專利名稱：：花生轉基因的方法
技術領域：
：本發明屬于生物工程領域，涉及一種花生轉基因的方法，該方法適用于所有的花生品種、品系或種質資源材料。
背景技術：
：植物轉基因技術通過各種不同的轉化系統，把從動物、微生物、病毒或植物等中分離到的目的基因(外源基因)，通過各種方法轉移到受體植物的基因組上，使得外源基因在受體植物中穩定遺傳，并賦予植物新的農藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產、優質等。花生是我國主要的油料作物，富含油脂和蛋白。利用生物工程和轉基因的手段進行品種改良和遺傳學研究是花生基因工程的重要內容。自1993年獲得第一例轉基因花生以來(Ozias-AkinsP,SchrmllJA，AndersonWFetal.Regenerationoftransgenicpeanutplantsfromstablytransformedembryogeniccallus.PlantScience,1993,93:185-194)，花生的基因轉化方法得到很多改進(許澤永，花生轉化和再生研究進展。農業生物技術學報，2001，9(2):107-111)。花生的轉化方法可以分為基于組織培養的基因轉化和非組織培養的基因轉化。基于組織培養的基因轉化是以外植體和源于之的培養物為轉基因受體。這些外植體包括成熟胚或無菌苗的胚軸、子葉、幼葉，未成熟胚及其胚軸、子葉等，源于之的培養物主要分為不定芽發生培養物和體細胞胚發生培養物。這些受體接受外源DNA的主要方法為農桿菌介導基因轉化、基因槍介導基因轉化。轉化后都要經過組織培養篩選抗性的轉化系和再生抗性轉化植株過程。此過程需要無菌環境、人工光照和控制溫/濕度等培養條件，一般受到基因型、外植體類型、受體狀態、培養篩選和再生植株方法和條件等很多因素的影響，因此高效組培植株再生技術是基于組織培養的基因轉化必要的前提條件之一。以上述不同花生器官、組織為外植體，通過器官發生和/或體胚發生途徑再生植株均獲得成功，隨著再生和轉化技術的進步，目前形成兩種主要花生基因轉化技術體系。農桿菌介導基因轉化以花生幼苗嫩葉、種子子葉為外植體誘導的不定芽發生培養物，通過卡那霉素篩選、器官發生再生轉化植株；基因槍介導轉化以未成熟胚(子葉)和成熟種胚、胚小葉為外植體誘導的胚性愈傷，通過潮霉素篩選獲得抗性轉化體胚，再生轉化植株。這均建立在比較成熟的器官和體胚發生再生植株研究的基礎上。以幼葉、胚小葉和子葉為外植體的器官發生植株再生技術研究。在80年代獲得成功的基礎上，致力于提高植株再生效率。Mckently等(McKentlyAH，MooreGA.GardnerFP.Regenerationofpeanutandperennialpeanutfromculturedleaftissue.CropScience,1991，31(3):833-83)以花生品種Florigiant8d齡苗幼葉為外植體，比較不同BA濃度，以5mg/LBA(芐氨基嘌呤)和lmg/LNAA(a-萘乙酸)MS培養基最優，90%以上外植體長出愈傷，其中38%長出芽點。轉至5mg/LBAMS培養基，84%長出枝條，平均每個外植體1-3個枝條。Eapen等(EapenS，GeorgeLPlantregenerationfromleafdiscsofpeanutandpigeo叩ea:influenceofbenzyladenine，indoleaceticacidandindoleaceticacid_aminoacidconjugates.PlantCellTissueandOrganCulture,1993，35(3):223-27)以花生10-12d苗齡幼葉為外植體，在含10MMBA和0.5MMIAA(口引哚乙酸)MS培養基中，約1/3外植體長出枝條，平均每個外植體長出枝條7個。Livingstone禾口Birch(LivingstoneDM,BirchRG.Plantreganerafionandmicroprojectile-mediatedgenetansferinembryonicleafletsofpeanut.Clrac/人s1/yp。卵esL.)AustralianJournalofPlantPhysiology,1995，22:585-591)以成熟種子胚小葉為外植體，在3mg/L,BA和lmg/LNAAMS培養基培養6周。參試兩品種分別有50%和66%外植體長出愈傷和芽點，平均芽點數分別為9.4和13個；轉移到5mg/LBAMS培養基有助于枝條長出，平均每個外植體5個枝條。國內，方小平等(方小平，許澤永，張宗義等.花生小葉外植體植株再生及農桿菌介導的基因遺傳轉化。中國油料，1996，18(4):52-5)以鄂花4號等3個品種4d齡苗幼葉為外植體，應用Livingstone方法。外植體愈傷誘導率提高到86-100%，平均再生植株達到了5個。Sharma(SharmaKK.AnefficientmethodfortheproductionoftransgenicplantsOirac/L/s/j^pogaesL.)through4§roZacterii//z7z^/we/aciennnediatedgenetictransformation.PlantScience,2000，159(1):7-19)以成熟種子子葉為外植體，在含20,BA和10HM2，4-D(2,4-二氯苯乙酸)MS誘導培養基上從子葉節傷口處誘導出大量芽點。隨后通過含2南BA枝條伸長培養基獲得枝條。90%以上外植體長出芽點。平均每個外植體獲得4-8個枝條。以未成熟胚(子葉)和成熟種胚、胚小葉為外植體的體胚發生再生植株技術。0zias—Akins(Ozias-AkinsP.Plantregenerationfromimmatureembryosofpeanut.PlantCellR印orts，1989,8:217-218)以未成熟胚為外植體，在含0.5-2.0mg/LPiclor柳(4-氨基-3,5,6-三氯吡啶-2-甲酸，毒莠定)的培養基中。50-60%的外植體誘導形成體胚，并獲再生植株。進一步研究表明在含0.5mg/LPicloramMS培養基中，未成熟子葉比胚軸誘導形成的體胚易于再生；胚性愈傷轉到含3mg/Lpicloram的培養基可以長期保存即獲得重復體胚發生培養物。體胚再生植株，先后通過含lmg/LNAAMS培養基以及含0.1mg/LBA和0.lmg/LNAAMS培養基培育。再轉到含3mg/LBA和1mg/LGA(赤霉素)培養基促使莖伸長，一次實驗獲得913個枝條(0zias-AkinsP,SchrrallJA，AndersonWFetal.Regenerationoftransgenicpeanutplantsfromstablytransformedembryogeniccallus.PlantScience,1993,93:185-194)。Hazara等(HazraS，etal.Directsomaticembryogenesisinpeanut(yirac力is1/y73。gea)Biotechnology.1989，7:949-95)以含3mg/L2,4-DMS培養基，誘導未成熟種胚直接形成體胚，每個外植體產生8-15個體胚。Baker等(BakerCM,BurnsJA，WetzsteinHY.Influenceofphotoperiodandmediumformulationonpeanutsomaticembryogenesis.PlantCellReports,1994，13(3-4):159-163)，Baker禾卩Wetzstein(BakerCM,WetzsteinHY.Repetitivesomaticembryogenesisinpeanutcotyledonculturesbycontinualexposureto2,4-D.PlantCellTissueOrgCult,1995，40:249-254)以20mg/L2，4-D誘導未成熟胚子葉形成體胚效果最好并可獲得重復體胚發生培養物；光強度和暗培養對體胚形成效率沒有影響，但對體胚形狀影響很大。