專利名稱：一種快速高效的植物人工微rna表達載體構建方法
技術領域：
本發明涉及的是生物基因克隆表達技術，特別是一種快速高效構建植物人工微RNA (artificial microRNAs， amiRNAs)表達載體的方法。特別適合用于大規模的構建針對植物的 不同基因的植物人工微RNA表達單元，以研究植物基因的功能。
背景技術：
隨著越來越多的物種全基因組序列測定工作的完成，當前的基因組學研究熱點已經由結 構基因組學轉向了功能基因組學，從而發展能夠快速、高效、高通量的基因功能研究方法和 策略也自然成為了研究熱點。RNA干擾(RNAinterference, RNAi)技術由于特異性高，操 作簡便，重復性好，已成為當今動植物基因功能研究中重要的手段之一，然而由于動植物細 胞本身內在的特點，RNAi技術在動物基因功能研究中的應用己經相當廣泛和普遍，而在植物 中，由于脫靶效應的存在導致其應用相對受阻。近一年多來，陸續有文獻報導植物人工微RNA (artificial microRNAs， amiRNAs)能夠高效、高特異性地沉默植物的內源和外源基因，而且 應用范圍比傳統的RNAi技術更加廣泛。在美國的擬南芥2010計劃中，就運用了植物 amiRNAs表達技術研究擬南芥中以多基因家族形式存在的基因的功能。
目前，已知的構建植物amiRNAs表達載體的方法主要有三種第一種是采用重疊延伸 PCR的方法，先按照需要設計三對引物，進行三輪獨立的PCR,獲得的三種PCR產物分別 含有待干擾的目的基因的靶序列、amiRNAs的環序列以及待干擾的目的基因靶序列的互補 序列；然后采用重疊延伸PCR的方法將獲得的三種PCR產物拼接成完整的amiRNAs莖環 結構序列(見圖1)，再將其克隆到植物雙元表達載體上。第二種是設計一對引物，該引物分 別含有針對目的基因設計的靶序列以及與靶序列互補的序列，且兩端分別帶有特定的酶切位 點，以從植物中獲得的microRNA (miRNA)的cDNA序列作為模板進行PCR,獲得的產物 經酶切酶連處理后克隆到入口載體上，然后采用Gateway重組的方法將amiRNAs的莖環結 構序列克隆到植物雙元表達載體上(見圖2)。第三種是直接合成法。通過以上方法雖然能夠 成功構建植物amiRNAs表達載體，但是明顯存在不足，主要表現在以下幾個方面
一、步驟繁瑣，克隆效率低。以上三種方法都需要對克隆的目的片段和載體進行特殊處 理，需要目的片段與載體的連接反應。三種方法中，載體都需要經過合適的酶切、純化處理。 第一種方法需要用三對不同的引物經第一輪PCR獲得三段200bp左右大小的DNA片段，對 其分別進行純化處理后，再以該純化產物為模板進行第二輪重疊延伸PCR,得到完整的 amiRNAs結構。由于第一輪PCR產物通常在200bp以下，因此純化效率較低，成本較高。
而且植物雙元載體一般較大(10kb以上)，amiRNAs莖環結構克隆上去之前的酶切、純化、 酶連操作相對困難。第二種方法需要在引物中額外添加針對干擾目的基因設計的靶序列以及 amiRNAs的側翼序列，通常需要長引物(大于60nt)或者多輪的PCR擴增才能獲得完整的 amiRNAs莖環結構序列，獲得的PCR產物也需要酶切，然后與同樣酶切處理過的入口載體 進行連接反應。這個過程不僅花費時間，而且增加了載體的自連背景，使后續的篩選過程復 雜化。第三種方法需要化學合成的兩條寡核苷酸單鏈體外退火，得到的產物需要純化處理， 然后與處理好的載體連接反應；由于待克隆的片段小于100bp，因此難以回收純化，而且要 鑒定正確的重組質粒較難，假陽性率高。
二、 不適合高通量的操作。以上三種方法中的待克隆目的片段都需要預先處理純化，都 依賴于載體與片段的連接反應。這些操作對于構建單個或少數植物amiRNAs表達載體可能 有效，但如果大規模構建植物amiRNAs表達載體卻非常困難，效率低下。第一種方法中， 得到一個完整的amiRNA莖環結構序列需要兩對特定的引物，四次獨立的PCR和回收步驟， 這不僅步驟煩瑣，費時費力，而且成本高。第二種方法中使用的引物通常大于60nt，第三種 方法需要使用的寡核苷酸單鏈通常為80-100nt，合成這些長的引物或寡核苷酸單鏈不僅大 大增加了實驗成本，而且堿基合成正確率大大下降，從而使得后續的篩選工作成本增加。
