purification Kit (Biodev 北京)抽提處于對數生長期的Serra"'a /rarce"e/75" H30(購自ATCC)的基因組 DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對獲得的細菌基因組進行檢測。
實施例2 Pfs酶基因的克隆和重組菌構建
1、簡并引物擴增
根據已報道其它種類的細菌pA基因的序列，運用Genefisher軟件設計簡并引物尸/W和尸A么引物序列為(其中，N=A/T/G/C， Y=C/T， R=A/G) 5， —CAACACCGGCTCCGCNGGNGGNYT-3， (SEQ ID NO: 3);禾口 ,/s么5' -CCGGGAAGGCGGCNGGRCANCCNG-3' (SEQ ID NO: 4)。 以實施例1獲得的粘質沙雷氏菌的基因組DNA為模板，擴增沙雷氏菌基因片段。
PCR擴增體系為基因組腿2u 1，弓|物尸/W禾口尸/W各1， dNTP2y 1， 10X7i^緩沖液5ul， TAKARA Tag聚合酶lul， ddH20 38 ul。
PCR反應程序為95°C預變性5min， 94°C變性30s， 59°C退火30s， 72°C延伸30s，循環30次，72°C延伸lOmin。
對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，部分結果如圖l所示。 將擴增條帶切膠后用博大泰克公司柱式割膠回收試劑盒回收，連接于 TaKaRa公司pMD-T載體上并轉化大腸桿菌DH5 a 。通過在氨芐青霉素LB平板 上進行藍白斑篩選結合菌落PCR擴增，鑒定出陽性克隆，并在上海英駿生物技 術公司進行序列測定。測序之后，設計反向PCR所需特異引物/Y^J和尸/s^ 尸/sJ: 5， —CAGTGTTCCAGTAGCAGGGTGG—3，(SEQ ID NO: 5);禾口 尸/W: 5， -TGTCGGAAGAAGTGCGCTACC-3，(SEQ ID NO: 6)。
2、 粘質沙雷氏菌基因組DNA的酶切
取10uL基因組DNA用限制性內切酶氾;xl 11I消化12h后，用0. 8%瓊脂 糖凝膠對消化后細菌基因組進行電泳分離，用割膠回收試劑盒回收大小在3-5 kb的片段，溶解于無菌水中。
3、 酶切片段的自身環化
取8uL回收的基因組願A片段，用TaKaRa自身環化連接試劑盒進行自身 環化連接反應。連接酶切片段時，注意反應條件要有利于形成自身環化分子。 反應體系為8uLDNA片段，luL連接緩沖液，luL連接酶；在12'C條件下 連接過夜，低于常規的連接溫度16°C。
4、 反向PCR擴增
用博大泰克公司DNA清潔試劑盒對連接反應液進行清潔處理，并將DNA洗 脫到20" L無菌的去離子水中，然后利用引物尸/6"J和/Ys^進行反向PCR。PCR擴增體系為基因組DNA2y 1，引物尸/W和/Ys4各2u 1， dNTP 2 u 1， 10X7^緩沖液5ul， TAKARA Tag polymerase lnl， ddH20 38 ul。
PCR反應程序為95°C預變性5min， 94°C變性30s， 58°C退火30s， 72°C延伸5min，循環30次，72°C延伸lOmin。
5、 反向PCR擴增產物的Southern雜交鑒定
為了確保反向PCR擴增產物含有核心區，在測序之前對反向PCR擴增產物 的特異性先進行鑒定，將反向PCR擴增產物在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳(圖2)。 隨后參照Amersham Pharmacia的《分子克隆》第二版(科學出版社出版時間 1999. 10.01)進行凝膠的變性、中和、轉膜及雜交鑒定，結果如圖3。
6、 反向PCR擴增產物的測序
再次電泳分離反向PCR產物后，根據Southern雜交鑒定呈陽性的條帶的 大小，切膠后，用博大泰克公司柱式割膠回收試劑盒回收，連接于TaKaRa公 司p腦-T載體上并轉化大腸桿菌DH5a。通過在氨芐青霉素LB平板上進行藍白 斑篩選結合菌落PCR擴增，鑒定出陽性克隆，并在上海英駿生物技術公司進行 序列測定。將測得全長序列在GenBank數據庫中進行分析，并借助NCBI的ORF Finder程序(http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)確定其中的完 整閱讀框，同時設計結構基因引物FpEXpfsl和RpEXpfs2:
FpEXpfsl: 5， -CGGGATCCATGAAAGTAGGCATCATCGGC-3，(SEQ ID NO: 7);
和
RpEXpfs2: 5， -CCCAAGCTTAAGCGCAGCCTCACATCAA-3，(SEQ ID NO: 8)。
7、 pfs基因的表達
利用pET28a("質粒(Novagen)，構建表達載體，表達目的基因，進一步確 認克隆基因的正確性。
7. 1 / A結構基因的擴增
根據反向PCR擴增產物序列的拼接結果，設計FpEXpfsl和RpEXpfs2表達 引物，以基因組DNA為模板，擴增出p&的完整結構基因。
PCR擴增體系為基因組DNA2ixl，引物FpEXpfsl和RpEXpfs2各2u 1，dNTP 2ul， 10X:Tag緩沖液5ul， TAKARA Tag聚合酶lwl， ddH20 38 ul。 PCR反應程序為95°C預變性5min， 94°C變性30s， 57°C退火30s，