光培養條件下形成的體胚粗糙、木質化，難于分離；而暗培養形成的體胚，光滑、易于分離。由于末成熟種胚的取材受到限制，從土中取出的莢果和胚極易污染等缺點。因此，各國科學家分別以成熟種子為材料開展研究。Chengalrayan等(ChengalrayanK，SathayeSS，HazraS.Somaticembryogenesisfrommatureembryo-derivedleafletsofpeanutGirac力i51/yp0卵e3U.PlantCellReports,1994，13(10):578-581)以胚小葉為外植體，在含20mg/L2,4-DMS培養基上誘導胚性愈傷，轉到含3mg/L2,4-D的培養基上20d內有90%的愈傷產生體胚。Baker等(BakerCM,DurhamRE，BumsJA，etal.Highfrequencysomaticerabryogenesisinpeanut(Arac/w'sL)usingmature,dryseed.PlantCellReport,1995，15:38-42)用源于成熟種胚的外植體誘導胚性愈傷和體胚，以20mg/L2,4--D暗培養最優，96%外植體產生體胚，平均每個外植體產胚7.6個，而品種間體胚誘導量有明顯差異。Livingstone等(LivingstoneDM,BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanut(ylrac/i51/"osesL.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43-51)進一步完善誘導條件，在含5mg/LpicloramMS培養基上暗培養6周，珍珠豆型品種Gajah每個種胚平均產生6.3體胚，普通型品種NC-7平均產生14.3個體胚。并應用滲透劑干燥處理，使得體胚再生植株率提高到60%。Chengalrayan等(ChengalrayanK，MhaskeVB，HazraS.High—frequencyconversionofabnormalpeanutsomaticembryos.PlantCellReports,1997，16:783-786)通過含8.9幽BA和14幽KT(激動素)MS培養基，或含22.7MMTDZ(噻二唑苯基)MS培養基培育，使體胚再生植株效率分別提高到86%和92%。國內，鄧向陽和衛志明(鄧向陽，衛志明.幼胚長度、2，4-D濃度、光強度等對花生體細胞胚發生的影響及高效再生系統的建立。植物生理學報，2000，26(6):525-531)以我國花生品種粵油116、魯花9號幼胚為材料通過含5-40mg/L2，4-D培養基上胚性愈傷率達75%以上，平均產胚量3個以上，并易再生植株。晏立英等(晏立英，陳坤榮，羅莉霞，許澤永，張宗義，方小平，陳金香。BirchRG，DieztgenRG.花生體胚誘導和植株再生研究。中國油料作物學報，2000，22(3):9-12)以我國花生品種鄂花4號為材料，成熟種胚為外植體，無論是20mg/L2，4-D或5mg/LpicloramMS培養基上胚性愈傷率達55-78%。平均產胚量4個。13個品種體胚誘導率6.0-83.3%。產胚量1.2-4.5個，差異顯著。8個品種體胚技條再生率達36.3-77.8%。農桿菌介導轉化通過器官發生再生轉化植株研究。巴西Lacorte等(LacorteC,MansurE，TimmermanB,etal.Genetransferintopeanut(Arac/w'51力j7o卵eaL)by4§ro^3cte/\z'"yz7t〃膨/acie/AS1.PlantCellReports,1991，10:354-357)，我國萊陽農學院分別報道農桿菌對花生有侵染力(DongJ，BiY,XiaL，etal.TeratomainductionandnopalinesynthasegenetransferinPeanut.ActaGeneticaSinica,1990,17(1):13-16)。前者測定4個農桿菌菌株，依據莖傷口接種致瘤數量和大小。以A281菌株致病力最強，Bo542和A208菌株次之，T37最差。后者僅用T37菌株接種41個花生品種和材料，僅6個產生腫瘤，也證實了T37菌株致病力弱。Mckently等(McKentlyAH，MooreGA，DoostarH，NiedzRP.Agrobacterium~mediatedtransformationofpeanutdac/w's/"o卵esL.)Embryoaxesandthedevelopmemoftransgenicplants.PlantCellR印ots，1995，14:699-703)測定5個菌株對花生致病力，以A281菌株最強，C58、A518和B6之，T37最弱。Mansur等(MansurEA，LacortC，FreitasGetal.Regulationoftransformationefficiencyofpeanut(/irac/is力/P。卵eaL.)explantsbyAgrobacteriumtumefaciensPlantScience,1993，89:93-99)以A281菌株優化轉化條件，共培以固體培養基好于液體，嫩葉外植體好于帶胚或不帶胚子葉，7-10d苗齡好于苗齡低的嫩葉，嫩葉前端外植體好于基端，接種菌合適濃度為l-5xl09,接種前丁香酮(AS)處理沒有提高致病力的作用。印度Eapen禾口George(EapenS，GeorgeL.y^ro力acteri"歷t"/77e/acj'e/76"mediatedgenetransferinpeanutC4^a(^力J^s■/7j70^aeaL.).Plantcellr印orts,1994，13:582-586)首次報道通過農桿菌轉化獲得轉基因花生植株。他們以9-10d苗齡嫩葉為外植體與含雙元質粒pBI121的農桿菌LBA4404菌株共培3d，50-100mg/L卡那霉素篩選，獲得抗卡那霉素、0-葡糖苷酸酶(GUS)活性陽性的轉基因花生。在溫室內20株轉基因花生植株均能開花，但僅3株結實，所結種子皺縮，末充分成熟。分子檢測證實外源基因已整合到花生基因組。美國ChengMing等(ChengM，JarretRL,LiZ，XingA，DemskiJW-ProductionoffertiletransgenicpeanutCirac/w'51力y/o卵eaL)plantsusing4§^o6scferiifflt"歷e/^cie"s.PlantCellReports,1996，15:653-657;ChengM，JarretRL,LiZ,DemskiJW.Expressionandinheritaneofforeigngenesintransgenicpeanutplantsgeneratedby4§ro63"eri"/zrmediatedtransformation.PlantCellReports,1997，16:541-544)報道通過農桿菌轉化獲得5個獨立的轉化系，共52株轉基因植株，并首次得到成熟T,代種子及后代。他們以花生10d齡苗嫩葉為外植體，與含PBI121雙元質粒的EHA101菌株共培2d，150mg/L卡那霉素篩選。用煙草葉片提取液處理農桿菌后接種，提高了GUS活性瞬間表達。轉化效率達0.2-0.3%。在T2代轉基因花生植株中，GUS基因或百分之百表達，或3:1的比例分離，證實外源基因巳整合進基因組并在后代穩定表達。