三、 不適合用于所有植物miRNA的種類。植物體內不同的miRNA的側翼序列和環序列 的長度差異很大。前兩種方法都不適合用于以環序列長度過短的miRNA為基礎的amiRNAs 的構建。第一種方法中，如果amiRNAs的環長度過短，將使得第一輪PCR產物的長度過短， 最終導致純化困難，回收效率低下。第二種方法只適合側翼序列堿基數目少而且環長度較長 的植物miRNA。
(參見刊物"Plant Cell. 2006 May; 18(5): 1134^51" ; "Plant Cell. 2006 May; 18(5): 1121-33." "Nat Biotechnol. 2006 Nov;24(11): 1420-8."參見網頁http:〃2010.cshl.edu/)
發明內容
本發明的目的是提供一種新的植物人工微RNA (artificial microRNAs， amiRNAs)表達載 體構建技術。該技術主要包括植物amiRNAs表達單元的構建和amiRNAs表達單元克隆到植物 雙元表達載體兩大步驟。該技術不需訂購長度大于60nt的引物，不需要對PCR產物及載體進 行酶切、連接步驟就能迅速地構建植物amiRNAs表達載體，真正做到快速、高效、低成本的 構建植物amiRNAs表達載體。
本發明中構建植物amiRNAs表達載體的具體方法為(見圖5):
—)含araiRNAs表達單元的供體質粒的構建
1)選擇并改造供體骨架載體。在miRNA 5'與3'側翼序列之間克隆一篩選標記基因或報 告基因的表達單元(如gfp、 ccdB等)，通過該表達單元的缺失，可以直接鑒定出含有植物 amiRNAs表達單元的重組子；在5'側翼序列(5'f lank)的前面添加一個控制植物amiRNAs表達 的啟動子(promoter),在3'側翼序列(3'flank)的后面添加一終止子序列(temiinator)，得到植 物amiRNAs的供體骨架載體(見圖3)。
2) 引物設計。根據在線軟件或相關運算規則，設計針對目的基因進行RNA干擾的靶序 列。首先以miRNA的環序列為基礎，設計一條長度與其相同的引物①；然后根據前面所述的 amiRNAs的供體骨架載體上miRNA的5'側翼序列和3'側翼序列，設計一對PCR引物(引 物②和引物③)，該對引物應該在與amiRNAs供體骨架載體特異性退火的序列5'末端加上已 設計的靶序列(TS1、 TS2),除此之外，引物②還應在5'末端加上與引物①特異性退火的序列 LSP1，弓l物③的5'末端還應加上引物①5，末端的10-15nt序列HR,使兩者末端產生10-15bp 的同源序列。(具體參見圖5B)
3) PCR擴增。利用2)中設計的引物①,，以前面所述的araiRNAs供體骨架載體為模 板，經套式PCR擴增，獲得的PCR產物含有amiRNAs供體骨架載體上的miRNA的側翼序列和 干擾目的基因的靶序列，而且PCR產物5'和3'末端分別帶有部分miRNA的環序列，同時PCR 產物缺失了 amiRNAs骨架載體中的篩選標記基因或報告基因的表達單元(如gfp、 ccdB等)。
(具體參見圖5C)
4) 同源重組轉化篩選。獲得的PCR產物直接轉化大腸桿菌DH1鄰感受態細胞，在大腸桿 菌體內經同源重組自環化，得到含有干擾目的基因的靶序列的amiRNAs表達單元的供體質粒。
以上敘述過程參見圖5中路線A—B—C—F。
除了以上敘述的方法外，構建含amiRNAs表達單元的供體質粒還可以通過下列方法實現:
1) 選擇并改造供體骨架載體。首先在miRNA 5'與3'側翼序列之間克隆一篩選標記基因 或報告基因的表達單元(如gfp、 ccdB等)，通過該表達單元的缺失，可以直接鑒定出含有 植物amiRNAs表達單元的重組子；在5'側翼序列(5'f lank)的前面添加一個控制植物amiRNAs 表達的啟動子(promoter)，在3'側翼序列(3'f lank)的后面添加一終止子序列(terminator)，得 到植物amiRNAs的供體骨架載體(見圖3)。
