專利名稱：同時獲得副產物普魯蘭的β-聚蘋果酸的制備方法
技術領域：
本發明的技術方案屬于生物法合成生物降解高分子材料研領域。
背景技術：
生物降解聚酯的合成研究始于20世紀60年代。1969年，研究圓弧青 霉菌(Pe"d〃/wm cyc/op/ww)的微生物學家Shimada禾口 Matsushima等推觀!l 該菌中可能存在含蘋果酸結構單元的聚合物，該聚合物能夠抑制圓弧青霉 菌的酸性蛋白酶活性，最終證實該聚合物為聚蘋果酸(PMA)。 1979年， Vert等首次合成了水溶性脂肪族聚酯——聚蘋果酸，它以蘋果酸為唯一單 體。1989年，Fisher等從黏菌(尸/^raram尸o(yce/ /za/wm)細胞中分離出PMA， 并發現它是DNA聚合酶a的抑制劑。迄今為止，以Vert、Cammas、Kajiyama 等為代表的國外學者已對PMA的合成、性能和應用做了較深入的研究； 國內直到近幾年才有學者對PMA的合成與性能做了基礎研究。
聚蘋果酸(PMA)是一種脂肪族聚酯類聚合物，是完全生物降解性的 新型生物高分子。PMA能被某些微生物先降解為低聚物，而后形成蘋果酸 單體，并最終降解為C02和H20，其降解產物無毒無害，不會對環境產生 二次污染，是一種理想的生物降解性材料。PMA主要有a、卩、Y三種結構， 存在于生物體內的主要是(3型，它具有良好的水溶性、可生物降解性、生 物相容性和生物可吸收性，而且它具有易代謝性和易修飾性。因此，J3-PMA 可以作為藥物載體及微膠囊材料、生物醫學材料，如手術縫合線和繃帶等， 還可作為化妝品、食品包裝材料等。
普魯蘭是出芽短梗霉產生的一種胞外多糖副產物，易溶于水，不溶于 乙醇。它是一種具有極好的成膜、成纖、阻氣、粘接、無毒性生物高分子， 己廣泛應用于生物醫藥和食品等領域。
PMA的制備主要有化學合成法和生物發酵法兩種。研究伊始，其合成
方法主要集中于化學合成法，又分為直接聚合法和開環聚合法兩種。直接
聚合法得到的主要是Y型PMA，并且相對分子質量比較低，實際應用價值 較小，而且催化劑有毒，較難分離得到產物。開環聚合法又分為交酯和內 酯開環法，交酯開環得到的是a型PMA，內酯開環法可得到P型PMA， 但該方法形成內酯的步驟較多、不經濟或產率太低。生物發酵法可得到P 型PMA，并且分子量相對較大，所需的原料簡單易得，反應條件溫和，具 有較大的開發應用前景。但是，長期以來，微生物法制備聚蘋果酸的研究 國際國內均處在實驗室水平，并存在PMA產量低、分離純化困難和黑色 素難以去除的問題，而且，由于忽視了副產物普魯蘭的分離純化，使聚蘋 果酸的制造成本高居不下，又引起環境問題。事實上，構建聚蘋果酸生產 用基因工程菌是解決產物分離純化問題最好的方法。然而，在高產聚蘋果 酸基因工程菌構建還沒有實現的情況下，副產物普魯蘭的去除一直是聚蘋 果酸生產需要高度重視的問題之一。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種同時獲得副產物普魯蘭的(3-聚蘋果酸的制備方法，實現P-聚蘋果酸和普魯蘭的雙產物發酵，有效去除 黑色素，減少由于副產物普魯蘭廢棄造成的環境污染。
本發明解決該技術問題所采用的技術方案是 第一步，培養基的配制
① 活化培養基即馬鈴薯蔗糖培養基(PSA):馬鈴薯200g/L，蔗糖
20g/L，瓊脂20g/L， pH5.6， 12廣C高壓蒸汽滅菌30分鐘；