72°C延伸75s，循環30次，72°C延伸lOmin。
PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖4所示。
7.2限制性酶切反應，純化及連接反應
經純化后的PCR產物，用預先設計在引物序列中酶切位點所對應的酶進行 酶切反應。本實驗中，所用的酶是&Mi I和氾/ d III。酶切體系PCR產物或 質粒溶液20 u 1 ， 5ayziH I 1 u 1 ， 〃// d III 1 u 1 ， 10 X緩沖液K 3 u 1 ， ddH20 5 u 1 ， 總體積30w 1。
由于所選用的兩個酶切位點在pET28a"'空質粒上相距很近(約30bp)因此， 酶切之后的PCR產物和質粒載體只需經過PCR清潔試劑盒即可達到純化的目 的。
經酶切純化后的PCR產物和質粒載體，可以用于連接反應。連接反應體系 酶切純化的PCR產物lOul，酶切純化的質粒3ul， T4連接酶lul, IOX連 接酶緩沖液2ul， ddH20 4 ul。連接后獲得重組質粒pETpfs，其主要結構如 圖5所示。
7. 3質粒制備與轉化
質粒抽提采用質粒提取試劑盒制備，參照生產商的說明書進行操作。 質粒轉化細胞使用氯化鈣法。具體操作如下
7.3.1大腸桿菌感受態細胞的制備
(1) 從新鮮的大腸桿菌培養平板上接種一單菌落于5ml LB液體培養基， 37。C培養過夜。
(2) 按O. 5-P/。的比例轉接于100ml LB液體培養基，37。C培養2-4個小時， 當菌液OD,約為O. 3。
(3) 將菌液轉移到預冷的50ml離心管中，冰浴30分鐘，4000rpm離心10分鐘。
(4) 去上清，沉淀懸浮于5ml預冷的0. 1M的CaCl2溶液中，冰浴15分鐘， 4000rpm離心10分鐘。(5) 去上清，沉淀懸浮于2ml預冷的0. 1M的CaCl2溶液中，冰浴10分鐘， 4000rpm離心10分鐘。
(6) 去上清，沉淀懸浮于lml預冷的O. 1M的CaCl2溶液中，加入高壓滅菌的 甘油至終濃度15%。
(7) 取200u l分裝于1.5ml tip管中，于-70。C保存，備用。
7.3.2重組質粒pETpfs的轉化
(1) 取O. l-lu g質粒DNA于200u l感受態細胞中，冰浴30分鐘。
(2) 42。C水浴熱激90秒，快速置于冰上1-3分鐘。
(3) 加入新鮮LB液體培養基800ul，于37。C振蕩培養45分鐘。
(4) 取200u 1菌液涂布于選擇性LB固體培養基表面。37。C培養12-16個小 時至單菌落出現。
7.3.3重組子的鑒定
將陽性菌落接種于含有卡那霉素(50mg/L)的LB液體培養基中進行培養并 提取質粒，按照"限制性酶切反應，純化及連接反應"中的酶切體系和條件用 SsMi I和氾72d III重組質粒進行雙酶切鑒定。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳， 結果見圖6，說明獲得的重組質粒是正確的。
經電泳結果證實，該陽性克隆菌落有DNA片段插入質粒pETpfs，含此重組 質粒pETpfs的重組大腸桿菌，即為轉化的A co乃'BL21(DE3)/pETpfs。
本發明的重組大腸桿菌BL21/pETpfs可用于研究Pfs基因的功能，以及對 QS系統合成信號分子的調控作用。同時也是研究QS系統調控微生物代謝的重 要工程菌。
實施例3 Pfs酶的誘導表達
將重組大腸桿菌BL21/pETpfs接種于添加適當抗生素的LB液體培養基中 (LB培養基組成為酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、 NaCl 1%， pH7. 0) ， 37。C搖床 培養過夜；再以5。/。的接種量轉接到裝有30mLLB培養基的250 mL搖瓶中，37°C 搖床培養4小時，加入IPTG誘導(終濃度lmM)，然后繼續培養6小時后，離心 收集菌體。將收集的菌體進行全菌SDS-PAGE電泳，結果如圖7所示，表明基 因工程菌表達出了 Pfs，圖中泳道M為標準蛋白分子量(自上而下的條帶分別為94.0， 66.2， 45.0, 35.0， 24.0， 20.0 , 14.4 kDa)。在24kD左右表達出了 一條明顯的蛋白條帶，酶已成功表達。
經驗證，所獲得的Pfs酶具有良好的水解S-腺苷高半胱氨酸的功能，酶活 性很高。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后， 本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權利要求書所限定的范圍。序列表
<110〉 華東理工大學
<120〉從粘質沙雷氏菌分離的S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶基因序列及表達重組菌株
<130〉 076396
<160〉 8
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211〉 702
<212〉 DNA
<213〉 Serratia marcescens
<400〉 1
atgaaagtaggcatcatcggcgc肌tggagcagg犯gtC8ccctgctgcgcgatca犯tx60
gaaaaccgtc犯accatcc3gcgcgcgggctgcga犯tctacaccggccagatcagcggc120