同一實驗室的LiZhi-jian等(LiZJ,JanetRL,DemskiJ.EngineeredresistancetotomatosporedwiltvirusintransgenicpeanutexpressingtheviralnucleocapsidganeTransgenicResearch,1997,6:297-305)改進上述方法用繁殖中期(O.D,=0.8-l.O)的農桿菌接種。隨后頭孢霉素從300mg/L降到100mg/L，卡那霉素降到IOOmg/L，結果縮短了獲得枝條所需時間，轉化效率提高到1.5%。他們獲得轉番茄斑萎病毒殼蛋白編碼基因N(TS群一N)基因花生植株，Southern分子雜交證實/57^-/\^基因己整合進花生基因組，在花生植株內的表達。對T2代轉基因花生抗性鑒定，轉基因花生植株接種葉癥狀比對照推遲約一周，褪綠斑明顯減少。接種30d后，所有對照花生均出現典型TSWV病害癥狀，而轉基因花生植株未出現系統癥狀，長勢同花生健株相似。國際半干旱熱帶地區作物所Sharma禾口Anjaiah(SharmaKK.Anefficientmethodfortheproductionoftransgenicplants(AracjWs/^po卵朋L.)through4^ro63cte/"/鵬t"膨/acie"nnediatedgenetictransformation.PlantScience,2000,159(1):7-19)用農桿菌C58(disarmed)菌株轉化成熟種子子葉外植體，通過125mg/L卡那霉素篩選，產生55%轉基因植株，移栽到溫室內獲得75個獨立的轉化系。Southernblot雜交證實外源基因已整合進基因組。國內方小平等(方小平，許澤永，張宗義等.花生小葉外植體植株再生及農桿菌介導的基因遺傳轉化。中國油料，1996,18(4):52-5;方小平，許澤永，張宗義，晏立英，陳坤榮，羅莉霞，陳金香，BirchRG，DieztgenRG.GUS基因和NPTII基固在轉基因花生后代的遺傳研究.花生科技，1999，(增刊)241-245)花生品種鄂花4號4d齡苗嫩葉作外植體，與AGL1菌株共培，經卡那霉素篩選獲得轉基因花生。轉基因花生在溫室內開花結實.獲得L代種子。外源基因表達通過卡那霉素抗性和GUS活性組織化學檢測得到證實。對轉基因TrT3后代分析表明GUS基因以1:1和3:1比例分離，隨代數增加，3:1分離比例增加。T3代可選擇到GUS基因純合單株。基因槍介導轉化胚性愈傷組織或幼胚，通過體胚再生轉化株研究。美國0zias_Akins等(Ozias-AkinsP,SchrmllJA,AndersonWFetal.Regenerationoftransgenicpeanutplantsfromstablytransformedembryogeniccallus.PlantScience,1993,93:185-194)首次報道用基因槍轉化胚性愈傷組織，經過潮霉素(固體-液體培養基)篩選，得到轉化植株。他們以未成熟種子子葉和胚作外植體。在含0.5mg/Lpicloram的MS培養基上誘導體胚和胚性愈傷，再轉移到含3mg/LpicloramMS培養基上暗培養長期保存。保存1-2年的胚性愈傷組織為轉化對象，通過基因槍轟擊，將含潮霉素抗性基因和&s基因的質粒導入。5周后，在含5-10mg/L潮霉素固體培養基上篩選2輪4w，再通過20mg/L潮霉素液體培養基2w連續篩選，每次轉化實驗獲得2個轉基因的胚性愈傷細胞系，約1%的愈傷組織經轉化后獲得一個穩定的轉化細胞系。轉化細胞系再生獲得100株花生植株。PCR擴增和Southern分子雜交證實外源基因已整合進花生基因組。在同一實驗中，采取固體連續篩選中可獲得抗性轉化細胞系，但未獲得再生植株，并認為液體篩選更快、有效。該實驗室采用類似改進的轉化(全液體培養基)篩選系統有多個報道Wang等(WangAM，FanHL，SingsitC，0zias-AkinsP.TransformationofpeanutwithasoybeanvspBpromoter-uidAchimericgeneI.OptimizationofatransformationsystemandanalysisofGUSexpressioninprimarytransgenictissuesandplants.PhysiolPlant,1998,102:38-48)用3個花生品種為材料，每次基因槍轟擊4.9cm2大小愈傷，轟擊后1-4d含10mg/L潮霉素液體培養基篩選lw，再20mg/L潮霉素液體培養基篩選6w,共獲得160個抗潮霉素細胞系，其中從38個細胞系中獲得200株轉基因植株，但19個細胞系79株植株開花、結實，他們認為可能是胚性憊傷保存過久引起染色體異常的緣故。Singsit等(SingsitC，AdangMJ",LynchRE,AndersonWF,WangAM,CardineauG,Ozias-AkinsP.ExpressionofaBacillusthuringiensiscryIA(c)geneintransgenicpeanutplantsanditsefficacyagainstlessercornstalkborer.TransgenRes.1997，6:169-176)報道通過基因槍轉化，將基因導入花生胚性愈傷。每次基因槍轟擊平均獲得0.5個抗潮霉素轉基因細胞系,8次實驗平均每次獲得4.8個潮霉素抗性細胞系，再生獲得119株轉基因植株。PCR和Southern分子雜交證實^TCrj^M基因和力p力基因巳整合進花生基因組。通過酶聯免疫實驗證實Gr/i^^;基因在花生植株內表達，CryIA(c)蛋白占整個可溶性蛋白的0.18%。非洲蔗螟(j57a幼7叩a7/wsh'"卵se77"sZe77e力詞養實驗證實轉基因花生具有抗蟲性，飼喂轉基因花生非洲蔗螟幼蟲由完全致死到減重66%。該實驗室同時獲轉Tswv核表殼蛋白N基因花生(YangH，SingsitC，WangA，GonsalvesD，0zias-AkinsP.Transgenicpeanutplantscontaininganucleocapsidproteingeneoftomatospottedwiltvirusshowdivergentlevelsofgeneexpression.PlantCellR印，1998,17(9):693-699)。美國另一實驗室(MagbanuaZV，DaytonWildeH,RobertsJK，ChowdhuryK，AbadJ,MoyerJW,WetzsteinHY，ParrottWA(2000)FieldresistancetoTomatospottedwiltvirusintransgenicpeanut(ArachishypogaeaL.)expressinganantisensenucleocapsidgenesequence.MolBreeding6:227-236)以源于成熟種胚的外植體2，4-D誘導重復體胚發生培養物(液體)，基因槍轟擊后8d開始液體培養基篩選獲轉Tswv核表殼蛋白N基因花生，大田實驗表現Tswv抗性。澳大利亞Livingstone禾卩Birch(XivingstoneDM，BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanut(Arac力is力"o3ev3L.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43-51)以源于成熟種胚的外植體picloram誘導體胚和胚性愈傷。用分別含報告基因w'W和篩選基因(力/力)的質粒包裹鎢粉，每次基因槍轟擊10cm2大小胚性愈傷，轟擊后2周后開始20mg/L潮霉素(固體培養基)篩選可獲得轉化體胚。