2) 引物設計。根據在線軟件或相關運算規則，設計干擾目的基因的靶序列。根據前面所 述的amiRNAs的供體骨架載體上miRNA 5'側翼序列和3'側翼序列，設計一對引物④和⑤； 同時根據該miRNA的環序列，再設計一對引物⑥和⑦，該引物應該在與所選用的植物miRNA 的環序列特異性退火的序列5'末端依次加上已設計的靶序列(TS1、 TS2)以及引物④和引物 ⑤的5'末端的10-15nt序列(冊l、冊2)，使兩PCR產物末端分別產生10-15bp的同源序列。
(具體參見圖5D/G)
3) PCR擴增。利用2)中設計的引物④和(D，以前面所述的amiRNAs供體骨架載體為模 板，進行PCR擴增；利用引物⑥和⑦，以含有所選用的植物miRNA的環序列的載體為模板， 進行PCR擴增。
4) 同源重組轉化篩選。獲得的兩種PCR產物經乙醇沉淀后按1: 5-10比例混合轉化至 大腸桿菌DH10p感受態細胞，在大腸桿菌體內經同源重組后，得到含有干擾目的基因的靶序 列的amiRNAs表達單元的供體質粒。
以上敘述過程參見圖5中路線A—D/G—E—F。
由于在以amiRNAs供體骨架載體為模板的PCR過程中，miRNA5，與3，側翼序列之間的篩
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選標記基因或報告基因的表達單元(如gfp、 CcdB等)缺失，重組質粒和原始模板可以通過 瓊脂糖凝膠電泳有效區分；還可以通過篩選標記基因或報告基因自身的特點，如gfp報告 基因表達能自發熒光，在大腸桿菌中，原始模板表達gfp自發熒光，排除因模板污染而產生 的背景。
二)人工微RNAs (amiRNAs)表達單元克隆到植物雙元載體上
1) 選擇并改造受體載體。首先在植物雙元載體上克隆一大腸桿菌的條件致死基因表達單 元，如/^ s基因(在培養基中加入氯化苯丙氨酸，表達的PHES對大腸桿菌有致死效應)， 而且該表達單元兩端分別帶有一個I-5bel酶切位點以及一段與含有araiRNAs表達單元的供體 質粒同源的50bp序列，獲得植物雙元受體載體(見圖4),將其轉入大腸桿菌BUN21 (pML300) 中。
2) 采用接合輔助的遺傳整合克隆方法(mating-assisted genetically integrated cloning ， MAGIC)將amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上，具體操作步驟如下
a) 將攜帶有包含ainiRNAs表達單元的供體質粒(構建過程前面已敘述)的大腸桿菌DH10p 接種于含有氨芐青霉素(Amp) 100wg/ml、葡萄糖0.2%的LB平板，將含有植物雙元受體載 體的大腸桿菌BUN21 (pML300)接種于含有卡那霉素(Kan) 50ug/ml、壯觀霉素(Spec) 50 P g/ml和葡萄糖0.2%的LB平板，于30X:過夜培養。
b) 挑取已長出的單菌落接種于5ml相應的液體培養基過夜培養。
c) 第二天，分別于4000rpm室溫離心5min，收集菌體，將收集的兩種菌體分別重懸于 lmlLB液體，重復上述離心重懸操作1-3次。將兩種菌體各取40"1分別加入到兩支不同的 試管中，試管內含有2ml添加了0.2X鼠李糖的LB培養基，于30'C搖2小時左右，使兩試管 中菌體的OD湖值達到0.15 - 0. 25。
d) 1: l混合上述兩種菌體，加阿拉伯糖使其終濃度為0.2%，混勻后，37'C靜置2小時， 然后37'C搖床培養2小時。
e) 將上述菌體涂布于含有氨芐青霉素100ug/ml、卡那霉素50iig/ml的LB固體平板， 42'C過夜培養。
f) 挑取單菌落，驗證重組子，選出植物人工微RNA (amiRNAs)表達載體。 上述步驟中，通過在培養基中添加阿拉伯糖，從大腸桿菌BUN21 (pML300)中誘導表
達出的內切酶I-S"I,可將供體質粒上amiRNAs表達單元和植物雙元受體載體上的大腸桿菌條 件致死基因表達單元(如pAe5)分別從其兩側I-S"I酶切位點處切下，因含有amiRNAs表 達單元的供體質粒和植物雙元受體載體經內切酶酶切后，切下的amiRNAs表達單元和 植物雙元受體載體的線性化酶切產物末端帶有50bp的彼此同源序列，所以在大腸桿菌BUN21 (pML300)中，由鼠李糖誘導表達出的重組酶可以使帶有50bp同源序列的兩片段在大腸桿 菌體內發生同源重組，從而獲得含有amiRNAs表達單元的植物雙元載體，即植物amiRNAs表 達載體。