gttgacgtggccctgctgaaatccggcatcggcaaagtctctgcggccatgggcaccacc180
ctgttgctgg3gc3Ctgcagccccgacgtggtgatcaat3ccggctccgccggcggcctg240
gccagcacgctgcgcgtgggcgacatcgtggtgtcgg卿a3gtgcgctaccacgacgcc300
gacgtcaccgccttcggctacgagccgggcc卿tggccggctgcccggcggcgttcgtc360
gccgatgatgcgctgatcgcgctggcggaaagctgcatcaaac3gctggatctgcacgcg420
gtgcgtggcctgatctgcagcggtgacgccttcatcaacggcgccgagccgctggcgcgc480
atccgcgccaccttcccgcgcgtcgccgccgtggaaatggaagccgcggcgatcgcccac540
gtxtgccatctgttcggcacgccgttcgtggtggtgcgcgccatttccgacgtcgccgac600
agcgaatcgcEicatgagctttgacgagttcctggtggtagcggccaagcagtccacgctg660
eitggtcaacgccatgctgcaaaccctggcc卿cgcggttga702
<210〉 2
<211〉 233
<212〉 PRT
<213〉 Serratia marcescens
<400〉 2
Met Lys Val Gly lie lie Gly Ala Met Glu Gin Glu Val Thr Leu Leu
15 10 15
Arg Asp Gin lie Glu Asn Arg Gin Thr lie Gin Arg Ala Gly Cys Glu
20 25 30
lie Tyr Thr Gly Gin lie Gly Gly Val Asp Val Ala Leu Leu Lys Ser
35 40 45
Gly lie Gly Lys Val Ser Ala Ala Met Gly Thr Thr Leu Leu Leu Glu
50 55 60
His Cys Ser Pro Asp Leu Val lie Asn Thr Gly Ser Ala Gly Gly Leu 65 70 75 80
Ala Ser Thr Leu Arg Val Gly Asp lie Val Val Ser Glu Glu Val Arg 85 90 95Ala
Ala
lie 145 lie
Ala
Arg
Glu
Met 225
His
Gly
Glu 130 Cys
Arg
lie
Ala
Phe 210 Leu
Asp Ala 100 Cys Pro 115
Ser Cys
Ser Gly
Ala Thr
Ala His 180 lie Ser 195
Leu Val Gin Thr
Asp Val
Ala Ala
lie Lys
Asp Ala 150 Phe Pro 165
Val Cys
Asp Val
Val Ala
Leu Ala 230
Thr
Phe
Gin 135 Phe
Arg
His
Ala
Ala 215 Lys
Ala
Val 120 Leu
lie
Val
Leu
Asp 200 Lys
Arg
Phe Gly 105
Ala Asp
Glu Leu
Asn Gly
Ala Ala 170 Phe Gly 185
Ser Glu Gin Ser Gly
Tyr Glu
Asp Ala
His Ala 140 Ala Glu 155
Val Glu
Thr Pro
Ser His
Thr Leu 220
Pro
Leu 125 Val
Gly Gin Met 110
lie Ala Leu Arg Gly Leu
Pro Leu Ala Arg 160
Met Glu Ala Ala 175
Phe Val Val Val 190
Met Ser Phe Asp 205
Met Val Asn Ala
<210〉 3
<211〉 24
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221> misc—feature
<223〉 引物
<220〉
<221〉 misc—feature
<222〉 (16).. (16)
<223〉 n是，c， g,或t
<220>
<221〉 misc—feature
<222〉 (19).. (19)
<223〉 n是a, c, g,或t
<220〉
<221〉 misc—feature
<222〉 (22).. (22)
<223〉 n是a， c, g,或t
<220〉
<221〉 misc—feature
<222〉 (23). ■ (23)
<223> y是t或c
<400〉 3caacaccggc tccgcnggng gnyt
24
<210〉 <211> <212> <213>
4
24 腿
人工序列
<220〉 <221〉 <223〉
misc—feature 引物
<220〉 <221〉 <222> <223〉
misc—feature (14).. (14) n是ei, c, g,
或
<220〉 <221> <222〉 <223〉
misc. (17)
—feature .(17) 3或g
<220〉 <221〉 <222〉 <223>