每次轟擊獲得3-6個獨立的轉化系。轟擊后6個月，獲得再生轉化植株。約有50%的轉化系同時獲得報告基因和篩選基因表達。Southern分子雜交證實外源基因已整合進T,代轉基因花生基因組。國內，許澤永等(許澤永，陳坤榮，晏立英，羅莉霞.張宗義，方小平，陳金香，DietzgenRG，BirchRG.花生體胚誘導、植株再生和基因槍介導遺傳轉化。《二十一世紀農業生物技術展望論壇》論文摘要集，1999:58-59)以我國花生品種"中花3號"為材料，采用上述轉化技術，獲得16個獨立的抗潮霉素體胚，并再生植株。PCR擴增和生物學測定表明，其中9個已導入抗潮霉素基因，5個同時導入花生條紋病毒CP基因。DengXiang-Yang等(DengXY，WeiZM，AnHL(2001)Transgenicpeanutplantsobtainedbyparticlebombardmentviasomaticembryogenesisregenerationsystem.CellRes,11(2):156-160)以我國花生品種粵油116、魯花9號幼胚為靶材料通過基因槍介導轉化含潮霉素抗性基因和GUS基因的質粒pCAMBIA1301后，于含2,4-D培養基中恢復誘導胚性愈傷10d后，在含10-20mg/L潮霉素固體培養基篩選4w，再經20mg/L潮霉素液體培養基篩選6w，得到抗潮霉素體胚并再生植株。PCR和Southern分子雜交證實外源基因已整合進花生基因組。綜合上述，國外美國、澳大利亞、印度及國際半干旱熱帶地區作物研究所相關實驗室已分別建立花生轉化和再生技術。美國率先獲得轉基因抗病、抗蟲花生。國內部分實驗室也已初步建立起花生轉化和再生技術，分別通過農桿菌和基因槍介導的基因轉化獲得轉基因花生。但是，目前無論是農桿菌還是基因槍介導的基因轉化均存在轉化和再生效率低、基因型限制、嵌合體和逃逸的問題。就農桿菌介導基因轉化技術來說。轉化和再生效率受花生品種影響(基因型影響)較大，嵌合體和逃逸問題嚴重，轉化率不高；但其優點是所需時間短，從外植體與農桿菌共培到獲得轉化植株，一般只需6個月。基因槍介導轉化雖然受花生品種因素影響相對小，轉化率仍低，雖嵌合體和逃逸問題不嚴重，但仍有少量逃逸嵌合體。其缺點是需要一定設備條件，同時從外植體準備到獲得轉化植株需要12個月，耗費人力、物力，且易產生體細胞變異，造成再生植株開花而不結實。因此，上述技術均需要進一步完善。非組織培養的基因轉化方法。不通過組培，直接轉化成熟種胚或種胚生長點獲得轉化植株的報道。美國Mckently等(McKentlyAH，MooreGA，DoostarH，NiedzRP.Agrobacterium—mediatedtransformationofpeanut(Arac力J's々KPO卵朋L)Embryoaxesandthedevelopmemoftransgenicplants.PlantCellR印ots，1995，14:699-703)報道將保留一片子葉的種胚劃傷接種EHA101菌株，直接播于消毒土內，由種胚接種后直接長出轉化株，獲得轉基因花生植株。實驗用花生品種Florigiant800粒種胚，約120粒種胚存活長出植株，其中11株花生有一片或更多葉片表達GUS活性，10株獲得種子。PCR和Southern分子雜交證實外源基因己整合進花生基因組。其中11號株為嵌合體，L代20株苗，GUS活性陽性3株。丁2代植株GUS基因遺傳符合3:1的分離規律。印度Rohini等(RohiniVK.RaoKS.Transformationofpeanut(Arac力j's力y/x卵eaL):anon-tissueculturebasedapproachforgeneratingtransgenicplants.PlantScience,2000，150:41-49)報道用LBA4404菌株采用相同接種技術，獲得轉基因花生。優化條件實驗表明，在農桿菌菌液中加入煙草汁液，與花生種胚共培16h可以增加轉化效率，獲得3.3%的轉化植株，并通過分子雜交證實外源基因已整合進花生基因組。Brar等(BrarGS，CohenBA,VickCL，JohnsonGW.Recoveryoftransgenicpeanut(^rac力/51力j70卵eaL)plantsfroraelitecultivarsutilizingACCELLtechnology.PlantJournal,1994，5(5):745-753)報道成熟種胚頂端分生組織，經基因槍用包被含Aar和番茄斑萎病毒外源基因的金粉轟擊，3_4周后95%的外植體直接伸長出枝條，枝條數量平均5個。通過GUS活性檢測篩選轉化枝條，結果說明，供試的兩個品種，嵌合的轉化枝條分別為8.8%和6.4%，GUS活性全株均勻表達的分別為2-3%和0.6%，分別獲得8和3個轉基因系。Southern分子雜交證實外源基因己整合到和T。^代轉基因花生植株的基因組。不通過組培，通過農桿菌和基因槍轉化成熟種胚，由生長點直接獲得轉化植株獲得成功。該項技術不需要組培設備，技術簡單，并可縮短選育時間。問題是嵌合體問題嚴重，篩選純合轉化株工作量大。通過導入抗除草劑的^9r基因，可以用除草劑篩選，提高篩選效率。國內一些實驗室應用花粉管通道技術將外源基因導入花生，已獲得不少經驗，因為是種質系統轉化法，以生殖器官或細胞為受體，直接利用植物受體本身的有性生殖過程或者種子發育過程，既免除了離體再生的組織培養，又縮短了獲得可遺傳轉基因種子的時間，值得進一步深入研究。綜上所述，不管是基于組織培養的基因轉化法，還是非組織培養的轉化法，都存在著轉化和再生效率低、基因型依賴、存在逃逸、嵌合體問題、從轉化到獲得轉基因(純合)種子的周期長、工作量大等缺點中的一項或幾項。目前還沒有一種花生轉基因方法實現了高通量、高效率轉化并解決逃逸、嵌合體問題，
發明內容本發明的目的是在于提供一種花生轉基因的方法，解決目前常用的花生遺傳轉化方法中轉化效率低，通量小，依賴基因型，存在逃逸，嵌合體等問題，該方法不僅轉化效率高、通量高、不存在基因型依賴，而且篩選效率高，避免了逃逸，嵌合體的問題。本發明提供的轉化體系有望解決相關技術瓶頸。發明人為了實現高通量、高效率的花生基因轉化，發明了花生轉基因技術。本發明的技術解決方案是以源于成熟種子胚軸上部的重復體細胞胚發生培養物為轉基因受體。在建立各類型花生的重復體細胞胚發生培養物及再生植株系統基礎上，確定了基因槍轉化的各條件組合。在各條件組合下，使攜帶外源基因(如潮霉素抗性、草銨膦抗性、草甘膦抗性等各種篩選標記基因和其它目的基因)的DNA轉化重復體細胞胚發生培養物細胞，在轟擊1-IO天后通過含致死濃度的篩選劑(如20mg/L潮霉素Hygromycin)的半固體培養基連續篩選獲得獨立的抗性細胞系后，無篩選下再生獲得轉基因花生植株T。代苗，及轉基因的L代合子(種子)。進行分子生物學方法(如PCR)篩選和分析(如Westernblot)表明外源基因穩定整合、表達遺傳。本發明可采用保存0-6年的成熟花生種子誘導的，啟始培養后l-10個月的重復體細胞胚發生培養物為轉基因受體；轉基因效率(所有實驗平均效率是每轟擊平均獲得約15.7個獨立的抗性細胞系)明顯提高，是以往報道的相似方法的最好效率(最好條件下為3-6獨立的抗性細胞系/每轟擊，Livingstone和Birch,EficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanutCirac力j's力ypoaeaL.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43-51)的至少3倍以上，轉化通量高；篩選效率高，無逃逸，無嵌合體；不存在基因型依賴，且再生植株高效容易；可大量獲得轉基因后代種子，且外源基因可穩定整合、表達遺傳。