所述的植物amiRNAs表達載體包括以所有植物miRNA結構為骨架構建的含有植物
amiRNAs表達單元的載體；控制植物amiRNAs表達的啟動子可以是組成型、誘導型、細胞 或組織特異性啟動子。
當步驟一)中構建的含有植物amiRNAs表達單元的載體用于植物原生質體的瞬間表達檢 測、或者通過除步驟二)所述的接合輔助的遺傳整合克隆方式以外的方法將amiRNAs表達單 元克隆到植物雙元載體上、或者不依賴于農桿菌介導的植株轉化時，用到的載體可以是能在 大腸桿菌體內復制的所有載體。
步驟二:)所述的將amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上，還可以通過傳統的酶切連 接的方法或者Gateway重組的方式來實現。
本發明與現有技術相比具有明顯的優勢
一、 本發明中，獲得的PCR產物轉化大腸桿菌DH10p菌株的感受態細胞，產物通過在大 腸桿菌體內同源重組，得到含有干擾目的基因的靶序列的amiRNAs表達單元的供體載體。然 后通過接合輔助的遺傳整合克隆的方式,快速高效地將含有干擾目的基因的靶序列的amiRNAs 表達單元轉移到植物雙元表達載體上。整個過程不需要酶切連接反應，也不需要對載體或目 的片段進行特殊處理，PCR產物就可直接轉化大腸桿菌感受態細胞。整個過程操作簡單方便， 實驗周期短,.重組效率高，能夠快速高效地構建植物amiRNAs表達載體。
二、 本發明在amiRNAs供體骨架載體上引入篩選標記基因或報告基因的表達單元(如 gfp、 ccdB等)，通過該表達單元的缺失，根據篩選標記基因或報告基因自身的特點，可以直 接鑒定出含有植物amiRNAs表達單元的重組子，如g/p報告基因表達能自發熒光，經PCR 后^^表達單元缺失，可根據轉化后的大腸桿菌菌落發光與否將模板淘汰；且最終的amiRNAs 供體質粒與模板大小有一定差異，也能通過簡單的瓊脂糖凝膠電泳區分開來；在amiRNAs受 體骨架載體上引入一個大腸桿菌的條件致死基因(如P力es)表達單元，amiRNAs表達單元 轉移上去之后該單元缺失，因此可通過在培養基中添加特殊化學物質(如氯化苯丙氨酸) 將含有模板質粒的大腸桿菌淘汰。利用引入的篩選標記基因或報告基因(如gfp、 ccdB等) 以及大腸桿菌的條件致死基因(如P力es)的方法能有效去除模板污染，真正做到零背景的 構建植物amiRNAs表達載體。
三、 本發明中構建amiRNAs表達單元所用到的每條引物長度都可控制在60nt以內，不僅 節省了實驗成本，而且大大降低了引物合成中的堿基錯誤率。
四、 本發明采用接合輔助的遺傳整合克隆(MAGIC)的方式將amiRNAs表達單元克隆到植 物雙元載體上，整個過程操作簡單方便，實驗周期短，重組效率高。
五、 本發明的整個過程操作簡單、成本低、效率高，很容易實現自動化和高通量操作。 該方法不僅適用于實驗室小規模的單個基因功能研究，也適用于大規模的功能基因組學研究。
圖1:重疊延伸PCR構建amiRNAs結構過程。
其中A和B為基于模板載體設計的一對引物，I 一IV為帶有針對目的基因設計的耙序列 的引物。重疊延伸PCR為將引物A-IV、 II-ffl、 I-B分別擴增得到的PCR產物混于一個反 應體系，利用引物A-B進行PCR得到的PCR產物為完整的amiRNA莖環結構。
圖2: Gateway重組的方式構建amiRNAs表達載體過程。
其中FW primer和RV primer為帶有干擾目的基因的耙序列引物，同時引物5'帶有 miR159a的側翼序列以及額外引入的酶切位點。
圖3:本發明中構建的amiRNAs供體骨架載體。Promoter為控制amiRNA表達的啟動子， 5' flank和3' flank為miRNA兩端側翼序列，她表示包括她在內的所有篩選標記基因或 報告基因表達單元，terminator表示終止信號，AmpK表示氨芐青霉素抗性基因，H3和H4表 示與50bp受體載體同源的序列，I-Scel表示酶切位點。
