專利名稱：一種制備聚合度為4-7的殼寡糖的方法
技術領域：
本發明公開了一種制備聚合度為4-7的殼寡糖的方法，屬生物技術領域。技術背景殼寡糖(Chitosan oligosaccharide)是指2-10個氨基葡萄糖以P -1，4-糖苷鍵連接而成的低 聚糖，學名為e-i, 4-寡聚-葡萄糖胺。它通常是由甲殼素(蝦、蟹殼等)脫乙酰化的產物 殼聚糖(脫乙酰化度》70%)，通過生物工程技術降解制備的低聚氨基葡萄糖(殼寡糖)。 是一種水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量產品。殼寡糖在人體內吸收率近 100%，其功效是殼聚糖的數十倍。研究證明殼寡糖具有提髙免疫，抑制癌腫瘤細胞生長, 促進肝脾抗體形成，預防成人疾病等功能，可應用于醫藥、功能性食品等領域。殼寡糖的結構與功能密切相關，聚合度范圍越寬，其功能就越不明確。如聚合度為6 的殼寡糖對腫瘤細胞的生長和痛細胞的轉移有明顯的抑制效果，而較高聚合度的殼寡糖比 殼聚糖本身和低聚合度殼寡糖對真菌和細菌的抑制作用更大。殼寡糖目前主要是由殼聚糖經化學法和酶法水解制備。化學法因反應條件劇烈，選擇 性差，而使產物雜質多、單糖含量高，低聚糖得率低；酶法降解，是用專一性或非專一性酶對殼聚糖進行降解而得到的殼寡糖。酶法降解避 免了低聚糖的破壞，食用安全性好，但主要是缺乏髙水解活力以及有商業化來源的酶制劑。目前的研究重點多集中在一些較為便宜的商業酶制劑上，包括葡萄糖酶、蛋白酶、脂 酶、淀粉酶、糊精酶、半纖維素酶和果膠酶都能在室溫及相對較低的pH值(pH3.3-4.5) 和較高的酶底比下水解殼聚糖，酶解效率低。如[申請號]00110009， 一種酶法降解殼聚糖 與膜分離相耦合生產殼寡糖的方法，酶解工藝復雜，酶解時間長，效率低。又如[申請 號]200510042017.4， 一種利用腐皮鐮孢菌生產殼寡糖的方法，同樣存在酶解時間長，酶解 需要6-8 h;效率低，在原料經過超聲波或輻照技術處理后， 一次酶解得率僅75%;分離 提取需采用多種膜濾技術，工藝復雜。為此，有必要采用新的制備技術，生產聚合度集中， 抑制腫瘤作用明顯的殼寡糖。發明內容為克服上述現有技術的不足，本發明采用單一的曲每產內切殼聚糖酶，通過采用簡便、 快速的透光率變化指標來確定酶反應終點，再用有機溶液沉淀，去掉少量的單糖、二糖， 可制備得到聚合度為4-7的殼寡糖。本發明的工藝流程殼聚糖原料一殼聚糖乙酸溶液—加酶水解一加NaOH—檢測堿性 酶的透光率一滅酶一離心一濃縮一有機溶液沉淀一復溶一再離心一干燥。具體操作方法1、 殼聚糖原料脫乙酰化度為75-95%的殼聚糖。2、 殼聚糖乙酸溶液殼聚糖用濃度為1%乙酸水溶液溶解，殼聚糖乙酸溶液濃度(W/V)為1%-5%。3、 酶法水解加殼聚糖內切酶3-6u/g殼聚糖，40-60'C,水解15—20分鐘，黏度下降 70%后，繼續水解，水解80-100分鐘左右。4、 力UNaOH:間隔一定時間取上述水解液2ml，加入2mllmol/L的NaOH，使其成為 堿性酶解液。5、 檢測堿性酶解液的透光率及滅酶當上述堿性醉解液透光率達到70-85%， 100'C滅 酶15分鐘。6、 離心離心機轉速為5000rpm,離心20分鐘，取上清液。7、 濃縮真空濃縮至固形物含量為10-20%。8、 有機溶劑沉淀用乙酵或丙酮(終濃度為85-95%)有機溶劑沉淀法，去除少量單 糖、二糖，取沉淀。9、 復溶用水復溶解，固形物含量20%。10、 再離心離心機轉速為5000rpm，離心20分鐘，取上清液。11、 干燥采用真空干燥法將上清液干燥。得到本發明聚合度為4-7的殼寡糖。 本發明實現了用單一性酶簡便、快速、高效的制備聚合度為4-7的殼寡糖，避免了化學法帶來的環境污染以及其他制備方法需要結合復雜的膜分離技術等生產成本高的不利， 酶解反應僅需2小時內可完成，酶解得率在85-90%,酶解工藝簡單，主要設備僅霈恒溫反 應釜，生產過程控制簡單、方便，所得殼寡糖聚合度明確，結構清楚，得率商的優點。
具體實施方式