misc. 咖 n是
—feature .(20) a, c， g,
或
<220〉 <221> <222〉 <223〉
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或
<400> 4
ccgggemggc ggcnggrc肌ccng
24
<210〉 ■<211〉 <212> <213〉
5
22 DNA
人工序列
<220〉 <221〉 <223〉
misc—feature 引物—
<400〉 5
cagtgttcca gtagcagggt gg
22<210〉 <211〉 <212〉 <213〉
6
21 腿
人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature <223〉 引物
<400〉 6
tgtcggaaga agtgcgctac c 21
<210〉 7
<211〉 29
<212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<221> misc_feature <223〉 引物
<400〉 7
cgggatccat gaaagtaggc atcatcggc 29
<210> 8
<211〉 28
<212〉 醒 <213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature 〈223〉 引物
<400〉 8
cccaagctta agcgcagcct cacatcaa 28
權利要求
1. 一種分離的S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有水解S-腺苷高半胱氨酸功能的多肽。
2. 如權利要求l所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO: 2所 示氨基酸序列的多肽。
3. —種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸 序列選自下組(a) 編碼如權利要求l所述多肽的多核苷酸；(b) 與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4. 如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。
5. 如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQIDNO: l所示的序列。
6. —種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7. —種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8. 權利要求l所述的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a) 在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b) 從培養物中分離出S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶多肽。
9. 一種從粘質沙雷氏菌基因組中分離S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶的編碼 基因的方法，其特征在于，所述的方法包括(1) 用限制性內切酶HindIII消化粘質沙雷氏菌基因組DNA，從消化產物中 分離3-5kb的DNA片段，并使這些DNA片段自身環化連接，形成自身環化分子；(2) 以步驟(1)獲得的自身環化分子為模板，以SEQ IDN0: 5和SEQ IDN0: 6所示序列的引物進行PCR擴增，收集分子量約702士50bp的擴增產物；(2)對步驟(2)獲得的擴增產物進行測序驗證，獲得含有完整閱讀框的 基因，即為S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶的編碼基因。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中，自身環化連 接的溫度是12"C。
全文摘要
本發明屬于生物技術和酶工程領域，公開了一種從粘質沙雷氏菌分離的S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶多肽，其是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽，或將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有水解S-腺苷高半胱氨酸功能的多肽。本發明還公開了所述酶的編碼基因，含有所述編碼基因的載體，以及含有所述載體的宿主細胞。本發明還公開了從粘質沙雷氏菌中分離S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶編碼基因的方法。
文檔編號C12N9/14GK101429500SQ20071004801
公開日2009年5月13日 申請日期2007年11月9日 優先權日2007年11月9日
發明者周文瑜, 孫建安, 張燎原, 虎 朱, 楊云龍, 沈亞領, 昱 邱, 魏東芝 申請人:華東理工大學