圖4:本發明中構建的amiRNAs受體骨架載體。LB和RB分別表示植物雙元表達載體的 左邊界和右邊界，ba^表示除草劑抗性基因，hyg^表示潮霉素抗性基因，H3和H4表示50bp 與amiRNAs供體載體同源的序列，pheS表示包括在內的所有大腸桿菌條件致死基因表 達單元，I-Scel表示酶切位點。
圖5:本發明中植物amiRNAs表達載體的構建過程。
其中A表示amiRNAs供體骨架載體，5' flank和3' flank分別表示miRNA的5'和3' 側翼序列。B和D表示根據miRNA的側翼序列和環序列設計的引物，箭頭所指方向為引物5' —3'方向，①表示根據環序列設計的一條引物；引物②和③中，SP1和SP2表示與側翼序列 退火區域，TS1和TS2表示針對目的基因設計的干擾耙序列及其互補序列，LSP1表示與引物 ①退火區域,，HR表示與環序列末端的同源區域；引物④和⑤中，5' flank和3' flank分別表 示miRNA的5'和3'側翼序列，VP1和VP2表示與載體退火區域。C和E表示PCR擴增 得到的線性產物。F表示經大腸桿菌體內同源重組后得到的含有amiRNAs表達單元的供體質 粒。G表示根據miRNA的環序列設計的引物⑥和⑦，loop sequence表示miRNA的環序列， LP1和LP2表示與環序列的退火區域，TS1和TS2表示針對目的基因設計的干擾靶序列及其 互補序列，HR1和HR2表示與載體兩端同源的區域。H表示本發明中構建的amiRNAs受體 骨架載體。I表示采用接合輔助的遺傳整合克隆(MAGIC)的方式獲得的植物amiRNAs表達 載體。
具體實施例方式
下面以實施例對本發明進一步說明 實施例l:
利用本發明的方法構建以模式植物擬南芥的一種miRNA~~miR156b為骨架，干擾目的基 因——P-葡萄糖酸苷酶基因(GUS)的amiRNAs表達載體。
1) 含干擾GUS基因的靶序列的amiRNAs表達單元的供體質粒的構建 首先構建一個包含由RNA聚合酶II型啟動子(CaMV35S)控制的miR156b表達單元
(CaMV35S-raiR156b-N0S)的供體質粒，在該供體質粒中包含的miR156b序列的5'側翼序列和 3'側翼序列之間引入妳基因表達單元，得到供體骨架載體pDonorl56b^fj)。根據miR156b 的環序列設計一條引物(D~~pl561oop，根據在線軟件設計干擾GUS基因的amiRNAs的耙 序列，根據miR156b的5'側翼序列和3'側翼序列設計一對反向PCR擴增供體質粒 pDonorl56b-gfi)的引物@——pGUSl和引物@——pGUS2，具體序列為 pl561oop: 5， atgcaggcactgttatgtgtctataactttgcgtgtgc 3 ，；
pGUS 1: 5 ， tgtctataactttgcgtgtgc加aflfcgc"gtoagrgcgGTTGCCTATCTCTGCCTG 3 ，； pGUS2: 5， ataacagtgcctgcaWaafcgc"gtoflgrgcgGTTTTCTCTGTTGCATTCCT3 ，:
其中，斜體為干擾GUS基因的靶序列,大寫為與供體骨架載體特異性退火的序列，pGUSl 中下劃線部分為與引物pl561oop退火的序列，pGUS2中下劃線部分為15nt的同源序列。以 構建好的供體骨架載體pDonorl56b-gfip為模板，利用上述3條引物進行套式PCR擴增，得到 的PCR產物直接轉化大腸桿菌DH10p感受態細胞，篩選得到重組質粒，即含有干擾GUS基 因的耙序列的amiRNA表達單元的供體質粒。實驗結果表明，陽性克隆率大于95%。
2) amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上
首先構建一個植物amiRNAs受體骨架載體在植物雙元載體pCAMBIA2300的多克隆位 點處引入一 p/iM基因表達單元，同時該表達單元兩端攜帶酶切位點及與供體骨架載體 pDonorl56b-gfi)中amiRNAs表達單元兩端同源的50bp序列，獲得植物雙元受體載體pR-2300， 并將其轉化至大腸桿菌BUN21 (pML300)中。
采用接合輔助的遺傳整合克隆(MAGIC)的方式，將amiRNAs表達單元克隆到植物雙 元載體上，具體操作步驟如下