這一轉基因方法，可以適用于所有花生品種或品系或種質資源材料，涉及的篩選標記基因和其它目的基因也不僅限于實施例陳述用的潮霉素抗性基因和人5cJ-W。一種花生轉基因的方法，包括下列步驟一、建立各類型花生的重復體細胞胚發生培養物保存0-6年的各類型(如蘭娜/弗吉尼亞型、西班牙型、中間型或品系或種質資源材料等)花生的成熟莢去殼，種仁乙醇表面消毒，然后NaOCl消毒，重蒸餾水3-5次漂洗。無菌條件下去掉種皮。成熟胚胚軸上部接種于含生長素的SEM培養基(體胚發生培養基，MS鹽，B5維生氣0.088M(3%)蔗糖，12.42pM(3mg/L)picloram禾卩0.8%瓊脂，調pH5.8，121°C滅菌15分鐘后，適當溫度控制在(55-60°C)時補充過濾滅菌6.84pM(1g/L)的谷氨酰胺)。培養皿28'C黑暗培養20-30天。每2-4周轉移體胚和胚性愈傷到新SEM培養基中繼代培養]-10個月獲得重復體細胞胚發生培養物。在本發明實施例陳述中主要使用M左治亞綠'品種實驗數據，但本發明不限于此花生品種及類型。二、外源DNA或基因構建在適當的植物表達框中并可在同一或不同載體上，抽提、純化外源基因植物表達框(DNA片段)或載體(質粒)和確定其濃度在本發明陳述的程序中，待轉化的外源DNA是各種篩選標記基因和目的基因。篩選標記基因可為植物表達載體攜帶的潮霉素抗性、草銨膦抗性、草甘膦抗性等篩選標記基因植物表達框。基因植物表達框包括基因編碼序列和在植物中調控基因表達的基本元件，一般為啟動子基因編碼序列轉錄終止子。植物表達載體可為pCAMBIA系列和pRT系列等。待轉化的外源目的基因為植物病原菌抗性基因、作物品質和產量等相關基因，可為人Ac7iZ基因；擬南芥Zffi57—y基因；花生/^Z^基因；花生力raA基因等(人Sc7-x7基因，DickmanMB，ParkYK，OltersdorfT,LiW，ClementeT,FrenchR.Abrogationofdiseasedevelopmentinplantsexpressinganimalanti鄰optoticgenes.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98:6957-6962;擬南芥jW67-v基因，Deslandes，L，Olivier,J.,Peeters,N.,Feng,D.X.，Khounlothara,M.,Boucher,C-,Somssich,I.，Genin，S.andMarco,Y.PhysicalinteractionbetweenRRS1-R:aproteinconferringresistancetobacterialwilt,andPopP2，atypeIIIeffectortargetedtotheplantnucleus.Proc.NatlAcad.Sci.USA,2003，100,8024-8029.;花生/^Z^基因，JungS,SwiftD，SengokuE，PatelM,Teul，F，PowellG，MooreK，AbbottA(2000b)Thehigh-oleatetraitinthecultivatedpeanut[ArachishypogaeaL].I.Isolationandcharacterizationoftwogenesencodingmicrosomaloleoyl-PCdesaturases.MolGenGenet263:796-805;花生^ra力基因，Viquez,0.M.'Koffi，K.N.,Dodo,H.W.，2003.Structureandorganizationofthegenomiccloneofamajorpeanutallergengene,Arah1.Mol.Immunol.40,565-571.等)。目的基因可通過常規分子克隆方法在適當的植物表達載體上(如pCAMBIA系列，pRT系列)構建目的基因植物表達框。目的基因與篩選標記基因植物表達框可連一起，即構建到同一植物表達載體上；目的基因與篩選標記基因植物表達框也可以分別處于不同植物表達載體上(如pCAMBIA系列，pRT系列)或DNA片段中。外源基因的植物表達框或載體構建、質粒或DNA片段的抽提、純化和確定濃度的具體操作參照常規分子克隆方法(J.薩姆布魯克等著，金東雁等譯，候云德等校，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1998)。在本發明實施例陳述中以潮霉素抗性基因為篩選標記基因，人^"-;^為目的基因，但本發明不限于用潮霉素抗性基因和人5"-W基因。三、微粒轟擊轉化重復體細胞胚發生培養物和篩選獨立抗性細胞系放置重復體胚發生胚性組織在SEM培養基中。準備金微粒懸浮液；金微粒懸浮與含篩選基因和非篩選目的基因的質粒或DNA片段混合。震蕩中依次加入氯化鈣和亞精胺。震蕩懸浮，短暫離心。乙醇漂洗包裹質粒或DNA片段的金微粒，乙醇重懸微粒，重懸微粒滴于金微粒載片(Macrocarrier)。根據Bio-RadPDS1000/He系統說明書進行轟擊。在轟擊后1-10天，被轟擊的胚性組織轉入含相應致死濃度篩選劑(如20mg/L潮霉素)的半固體SEM培養基連續篩選。在篩選約1個月后，仔細地辨認、分離獨立的可能的抗性細胞系。各系組織直接地繼代培養于新鮮的含致死濃度篩選劑的半固體SEM培養基中篩選。在以后各輪篩選，可存活增殖，抗性被證實的獨立系獲得抗性細胞系系號。在篩選之下繼代培養(約1-2個月)增殖抗性細胞系，增殖體胚用于植株再生。在本發明實施例陳述中使用潮霉素抗性基因和潮霉素，以篩選轉基因抗性細胞系，但本發明不限于用潮霉素抗性基因和潮霉素。四、再生植株和傳代抗性細胞系體胚在含植物調節物質的培養基中26°C黑暗成熟。體胚轉移入含細胞分裂素的培養基中，經培養基操作過程1TDZ或3B1G，在16/8小時光周期光照培養(約6w)萌芽。切下至少2cm長的芽于含生長素的培養基生根(約lw)。生根的小植株移入花土中，最后轉移到溫室。在人工生長室按照正常的栽培管理措施管理，收獲L代合子(種子)。按照正常的栽培管理措施對各T,代種子系繼續傳代選育。五、轉基因植株和轉基因后代分子分析分子分析抗性細胞系、再生植株和種子。參照常規方法，從
發明內容二、三、四中不同的抗性細胞系、再生植株和種子獲得適量的愈傷、再生植株葉、種子子葉提取DNA(YangH,SingsitC，WangA,GonsalvesD，Ozias-AkinsP.Transgenicpeanutplantscontaininganucleocapsidproteingeneoftomatospottedwiltvirusshowdivergentlevelsofgeneexpression.PlantCellR印，1998，17(9):693-699)或RNA(YangH，SingsitC,WangA,GonsalvesD,Ozias-AkinsP.Transgenicpeanutplantscontaininganucleoca,psidproteingeneoftomatospottedwiltvirusshowdivergentlevelsofgeneexpression.PlantCellR印,1998,17(9):693-699)或蛋白質(SingsitC,AdangMJ,LynchRE，AndersonWF,WangAM，CardineauG,Ozias-AkinsP.ExpressionofaBacillusthuringiensiscryIA(c)geneintransgenicpeanutplantsanditsefficacyagainstlessercornstalkborer.TransgenRes.1997,6:169-176)。