② 發酵培養基的配制葡萄糖120g/L， NaN032g/L， KH2P04 0.1g/L， MgS04.7H20 0.2g/L， KC1 0.5g/L， CaCO330g/L， pH 4.0, 121。C高壓蒸汽滅 菌15分鐘，CaC03單獨干熱滅菌，180°C2小時；
第二步，菌種活化
將凍干菌禾中-出芽短梗霉(4wrcok^Www; w〃w/am， As3.837)采用
PSA在22-26t:進行活化培養40-卯小時； 第三步，種子培養在固體平板上挑取第二步制得的活化單菌，接種于裝有第一步制得的
發酵培養基的L管中，在24-30'C ， 120 r/min條件下振蕩培養40-100小 時；
第四步，接種發酵
將第三步制得的種子培養物以0.8-2%接種于發酵培養基中，在 24-30°C， 120 r/min條件下振蕩培養發酵8-14天； 第五步，分離純化
① 卩-聚蘋果酸與普魯蘭的初步分離在第四步發酵結束后，離心，固 液分離，除去菌體；將發酵液調節pH至5.0，加等體積乙醇，黑色絮狀沉 淀即為吸附了黑色素的普魯蘭，淡黃色澄清液即為溶(3-聚蘋果酸液；過濾 分離；將溶p-聚蘋果酸液濃縮后加二倍體積乙醇，出現的少量絮狀沉淀為 普魯蘭，過濾并入初次沉淀的普魯蘭中；二次旋蒸濃縮上清液，得到較為 純化的卩-聚蘋果酸濃縮液；
② P-聚蘋果酸的純化將上面①濃縮后的p-聚蘋果酸溶液加4倍體積 乙醇，置于fC冰箱過夜，有白色沉(3-聚蘋果酸沉淀析出；再次溶于50-100 倍重量的水中，透析或超濾2天，去除(3-聚蘋果酸中的黑色素和一些小分 子物質，冷凍干燥，得p-聚蘋果酸白色粉末產物；
③ 普魯蘭的純化配制乙醇/丁酮比例6: 4的混合溶劑，將上面①得 到的普魯蘭與5-15倍該溶劑混合，攪拌2天，使普魯蘭與黑色素充分分離； 將普魯蘭粗品溶于水中，用常規透析方法透析除去殘留的黑色素；將經過 純化的普魯蘭溶液冷凍干燥，得副產物微黃色普魯蘭固體。
本發明與現有技術相比，有益效果是第一，使用該制備方法以出芽 短梗霉進行發酵可獲得卩-聚蘋果酸和普魯蘭雙產物；第二，能夠有效去除 黑色素，提高產物純度；第三，由于副產物普魯蘭的分離純化，既可降低 卩-聚蘋果酸的生產成本，又可避免由于普魯蘭隨黑色素的廢棄引起的環境 問題，減少環境污染。
具體實施方式
實施例l
按如下步驟制備(3-聚蘋果酸和普魯蘭 第一步，培養基的配制
①活化培養基即馬鈴薯蔗糖培養基(PSA):馬鈴薯200g/L，蔗 糖20g/L，瓊脂20g/L， pH5.6， 12rC高壓蒸汽滅菌30分鐘；
.②發酵培養基的配制葡萄糖120g/L， NaN03 2g/L， KH2P04 0.1g/L， MgSO4.7H2O0.2g/L， KC10.5g/L， CaCO330g/L， pH4.0, 121°C 高壓蒸汽滅菌15分鐘，CaCCb單獨干熱滅菌，18(TC2小時； 第二步，菌種活化 -將保存于一70。C的甘油管中的出芽短梗霉(^weokwWwm; w〃w/ara， As 3.837)采用第一步配置的PSA培養基在24'C進行活化培養48 小時。 第三步，種子培養
在固體平板上挑取第二步制得的單菌，接種于裝有5mL第一步制得 的發酵培養基的L管中，在24。C ， 120 rpm條件下振蕩培養90小 時。
第四步，接種發酵
以0.8%的接種量將第三步制得的種子培養液接種于發酵培養基中， 在28'C， 120rpm條件下振蕩培養發酵14天。