a) 將攜帶有包含干擾GUS基因的靶序列的amiRNAs表達單元的供體質粒的大腸桿菌 DH1鄰接種于含有氨芐青霉素(Amp) 100ug/ml、葡萄糖0.2%的LB平板，將含有植物雙元 受體載體PR-2300的大腸桿菌BUN21 (pML300)接種于含有卡那霉素(Kan) 50ug/ml、壯觀 霉素(Spec) 50 u g/ml和葡萄糖0.2%的LB平板，于30匯過夜培養。
b) 挑取已長出的單菌落接種于5ml相應的液體培養基過夜培養。
c) 第二天，分別于4000rpm室溫離心5min,收集菌體，將收集的兩種菌體分別重懸于 lml LB液體，重復上述重懸、離心操作1-3次。將兩種菌體各取40ul分別加入到兩支不同 的試管中，試管內含有2ml添加了0.2W鼠李糖的LB培養基，于30'C搖2小時左右，使兩試 管中菌體的0D湖值達到0.15 ~ 0.25。
d) 按l: l比例混合上述兩種菌體，加阿拉伯糖使其終濃度為0.2%，混勻后，37"靜置 2小時，然后37'C搖床培養2小時。
e) 將上述菌體涂布于含有氨芐青霉素100ug/ml、卡那霉素50ng/ml的LB固體平板， 42'C過夜培養。
f)挑取單菌落，驗證重組子，驗證正確的重組質粒即為含有干擾GUS基因的amiRNAs表 達載體。
實驗結果表明，獲得amiRNAs表達載體的陽性克隆率達到100%。 實施例2:
利用本發明的方法構建以模式植物擬南芥的一種miRNA—-raiR319a為骨架，干擾擬南芥 八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)基因的araiRNAs表達載體。
1) 含干擾PDS基因的耙序列的amiRNAs表達單元的供體質粒的構建 首先構建一個包含由RNA聚合酶II型啟動子(CaMV35S)控制的miR319a表達單元
(CaMV35S-raiR319a-NOS)的供體質粒載體，在該供體質粒載體中包含的miR319a的5'側翼序 列和3'側翼序列之間引入她基因表達單元，得到供體骨架載體pDonor319a-g^。根據在線 軟件設計干擾PDS基因的amiRNAs靶序列，根據miR319a的5'側翼序列和3'側翼序列設計 一對反擴供體骨架載體pDonor319a-gfj)的引物0——pD319a-l和引物 ——pD319a-2，根據 miR319a的環序列序列設計一對引物 ——p319a-PDSl和引物@——p319a-PDS2，設計好的 引物序列為:
pD319a-h 5， ctetcttttgtattccaatttagctcga 3 ，； pD319a-2: 5, ctacatatatattcctaaaacatcaagagtccc3 ，；
p319a-PDS 1: 5, ggaatatatatgtag c/cgc欲a加toaftcacaggtcgtgatatgattca3,; p319a-PDS2: 5' g幼tacaaaagagag ctogcgga加to"cgafca tcaaagagaatcaatgatccaa3';
其中，斜體為干擾PDS基因的amiRNAs的靶序列，小寫灰色陰影部分為與反擴供體骨 架載體pDonor319a-gfj)的PCR產物的15nt同源區，下劃線部分為與miR319a環序列的退火 序列。以質粒pDonor319a-g^為模板，利用引物pD319a-l和pD319a-2進行PCR擴增，以 帶有完整miR319a序列的質粒為模板，利用引物p319a-PDSl和p319a-PDS2進行PCR擴增， 獲得的兩種PCR產物經乙醇沉淀后按1: 5-10的比例混合，然后轉化大腸桿菌DH1鄰感受 態細胞，篩選獲得的重組質粒，即為含有干擾PDS基因的靶序列的amiRNAs表達單元的供 體質粒。實驗結果表明，陽性克隆率大于80%。
2) amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上
首先構建一個植物amiRNAs受體骨架載體在植物雙元載體pCAMBIA2300的多克隆位 點處引入一 p/j^基因表達單元，同時該p/!M基因表達單元兩端攜帶酶切位點及與供體 載體pDonoi319a-gQ)中的amiRNAs表達單元兩端同源的50bp序列，獲得植物雙元受體載體 pR-2300。