按照常規分子分析方法(J.薩姆布魯克等著，金東雁等譯，候云德等校，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1998)PCR分析初步確定目的基因和篩選基因整合與否。Southernblot分析進一步確定外源基因在抗性細胞系、再生植株和種子中的穩定整合轉化性和轉化事件獨立性(J.薩姆布魯克等著，金東雁等譯，候云德等校，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1998)。Northernblot(YangH，SingsitC,WangA，GonsalvesD，Ozias-AkinsP.Transgenicpeanutplantscontaininganucleocapsidproteingeneoftomatospottedwiltvirusshowdivergentlevelsofgeneexpression.PlantCellR印，1998,17(9):693—699)、Westernblot(J.薩姆布魯克等著，金東雁等譯，候云德等校，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1998)、E1ISA(SingsitC，AdangMJ，LynchRE，AndersonWF，WangAM,CardineauG，Ozias-AkinsP.ExpressionofaBacillusthuringiensiscryIA(c)geneintransgenicpeanutplantsanditsefficacyagainstlessercornstalkborer.TransgenRes.1997，6:169-176)等分析進一步確定目的基因和篩選基因的表達水平、穩定性和傳代遺傳情況。在各代中篩選劑抗性分析進一步確定篩選基因的表達水平、穩定性和傳代遺傳情況。本發明的特點是轉化效率高、通量高、不存在基因型依賴，而且篩選效率高避免了逃逸，嵌合體的問題。本發明的優點主要體現在以下幾個方面本發明提供以源于貯藏0-6年各類型花生的成熟種子胚軸上部建立花生重復體細胞胚發生培養物的方法及體胚再生的培養基操作過程1TDZ和3B1G兩種再生植株方法，均不依賴于花生基因型且高效。在本發明提供的花生轉化方法，對轉化各條件進行分析、優化和組合，達到了提高轉化效率的目的。本發明提供的花生轉化方法效率高是目前報道的類似方法最好條件下最好效率的至少3倍以上，實現了高通量基因轉化。在本發明提供的花生轉化方法中轉化不依賴于花生基因型，即適合任何品種、品系或種質資源材料，克服了農桿菌介導轉化法中基因型依賴問題。本發明中轟擊l-10d后在含致死濃度篩選劑的半固體培養基中啟始篩選，篩選效率高，不僅提高了轉化效率，也避免了目前普遍使用的轉化方法中存在的逃逸和嵌合體問題。本發明獲得的轉基因植株可大量獲得轉基因后代種子，且外源基因可穩定整合、表達遺傳。圖1外源基因表達載體示意圖。目的基因人5"-;^和篩選基因知t均CaMV35S啟動子控制下。圖2重復體細胞胚發生培養物。啟始培養后3個月(4次繼代培養)獲得明顯的花生重復體細胞胚發生培養物。圖3大約1個月篩選后，獨立的可能的抗性細胞系。大約1個月篩選后，一部分胚狀體能變成更大的堅實白色體胚，并且低部通常黑死，和一部分胚狀體能形成新的次級體胚而舊體胚變成棕色(不生長)。這些白色體胚被認為是潛在的潮霉素抗性體胚。其它大多數胚狀體則變棕黑，收縮或解體不可見；圖4從潮霉素抗性細胞系愈傷提取基因組DNA對(非篩選)目的基因5c7-;d編碼區(700bp片段)PCR分析。PCR模板在各反應中空白對照(Nullcontrol)為水；負對照(Negativecontrol)為非轉化培養物愈傷提取基因組DNA;正對照(Postivecontrol)為pRT-66-Bcl，即轉化的質粒DNA。其他各孔為各潮霉素抗性細胞系其愈傷提取基因組DNA(標明了各潮霉素抗性細胞系系號)。約60%的潮霉素抗性細胞系編碼區PCR分析呈陽性，即產生特定的W編碼區700bp片段條帶。同時，所有花生基因組樣品(包括負對照非轉化花生基因組)可產生400bp條帶，表明在此擴增條件下花生基因組自身的400bp片段被擴增。空白對照和正對照均無此400bp條帶。圖5a為再生植株的葉子提取基因組DNA對篩選基因力pt(850bp片段)PCR分析。PCR模板在各反應中空白對照(Nullcontrol)為水；負對照(Negativecontrol)為非轉化培養物愈傷提取基因組DNA;正對照(Postivecontrol)為pRT-66-Bcl，即轉化的質粒DNA。其他各孔為再生植株的葉子提取基因組DNA(標明了各再生植株株號，由各潮霉素抗性細胞系系號加最后植株株號數字段形成)。100%的再生植株力pt篩選基因PCR分析呈陽性，即產生特定的力/^的850bp條帶。即表明了轉化篩選無逃逸。圖5b為再生植株的葉子提取基因組DNA(同樣樣品)對(非篩選)目的基因5cJ-W編碼區(700bp片段)PCR分析。PCR模板在各反應中空白對照(Nullcontrol)為水；負對照(Negativecontrol)為非轉化再生植株提取基因組DNA;正對照(Postivecontrol)為pRT-66-Bcl,即轉化的質粒DNA。其他各孔為再生植株的葉子提取基因組DNA(標明了標明了各再生植株株號，由各潮霉素抗性細胞系系號加最后植株株號數字段形成)。可清楚地看到由同一潮霉素抗性細胞系再生的植株W編碼區PCR分析完全相同，即都表現陽性產生特定的W編碼區700bp片段條帶或陰性。表明了同一潮霉素抗性細胞系是非嵌合體，即無嵌合體問題。圖5B與圖5A的各樣品順序和標示是完全一樣的。圖6從再生植株的葉子提取蛋白Westernblot分析5c7-,7表達Bcl-xl蛋白水平。正對照(Postivecontrol)為重組人Bcl-xLprotein;負對照(Negativecontrol)為非轉化植株。部分轉化植株5c7-;^基因穩定整合表達Bcl-xl蛋白，而負對照無信號具體實施例方式下面結合具體實施方式對本發明做進一步的說明。實施例l:獲得花生重復體細胞胚發生培養物。花生品種粵油116(廣東農業科學院培育，連續開花亞種珍珠豆型，subsp.Var.n/7卵"'s，Spanishtype西班牙型)、魯花9號(山東農業科學院培育，連續開花亞種中間型)、'佐治亞綠'(美國佐治亞大學培育，交替開花亞禾中普通型，Subsp./ypogaesVar./y/w《3es，runner/virginiatype蘭娜/弗吉尼亞型)。這些品種是優質或抗病花生品種，是各地域主要栽培品種之一。按照正常栽培管理和肥水措施種植收獲果莢(粵油116、魯花9號本人留存，'佐治亞綠'從美國佐治亞大學獲得)。成熟果莢在密封塑料袋中5'C下貯藏1-6年。去殼種仁70%乙醇表面消毒l-3分鐘，然后在1%NaOCl(20%Clorox商業漂白液)消毒30-60分鐘，用重蒸餾水3-5次漂洗。無菌條件下去掉種皮。成熟胚胚軸上部接種SEM培養基(somaticembryogenesismedium,體胚發生培養基).'MS鹽(Murashige和Skoog1962)，B5維生素(Gamborg等1968)，0.088M(3%)蔗糖，12.42nM(3mg/L)picloram禾卩0.8%瓊脂，調pH5.8，121°C滅菌15分鐘后，適當溫度控制在(55-6(TC)時補充過濾滅菌6.84pM(lg/L)的谷氨酰胺。培養皿Parafilm(AmericanNationalCan,Chicago,IL.,USA)密封，28'C黑暗培養20-30天。觀察統計產生胚性愈傷或體胚的外植體數量和外植體總數。每2-4周轉移體胚和胚性愈傷到新SEM培養基中繼代培養。