第五步，分離純化
① (3-聚蘋果酸與普魯蘭的初步分離在第四步發酵結束后，離心固 液分離，除去菌體；將發酵液調節pH至5.0，加等體積乙醇，黑色絮狀 沉淀即為吸附了黑色素的普魯蘭，淡黃色澄清液即為P-聚蘋果酸溶液； 過濾分離；將P-聚蘋果酸溶液濃縮后加二倍體積乙醇，出現的少量絮狀 沉淀為普魯蘭，過濾并入初次沉淀的普魯蘭中；二次旋蒸濃縮上清液， 得到較為純化的(3-聚蘋果酸濃縮液；
② P-聚蘋果酸的純化將上面①濃縮后的卩-聚蘋果酸溶液加4倍體 積乙醇，置于^C冰箱過夜，有白色P-聚蘋果酸沉淀析出；再次溶于50 倍重量的水中，透析兩天，去除P-聚蘋果酸中的黑色素和一些小分子物
質，冷凍干燥，得(3-聚蘋果酸白色粉末產物；
③普魯蘭的純化配制乙醇/丁酮比例6: 4的混合溶劑，將上面① 得到的普魯蘭與8倍該溶劑混合，攪拌2天，使普魯蘭與黑色素充分分 離；將普魯蘭粗品溶于水中，用透析袋透析除去殘留的黑色素。將經過 純化的普魯蘭溶液冷凍干燥，得副產物致密膜狀微黃色普魯蘭固體。
實施例2
按如下步驟制備(3-聚蘋果酸和普魯蘭 第一步，培養基的配制
① 活化培養基即馬鈴薯蔗糖培養基(PSA):馬鈴薯200g/L，蔗糖
20g/L，瓊脂20g/L， pH5.6， 121'C高壓蒸汽滅菌30分鐘；
② 發酵培養基的配制葡萄糖120g/L， NaN032g/L， KH2P04 0.1g/L， MgS(V7H2O0.2g/L， KC10.5g/L， CaC03 30g/L pH 4.0, 121。C高壓蒸汽 滅菌15分鐘，CaC03單獨干熱滅菌，18(TC2小時；
第二步，菌種活化
將保存于一70。C的甘油管中的出芽短梗霉"" o6os誠ww/w〃wAms， As 3.837)采用第一步制得的PSA培養基在24"C進行活化培養48小時。 第三步，種子培養
在固體平板上挑取第二步制得的單菌，接種于裝有5mL第一步制得的 發酵培養基的L管中，在26。C ， 120rpm條件下振蕩培養72小時。 第四步，接種發酵
以1%的接種量將種子培養液接種于發酵培養基中，在28"C， 120 rpm 條件下振蕩培養發酵9天。
第五步，分離純化
①p-聚蘋果酸與普魯蘭的初步分離第四步得到的發酵液13000 rpm 離心10分鐘，除去菌體。將發酵液調節pH5.0，加入等體積的無水乙醇， 觀察到有黑色絮狀漂浮物生成，此即為普魯蘭，離心分出。部分黑色素 附著于普魯蘭上， 一同被分出。淡黃色P-聚蘋果酸澄清液濃縮后，加入
2倍體積無水乙醇，離心再次分離普魯蘭。
② (3-聚蘋果酸的純化將一次沉淀后的上清液旋轉蒸發濃縮后，加入
約4倍體積的無水乙醇，置于4。C冰箱過夜，進行二次沉淀，即有p-聚蘋 果酸沉出。發現沉淀的(3-聚蘋果酸以膠體狀態存在于乙醇和水的混合液中， 向其中加入2 % (w/w)NaCl即有P-聚蘋果酸沉淀下來。將所得的|3-聚蘋果 酸沉淀再次溶于100水倍中，用透析袋透析除去殘留的黑色素。將透析后 的|3-聚蘋果酸溶液冷凍干燥，即得白色(3-聚蘋果酸產品。
③ 普魯蘭的純化將上面①兩次分離出的普魯蘭和黑色素的混合物置 于乙醇/丁酮比例6 : 4的混合溶劑中，在磁力攪拌器上80rpm攪拌2天， 過濾得到普魯蘭粗品，棄去含有黑色素的混合液。將普魯蘭粗品溶于水中， 用透析袋透析除去殘留的黑色素。冷凍干燥透析袋中的普魯蘭溶液，得到 副產物淡黃色普魯蘭。