采用接合輔助的遺傳整合克隆(MAGIC)的方式(操作步驟同實施例1)，將amiRNAs 表達單元克隆到植物雙元載體上，獲得含有攜帶干擾PDS基因的靶序列的amiRNAs表達單元 的植物amiRNAs表達載體。實驗結果表明，獲得植物amiRNAs表達載體的陽性克隆率達到 100%。
權利要求
1.一種快速高效的植物人工微RNA表達載體構建方法，其特征在于步驟為一)含amiRNAs表達單元的供體質粒的構建1)選擇并改造供體骨架載體，在miRNA5’與3’側翼序列之間克隆一篩選標記基因或報告基因表達單元，在5’側翼序列的前面添加一個控制植物amiRNAs表達的啟動子，在3’側翼序列的后面添加一終止子序列，得到植物amiRNAs的供體骨架載體；2)引物設計，根據在線軟件或相關運算規則，設計針對目的基因進行RNA干擾的靶序列，首先以miRNA的環序列為基礎，設計一條長度與其相同的引物①；然后根據前面所述的amiRNAs的供體骨架載體上miRNA的5’側翼序列和3’側翼序列，設計一對PCR引物②和③，該對引物應該在與amiRNAs供體骨架載體特異性退火的序列5’末端加上已設計的靶序列TS1、TS2，除此之外，引物②還應在5’末端加上與引物①特異性退火的序列LSP1，引物③的5’末端還應加上引物①5’末端的10-15nt序列HR，使兩者末端產生10-15bp的同源序列；3)PCR擴增，利用2)中設計的引物①②③，以前面所述的amiRNAs供體骨架載體為模板，經套式PCR擴增，獲得的PCR產物含有amiRNAs供體骨架載體上的miRNA的側翼序列和干擾目的基因的靶序列，而且PCR產物5’和3’末端分別帶有部分miRNA的環序列，同時PCR產物缺失了amiRNAs骨架載體中的篩選標記基因或報告基因表達單元；4)同源重組轉化篩選，獲得的PCR產物直接轉化大腸桿菌DH10β感受態細胞，在大腸桿菌體內經同源重組自環化，得到含有干擾目的基因的靶序列的amiRNAs表達單元的供體質粒；二)將人工微RNAs表達單元克隆到植物雙元載體上1)選擇并改造受體載體，首先在植物雙元載體上克隆一大腸桿菌條件致死基因表達單元，而且該表達單元兩端分別帶有一個I-SceI酶切位點以及一段與含有amiRNAs表達單元的供體質粒同源的50bp序列，將其轉入大腸桿菌BUN21(pML300)中；2)采用接合輔助的遺傳整合克隆方法將amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上，驗證重組子，選出植物人工微RNA表達載體。
2、 一種快速高效的植物人工微RNA表達載體構建方法，其特征在于步驟為 一)含amiRNAs表達單元的供體質粒的構建1) 選擇并改造供體骨架載體，首先在miRNA 5'與3'側翼序列之間克隆一篩選標記基因 或報告基因表達單元，在5'側翼序列的前面添加一個控制植物amiRNAs表達的啟動子，在3' 側翼序列的后面添加一終止子序列，得到植物amiRNAs的供體骨架載體；2) 引物設計，根據在線軟件或相關運算規則，設計干擾目的基因的靶序列，根據前面所 述的amiRNAs的供體骨架載體上miRNA 5，側翼序列和3，側翼序列，設計一對引物④和⑤； 同時根據該miRNA的環序列，再設計一對引物⑥和⑦，該引物應該在與所選用的植物miRNA 的環序列特異性退火的序列5'末端依次加上已設計的靶序列TS1、 TS2，以及引物④和引物 ⑤的5，末端的10-15nt序列HR1、 HR2，使兩PCR產物末端分別產生10-15bp的同源序列； 3) PCR擴增，利用2)中設計的引物④和⑤，以前面所述的amiRNAs供體骨架載體為模 板，進行PCR擴增；利用引物⑥和⑦，以含有所選用的植物miRNA的環序列的載體為模板， 進行PCR擴增；4) 同源重組轉化篩選，獲得的兩種PCR產物經乙醇沉淀后按1: 5 10比例混合轉化至 大腸桿菌DH10P感受態細胞，在大腸桿菌體內經同源重組后，得到含有干擾目的基因的靶序 列的amiRNAs表達單元的供體質粒；二)人工微RNAs表達單元克隆到植物雙元載體上1) 選擇并改造受體載體，首先在植物雙元載體上克隆一大腸桿菌條件致死基因表達單元， 而且該表達單元兩端分別帶有一個I-5bel酶切位點以及一段與含有araiRNAs表達單元的供體 質粒同源的50bp序列，將其轉入大腸桿菌BUN21 (pML300)中；2) 采用接合輔助的遺傳整合克隆方法將amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上，驗 證重組子，選出植物人工微RNA表達載體。