本發明實施例一1、 殼聚糖原料脫乙酰化度為75%的殼聚糖。2、 殼聚糖乙酸溶液殼聚糖用濃度為1%乙酸水溶液溶解，殼聚糖乙酸溶液濃度(W/V)為1%。3、 酶法水解加殼聚糖內切酶3u/g殼聚糖，40'C，水解15分鐘，黏度下降70%后， 繼續水解，水解80分鐘。4、 加NaOH:間隔一定時間取上述水解液2ml,加入2ml lmol/L的NaOH，使其成為 堿性酶解液。5、 檢測滅性酶解液的透光率及滅酶當上述堿性酶解液透光率達到70%, 100'C滅瞎 15分鐘。6、 離心離心機轉速為5000rpm，離心20分鐘，取上清液。7、 濃縮真空濃縮至固形物含量為10%。8、 有機溶劑沉淀用乙酵或丙酮(終濃度為85-95%)有機溶劑沉淀法，去除少量單 糖、二糖，取沉淀。9、 復溶用水復溶解，固形物含量20%。10、 再離心離心機轉速為5000rpm，離心20分鐘，取上清液。11、 干燥采用真空干燥法將上清液干燥。得到本發明聚合度為4-7的殼寡糖。 本發明實施例二1、 殼聚糖原料脫乙酰化度為85%的殼聚糖。2、 殼聚糖乙酸溶液殼聚糖用濃度為1%乙酸水溶液溶解，殼聚糖乙酸溶液濃度(W/V)為3%。3、 酶法水解加殼聚糖內切酶4.5u/g殼聚糖，50'C，水解20分鐘，黏度下降70%后， 繼續水解，水解90分鐘。4、 加NaOH:間隔一定時間取上述水解液2ml，加入2ml lmol/L的NaOH,使其成為 堿性酶解液。5、 檢測械性酶解液的透光率及滅酶當上述堿性酶解液透光率達到75%, IOO'C滅醵 15分鐘。6、 離心離心機轉速為5000rpm，離心20分鐘，取上淸液。7、 濃縮真空,至固形物含量為20%。8、 有機溶劑沉淀用乙BE或丙酮(終濃度為90%)有機溶劑沉淀法，去除少量單糖、 二糖，取沉淀。9、 復溶用水復溶解，固形物含量20%。10、 再離心離心機轉速為5000rpm，離心20分鐘，取上清液。11、 干燥采用真空干燥法將上清液干燥。得到本發明聚合度為4-7的殼寡糖。 本發明實施例三1、 殼聚糖原料脫乙酰化度為95%的殼聚糖。2、 殼聚糖乙酸溶液殼聚糖用濃度為1%乙酸水溶液溶解，殼聚糖乙酸溶液濃度(W/V)為5%。3、 酶法水解加殼聚糖內切酶6u/g殼聚糖，60'C,水解20分鐘，黏度下降70%后， 繼續水解，水解100分鐘。4、 加NaoH:間隔一定時間取上述水解液2ml，加入2ml lmol/L的NaOH，使其成為 堿性酶解液。5、 檢測堿性酶解液的透光率及滅酶當上述堿性酶解液透光率達到85%, IOO'C滅嗨 15分鐘。6、 離心離心機轉速為5000rpm，離心20分鐘，取上淸液。7、 濃縮真空濃縮至固形物含量為10%。8、 有機溶劑沉淀用乙酵或丙酮(終濃度為卯％)有機溶劑沉淀法，去除少量單糖、 二糖，取沉淀。9、 復溶用水復溶解，固形物含量20%。10、 再離心離心機轉速為5000rpm,離心20分鐘，取上清液。11、 千燥采用真空干燥法將上清液干燥。得到本發明聚合度為4-7的殼寡糖。 本發明以單一性酶降解殼聚糖,采用方便，快速的透光率變化指標來確定酶解反應終點，然后通過有機溶液沉淀除去少董單糖、二糖，可得到高濃度聚合度為4-7的殼寡糖，得率 在85%-卯％之間，可廣泛應用于醫藥、功能性食品等行業，具有應用和推廣價值。權利要求
1. 一種制備聚合度為4-7的殼寡糖的方法，其特征在于按下面方法操作(1)殼聚糖原料脫乙酰化度為75-95％的殼聚糖；(2)殼聚糖乙酸溶液殼聚糖用濃度為1％乙酸水溶液溶解，殼聚糖乙酸溶液重量體積百分比濃度為1％-5％；(3)酶法水解加殼聚糖內切酶3-6u/g殼聚糖，40-60℃，水解15-20分鐘，黏度下降70％后，繼續水解，水解80-100分鐘左右；(4)加NaOH取上述水解液2ml，加入2ml 1mol/L的NaOH，使其成為堿性酶解液；(5)檢測堿性酶解液的透光率及滅酶當上述堿性酶解液透光率達到70-85％，100℃滅酶15分鐘；(6)離心離心機轉速為5000rpm，離心20分鐘，取上清液；(7)濃縮真空濃縮至固形物含量為10-20％；(8)有機溶劑沉淀用終濃度為85-95％乙醇或丙酮有機溶劑沉淀法，去除少量單糖、二糖，取沉淀；(9)復溶用水復溶解，固形物含量20％；(10)再離心離心機轉速為5000rpm，離心20分鐘，取上清液；(11)干燥采用真空干燥法將上清液干燥，得到本發明聚合度為4-7的殼寡糖。
全文摘要
本發明公開了一種制備聚合度為4-7的殼寡糖的方法，屬生物技術領域。采用脫乙酰化度75-95％的殼聚糖為原料，用濃度為1％的乙酸溶解其濃度(W/V)為1-5％乙酸溶解，加入殼聚糖內切酶3-6u/g殼聚糖水解，粘度下降70％，繼續水解后，間隔一定時間取上述水解液2ml，加入2ml 1mol/L的NaOH，使其成為堿性酶解液。當堿性液透光率達到70-85％時，100℃滅酶，離心20分鐘，取上清液，濃縮至固形物含量10-20％，用乙醇或丙酮(終濃度為85-95％)沉淀，再復溶和離心，最后真空干燥，得到本發明聚合度為4-7的殼寡糖，得率為85-90％。本發明用單一酶降解殼聚糖，具有酶解效率高，酶解可在2小時內完成，制備過程控制方便，具有應用和推廣價值。
文檔編號C12P19/04GK101235404SQ20071006714
公開日2008年8月6日 申請日期2007年1月29日 優先權日2007年1月29日
發明者夏文水, 方旭波, 潔 陳, 陳小娥 申請人:浙江海洋學院