實施例3
按如下步驟制備卩-聚蘋果酸和普魯蘭 第一步，培養基的配制
① 活化培養基即馬鈴薯蔗糖培養基(PSA):馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L， 瓊脂20g/L， pH5.6， 121°C，高壓蒸汽滅菌30分鐘；
② 發酵培養基的配制葡萄糖120g/L， NaN03 2g/L， KH2P04 0.1g/L， MgS04.7H20 0.2g/L， KC1 0.5g/L， CaCO330g/L， pH 4.0, 121。C高壓蒸汽滅 菌15分鐘，CaC03單獨干熱滅菌，180°C2小時；
第二步，菌種活化
將保存于一70°C的甘油管中的出芽短梗霉Uwreo6oyWww pw〃w/""j, As 3.837)采用第一步制得的PSA培養基在22。C進行活化培養90小時。 第三步，種子培養
在固體平板上挑取第二步制得的單菌，接種于裝有5mL第一步制得的 發酵培養基的L管中，在28'C ， 120rpm條件下振蕩培養60小時。 第四步，接種發酵
以2%的接種量將第三步制得的種子培養液接種于發酵培養基中，在 26°C， 120rpm條件下振蕩培養發酵8天。 第五步，分離純化
① p-聚蘋果酸與普魯蘭的初步分離在第四步發酵結束后，離心固液 分離，除去菌體；將發酵液調節pH至5.0，加等體積乙醇，黑色絮狀沉淀 即為吸附了黑色素的普魯蘭，淡黃色澄清液即為(3-聚蘋果酸溶液；過濾分 離；將P-聚蘋果酸溶液濃縮后加二倍體積乙醇，出現的少量絮狀沉淀為普 魯蘭，過濾并入初次沉淀的普魯蘭中；二次旋蒸濃縮上清液，得到較為純 化的P-聚蘋果酸濃縮液；
② (3-聚蘋果酸的純化將上面①濃縮后的P-聚蘋果酸溶液加4倍體積 乙醇，置于fC冰箱過夜，有白色p-聚蘋果酸沉淀析出；再次溶于50倍重 量的水中，采用中空纖維分離器，用常規超濾方法進行超濾，膜的載留分 子量為5000D，去除(3-聚蘋果酸中的黑色素和一些小分子物質，冷凍干燥， 得I3-聚蘋果酸白色粉末產物；
③ 普魯蘭的純化先將上面①得到的普魯蘭溶于5倍重量的蒸餾水 中，8(TC水浴鍋加熱2小時，除去普魯蘭酶；配制乙醇/丁酮比例6: 4的 混合溶劑，將上述普魯蘭與8倍該溶劑混合，攪拌2天，使普魯蘭與黑色 素充分分離；將普魯蘭粗品溶于水中，用透析袋透析除去殘留的黑色素。 將經過純化的普魯蘭溶液冷凍干燥，得副產物致密膜狀微黃色普魯蘭固體。
權利要求
1.同時獲得副產物普魯蘭的β-聚蘋果酸的制備方法，包括以下步驟第一步，培養基的配制①活化培養基即馬鈴薯蔗糖培養基(PSA)馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L，pH5.6，121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘；②發酵培養基的配制葡萄糖120g/L，NaNO3 2g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，KCl 0.5g/L，CaCO3 