3、 根據權利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表達載體構建方法，其特征 在于采用接合輔助的遺傳整合克隆方法將amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上的具體 操作步驟如下a) 將構建的攜帶有包含amiRNAs表達單元的供體質粒的大腸桿菌DH1鄰接種于含有氨芐 青霉素(Amp) 100ug/ml、葡萄糖0.2%的LB平板，將含有植物雙元受體載體的大腸桿菌 BUN21 (pML300)接種于含有卡那霉素50 u g/ml、壯觀霉素50 u g/ml和葡萄糖0.2%的LB平 板，于3(TC過夜培養；b) 挑取已長出的單菌落接種于5ml相應的液體培養基過夜培養；c) 第二天，分別于4000rpm室溫離心5min，收集菌體，將收集的兩種菌體分別重懸于 lmlLB液體，重復上述離心重懸操作1-3次，將兩種菌體各取40ul分別加入到兩支不同的 試管中，試管內含有2ml添加了 0.2M鼠李糖的LB培養基，于3(TC搖2小時左右，使兩試管 中菌體的OD腳值達到0. 15 ~ 0. 25;d) 1: l混合上述兩種菌體，加阿拉伯糖使其終濃度為0. 2%，混勻后，37'C靜置2小時， 然后37'C搖床培養2小時；e) 將上述菌體涂布于含有氨芐青霉素100u g/ml、卡那霉素50 w g/ml的LB固體平板， 42X:過夜培養；f) 挑取單菌落，驗證重組子，選出植物人工微RNA表達載體。
4、 根據權利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表達載體構建方法，其特征 在于將amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上的方法還可以通過傳統的酶切連接的方法 或者Gateway重組的方式來實現。
5、 根據權利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表達載體構建方法，其特征 在于構建的含有植物amiRNAs表達單元的載體所用到的載體可以是能在大腸桿菌體內復制的 所有載體。
6、根據權利要求1或2所述的快速高效的植物人工微RNA表達載體構建方法，其特征 在于所述的植物amiRNAs表達載體包括以所有植物miRNA結構為骨架構建的含有植物 amiRNAs表達單元的載體；控制植物amiRNAs表達的啟動子可以是組成型、誘導型、細胞 或組織特異性啟動子。
全文摘要
本發明提出了一種快速高效的植物人工微RNA(amiRNAs)表達載體構建方法，它是通過以下兩大步驟完成的。一)含amiRNAs表達單元的供體質粒的構建1)選擇并改造供體骨架載體，2)引物設計，3)PCR擴增，4)同源重組轉化篩選；二)將amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上1)選擇并改造受體載體，2)采用接合輔助的遺傳整合克隆方法將amiRNAs表達單元克隆到植物雙元載體上，驗證重組子，選出植物amiRNAs表達載體。在改造供體骨架載體和受體載體時，分別克隆了篩選標記基因或報告基因表達單元和大腸桿菌條件致死基因表達單元。本發明不需要酶切連接反應，也不需要對載體或目的片段進行特殊處理，整個過程操作簡單方便，實驗周期短，重組效率高，能夠快速、高效、零背景、高通量地構建植物amiRNAs表達載體。
文檔編號C12N15/29GK101368188SQ20071005356
公開日2009年2月18日 申請日期2007年10月16日 優先權日2007年10月16日
發明者紅 嚴, 馬立新 申請人:湖北大學