觀察統計體胚數、總胚性愈傷數及體胚發生方式等情況。在啟始培養后約3個月(約4-5次繼代培養)獲得明顯的花生重復體細胞胚發生培養物(附圖2)。每次繼代培養后體胚數至少翻倍，體細胞胚發生百分比效率在80%左右，培養物可繼代多年仍保持再生能力。各類型花生及貯藏年限均對獲得花生重復體細胞胚發生培養物無影響。(表l)。貯藏1-6年的花生成熟種子仍能用于誘導重復體細胞胚發生培養物是以往文獻未報道的，將在實際育種和組培中有用。在本發明實施例陳述中使用'佐治亞綠'品種實驗數據，但本發明不限于此花生品種及類型。200710053585.3說明書第18/22頁表1不同貯藏年限"佐治亞綠"成熟種子啟始培養3個月后重復體細胞胚發生百分比效率成熟種子貯藏年限(年)12456體細胞胚發生百分比效率(％)77.480.579.976.080.2實施例2:外源DNA或基因構建在適當的植物表達框中并連在同一載體上，抽提、純化外源基因植物表達載體(質粒)和確定其濃度。pZP211-Bel-xL中目的基因人A7-;^基因植物表達框(DickmanMB,ParkYK，OltersdorfT,LiW,ClementeT，FrenchR.Abrogationofdiseasedevelopmentinplantsexpressinganimalantiapoptoticgenes.ProcNatlAcadSciUSA,2001，98:6957-6962)經尸"/酶切克隆于pUC19(本實驗室保存)后經過分b/z^ci/雙酶切亞克隆于質粒pRT-66(Dr.R.T5pfer惠贈)植物表達載體，質粒pRT-66帶篩選標記基因(潮霉素抗性力pt基因)植物表達框(T6pferR，MaasC，Horicke-GrandpierreC，SchellJ，SteinbissH-H.Expressionvectorsforhigh-levelgeneexpressionindicotyledonousandmonocotyledonousplants.MethEnzymol，1993，217:66-78)。質粒載體構建(附圖l)、質粒的抽提、純化、濃度確定和序列測定具體操作參照常規分子克隆方法或從商業服務獲得。在本發明實施例陳述中使用潮霉素抗性基因為篩選標記基因，人A/-為目的基因，但本發明不限于用潮霉素抗性基因和人實施例3:微粒轟擊轉化重復體細胞胚發生培養物和篩選獨立抗性細胞系。從實施例1中啟始培養3-IO個月后的花生重復體細胞胚發生培養物取大約10-15個重復體胚發生胚性組織，放置在SEM培養基中大約3cm直徑區域之內(約7cm2)。將準備好的50W金微粒(直徑0.6或1.0Mm，Bio-Rad)懸浮液(60mg/ml)(Ozias-Akins等1993)與5W(lPg/Hl)含CaMV35S啟動子控制下篩選基因(力pt)和非篩選目的基因(人iW-;r7)植物表達框的質粒混合。震蕩中依次加入50W2.5M氯化鈣和2(￥10.1M亞精胺。震蕩懸浮5-8分鐘，短暫離心10000卬111。100%乙醇漂洗金微粒，60W100%乙醇重懸(Ozias-AkinsP,SchrmllJA，AndersonWFetal.Regenerationoftransgenicpeanutplantsfromstablytransformedembryogeniccallus.PlantScience,1993,93:185-194)。吸取8-10W微粒懸浮滴于金微粒載片(Macrocarrier)。根據Bio-RadPDS1000/He系統說明書進行轟擊，條件是12410kPa(1800psi)破裂膜，95kPa(28英寸汞柱)真空壓力，培養皿在金微粒載片下6cm。在轟擊后1-10天，被轟擊的胚性組織轉入含20mg/L潮霉素(致死濃度)半固體SEM培養基。該篩選策略是以往文獻從未采用的，具有明顯新穎性。在約1個月篩選后，仔細地辨認、分離獨立的可能的抗性細胞系(附圖3)。各系組織直接地繼代培養于新鮮的含20mg/L潮霉素(致死濃度)半固體SEM培養基中。在以后各輪篩選，可存活增殖、抗性被證實的獨立系獲得抗性細胞系系號。轉基因效率在各條件組合下為每轟擊平均獲得15.7(1035/66，獨立的抗性細胞系數/轟擊數)個獨立的抗性細胞系，最佳條件下的實驗平均可達20.5以上(656/32)，轉化通量高(表2)。在采取新篩選策略下，轉化效率明顯好于(3-6倍于)以往報道的相似方法的最好效率(最好條件下3-6獨立的抗性細胞系/每轟擊，LivingstoneDM，BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpea皿tG4rac/w'51力j7oaeaL.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999，5(1):43-51)，體現了其創造性和實用價值，即高效率、高通量轉化。在篩選之下繼代培養(約1-2個月)增殖潮霉素抗性細胞系，增殖體胚用于植株再生。在本發明實施例陳述中使用潮霉素抗性基因(力pt)，以潮霉素篩選轉基因抗性細胞系，但本發明不限于用潮霉素抗性基因和潮霉素篩選。表2"佐治亞綠"重復體胚發生胚性組織在一些條件組合下轉化效率."(獨立的抗性細胞系/轟擊數)重復體胚發生胚性組織5啟始培養后(月)9999啟始篩選在轟擊后(天)3每轟擊平均獲得獨立的6121320.539.6511.4抗性細胞系數(個)(18/3)"(208/16)(656/32)(96/10)(57/5)實施例4:再生植株和傳代實施例2獲得部分(60個)獨立的潮霉素抗性細胞系的體胚在MSBO培養基(MS鹽、B5維生素和0.088M蔗糖)加5.37賜(1mg/L)NAA(稱為1NAA)26°C黑暗培養促使體胚成熟。源于同一獨立抗性細胞系的體胚隨機地(不挑選)進入兩個再生方法之一，培養條件均是30MMolm-2s-l光強、16/8小時光周期。其一的培養基操作過程(稱為1TDZ):通過含4.9W(約lmg/L)TDZ(噻二唑苯基)MS培養基培育，促使體胚轉換。第二種再生處理(稱為3B1G):轉到于基礎培養基加13.31剛(3mg/L)BA和2.89PM(]mg/L)GA培養基中促體胚轉換。兩種培養基操作過程在6個星期以后，統計枝芽的數量和體胚總數，體胚產生至少帶一片四具小葉葉子的枝芽被認為是體胚轉換(萌芽)。實驗被重復一次。長度至少2cm的枝芽被切下于基礎培養基加上0-0.54NAA生根lw(大約95%)。生根的小植株移入花土中，最后轉移到溫室觀察再生植物的育性。結果表明兩種再生方法的體胚轉換(萌芽)率無明顯差異(表3)，但比以往的相似轉化系統的再生方法效率高和相當(LivingstoneDM，BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanut//paaesL)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43—51)。從啟始培養到獲得抗性再生植株大約需9-12個月，比以往的相似轉化方法快和相當(LivingstoneDM，BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanut(Arac/w-s//poaeaL.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43-51)。轉移生根的植株入土生存率高(大約95%)。生存的三百左右植株移入溫室后，大半開花，與以往的相似轉化方法相當。在人工生長室按照正常的栽培管理措施管理，收獲T,代合子(種子)，多達2500顆正常種子，體現了高效率、高通量的特點。按照正常的栽培管理措施對各t代種子系繼續傳代選育。表3兩種再生方法的體胚轉換(萌芽)率<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例5:轉基因植株和轉基因后代分子分析參照常規分子克隆方法，從