30g/L，pH4.0，121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘，CaCO3單獨干熱滅菌，180℃2小時；第二步，菌種活化將凍干菌種——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulan，As3.837)采用PSA在22-26℃進行活化培養40-90小時；第三步，種子培養在固體平板上挑取第二步制得的活化單菌，接種于裝有第一步制得的發酵培養基的L管中，在24-30℃，120r/min條件下振蕩培養40-100小時；第四步，接種發酵將第三步制得的種子培養物以0.8-2％接種于發酵培養基中，在24-30℃，120r/min條件下振蕩培養發酵8-14天；第五步，分離純化①β-聚蘋果酸與普魯蘭的初步分離在第四步發酵結束后，離心，固液分離，除去菌體；將發酵液調節pH至5.0，加等體積乙醇，黑色絮狀沉淀即為吸附了黑色素的普魯蘭，淡黃色澄清液即為溶β-聚蘋果酸液；過濾分離；將溶β-聚蘋果酸液濃縮后加二倍體積乙醇，出現的少量絮狀沉淀為普魯蘭，過濾并入初次沉淀的普魯蘭中；二次旋蒸濃縮上清液，得到較為純化的β-聚蘋果酸濃縮液；②β-聚蘋果酸的純化將上面①濃縮后的β-聚蘋果酸溶液加4倍體積乙醇，置于4℃冰箱過夜，有白色沉β-聚蘋果酸沉淀析出；再次溶于50-100倍重量的水中，透析或超濾2天，去除β-聚蘋果酸中的黑色素和一些小分子物質，冷凍干燥，得PMA白色粉末產物；③普魯蘭的純化配制乙醇/丁酮比例6∶4的混合溶劑，將上面①得到的普魯蘭與5-15倍該溶劑混合，攪拌2天，使普魯蘭與黑色素充分分離；將普魯蘭粗品溶于水中，用常規透析方法透析除去殘留的黑色素；將經過純化的普魯蘭溶液冷凍干燥，得副產物微黃色普魯蘭固體。
2. 根據權利要求l所述的制備卩-聚蘋果酸和普魯蘭的方法，其特征在于，菌種 活化溫度為24"C，活化培養時間為48-60小時。
3. 根據權利要求l所述的制備卩-聚蘋果酸和普魯蘭的方法，其特征在于種子培 養溫度為28'C,培養時間為60小時。
4. 根據權利要求l所述的制備P-聚蘋果酸和普魯蘭的方法，其特征在于，在卩-聚蘋果酸純化步驟中，加入4倍體積乙醇的同時還加入2% (w/w) NaCl固體， 以使PMA充分沉淀。
5. 根據權利要求l所述的制備卩-聚蘋果酸和普魯蘭的方法，其特征在于，在普 魯蘭的純化步驟中，先將普魯蘭溶于5-15倍重量的蒸餾水中，8(TC水浴鍋加熱 2小時，除去普魯蘭酶，冷卻后，再加入乙醇/丁酮混合溶劑去除黑色素。
全文摘要
本發明公開了一種同時獲得副產物普魯蘭的β-聚蘋果酸制備方法。利用本方法能夠有效去除黑色素，提高產物純度；可減少由于普魯蘭隨黑色素的廢棄而引起的環境污染。本發明通過下述技術方案予以實現將出芽短梗霉菌種經活化和種子培養后接種于發酵培養基中；在24-30℃，和120rpm條件下培養8-14天，發酵結束后，固液分離，除去菌體。加等體積乙醇分離出普魯蘭沉淀和黑色素，澄清液濃縮后加二倍體積乙醇離心再次分離普魯蘭。二次濃縮。加四倍體積的乙醇沉淀β-聚蘋果酸，并再次溶于水中，透析或超濾除去殘留黑色素和一些小分子物質，冷凍干燥獲得β-聚蘋果酸成品。分離出的普魯蘭溶于乙醇/丁酮混合液中，除去黑色素，經透析后冷凍干燥獲得普魯蘭。
文檔編號C12R1/645GK101100687SQ20071005839
公開日2008年1月9日 申請日期2007年7月25日 優先權日2007年7月25日
發明者娜 劉, 莉 劉, 孫村民, 宋存江, 王淑芳, 郭紅彥, 馬晨燕 申請人:南開大學