發明內容二、三、四中不同的抗性細胞系、再生植株和種子獲得適量的愈傷、再生植株葉、種子子葉以適當的方法提取DNA或RNA或蛋白質。按照常規分子分析方法PCR分析初步確定5c7-W和篩選基因整合與否。Southernblot分析進一步確定抗性細胞系、再生植株和種子的穩定整合轉化性和獨立性。Northernblot、Westernblot、ELISA和其他適當方法分析進一步確定5"i7的表達水平、穩定性和傳代遺傳情況。在各代中篩選劑抗性分析進一步確定篩選基因的表達水平、穩定性和傳代遺傳情況。1)以PCR分析潮霉素抗性細胞系和再生植株為實施例進行陳述初步確定U-"'和篩選基因(知O整合與否從不同的潮霉素抗性細胞系取愈傷或再生植株葉大約70毫克以快速CTAB方法提取DNA。使用PCR擴增700bp5d-;d編碼序列(正義引物5'-ctagatatcatgagtcagagcaaccgggagctg-3，；反義弓|物5'-catgagctctagatcatttccgactgaagag-3，)禾口850bp如f序歹U(正義弓I物5'-gaaaaagcctgaactcaccgcgac-3，；反義弓l物5'-cgcccasgctgcatcatcgaaatt-3')分析5c7-;^和力/z:整合與否。在(微升)PCR體系中分別加入去離子水13.3Hl，10XBuffer2W,2.5mMdNTPO.5W，25mMMgCl21.5W,Taq酶0,1(l單位),植物總DNA(50-100ng)。PCR條件94°C2分鐘94°C30秒，50°C30秒，72°C60秒35個周期；72°C7分鐘。1%瓊脂糖膠TBE電泳分析PCR產品。從潮霉素抗性細胞系愈傷提取基因組DNA對非篩選基因&7-W全長度編碼區(700bp片段)PCR分析，估計W與力/^共轉化效率大約是60%(附圖4)。PCR分析證實所有從不同的系再生植株的葉子均整合篩選基因力pt，表明在這個轉化系統中沒有逃逸問題，既使在再生過程中沒有篩選壓力情況下(附圖5a)。對非篩選目的基因ScJ-;d的PCR分析表示，從同一獨立體胚系再生的不同的植物通常產生同一PCR結果，表明在這個轉化篩選系統中嵌合體問題也幾乎不存在(附圖5b)。2)以Westernblot分析再生植株為實施例進行陳述初步確定5c7-W基因穩定整合表達與否從不同再生植株取適當發育階段的葉子，提取總蛋白。按照常規方法進行Westernblot分析，所用儀器試劑為電泳儀(mini-ProteanII鄰paratus，Biorad，Hercules,CA),正對照重組人Bcl-xLprotein(ProteinXUb,SanDiego,CA)，負對照非轉化的'佐治亞綠'，一抗為人Bcl-xLprotein單克隆抗體(anti-Bcl-xLmonoclonalantibody,ChemiconInternational,Temecula,CA)，酶耳關二抗(Alkalinephosphataseconjugatedsecondaryantibody,ChemiconInternational,Temecula,CA)，顯色檢測系統(NBT-BCIPdetectionsystem,Roche,Pleasanton，CA)。結果表明部分轉化植株5c7-義7基因穩定整合表達Bcl-xl蛋白，而負對照無信號(附圖6)。3)對各L代種子系繼續傳代，葉片潮霉素抗性抗性分析進一步確定篩選基因可以穩定性表達和遺傳，Westernblot分析表明Ac7-;d基因可以在部分后代中穩定整合表達Bcl-xl蛋白。權利要求1、一種花生轉基因的方法，它包括下列步驟A、建立花生的重復體細胞胚發生培養物貯藏0-6年花生的成熟莢去殼，種仁乙醇表面消毒，然后NaOCl消毒，重蒸餾水3-5次漂洗，無菌條件下去掉種皮，成熟胚胚軸上部接種于含生長素的SEM培養基，體胚發生培養基，MS鹽，B5維生素，0.088M3％蔗糖，12.42μM3mg/Lpicloram和0.8％瓊脂，調pH5.8，121℃滅菌15分鐘后，溫度控制在55-60℃時補充過濾滅菌6.84μM(1g/L)的谷氨酰胺，培養皿28℃黑暗培養20-30天，每2-4周轉移體胚和胚性愈傷到新SEM培養基中繼代培養1-10個月獲得重復體細胞胚發生培養物；B、外源DNA或基因構建在植物表達框中并在同一或不同載體上，抽提、純化外源基因植物表達框或載體和確定其濃度待轉化的外源DNA是篩選標記基因和目的基因，篩選標記基因為植物表達載體攜帶的潮霉素抗性、草銨膦抗性、草甘膦抗性篩選標記基因植物表達框，植物表達載體為pCAMBIA系列和pRT系列，待轉化的外源目的基因為植物病原菌抗性基因、作物品質和產量相關基因，為人Bc1-x1基因；擬南芥RRS1-R基因；花生FAD2基因；花生Arah基因，在植物表達載體上構建目的基因植物表達框，目的基因與篩選標記基因植物表達框可連一起，即構建到同一植物表達載體上；目的基因與篩選標記基因植物表達框分別處于不同植物表達載體上或DNA片段中，外源基因的植物表達框或載體構建、質粒或DNA片段的抽提、純化和確定濃度；C、微粒轟擊轉化重復體細胞胚發生培養物和篩選獨立抗性細胞系放置重復體胚發生胚性組織在SEM培養基中，準備金微粒懸浮液，金微粒懸浮與含篩選基因和非篩選目的基因的質粒或DNA片段混合，震蕩中依次加入氯化鈣和亞精胺，震蕩懸浮，離心，乙醇漂洗包裹質粒的金微粒，乙醇重懸微粒，重懸微粒滴于金微粒載片，轟擊，被轟擊的胚性組織轉入含致死濃度篩選劑培養基，在1個月篩選后，分離獨立的抗性細胞系，各系組織直接地繼代培養于新鮮的含致死濃度篩選劑的半固體SEM培養基中篩選，存活增殖、抗性被證實的獨立系獲得抗性細胞系系號，在篩選之下繼代培養增殖抗性細胞系，增殖體胚用于植株再生；D、再生植株和傳代抗性細胞系體胚在含植物調節物質的培養基中26℃黑暗成熟，體胚轉移入含細胞分裂素的培養基中，經培養基操作過程1TDZ或3B1G，在16/8小時光周期光照培養萌芽，切下2cm長的芽于含生長素的培養基生根，生根的小植株移入花土中，最后轉移到溫室，栽培管理，收獲T1代合子，對T1代種子系繼續傳代選育；E、轉基因植株和轉基因后代分子分析，分子分析抗性細胞系、再生植株和種子從B、C、D步驟中的抗性細胞系、再生植株和種子的愈傷、再生植株葉、種子子葉提取DNA或RNA或蛋白質，確定目的基因和篩選基因整合，確定外源基因在抗性細胞系、再生植株和種子的穩定整合轉化性和轉化事件獨立性，確定目的基因的表達水平、穩定性和傳代遺傳。2、根據權利要求1所述的一種花生轉基因的方法，其特征在于轟擊后1-10天啟始半固體培養基篩選。3、根據權利要求l所述的一種花生轉基因的方法，其特征在于篩選劑為20mg/L潮霉素的半固體培養基連續篩選。全文摘要本發明公開了一種花生轉基因的方法，其步驟是首先建立花生的重復體細胞胚發生培養物；其次是將外源DNA或基因構建在植物表達框或表達載體中，抽提、純化和確定外源DNA的濃度；第三是微粒轟擊轉化重復體細胞胚發生培養物和篩選獨立抗性細胞系；第四是再生植株和傳代；第五是轉基因植株和轉基因后代分子分析。本發明采用保存0-6年的成熟花生種子誘導的，啟始培養后1-10個月的重復體細胞胚發生培養物為轉基因受體；轉基因效率高，轉化通量高；轟擊后篩選效率高，無逃逸，無嵌合體；整個過程不存在基因型依賴，且再生植株高效容易，可大量獲得轉基因后代種子，且外源基因可穩定整合、表達遺傳。文檔編號C12N15/09GK101186910SQ20071005358公開日2008年5月28日申請日期2007年10月18日優先權日2007年10月18日發明者鄧向陽申請人:中國科學院亞熱帶農業生態研究所;鄧向陽